Introduction
Spise er afgørende; dog deregulering af fødeindtagelse resulterer i spiseforstyrrelser såsom bulimi, anoreksi eller den generelle tendens til at spise for meget pålægger omkostninger på enkeltpersoner og samfundet 1, 2, 3. Målet med den nuværende forskning er at afdække reguleringsmekanismer af fødeindtagelse og give en strategi for at omgå uorden formation. Talrige undersøgelser anvender pattedyr modelorganismer har givet ny indsigt i kredsløb og den rolle, signalsystemer i spiseforstyrrelser 4, 5, 6. Ikke desto mindre er vores viden om neuronale og molekylære baser ligger til grund for disse lidelser er stadig langt fra afsluttet. I de seneste år, frugten flyve Drosophila melanogaster er blevet et værdifuldt modelsystem til optrevling grundlæggende mekanistiske indsigt i reguleringen af metabolism 7, 8, 9. Kapillarrøret Feeder (CAFE) assay for Drosophila melanogaster blev etableret i laboratoriet af Seymour Benzer i 2007 inspireret af et tidligere arbejde af Dethier i blowfly 10, 11. CAFE assay gjorde det muligt direkte at måle fødeindtagelse i Drosophila melanogaster. I denne adfærdsmæssige testsystem, fluer lever af flydende fødevarer omhandlet i graduerede glaskapillarer anbragt inde i et hætteglas. Faldet af kapillære menisk indikerer tab af mad løsning via fordampning og fødeindtagelse. Bestemmelse af fordampning rente med hætteglas uden fluer tillader nøjagtig kvantificering af fødeindtagelse.
CAFE-analysen er en af flere adfærdsmæssige paradigmer bruges til at måle fodring i Drosophila melanogaster og forskere nødt til at vælge den mest hensigtsmæssige for deres specifikkespørgsmål. Beslutningen om at anvende en bestemt assay bør overveje følgende punkter: arten af fødevarer omhandlet; fodring tilstand; måling af indtagelse eller optagelse af næringsstoffer og efterforskning fødevareforbrug eller reaktion på mad.
CAFE assay som beskrevet i denne rapport er ideel til følgende fødeindtagelsen af en flydende fødekilde under en opretstående fodring tilstand. Alternativt fødeindtagelse kan måles for en flue gruppe på en farvet fødekilde i et hætteglas eller på en plade. Fluer normalt dræbt eller bedøvet efter fodring, og mængden af indtaget farvestof bestemmes ved spektrometri eller visuel inspektion af farvede abdomen. Fluer begynder at udskille den indtagne fødevarer kun 30 min efter indtagelse, hvorfor denne fremgangsmåde er vanskelig at anvende til analysen af kontinuerlige længere fodring behaviors 12, 13.
I modsætning fluer holdes intakt ved absorberbar farvestofs med radioaktive sporstoffer anvendes og deres forbrug af radioaktive isotoper er scoret i en scintillationstæller 14, 15. Absorption af det radioaktive ved fluen fordøjelsessystem gør langsigtet mad optagelse måling er muligt, men kan føre til undervurdering af forbruget på grund af ikke-absorberede og udskilles tracer molekyler. En anden tilgang til at måle respons på mad i Drosophila melanogaster er den snabel forlængelse respons (PER), hvilket normalt sker for fødeindtagelse 16. Denne elegante metode måler første reaktion på en fødevare stimulus, men ikke registrerer mængden af indtaget. Fødeindtagelse dynamisk justeres under fodring ved hjælp af flere post-fordøjelsesproblemer feedback-signaler, der er kritiske for regulering af fodring 17, 18. Adskillige forsøg er blevet gjort i de seneste år til semi-automatisere dataindsamling i PER analysen 19, 20. PER detekteres af en elektrisk pude eller en kombination af elektroder og talt via computer. Kombinere PER assay med radioisotop optagelse afslørede, at dette assay er begrænset af lav følsomhed over for detektion mængde fodring forskelle 18. Den manuelle fodring assay (Mafe) 21, hvori en flue fødes manuelt med et glas kapillarrør, blev for nylig udviklet til måling mad-optagelse i en enkelt immobiliseret flue. Den Mafe assay eliminerer interferens på fødesøgning og fodring initiering og har en tidsopløsning sekunder, og initiering af PER og fødeindtagelse kan overvåges uafhængigt i assayet. Men den måde, hvorpå immobilisering af fluen påvirker visse aspekter af fodring adfærd (f.eks bevægelse, motivation) skal stadig undersøges. For fremragende sammenlignende undersøgelser af forskellige assays til måling fødevareforbruget i Drosophila miglanogaster og hjælpe forskerne finde den mest hensigtsmæssige, se rapporter fra Deshpande og Marx 13, 22.
CAFE assay undgår nogle af ulemperne ved andre assays beskrevet ovenfor og kombinerer nemme at anvende med pålidelig måling af fødeindtagelse. Her er en detaljeret beskrivelse af CAFE analysen forudsat, og vi viser en simpel opsætning modifikation at reducere fordampning. Repræsentative resultater, herunder en to mad valg assay (kort og lang sigt) og saccharose optagelse af fluer er påvist. I diskussionen sammenligner vi vores beskrevne metode med alternative måder at udføre CAFE analysen, og fremhæve potentielle begrænsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. CAFE Assay
BEMÆRK: Analysen består af tre komponenter: en eksperimentel hætteglas, en bestemt låg og mikro- kapillærer. En plastboks med låg anvendes til at transportere de forberedte hætteglas og at styre fugtigheden mere effektivt.
- Brug en Drosophila melanogaster kultur plast hætteglas (valgfrit 8 cm højde, 3,3 cm diameter) som et rør til assayet.
- Forsegle hætteglasset med en fremstillet plexiglas låg indeholdende en O-ring (figur 1A, 1B). Load fluer ved at trykke eller med en blowpipe gennem låget centrale åbning (0,9 cm i diameter), som også giver mulighed for luftcirkulation og vandforsyning, og lukke hullet med en svamp spuns. Seks mindre koniske åbninger (0,4 cm øvre diameter, 0,3 cm indvendig diameter) omgiver det centrale hul og passer pipettespidserne af 2 - 20 volumen pi at holde kapillærerne på plads. (Se supplerende tal for tekniske detaljer af låget.)
BEMÆRK: Brugenaf en svamp prop med åbninger til kapillærer i stedet for skræddersyet låg bruges i vores manuskript er mulig. Vores tilpassede låg tillader sikker håndtering af de fremstillede hætteglas minimerer risikoen for kapillærer falde ned. - At præsentere den flydende mad, bruge 5 pi mikrokapillærer med 1 pi mærker. Anbring kapillærer i de koniske åbninger i låget ved at afskære toppen af en 2 - 20 pi pipettespids og indsættelse af spidsen i hullet (figur 1B, er markeret med rød kant). For at forhindre fluer i at slippe ud, indsætte et uklippet 2-20 uL pipettespids i samme åbning.
- Til sikkert håndtere flere tilberedte hætteglas, placere dem i en plastboks med en gitret indlæg (figur 2A).
2. Fremstilling af fluer
- Holde fluer på standard fødevarer ved 25 ° C, 60% relativ fugtighed og en 12 h / 12 h lys-mørke-cyklus.
- For at styre avl forhold indføre 35 jomfruelige hunner enD 15 hanner for hver forsøgsgruppe i en plastik hætteglas kultur (9,8 cm højde, 4,8 cm i diameter), der indeholder 50 ml flyve mad. Tillad fluer at lægge æg i de første 3 dage, derefter overføre voksen flyver til friske fødevarer hætteglas og lad dem lægge æg i to dage mere. Herefter gentager overførslen igen. Kassér voksen flyver efter 2 dage mere.
- Som fødeindtagelse afhænger af flue størrelse, bestemme vægten af en gruppe på 100 fluer ved bedøve 2- til 3 dage gamle voksne fluer under anvendelse af en CO 2 flue pad og samle dem i et 1,5 ml plastrør og måling med en standard laboratorieskala. Bestem våd vægt på mindst fire uafhængige flyve grupper sorteret efter køn (tabel 1); bruge vægten til at beregne uL mad forbrug pr mg flue. Brug den værdi, til at bestemme mængden af mad, at en enkelt flue feeds pr eksperiment og justere antallet af fødevarebårne fyldte kapillærer i overensstemmelse hermed for at undgå tømning af kapillærerne ved at fodre.
- For et 3 h assay brug20 fluer og to fyldte kapillærer. For en langsigtet eksperiment (> 3 timer og op til 9 dage), skal du bruge en gruppe på otte fluer med en forsyning af fire fyldte kapillærer (kan ikke opnås pålidelige resultater med mindre end otte fluer under de beskrevne forhold).
- Separate fluer i grupper (8 eller 20 fluer) efter måling vægt under CO 2 eksponering. Overfør gruppe til en ny fødevare hætteglas (indeholdende 15 ml standard fødevarer) til at tillade genvinding fra CO 2 sedation i 48 timer før forsøget. Brug 4- til 6 dage gamle fluer til CAFE-analysen.
- Som ikke-sultede vildtype fluer gødes kun marginalt 19, 21, pre-sulte flyver i 3 timer fodringsforsøg. Nr fastende er påkrævet, når fødeindtagelse er overvåget over flere dage. For faste, overførsel flyver 16 til 20 timer før testning ved forsigtigt at banke dem ind i et hætteglas indeholdende kun 45 mm i diameter foldet filtrerpapir fugtet med ~ 0,5 ml Hedeselskabet2 O (dobbelt-destilleret vand), og tæt med en sluttet CAFE assay låg.
3. Udarbejdelse af flydende fødevarer
- Der fremstilles en 3 M (10%, vægt / volumen) saccharose stamopløsning ved at udfylde 102,6 g saccharose (C 12 H 22 O 11) til 100 ml Hedeselskabet 2 O. afpipetteres 3 pi, 33 pi, 333 pi, 3,3 ml og 6,6 ml af stamopløsningen til et 15 ml plastikrør; tilsættes 2 ml af fødevarer farve (for rød: Cochenille [E124] for blå: Indigocarmin [E132]) og fyld til 10 ml med Hedeselskabet 2 O. De resulterende koncentrationer er 0,001, 0,01, 0,1, 1, og 2 M saccharose .
BEMÆRK: Maden farvestof tillader visualisere menisken lettere. Men farvestoffet kan have en indvirkning på fødeindtagelse. For at undgå en skævhed som følge af farvestoffet dispensere fødevarer farvestof eller randomiseret brugen af farvestoffer til fødevare- prøver under eksperimentet og grupper. - For at teste for alkohol præference pipette 333 pi af 3 M saccharose stamopløsning i et 15 ml plastrør.Tilføj 1,5 ml (2,3 ml) fra 100% EtOH (ethanol) og tilsæt Hedeselskabet 2 O op til 10 ml for at resultere i 15% (0,25 mM) og en 23% (0,39 mM) arbejdsopløsninger.
- Hold stamopløsninger ved -20 ° C og arbejdsvilkår løsninger ved 4 ° C; anvendes inden 1 uge.
- Fyld op til 10 kapillærer på samme tid med en farvet mad opløsning ved kapillær kraft. Sæt enderne af kapillarerne i saccharoseopløsning (holding kapillarerne i en 45 ° vinkel til opløsningen). Stop hvis væsken når toppen (5 pi) varemærke af kapillæren, og fjerne overskydende opløsning på ydersiden og indersiden med filtrerpapir.
4. Montering og Udførelse af Kapillær Feeder Assay
- Hvis fasten ikke er nødvendig, overføre de eksperimentelle fluer til analysen ved at trykke eller blow-rør. Sørg for at medtage tre kontrol hætteglas uden fluer at kvantificere fordampning.
- Fjern forsigtigt en pipettespids (2 - 20 pi volumen), der afsluttes af en af den ydre åbnigs, og indsætte et fyldt glas kapillar, bottom-ende først. Fastgør kapillarrøret ved at placere pipettespidsen tilbage ud til kapillarrøret. Hvis flere fødevarer løsninger testes, gentages denne procedure i overensstemmelse hermed.
- Placer kapillarrøret slutter inde alle hætteglas på samme niveau for at undgå bias, som kunne opstå, hvis de fødekilder blev placeret i forskellige højder (3 - 4 cm fra låget); holde en afstand til filtrerpapiret at forhindre kapillær i at lække ved et uheld at berøre filtrerpapir eller forskellige viskositeter på fødekilder.
- Mærk den øvre ende af den farvede væske under anvendelse af en markeringspen (varemærke begyndelsen). For at sikre de forskellige kapillærer kan identificeres, mærke dem individuelt ved hjælp af en farve eller stribe kode.
- Placer flere forberedt CAFE analyser i en plastboks med inddelte indlæg og overføres beholderen (figur 2A) til en sikker position under laboratorieforhold eller i en temperatur-, lys- og luftfugtighed-kontrollerede climspiste kammer (parametre: 25 ° C, 60% relativ fugtighed, 12 timer / 12 timer lys-mørke-cyklus) for den eksperimentelle periode (f.eks 3 timer eller dage).
- Som nederste filterpapir udtørrer hvis assayet udføres over flere dage, anvende frisk vand hver 24 timer via svampen spuns (100 pi) for at holde luftfugtigheden konstant inde i assayet. Brug fire separate hætteglas (8 cm højde, 3,3 cm i diameter) fyldt med 30 ml Hedeselskabet 2 O som fugtighed enheder og placere dem ved siden af CAFE analyser i plastboks. Brug et dæksel til plastic boks for at fugtighed kontrolleret miljø under eksperimentet (figur 2A).
BEMÆRK: Bredere variabilitet sker under laboratorieforhold; men det er muligt at udføre CAFE assay ved stuetemperatur (f.eks., i et klasseværelse). Anvendelsen af en befugtning indretning (filtrerpapir, med eller uden en våd svamp spuns, fyldte vand hætteglas og dækning for plastboks) er stærkt tilskyndet til at formindske fordampning (- Udskift kapillærerne med frisk fyldt dem for langsigtede eksperimenter hver 24 h. Notér døde fluer før hver 24 timer interval og anvende antallet af levende fluer til at beregne forbruget pr flue for den følgende periode. Kassér de gamle kapillærer efter måling tilbagegangen af menisken (se 5.1).
BEMÆRK: Under en 3 timer eksperiment vi næppe se nogen døde fluer. Under en 4 dages studie vi normalt finde 1 - 3 døde fluer.- Ved afslutningen af assayet eller før udskiftning kapillarrøret, markere de nedre menisk på kapillærrøret (varemærke ende) med en tusch, medens CAFE assayet er stadig i oprejst position. Kassér de data, hvis mark ende ikke er under den indledende mærke (mærke begynder). Fjern ikke låget, da dette kan ændre menisken.
- Fjern forsigtigt kapillærerne fra assayet og gemme dem til dataindsamling. Kontrollere, om væsken inden i kapillarrøret nåede den nedre ende, hvis ikke discard dataene, som fødevarer var ikke tilgængelig for fluer. Saml alle kapillærer per hætteglas som en gruppe. Indsæt uslebne pipettespidser i alle åbninger for at forhindre fluer i at undslippe. Afmonter opsætning og vaske hætteglas, låg og svamp spunse i en sæbe bad og tør natten over ved stuetemperatur til videre brug.
BEMÆRK: Fluer kan yderligere analyseret efter analysen. Bekræft mad optagelse af øjet eller under en dissektion mikroskop.- Gentagne eksperimenter med de samme genotyper af mindst tre forskellige dage.
- Udskift kapillærerne med frisk fyldt dem for langsigtede eksperimenter hver 24 h. Notér døde fluer før hver 24 timer interval og anvende antallet af levende fluer til at beregne forbruget pr flue for den følgende periode. Kassér de gamle kapillærer efter måling tilbagegangen af menisken (se 5.1).
5. Dataindsamling og analyse
- Mål afstanden mellem mark begyndelse og mærke ende på kapillær ved hjælp af en skydelære eller en lineal. For at overføre data direkte til et regneark, skal du bruge en USB (Universal Serial Bus) er tilsluttet digital skydelære (figur 1E). Kassér kapillærerne efter målingen.
- Hensyn til kapillær størrelse at beregne fødeoptagelse eller fordampning. For eksempel overveje en hætteIllary der er 73 mm lang og indeholder 5 pi fødevarer opløsning. Et fald 14,6 mm i menisken afspejler optagelsen af en uL løsning. Beregn mad optagelse ved anvendelse af følgende formel:
Mad optagelse (pi) = målte afstand (mm) / 14,6 mm - For at udelukke effekten af fordampning på fødeindtagelse, beregne betyde fordampning i de tre (som minimum) kontrol hætteglas uden fluer. Trække denne middelværdi fra værdien opnået for fødevareforbruget af fluer.
- Brug følgende formel til at bestemme det samlede forbrug pr flue:
Mad forbrug (pi) = (Food optagelse [uL] - fordampningstab [uL]) / total antal fluer i hætteglasset. Til langvarig eksperimenter anvende antallet af fluer i live inden begyndelsen af den 24 timer interval. - For at tage højde for forskelle i kropsstørrelse, såsom mellem mandlige og kvindelige fluer, normalisere mad forbrug til kropsvægt (uL mad / mg flue).
- Brug statistisk software til dataanalyse. For normenallieret distribuerede data, brug studerendes T -tests til at bestemme forskelle mellem to flyve grupper og bruge ANOVA (variansanalyse) med post hoc Tukey Cramer test i mere end to grupper. I en valgsituation, analysere forskelle fra tilfældigt valg ved anvendelse af en ikke-parametrisk én stikprøve sign test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluer af w 1118 genotype anvendes til at vise, hvordan analysen udføres. De w 1118 mutanter er almindeligt anvendt til at generere transgene linjer og styre den genetiske baggrund af transgener mærket med hvide gen. Normalt for adfærdsmæssige forsøg, er alle transgene linjer tilbagekrydset i fem generationer til samme w 1118 materiel, der anvendes som en eksperimentel kontrol. Vi viser forskellige eksperimenter: en sammenligning af fordampning tab for vores modificeret setup, en kortsigtet mad valg eksperiment, en langsigtet fødeindtagelse eksperiment, og et eksperiment på forskellige saccharose fortyndinger.
Fordampning spiller en kritisk rolle i udførelsen af CAFE analysen. Vi inkluderede yderligere tilgange til vores assay for at mindske fordampning: i) den centrale svamp spuns er genopfyldes med vand hver 24 timer; ii) supplenelle vandfyldt hætteglas inden transportkassen og iii) anvendelsen af et dække for boksen for at skabe en fugtighed kabinet (se 4.6). Sammenligning fordampningen mellem et setup uden og med ovennævnte enheder, er en væsentlig reduktion i fordampningen set. Selv effekten af højere volatilitet af en ethanol opløsning er ikke påvises ved hjælp af den nye opsætning.
I et to-choice mad eksperiment en gruppe på 20 fluer kan fodre i 3 timer. I naturlige miljøer, bananfluer foder fortrinsvis på fermentering frugter med alkohol 22, og det er blevet vist, ved anvendelse af en lignende opsætning, at fluer foretrækker gær-saccharose løsninger med ethanol i løbet gær-saccharose løsninger uden ethanol 23. Her er to fødevarer valg tilbudt, en 0,1 M sucroseopløsning mærket med rødt farvestof i fødevarer og en 0,1 M sucroseopløsning med 15% EtOH mærket med blå farvestof i fødevarer (figur 1A, C). Visuel examinering af maven angiver, at fluerne foder på begge løsninger (figur 1D). Foderforbrug per flue er signifikant større (næsten 2 gange) for saccharoseopløsning indeholdende EtOH (figur 3A).
I et følgende eksperiment, en langsigtet undersøgelse, en gruppe på otte fluer har adgang til lignende fødekilder i 4 dage, og fluer forbruge mere af ethanol-holdige fødevarer på hver dag (figur 3B). Den præference indeks for ethanol ([Suc + EtOH] - [Suc] / samlet forbrug) forbliver konstant i denne periode (gennemsnit = 0,29, tabel 4). Den observerede præference ethanol er i overensstemmelse med en række andre publikationer og viser, at fluer kan skelne mellem forskellige fødevarer kilder 24, 25, 26. Den observerede ethanol tiltrækning kan være et resultat af de forskellige kaloriebehov indholdet afde tilbudte løsninger og de givende egenskaber af ethanol 24. Assayet kan også anvendes til at måle negative virkninger af kosttilskud. Ja og kolleger viste i den første offentliggørelse af denne metode, at anvendelsen af paraquat (en oxiderende stof) falder fødevareforbrug 10.
I det næste eksperiment, er forskellen i fødeindtagelse mellem kønnene vist. Metaboliske krav er forskellige mellem mandlige og kvindelige D. melanogaster. For eksempel, mens mandlige fluer foretrækker kulhydrat-rige fødevarer, under ægproduktionen, en fase, der kræver øget protein biosyntese, hunner foretrækker proteinrige kost i løbet af kulhydratrige kost 27. Parret mandlige og kvindelige fluer blev anvendt i dette eksperiment. For at analysere forskelle i fødeindtagelse mellem 20 mandlige og 20 kvindelige fluer inden for en 3 timer fodring interval, er en cafe assay udført ved hjælp af en sucrose concentration serien. Fem kapillærer blev leveret, med opløsninger i området fra 10 - 3 for 2 M sucrose, og forbruget af hver opløsning blev målt (figur 4A). Resultaterne viste, at begge køn foretrukne hi koncentration sucroseopløsninger som fødekilde (figur 4A). Men hundyr forbruges væsentligt mere af de to laveste koncentration sucroseopløsninger sammenlignet med mænd (p <0,05); på den anden side, hanner forbruges væsentligt flere af de højere koncentration opløsninger (p <0,001). Bemærk, at disse data ikke højde for forskelle i kropsstørrelse. Female D. melanogaster er som regel større og tungere end mænd (tabel 1). Når fødevareforbruget er normaliseret til at flyve masse, forskelle mellem mænd og kvinder i forbruget af lav saccharose løsninger er ikke længere signifikant. Sammenfattende hanner forbruge mere saccharoseopløsning end parret hunner, i overensstemmelse med tidligere data, reflecting mulige forskellige metaboliske krav, præferencer næringsstoffer eller simple forskelle i evnen til at fodre på kapillærerne mellem de to køn.
Figur 1: Drosophila melanogaster Kapillær Feeder analysen. A) fodring assay med fluer. Fugtet filtrerpapir giver vand i bunden af hætteglasset. Fire kapillærer leveres under forsøget (rød- og blå-farvet mad i modsatte kapillærer). Bemærk at kapillærerne er fastgjort i stilling ved en anden pipettespids, og ubrugte positioner lukkes med pipettespidser. Et skum prop i midten af låget giver mulighed for luftskifte. B) Detaljeret visning af låget. Cut pipettespidser (2 - 20 pi, røde kanter) indsættes i de koniske åbninger af ubrugte positioner, og en anden piPette spids er indsat i den afskårne spids for at lukke hullet. De afskårne pipettespidser anvendes til at styre placering af mikrokapillærer, og uskårne spidser benyttes til at holde kapillærerne stramme. C) En D. melanogaster flue feeds på et kapillarrør. D) Efter fodring, fødevarer farve ses tydeligt i gylp maven. E) en digital skydelære anvendes til at måle afstanden mellem varemærke begynder og markere slutningen af menisken. Dataene overføres direkte til et Excel-regneark via USB. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Indflydelse af Fordampning i Kapillær Feeder-analysen. A) Multiple CAFE assay placeres indeen plastboks med en gitret indlæg. Til styring af fugtigheden under eksperimentet fire vandfyldte hætteglas (røde fælge) anbringes inde i gitteret. Fordampningen kontroller er placeret i direkte nærhed af disse hætteglas. En dækning for hele opsætningen vises i baggrunden. B) Sammenligning af tabet volumen ved fordampning. Middelværdien for fordampning over 4 dage er vist. Fugtighed styres ved (i) at anvende vand til den centrale svamp spuns (24 h interval); (Ii) at tilsætte fire vandfyldte hætteglas i nettet; og (iii) ved hjælp af en plastik dækning for hele opsætningen. Fordampningen er betydeligt lavere, hvis luftfugtigheden styres for begge testede opløsninger (*** P ≤ 0,001; N = 48). Ingen forskelle i volatiliteten mellem EtOH indeholder og ikke indeholder saccharose løsning kan påvises med fugtighed, der anvendes. Klik her for at se en større udgave afdette tal.
Figur 3: Præference for Ethanol (EtOH) indeholder saccharose i Saccharose Solution. A) Mad forbrug for mandlige w 1118 fluer vises. Hannerne forbruge betydeligt mere af en 15% EtOH indeholder saccharose løsning end en almindelig rørsukkeropløsning. *** P ≤ 0,001; N = 27. B) Fluer betydeligt foretrækker en sucrose opløsning indeholdende 23% EtOH i løbet af en 4-dages prøveversion. *** P ≤ 0,001; ** P ≤ 0,01; N = 16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Consumption (uL / flyve og uL / mg flue) af forskellige Saccharose Koncentrationer af mandlige og kvindelige w 1118 Flies. A) Forbruget af forskellige koncentrationer af saccharose løsninger varierer betydeligt mellem mænd og kvinder. Kvindelige fluer forbruge mere ved lavere koncentrationer saccharose og mandlige fluer forbruge mere ved højere koncentrationer. * P <0,05; *** P <0,001; N = 27 forsøg med 20 hanner hver, N = 30 forsøg med 20 hunner hver). B) Food optagelse på en massebasis. En betydelig stigning i forbruget sker mellem mandlige og kvindelige fluer for 0,1 til 2 M saccharose løsninger, når normaliseret til at flyve masse. *** P ≤ 0,001; N = 27 hanner, n = 30 hunner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Legemsvægt af mandlige og kvindelige w 1118 Flies. Fire til fem grupper på 100 fluer blev målt, og kropsvægt (mg / flue) blev beregnet. Middelværdier (med STDEV (standardafvigelse) og STERROR (standard error)) er vist. Middelværdier anvendes til at normalisere foderforbrug at flyve masse (pl / mg flue). Klik her for at downloade dette regneark.
Tabel 2: Fordampning Loss (pi) i CAFE-analysen. Mængden af væske tabt ved fordampning er vist i 4 dage. Fugt er kontrolleret (+) eller ingent (-) som beskrevet i figur 2. Fordampning data for to forskellige opløsninger (saccharose og saccharose plus EtOH) er vist. Middelværdier er præsenteret for hver dag, og i perioden (med STDEV og STERROR). Inddampningen tab af saccharose fortyndinger eksperiment er vist nedenunder separat (middelværdier). Klik her for at downloade dette regneark.
Tabel 3: Forbrug af 0,1 M saccharose med / uden 15% EtOH ved Male w 1118 Fluer Fed i 3 timer. Forbrug af begge løsninger af grupper af 20 fluer blev målt i 3 timer på 3 dage. Forbrug værdier for flyve grupper er divideret med antallet af testede fluer til at estimere mikroliter optagelse pr flue efter subtraktion fordampningstab. Middelværdier (med STDEV og STERROR) er vist. Klik her for at downloade dette regneark.
Tabel 4: Forbrug af 0,1 M Saccharose med og uden 23% EtOH i fire dage af Male w 1118 Flies. Forbrug af begge opløsninger af grupper af 8 fluer blev målt i 24 timer i 4 dage. Præference indeks for ethanol blev beregnet ved hjælp af følgende formel ([Suc + EtOH] - [Suc] / samlet forbrug). Forbrug værdier for flyve grupper er divideret med antallet af testede fluer til at estimere optagelsen uL per flue efter fradrag fordampning tab. Middelværdier (med STDEV og STERROR) er vist for hver dag..jove.com / filer / ftp_upload / 55024 / JoVE55024R1-Diegelmann-Bord-4.xlsx "target =" _ blank "> Klik her for at downloade dette regneark.
Tabel 5: Forbrug af fem koncentrationer af saccharose af mandlige og kvindelige w 1118 Flies. Indtagelse af hver opløsning, og værdien for summen af saccharoseindtagelserne, er vist. Middelværdier for hver koncentration er angivet nedenfor hver kolonne (med STDEV og STERROR). For at beregne indtaget baseret på flue masse (mikroliter optagelse pr milligram flue), er fødevareforbrug divideret med den gennemsnitlige vægt af mandlige eller kvindelige fluer (fra tabel 1, vist til højre). Klik her for at downloade dette regneark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rapporten beskriver CAFE analysen i en trin-for-trin mode med fokus på den tekniske opsætning og gode præstationer i laboratoriet. På grund af sin enkelhed, kan dette assay også anvendes uddannelsesmæssigt som en skole eksperiment. Eksemplerne viser, at analysen giver undersøgelse af fødevarer sensing, præferencer og forbrug i Drosophila melanogaster over korte og længere perioder (timer til dage). CAFE-analysen er blevet anvendt bredt i marken for at undersøge emner, herunder mad og forbrug af narkotika, afhængighed, energi homeostase og neuronal styring af fodring 16, 18, 24, 25.
I CAFE test skal eksperimentelle fluer med held udføre flere opgaver at få mad, såsom fouragering, sansning og bevægelse; manglende evne til at udføre disse opgaver kan resultere i reduceret forbrug. Tilaldrende adfærd afhænger hovedsageligt af sult tilstand fluer og kan forøges ved at faste 19, 21. Sensing, og dermed lokalisering, den fødekilde kan påvirkes af evnen af fluen til at lugte eller smag og måske indirekte resultere i en lavere forbrug sats 28. Visningen af maden i slutningen af en kapillær tvinger fluen til at klatre ned og aktivt holde sig i en omvendt position til at fodre. For at holde drikke position på kapillarrøret, skal fluen koordinere sin muskelsammentrækning. Nedskrivning eller hyperaktivitet af bevægelse klart ville påvirke mad optagelse, som gør bevægelseskomponenter mangler som følge af aldring. Desuden interferens fra andre fluer i løbet af denne manøvre fører til tidlig afslutning for fødeindtag. Derfor bør bestemmes af antallet af fluer, der skal anvendes inden forsøget. Dette tal skal sikre, at alle fluerne kan fodre korrekt og bør kontrollere for fly tæthed i hætteglasset (fra 8 op til et maksimum på 20 fluer i vores D. melanogaster CAFE assay hætteglas). Fodring er påvirket af den ernæringsmæssige værdi af måltidet, og fluer dynamisk justere deres indtagelse overensstemmelse hermed 24, 29. Det blev vist, at mutanter mangler neurotransmitteren octopamin har normale PER respons scores men samtidig viser et signifikant fald i fødeindtagelse 14. Desuden under fodring, motivationen til at fortsætte med at spise fald og fører til ophør af adfærd.
Ovennævnte betragtninger gælder ikke kun for CAFE assay, indflydelse, de fodring adfærd målt i andre testsystemer også. Derfor skal der tages evne fluer at udføre analysen i betragtning ved måling af fødeindtagelse. Selv om det ikke er teknisk udfordrende, CAFE analysen har nogle potentielle praktiske ulemper. Faldet af meniskeninde kapillarrøret afhænger fordampningstab og fødeindtagelse ved fluerne. Høj fordampning er problematisk med hensyn til signal-støjforholdet og bør derfor minimeres. Vi anvendte flere ekstra tilgange og enheder til at styre luftfugtigheden i forsøgsperioden (se 4.6). Dette tilbehør hjulpet os med at reducere fordampningen betydeligt og endda elimineret effekter af forskellig volatilitet af fødekilder vi brugte. Men hvis ingen klimakammer er tilgængelig assayet kan udføres ved stuetemperatur (fx i et klasseværelse) med højere fordampning værdier som en ulempe.
Som nævnt i protokollen, enderne af kapillarerne skal placeres på samme niveau inde i hætteglasset for at undgå bias i gylp valg på grund af forskellige afstande til fødekilde. For at opnå dette, er det kapillære position fikseret med en anden pipettespids. Længden af kapillæren synes ikke at være et kriterium for fodring i Wild-typen flyver 10. Enhver spild af væsken kan underminere nøjagtig udlæsning af fødevareforbruget (se 4.3 og 4.9); en vibrationsfri miljø forhindrer spild. Partikler i opløsningen blok kapillær flow og forhindre fødeindtagelse. Fødevarer opløsning, især hvis den indeholder gær, skal være helt opløst at undgå en sådan blokering. Anvendelsen af vandopløselige gærekstrakt kan overvinde dette problem, men som en ufuldstændig kilde til ernæring kan forårsage yderligere fitness omkostninger. Mad tilgængelighed skal evalueres før og efter forsøget. Det eneste skår data, der skal indgå i analysen er, at opnåede hvor adgang til mad var til stede under hele forsøget (se 4.9). Den upside-down fodring stillingen er en kritisk træk af eksperimentet. Under naturlige forhold, denne fodring position er ikke ukendt at flyve, da frugterne hænger ned fra træerne, og de kunne klatre ned en rådden frugt. Dette understøttes af eksperimenter Comparing måltidet størrelser af fluer fodring i en omvendt position i CAFE analysen til (i) en horisontal spise stilling immobiliserede fluer i Mafe assay og (ii) en højre side-up fodring position ved hjælp af radioaktivt mærket mad 13, 21 . Selvom hovedet mad display ikke synes at være et problem for fluerne, kan det påvirke sammensætningen af fødevarer inde i kapillarrøret. Suspenderede kosttilskud såsom gærceller kunne synke via tyngdekraften til bunden af kapillæren og derfor kan være mere koncentreret på bunden eller kan sætte kapillarrøret. Dette ville påvirke flyve adfærd og dermed resultaterne. Sikring af, at komponenterne i fodring opløsningen er fuldstændig opløst, og ofte indføre friske kapillærer under langvarige forsøg, minimerer denne indflydelse på fødeindtagelse.
Brugen af CAFE analysen beskrevet her tillader måling af fødeindtagelse i en flue gruppe over tid spænder aftimer eller dage. Hvis der kræves mere detaljeret analyse (f.eks., Opførslen af en enkelt flue eller adfærd i intervallet minutter), andre fodring assays, såsom Mafe assay er mere passende. Det kan være muligt, at antallet af fluer, der skal reduceres yderligere ved anvendelse af en 1,5 ml mikrocentrifugerør og en enkelt kapillar 30.
Antallet af eksperimenter, der anvendes til opnåelse af de repræsentative resultater varierer fra 15 til 27, i overensstemmelse med beskrevne forsøg i litteraturen 17, 24. Assayet kan udføres i en klassisk blind måde, der udelukker potentielle bias fra forsøgslederen, og det er normalt gentages mindst fire til fem gange på hver af flere dage. Data fra CAFE analysen kan normaliseres til kropsvægt for at tage højde for forskelle i fodring adfærd relateret til kroppens størrelse. De med dette assay resultater er robuste og reproducerbare, således at deter blevet indført med succes i praktiske kurser for studerende.
CAFE-analysen er meget udbredt inden for metaboliske og smag forskning i Drosophila melanogaster; det har flere anvendelser i at teste rolle kosttilskud og / eller lægemidler på spiseadfærd, og det kan bruges til at undersøge dosis respons på en bestemt fødevare kilde 24. I kombination med den bemærkelsesværdige række teknikker, der anvendes til at manipulere neuronal kredsløb i D. melanogaster, dette assay tillader også forskere til at undersøge den rolle, forstærkning systemer på spiseadfærd 12, 17, 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vials (breeding) | Greiner Bio-One | 960177 | www.greinerbioone.com |
| Vials (CAFE assay) | Greiner Bio-One | 217101 | www.greinerbioone.com |
| Lid-CAFE assay | Workshop | – | – |
| Plastic box, low wall | Plastime | 353 | www.plastime.it |
| Cover for the plastic box | Workshop | – | – |
| Capillaries | BLAUBRAND | REF 7087 07 | www.brand.de |
| Pipette tips | Greiner Bio-One | 771290 | www.greinerbioone.com |
| Filter paper circles | Whatman | 10 311 804 | www.sigmaaldrich.com |
| D(+)-Sucrose | AppliChem | 57-50-1 | www.applichem.com |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 20,821,330 | www.vwr.com |
| Food color (red, E124) | Backfun | 10027 | www.backfun.de |
| Food color (blue, E133) | Backfun | 10030 | www.backfun.de |
| Soap solution (CVK 8) | CVH | 103220 | www.cvh.de |
| Digital caliper | GARANT | 412,616 | www.hoffmann-group.com |
| Vials (breeding) | Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm | ||
| Vials (CAFE assay) | Height 8 cm, diameter 3.3 cm | ||
| Lid-CAFE assay | Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file. |
||
| Plastic box, low wall | A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions | ||
| Cover for the plastic box | Dimensions (37 x 29 x 18 cm) | ||
| Capillaries | DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished | ||
| Pipette tips | Pipettes for the outer circle are cut according to the lid | ||
| Filter paper circles | 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used | ||
| D(+)-Sucrose | Not harmful | ||
| Ethanol absolute | Highly flammable liquid and vapor | ||
| Food color (red, E124) | Not stated | ||
| Food color (blue, E133) | Not stated | ||
| Soap solution (CVK 8) | Odor neutral soap | ||
| Digital caliper | |||
| Standard fly food | (for 20 L) | ||
| Agar | 160 g | ||
| Brewer's Yeast | 299.33 g | ||
| Cornmeal | 1,200 g | ||
| Molasses | 1.6 L | ||
| Propionic acid | 57.3 mL | ||
| Nipagin 30% | 160 mL |
References
- Krauth, C., Buser, J., Vogel, K. How high are the costs of eating disorders - anorexia nervosa and bulimia nervosa - for German society. Eur. J. Health Econ. 3 (4), 244-250 (2002).
- Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity and instrumental variables approach. J. Health Econ. 31, 219-230 (2012).
- PriceWaterhouse Coopers LLP. The costs of eating disorders: Social, health and economic impacts. Assessing the impact of eating disorders across the UK on behalf of BEAT. PwC. , Available from: https://www.beat.co.uk/assets/000/000/302/The_costs_of_eating_disorders_Final_original.pdf (2015).
- Lenard, N. R., Berthoud, H. R. Central and peripheral regulation of food intake and physical activity: pathways and genes. Obesity. 16, S11-S22 (2008).
- Magni, P., et al. Feeding behavior in mammals including humans. Trends in Comp. Endocrinology and Neurobiology. 1163, 221-232 (2009).
- Morton, G. J., Meek, T. H., Schwartz, M. W. Neurobiology of food intake in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 15, 367-378 (2014).
- Bharuchka, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster to study metabolism. Pediatr. Res. 65 (2), 132-137 (2009).
- Smith, W. W., Thomas, J., Liu, J., Li, T., Moran, T. H. From fat fruit fly to human obesity. Physiol. Behav. 136, 15-21 (2014).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, (2013).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Dethier, V. G. The Hungry Fly: A Physiological Study of the Behavior Associated with Feeding. , Harvard Univ Press. Cambridge, MA. (1976).
- Albin, S. D., Kaun, K. R., Knapp, J., Chung, P., Heberlein, U., Simpson, J. H. A subset of serotonergic neurons evokes hunger in adult Drosophila. Curr. Biol. 25, 2435-2440 (2015).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat. Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Geer, B. W., Olander, R. M., Sharp, P. L. Quantification of dietary choline utilization in adult Drosophila melanogaster by radioisotope methods. J. Insect Physiol. 16, 33-43 (1970).
- Thompson, E. D., Reeder, B. A., Bruce, R. D. Characterization of a method for quantitating food consumption for mutation assays in Drosophila. Environ. Mol. Mutagen. 18, 14-21 (1991).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Scheiner, R., Steinbach, A., Classen, G., Strudthoff, N., Scholz, H. Octopamine indirectly affects proboscis extension response habituation in Drosophila melanogaster by controlling sucrose responsiveness. J. Insect Physiol. 69, 107-117 (2014).
- Liu, Y., Luo, J., Carlsson, M. K., Nässel, D. R. Serotonin and insulin-like peptides modulate leucokinin-producing neurons that affect feeding and water homeostasis in Drosophila. J. Comp. Neurol. 523, 1840-1863 (2015).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), e101107 (2014).
- Itskov, P. M. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behavior in Drosophila. Nat. Commun. 5, 4560 (2014).
- Qi, W., Yang, Z., Lin, Z., Park, J. Y., Suh, G. S. B., Wang, L. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol. Brain. 8, 87 (2015).
- Marx, V. Metabolism: feeding fruit flies. Nat. Methods. 12 (7), 609-612 (2015).
- Spieth, H. T. Courtship behavior in Drosophila. Annu. Rev. Entomol. 19, 385-405 (1974).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Curr. Biol. 19 (24), 2126-2132 (2009).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (7), 2498-2503 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Ethanol preference in Drosophila melanogaster is driven by its caloric value. Alcohol Clin. Exp. Res. 36 (11), 1903-1912 (2012).
- Vargas, M. A., Luo, N., Yamaguchi, A., Kapahi, P. A role for S6 kinase and serotonin in postmating dietary switch and balance of nutrients in D. melanogaster. Curr. Biol. 20 (11), 1006-1011 (2010).
- Masek, P., Scott, K. Limited taste discrimination in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (33), 14833-14838 (2010).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr. Opin. Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Luo, J. N., Lushchak, O. V., Goergen, P., Williams, M. J., Nässel, D. R. Drosophila insulin-producing cells are differentially modulated by serotonin and octopamine receptors and affect social behavior. Plos One. 9 (6), e99732 (2014).
