Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

De capillaire Feeder test meet voedselinname bij Published: March 17, 2017 doi: 10.3791/55024
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1, 1, 1
1Institute of Zoology, Albertus-Magnus University of Cologne, 2Department of Veterinary Biomedical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

Introduction

Eten is van essentieel belang; echter deregulering van voedselinname waardoor eetstoornissen zoals boulimie, anorexia of algemene tendens om oplegt overeten kosten particulieren en maatschappij 1, 2, 3. Het doel van dit onderzoek is om regulerende mechanismen van de voedselinname te ontdekken en een strategie voor het omzeilen van wanorde formatie te verstrekken. Talrijke studies met zoogdiermodel organismen zijn nieuwe inzichten van de schakeling en de rol van signaleringssystemen die in eetstoornissen 4, 5, 6. Niettemin, onze kennis van de neuronale en moleculaire grondslagen van deze aandoeningen nog lang niet voltooid. In de afgelopen jaren, de fruitvlieg Drosophila melanogaster is een waardevol modelsysteem voor het ontrafelen van fundamentele mechanistische inzichten in de regulatie van metabolis gewordenm 7, 8, 9. De capillaire Feeder (CAFE) assay voor Drosophila melanogaster werd opgericht in het lab van Seymour Vergelijkbare in 2007 geïnspireerd door een eerder werk van Dethier in bromvlieg 10, 11. De KOFFIE bepaling maakte het mogelijk om direct te meten voedselinname bij Drosophila melanogaster. In deze gedrags-testsysteem, vliegen voeden zich met vloeibaar voedsel verstrekt in gesorteerde glas haarvaten geplaatst in een flesje. De daling van de capillaire meniscus geeft verlies van voedsel oplossing via verdamping en voedselconsumptie. Het bepalen van de verdamping door flesjes zonder vliegen maakt het mogelijk nauwkeurige kwantificering van de voedselinname.

De KOFFIE assay is één van verscheidene gedragsparadigma's gebruikt voor het voederen meten Drosophila melanogaster en onderzoekers moeten de meest geschikte kiezen voor hun specifiekevraag. De beslissing om een ​​bepaalde test te gebruiken moet de volgende punten te overwegen: de aard van het voedsel verstrekt; het voederen toestand; het meten van de inname of opname van voedingsstoffen en het onderzoek voedselconsumptie of reactie op voedsel.

De CAFE-assay zoals beschreven in dit rapport is ideaal voor het volgen van de voedselinname van een vloeistof bron van voedsel onder een rechtopstaande voeden toestand. Als alternatief kan de voedselinname kan worden bepaald voor een vlieg groep op een gekleurde voedselbron in een flesje of op een plaat. Vliegen worden normaal gedood of verdoofd na de voeding en de hoeveelheid opgenomen kleurstof wordt bepaald door spectrometrie of visuele inspectie van de gekleurde buik. Vliegen beginnen om de opgenomen voedsel scheiden pas 30 minuten na inname, dus deze aanpak is moeilijk te gebruiken voor de analyse van continue langer voeden gedragingen 12, 13.

In tegenstelling worden vliegt intact gehouden wanneer absorbeerbare kleurstofs met radioactieve tracers worden gebruikt en hun consumptie van radio-isotoop wordt gescoord in een scintillatieteller 14, 15. Absorptie van het radiolabel door de vlieg spijsverteringsstelsel maakt op lange termijn voedselopname meting mogelijk, maar kan leiden tot een onderschatting van het verbruik als gevolg van niet-geabsorbeerd en uitgescheiden tracer moleculen. Een andere benadering om de respons op voedsel in Drosophila melanogaster te meten is de proboscis extensie respons (PER), die normaal gesproken optreedt voor voedselinname 16. Deze elegante methode meet het initiële antwoord op een levensmiddel stimulus, maar niet de hoeveelheid inname nemen. Voedselinname wordt dynamisch aangepast tijdens het voeden met behulp van verschillende post-digestieve feedback signalen die van cruciaal belang voor de regulering van de voeding 17, 18 zijn. Verschillende pogingen zijn in de afgelopen jaren semi-automatiseren gegevensverzameling met PER assay 19, 20. De PER wordt gedetecteerd door een elektrisch pad of een combinatie van de elektroden en geteld via de computer. Combineren van de PER assay met radioisotoop opname gebleken dat deze assay beperkt door de lage gevoeligheid voor het detecteren van de hoeveelheid voeding 18 verschillen. De voeding assay manual (MAFE) 21, waarin een vlieg handmatig wordt gevoed met een glazen capillair, werd onlangs ontwikkeld om voedselopname te meten in één geïmmobiliseerde vlieg. De MAFE test elimineert de interferentie van foerageren en voederen initiatie en heeft een tijdsresolutie van seconden, en initiatie van PER en voedselconsumptie kunnen onafhankelijk worden gecontroleerd in de test. De wijze waarop immobilisatie van de vlieg invloed bepaalde aspecten van voedingsgedrag (bv locomotie, motivatie) moet nog worden onderzocht. Voor een uitstekende vergelijkende overzichten van de verschillende assays voor het meten van de voedselconsumptie in Drosophila melanogaster en onderzoekers vinden van de meest geschikte hulp, zie verslagen van Deshpande en Marx 13, 22.

De assay KOFFIE vermijdt enkele van de nadelen van andere die hierboven beschreven en eenvoudige bediening met betrouwbare meting van voedselinname. Hier wordt een gedetailleerde beschrijving van de CAFE-test geleverd en laten we een eenvoudige setup wijziging van verdamping te verminderen. Representatieve resultaten waaronder een twee voedselkeuze assay (korte en lange termijn) en de sucrose opname van vliegen is aangetoond. In de discussie vergelijken we onze methode beschreven met alternatieve manieren om de CAFE-test uit te voeren, en markeer mogelijke beperkingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. De CAFE Assay

OPMERKING: De test bestaat uit drie componenten: een experimentele flesje, een specifieke deksel en micro- capillairen. Een plastic doos met deksel wordt gebruikt om de voorbereide flesjes transporteren en de vochtigheid efficiënter regelen.

  1. Gebruik een Drosophila melanogaster cultuur plastic flesje (optioneel 8 cm hoog, 3,3 cm diameter) als een buis voor de test.
  2. Verzegel de flacon met een plexiglas deksel vervaardigd met een O-ring (Figuren 1A, 1B). Load vliegt door te tikken of met een blaaspijp door de centrale opening van het deksel (0,9 cm diameter), die ook zorgt voor luchtcirculatie en watervoorziening, en sluit het gat met een spons stop. Zes kleinere conische openingen (0,4 cm bovenste diameter 0,3 cm binnendiameter) rondom de centrale opening en plaats de pipetpunten van 2-20 pl volume met de capillairen zijn plaats te houden. (Zie aanvullende cijfers voor technische details van het deksel.)
    LET OP: Het gebruikvan een spons stop met openingen voor de capillairen in plaats van de op maat gemaakte deksel in onze manuscript mogelijk. Onze op maat deksel zorgt voor een veilige afhandeling van de voorbereide flesjes minimaliseren van het risico van de haarvaten te vallen.
  3. Om de vloeibare voedingsmiddelen aanwezig zijn, gebruikt 5 pi microcapillairen met 1 pl merken. Plaats de capillairen in de conische openingen in het deksel door het afsnijden van de top van een 2-20 pi pipetpunt en de tip in het gat (Figuur 1B, Rood rand). Om vliegen te voorkomen ontsnappen, plaats een ongesneden 2-20 pi pipet tip in dezelfde opening.
  4. Om veilig te behandelen meerdere voorbereide flacons, plaats ze in een plastic doos met een gerasterde inlay (Figuur 2A).

2. Voorbereiding van Vliegen

  1. Blijf vliegen op standaardvoedsel bij 25 ° C, 60% relatieve luchtvochtigheid en een 12 uur / 12 uur licht-donker cyclus.
  2. Om kweekomstandigheden controle, de invoering van 35 maagdelijke vrouwtjes eend 15 mannen voor elke experimentele groep in een plastic flesje cultuur (9,8 cm hoog, 4,8 cm diameter) met 50 ml vlieg voedsel. Laat vliegen om eieren te leggen voor de eerste 3 dagen, vervolgens over te dragen volwassen vliegt naar vers voedsel flesjes en laat ze eieren leggen voor twee dagen. Hierna herhaalt u de overdracht opnieuw. Teruggooi volwassen vliegt na 2 dagen.
  3. Aangezien voedselinname afhankelijk fly vormen, bepalen het gewicht van een groep 100 vliegen door verlamming 2 tot 3 dagen oude volwassen vliegen met een CO 2 vliegen pad en verzamelen in een 1,5 mL plastic buis en meten met een standaard laboratoriumschaal. Bepaal het natte gewicht van ten minste vier onafhankelijke fly groepen naargelang hun geslacht (tabel 1); Gebruik het gewicht te berekenen ul voedselconsumptie per mg vliegen. Met de waarde voor de hoeveelheid voedsel die een vlieg voer per experiment bepaald en pas het aantal door voedsel gevulde capillairen dienovereenkomstig ledigen van de capillairen te voorkomen door het voeren.
    1. Voor een 3 uur assay gebruik20 vliegen en twee gevulde capillairen. Voor lange termijn experiment (> 3 uur en tot 9 dagen), gebruik een groep van acht vliegen met een toevoer van vier gevulde capillairen (betrouwbare resultaten kunnen worden verkregen met minder dan acht vliegen onder de beschreven omstandigheden).
  4. Aparte vliegen in groepen (8 of 20 vliegen) na het meten gewicht onder CO 2 blootstelling. Breng de groep om een nieuwe voeding injectieflacon (bevattende 15 ml standaardvoedsel) om herstel CO 2 sedatie gedurende 48 uur voorafgaand aan het experiment mogelijk. Gebruik 4- tot 6-dagen oude vliegt voor het CAFE-test.
  5. Als niet-uitgehongerd wild-type vliegt voeden slechts marginaal 19, 21, pre-verhongeren vliegt gedurende 3 uur voeden experimenten. Geen vasten is nodig wanneer de voedselconsumptie over meerdere dagen wordt gecontroleerd. Voor het vasten, de overdracht vliegt 16 tot 20 uur voorafgaand aan de test door ze voorzichtig te tikken in een flesje met alleen een 45-mm diameter gevouwen filterpapier bevochtigd met ~ 0,5 ml DDH2 O (tweemaal gedestilleerd water), en sluit af met een aangesloten CAFE assay deksel.

3. Voorbereiding van Liquid Food

  1. Bereid een 3 M (10%, w / v) sucrose voorraadoplossing vult 102,6 g sucrose (C 12 H 22 O 11) naar 100 ml DDH 2 O. Pipetteer 3 pL, 33 pL, 333 pL, 3,3 ml en 6,6 ml van de voorraadoplossing in een 15 ml plastic buis; voeg 2 ml van voedsel kleur (rood voor: Cochenille [E124], want blauw: Indigokarmijn [E132]) en tot 10 ml te vullen met DDH 2 O. De resulterende concentraties zijn 0,001, 0,01, 0,1, 1 en 2 M sucrose .
    NB: Het eten kleurstof maakt het gemakkelijker visualiseren van de meniscus. Maar de kleurstof kan een impact hebben op de voedselinname te hebben. Om een ​​voorspanning te voorkomen door de kleurstof bereid het voedsel kleurstof of willekeurig het gebruik van kleurstoffen aan de voedselmonsters tijdens het experiment en groepen.
  2. Om te testen op alcohol voorkeur pipet 333 pi van de 3 M sucrose voorraad oplossing in een 15 ml plastic buis.Voeg 1,5 mL (2,3 ml) van 100% EtOH (ethanol) en voeg DDH 2 O tot 10 ml te resulteren in 15% (0,25 mM) en 23% (0,39 mM) werkoplossingen.
  3. Houd voorraad oplossingen bij -20 ° C en werkende oplossingen bij 4 ° C; te gebruiken binnen 1 week.
  4. Vult tot 10 capillairen tegelijk met gekleurde voedingsoplossing door capillaire kracht. Steek de einden van de capillairen in de sucrose oplossing (die de capillairen bij een 45 ° hoek met de oplossing). Stoppen als de vloeistof de top (5 ui) teken van de capillaire bereikt, en verwijder de overtollige oplossing aan de buitenkant en de binnenkant met papieren zakdoekje.

4. Montage en uitvoeren van de capillaire feeder Assay

  1. Als het vasten niet nodig is, de overdracht van de experimentele vliegen om de analyse door te tikken of door blaaspijp. Zorg ervoor dat u drie controle flesjes bevatten zonder vliegen om verdamping te kwantificeren.
  2. Haal een pipet tip (2-20 pi volume), dat is het sluiten van één van de buitenste openings, en steek eerst een gevulde glazen capillaire, bottom-end. Zet het capillair door het plaatsen van de pipet tip terug naast het capillair. Als er meerdere food oplossingen worden getest, daarom herhaal deze procedure.
  3. Plaats de capillaire eindigt in alle flesjes op hetzelfde niveau vertekening die kunnen optreden wanneer de voedselbronnen zich bevinden op verschillende hoogten te voorkomen (3-4 cm vanaf het deksel); houd dan het filterpapier te voorkomen dat de capillaire lekt door ongeluk aanraken van het filterpapier of verschillend viscositeiten voedselbronnen.
  4. Label de bovenkant van de gekleurde vloeistof met een markeerstift (mark begin). Ter controle van de verschillende capillairen kan worden geïdentificeerd, hen individueel met een kleur of code streep.
  5. Plaats meerdere voorbereid CAFE assays in een plastic doos met gerasterde inlay en de overdracht van de doos (Figuur 2A) naar een veilige positie onder laboratoriumomstandigheden of in een temperatuur-, licht- en luchtvochtigheid gecontroleerde climat kamer (parameters: 25 ° C, 60% relatieve vochtigheid, 12 uur / 12 uur licht-donker cyclus) gedurende de experimentele periode (bijvoorbeeld 3 uur of dagen).
  6. Als bodem filterpapier uitdroogt als de test wordt uitgevoerd over meerdere dagen, gelden zoet water om de 24 uur via de spons stop (100 ul) om de luchtvochtigheid constant in de test te houden. Gebruik vier afzonderlijke flacons (8 cm hoog, 3,3 cm diameter) gevuld met 30 ml DDH 2 O als luchtvochtigheid apparaten en leg ze naast het CAFE assays in de plastic doos. Gebruik een dekmantel voor de plastic doos aan vochtigheid gecontroleerde omgeving tijdens het experiment (Figuur 2A) te creëren.
    LET OP: Bredere variabiliteit optreedt onder laboratoriumomstandigheden; het is echter mogelijk om de CAFE assay bij kamertemperatuur bekleden (bijv., in een klaslokaal). Het gebruik van een bevochtiging apparaat (filter papier, al dan niet met een natte spons stop, gevuld water flesjes en dekking voor de plastic doos) wordt sterk aangemoedigd om verdamping te verminderen (
  7. Vervang de haarvaten met vers gevuld die voor de lange termijn experimenten om de 24 uur. Noteer dode vliegen voor elke 24 uur interval en het gebruik van het aantal levende vliegen om het verbruik per fly te berekenen voor de volgende periode. Gooi de oude haarvaten na het meten van de daling van de meniscus (zie 5.1).
    LET OP: Tijdens een 3 uur experiment we nauwelijks dode vliegen te zien. Tijdens een 4 dagen studie vinden we meestal 1-3 dode vliegen.
  8. Aan het einde van de test of voor het vervangen van de capillaire, markeren de onderste meniscus van het capillair (mark end) met een marker pen, terwijl de CAFE-test is nog steeds in de rechtopstaande positie. Gooi de gegevens als merk einde is niet onder de oorspronkelijke merk (mark begin). Het deksel niet verwijderen, omdat dit de meniscus zou kunnen veranderen.
  9. Haal de haarvaten van de test en bewaar ze voor het verzamelen van gegevens. Controleer of de vloeistof in de capillair het ondereinde bereikt als niet Discard van de gegevens, als voedsel was niet toegankelijk voor het vliegen. Verzamel alle haarvaten per flacon als een groep. Plaats ongesneden pipetpunten in alle openingen te voorkomen dat vliegen ontsnappen. Demonteren setup en was de flesjes, deksels en spons sponnen in een soap bak en droog gedurende de nacht bij kamertemperatuur verder gebruik.
    OPMERKING: Vliegen kan verder worden geanalyseerd na de test. Bevestig voedselopname op het oog of onder een dissectie microscoop.
  10. Herhaalde bepalingen met dezelfde genotypes op ten minste drie dagen.

5. gegevensverzameling en analyse

  1. Meet de afstand tussen merk begin en het einde teken aan de capillair met behulp van een schuifmaat of een liniaal. Als u gegevens rechtstreeks over te dragen aan een spreadsheet, gebruik dan een USB (Universal Serial Bus) aangesloten digitale beugel (figuur 1E). Gooi de capillairen na de meting.
  2. Account voor capillaire grootte voedselopname of verdamping te berekenen. Neem bijvoorbeeld een dopIllary dat is 73 mm lang en bevat 5 pl van voedingsoplossing. Een 14,6 mm afname van de meniscus weerspiegelt de opname van 1 pi oplossing. Bepalen voedselopname met de volgende formule:
    Voedselopname (pl) = gemeten afstand (mm) / 14,6 mm
  3. Om het effect van verdamping voedselinname sluiten berekenen betekenen verdamping in de drie (minimaal) controle flesjes zonder vliegen. Trek deze gemiddelde waarde van de voor voedselconsumptie verkregen door de vliegen waarde.
  4. Gebruik de volgende formule om het totale verbruik per fly te bepalen:
    voedselconsumptie (pl) = (Food opname [ul] - door verdamping verlies [ul]) / totaal aantal vliegen in de flacon. Voor langdurige experimenten gebruikt het aantal vliegen levend voorafgaand aan de 24 uur interval.
  5. Om rekening te houden met verschillen in lichaamsgrootte, zoals tussen mannelijke en vrouwelijke vliegt, normaliseren voedselconsumptie aan het lichaamsgewicht (pl food / mg fly).
  6. Gebruik van statistische software voor data-analyse. voor normally gedistribueerde data, gebruik student T -testen de verschillen tussen twee vliegen groepen te bepalen en gebruik ANOVA (variantieanalyse) met post hoc test Tukey Cramer meer dan twee groepen. In een keuze situatie te analyseren verschillen ten opzichte van een willekeurige keuze met behulp van een niet-parametrische één steekproef sign-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vliegen van de w 1118 genotype gebruikt aantonen hoe de test wordt uitgevoerd. W 1118 mutanten worden gewoonlijk gebruikt om transgene lijnen te genereren en besturen de genetische achtergrond van transgenen gemarkeerd met het witte gen. Normaal, voor gedragsexperimenten, alle transgene lijnen teruggekruist vijf generaties dezelfde w 1118 aandelen, die wordt gebruikt als een experimentele controle. We tonen verschillende experimenten: vergelijking van verdampingsverlies onze gemodificeerde opstelling, korte-termijn voedselkeuze experiment werd een langdurige voedselopname experiment en een experiment met verschillende verdunningen sucrose.

Verdamping speelt een cruciale rol in de prestaties van de CAFE-test. We begrepen aanvullende benaderingen van onze test om verdamping te verminderen: i) de centrale spons stop wordt opnieuw gevuld met water om de 24 uur; ii) additionele water gevulde flesjes in het vak transport en iii) het gebruik van een dekmantel voor het vak om een ​​luchtvochtigheid kast te maken (zie 4.6). Vergelijking van de verdamping tussen een opstelling zonder en met bovengenoemde inrichtingen wordt een significante vermindering van verdamping gezien. Zelfs het effect van hogere vluchtigheid van een ethanol bevattende oplossing is niet detecteerbaar met de nieuwe opstelling.

In een twee keuze food experiment een groep van 20 vliegen kan voeden 3 uur. In natuurlijke omgevingen, fruitvliegen voeden voorkeur op fermenteren vruchten met alcohol 22, en er is aangetoond, met een gelijkaardige opstelling, die vliegen voorkeur gist sucrose oplossingen met ethanol dan gist sucrose oplossingen zonder ethanol 23. Hier worden twee voedingskeuzes aangeboden, een 0,1 M sucrose oplossing gelabeld met rode kleurstof en een 0,1 M sucrose-oplossing met 15% EtOH gelabeld met blauwe kleurstof (Figuur 1 A, C). Visual examinering van de buik aan dat de vliegen voeden met beide oplossingen (figuur 1D). Voedselconsumptie per vlieg is aanzienlijk groter (bijna 2-voudig) voor de sucrose-oplossing die EtOH (figuur 3A).

In een volgend experiment werd een langdurige studie werd een groep van acht vliegt toegang vergelijkbare voedselbronnen gedurende 4 dagen, en vliegen verbruiken meer van de ethanolbevattende voedsel op elke dag (figuur 3B). De voorkeur index voor ethanol ([Suc + EtOH] - [Suc] / totaal verbruik) blijft constant over deze periode (gemiddelde = 0,29, tabel 4). De waargenomen voorkeur ethanol is met een aantal andere publicaties en shows die kunnen vliegen onderscheid maken tussen verschillende voedselbronnen 24, 25, 26. De waargenomen ethanol aantrekkingskracht kan een gevolg van de verschillende calorische inhoud van zijnde geboden oplossingen en van de belonende eigenschappen van ethanol 24. De test kan ook worden gebruikt om de negatieve effecten van voedingssupplementen meten. Ja en collega's toonden in de eerste publicatie van deze werkwijze dat de toepassing van paraquat (een oxiderend middel) afneemt voedselconsumptie 10.

In het volgende experiment wordt het verschil in voedselinname tussen de seksen weergegeven. Metabole eisen verschillen tussen mannelijke en vrouwelijke D. melanogaster. Bijvoorbeeld, terwijl mannelijke vliegen voorkeur koolhydraatrijk voedsel, tijdens de productie van eieren, een fase die verhoogde eiwit biosynthese vereist, vrouwen de voorkeur aan eiwitrijke diëten op koolhydraatrijke voeding 27. Gedekt mannelijke en vrouwelijke vliegen werden in dit experiment gebruikt. Om de verschillen in voedselinname tussen de 20 mannelijke en 20 vrouwelijke vliegen binnen een 3 uur voeden interval te analyseren, wordt een CAFE-test uitgevoerd met een sucrose concentrantsoen serie. Vijf capillairen werden verstrekt, oplossingen van 10, 3 - 2M sucrose en consumptie van elke oplossing werd gemeten (Figuur 4A). De resultaten toonden dat beide seksen voorkeur hoge concentratie sucrose oplossingen als voedselbron (Figuur 4A). Vrouwelijke dieren verbruikt aanzienlijk meer van de twee laagste concentratie sucrose-oplossingen in vergelijking met mannen (p <0,05); anderzijds, mannetjes verbruikt aanzienlijk meer van de hogere-concentratie oplossingen (P <0,001). Merk op dat deze gegevens hield geen rekening met verschillen in lichaamsgrootte. Vrouwelijke D. melanogaster zijn meestal groter en zwaarder dan mannen (tabel 1). Wanneer de voedselconsumptie wordt genormaliseerd om de massa te vliegen, de verschillen tussen mannen en vrouwen in de consumptie van laag-sucrose oplossingen zijn niet langer significant. Samengevat, mannetjes verbruiken meer sucrose oplossing dan bevruchte vrouwtjes, in overeenstemming met eerdere gegevens, reflecterende mogelijke verschillende metabolische eisen nutriënt voorkeuren of eenvoudige verschillen in het vermogen te voeden met de capillairen tussen de geslachten.

Figuur 1
Figuur 1: De Drosophila melanogaster capillaire Feeder Assay. A) Het voeren test met vliegen. Bevochtigd filtreerpapier levert water op de bodem van de flacon. Vier haarvaten zijn voorzien tijdens het experiment (rood- en blauwgekleurde food in tegengestelde haarvaten). Merk op dat de haarvaten in de positie zijn beveiligd met een tweede pipet tip, en ongebruikte posities worden gesloten met behulp van een pipet tips. Een schuim plug in het midden van het deksel lucht binnenlaat. B) Gedetailleerde mening van het deksel. Cut pipetpunten (2-20 pl, rode ster) worden in de openingen van conische gebruikte ruimten, en een tweede piPette tip is in de uitsparing tip ingebracht om het gat te sluiten. De cut pipetpunten worden gebruikt om de plaatsing van de microcapillairen controleren en ongesneden tips worden gebruikt om de capillairen vast te houden. C) Een D. melanogaster vlieg feeds op een capillair. D) Na het voeden, voedsel kleur is duidelijk zichtbaar in de vlieg buik. E) Een digitale beugel wordt gebruikt om de afstand tussen merk meten begin en markeer einde van de meniscus. De gegevens worden direct overgebracht naar een Excel-spreadsheet via USB. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Invloed van verdamping in de Capillaire Feeder Assay. A) Meerdere CAFE-test aan de binnenkanteen plastic doos met een gerasterde inlay. Voor het regelen van de luchtvochtigheid tijdens het experiment vier water gevulde flesjes (rode velgen) worden in het rooster geplaatst. De verdamping controles worden in de directe omgeving van deze flesjes. Een deksel voor de gehele installatie wordt weergegeven op de achtergrond. B) Vergelijking van het volumeverlies door verdamping. De gemiddelde waarde voor de verdamping meer dan 4 dagen wordt weergegeven. Vochtigheid wordt geregeld door (i) het met een natte spons het centrale stop (24 h-interval); (Ii) het toevoegen van vier water gevulde flesjes in het net; en (iii) met behulp van een plastic hoes voor de hele setup. De verdamping aanzienlijk lager als vochtigheid gecontroleerd voor beide oplossingen getest (*** p ≤ 0,001; N = 48). Geen verschillen in volatiliteit tussen EtOH bevatten en non-bevattende sucrose-oplossing is detecteerbaar met de luchtvochtigheid apparaten gebruikt. Klik hier om een grotere versie te bekijkendit figuur.

figuur 3
Figuur 3: Voorkeur voor ethanol (EtOH) met sucrose op sucrose-oplossing. A) de voedselconsumptie voor mannelijke w 1118 vliegt wordt getoond. Mannetjes verbruiken aanzienlijk meer een EtOH 15% met sucrose oplossing dan van een gewone sucrose-oplossing. *** P ≤ 0,001; N = 27. B) Vliegen sterk de voorkeur aan een sucrose-oplossing met 23% EtOH gedurende een 4-dagen trial. *** P ≤ 0,001; ** P ≤ 0,01; N = 16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Consumption (pl / vliegen en pl / mg fly) van verschillende sucrose concentraties van Mannelijke en Vrouwelijke w 1118 Flies. A) Het gebruik van verschillende concentraties sucrose oplossingen aanzienlijk verschilt tussen mannen en vrouwen. Vrouw vliegt verbruiken meer bij lagere concentraties sucrose, en mannelijke vliegt verbruiken meer bij hogere concentraties. * P <0,05; *** P <0,001; N = 27 onderzoeken met 20 mannen elk N = 30 onderzoeken met 20 vrouwtjes elk). B) opname Eten op een massabasis. Een aanzienlijke stijging van het verbruik optreedt tussen mannelijke en vrouwelijke vliegen voor de 0,1 tot 2 M sucrose oplossingen wanneer genormaliseerd om de massa te vliegen. *** P ≤ 0,001; N = 27 mannetjes, N = 30 vrouwen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

tafel 1
Tabel 1: Lichaamsgewicht van mannelijke en vrouwelijke w 1118 Flies. Vier tot vijf groepen 100 vliegen werden gemeten en lichaamsgewicht (mg / fly) berekend. Gemiddelde waarden (met STDEV (standaarddeviatie) en STERROR (standaard fout)) worden weergegeven. Gemiddelde waardes worden gebruikt om te normaliseren voedselconsumptie massa (pl / mg fly) vliegen. Klik hier om deze spreadsheet te downloaden.

tafel 2
Tabel 2: Verdamping Loss (pl) in de CAFE Assay. De hoeveelheid vloeistof de verdamping wordt getoond voor 4 dagen. Vochtigheid wordt gecontroleerd (+) of geent (-) zoals beschreven in figuur 2. Verdamping gegevens voor twee verschillende oplossingen (sucrose en sucrose plus EtOH) getoond. Gemiddelde waarden worden gepresenteerd voor elke dag en in de periode (met STDEV en STERROR). De verdamping verlies van de sucrose verdunningen experiment wordt onder afzonderlijk weergegeven (gemiddelde waarden). Klik hier om deze spreadsheet te downloaden.

tabel 3
Tabel 3: Verbruik van 0,1 M sucrose met / zonder 15% EtOH door mannelijke w 1118 vliegt Fed gedurende 3 uur. Verbruik van beide oplossingen door groepen 20 vliegen werd gemeten gedurende 3 uur op 3 dagen. Verbruikswaarden voor vlieg groepen worden gedeeld door het aantal geteste vliegen naar microliter opname per fly schatten na aftrek van door verdamping verlies. Gemiddelde waarden (met STDEV en STERROR) getoond. Klik hier om deze spreadsheet te downloaden.

tabel 4
Tabel 4: Verbruik van 0,1 M sucrose met en zonder 23% EtOH voor de Vierdaagse door mannelijke w 1118 Flies. Verbruik van beide oplossingen van groepen 8 vliegen werd gemeten 24 uur gedurende 4 dagen. Voorkeur index voor ethanol werd berekend met behulp van de volgende formule ([Suc + EtOH] - [Suc] / het totale verbruik). Verbruikswaarden voor vlieg groepen worden gedeeld door het aantal geteste vliegen tot ui opname per fly schatten na aftrek van verlies door verdamping. Gemiddelde waarden (met STDEV en STERROR) getoond voor elke dag..jove.com / files / ftp_upload / 55024 / JoVE55024R1-Diegelmann-Table-4.xlsx "target =" _ blank "> Klik hier om deze spreadsheet te downloaden.

tabel 5
Tabel 5: Consumptie van vijf concentraties van sucrose door Mannelijke en Vrouwelijke w 1118 Flies. Inname van elke oplossing, en de waarde voor de som van sucrose inname, wordt getoond. Gemiddelde waarden voor elke concentratie worden onder elke kolom gegeven (met STDEV en STERROR). Om de inname gebaseerd op fly massa (microliter opname per milligram van de vlieg) te berekenen, wordt voedselconsumptie gedeeld door het gemiddelde gewicht van de man of vrouw vliegen (uit tabel 1, getoond aan de rechterkant). Klik hier om deze spreadsheet te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het rapport beschrijft de CAFE-test in een stap-voor-stap mode, gericht op de technische installatie en haar succesvolle optreden in het laboratorium. Vanwege zijn eenvoud, deze test kan ook worden gebruikt als educatief schoolexperiment. De voorbeelden laten zien dat de test maakt onderzoek voedsel sensing, voorkeur en verbruik in Drosophila melanogaster over korte en langere perioden (uren tot dagen). Het CAFE-test is op grote schaal gebruikt in het veld om onderwerpen, zoals voedsel en drugsgebruik, verslaving, energie homeostase en neuronale controle van het voeden van 16, 18, 24, 25 te onderzoeken.

In de CAFE-test, moet experimentele vliegen met succes verschillende taken om voedsel te verkrijgen, zoals foerageren, sensing en beweging uit te voeren; onvermogen om deze taken uit te voeren kan resulteren in een verminderde consumptie. Voorverouderingsgedrag hangt vooral af van de honger stand van de vliegen en kan worden verhoogd door te vasten 19, 21. Sensing en daardoor lokalisatie, van de bron van voedsel kan worden beïnvloed door het vermogen van de vlieg te ruiken of proeven en misschien indirect resulteren in een lager verbruik 28. De weergave van het voedsel aan het einde van een capillaire krachten de vlieg naar beneden te klimmen en zich actief te houden in een omgekeerde positie te voeden. Om het drinkwater positie op de capillaire te houden, moet de vlieg zijn spieren te coördineren. Impairment of hyperactiviteit van voortbewegen zou duidelijk invloed op voedselopname, net als de voortbeweging tekortkomingen als gevolg van veroudering. Bovendien interferentie door andere vliegen tijdens deze manoeuvre leidt tot voortijdige beëindiging van voedselopname. Daarom moet het aantal vliegen te gebruiken voorafgaand aan het experiment worden bepaald. Dit nummer moet ervoor zorgen dat alle vliegen naar behoren kan voeden en moeten controleren voor fly dichtheid in de flacon (van 8 tot maximaal 20 vliegen in onze D. melanogaster KOFFIE assay flesje). Voeding wordt beïnvloed door de voedingswaarde van de maaltijd en vliegen dynamisch hun inname aan te passen 24, 29. Er werd aangetoond dat mutanten missen de neurotransmitter octopamine een normale respons PER scores maar tegelijkertijd een significante afname van voedselinname 14. Bovendien, tijdens het voeden, de motivatie om te eten daalt verder en leidt tot beëindiging van het gedrag.

De bovengenoemde overwegingen gelden niet alleen voor de CAFE assay beïnvloeden zij voedingsgedrag gemeten in andere testsystemen ook. Daarom moet het vermogen van vliegen verrichten van de bepaling rekening worden gehouden bij het bepalen voedselinname. Hoewel het niet technisch uitdagend, het CAFE-test heeft een aantal mogelijke praktische bezwaren. De daling van de meniscusin de capillaire afhankelijk verdampingsverlies en voedselinname van de vliegen. Hoge verdamping problemen betreffende de signaal-ruisverhouding en moeten daarom worden geminimaliseerd. We pasten een aantal extra benaderingen en apparaten om de luchtvochtigheid te controleren tijdens de experimentele periode (zie 4.6). Deze accessoires hebben ons geholpen om de verdamping aanzienlijk en zelfs opgeheven effecten van verschillende volatiliteit van de voedselbronnen we gebruikten te verminderen. Indien echter geen klimaatruimte beschikbaar de test kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (bijvoorbeeld in een klaslokaal) met hogere verdamping waarden nadeel.

Zoals in het protocol, de einden van de capillairen moeten op hetzelfde niveau in het flesje te plaatsen om vertekening in de keuze van de vlieg voorkomen vanwege verschillende afstanden tot de voedselbron. Hiertoe wordt het capillair positie gefixeerd met een tweede pipetpunt. De lengte van de capillaire lijkt niet een criterium voor voeding van wild-soort vliegt 10. Elke morsen van de vloeistof kan accurate uitlezing van de voedselconsumptie te ondermijnen (zie 4.3 en 4.9); een trillingsvrije omgeving voorkomt morsen. Deeltjes in de oplossing blok capillair stromen en te voorkomen dat de voedselconsumptie. De voedingsoplossing, vooral als het gist bevat, moet volledig opgelost om een ​​dergelijke verstopping te voorkomen. Het gebruik van water oplosbare gistextract kan dit probleem maar als een onvolledige voedingsbron dit opnieuw fitheidkosten kan veroorzaken. toegankelijkheid levensmiddelen moet worden geëvalueerd voor en na het experiment. De enige vlieg gegevens die moeten worden opgenomen in de analyse is dat verkregen wanneer toegang tot voedsel gedurende de gehele proef aanwezig was (zie 4.9). De upside-down voeden positie is een cruciaal onderdeel van het experiment. Onder natuurlijke omstandigheden, deze voeden positie is niet onbekend voor de vlieg, als vruchten hangen af ​​van de bomen en ze kunnen klim naar beneden een rotte vrucht. Dit wordt ondersteund door experimenten comparing de maaltijd groottes van vliegen voeden in een omgekeerde positie in het café test om (i) een horizontale eten positie geïmmobiliseerd vliegen in de MAFE assay en (ii) een rechterzijde-feeding vast met radiolabeled voedsel 13, 21 . Hoewel de upside-down voedselvertoning lijkt geen probleem voor de vliegen zijn, kan dit van invloed op de samenstelling van voedsel in het capillair. Gesuspendeerd supplementen zoals gistcellen kan zinken de zwaartekracht naar de bodem van de capillaire en dus meer geconcentreerd op de bodem kan zijn of kan het capillaire plug. Dit zou fly gedrag en daarmee de resultaten te beïnvloeden. Ervoor zorgen dat de componenten van de voedingsoplossing volledig is opgelost, en vaak de invoering van nieuwe haarvaten tijdens langdurige experimenten, minimaliseert dit invloed op de voedselinname.

Het gebruik van de CAFE-test hier beschreven maakt meting van de voedselinname in een vlieg groep na verloop van tijd overspant vanuren of dagen. Als er meer gedetailleerde analyse vereist (bijv., Het gedrag van een vlieg of gedrag in het bereik van minuten) voertechniek assays, zoals MAFE assay zijn geschikter. Het is mogelijk om het aantal vliegen verder worden verminderd door het gebruik van een 1,5 ml microcentrifugebuis en een enkele capillair 30.

Het aantal experimenten gebruikt om de representatieve resultaten te verkrijgen varieert van 15 tot 27 in overeenstemming met experimenten in de literatuur 17, 24 beschreven. De test kan worden uitgevoerd in een klassieke blinde manier die uitsluit mogelijke bias van de experimentator en wordt ten minste vier tot vijf keer herhaald op elk van meerdere dagen. Gegevens verkregen met de CAFE test kan worden genormaliseerd naar lichaamsgewicht rekening met verschillen in voedingsgedrag verband met lichaamsgrootte. De met deze analyseresultaten zijn robuust en reproduceerbaar, zodatis met succes geïntroduceerd in praktische cursussen voor afgestudeerde studenten.

De KOFFIE test wordt veel gebruikt op het gebied van metabolische en smaak onderzoek in Drosophila melanogaster; heeft meerdere toepassingen het testen van de rol van voedingssupplementen en / of drugs op voedingsgedrag, en kan worden gebruikt om de dosis op speciaal voedselbron 24 onderzoeken. In combinatie met de opmerkelijke variëteit aan technieken om neuronale circuits in D. melanogaster manipuleren, deze test maakt ook onderzoekers om de rol van versterking systemen onderzoeken op voedingsgedrag 12, 17, 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vials (breeding) Greiner Bio-One 960177 www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay) Greiner Bio-One 217101 www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay Workshop – –
Plastic box, low wall Plastime 353 www.plastime.it
Cover for the plastic box Workshop – –
Capillaries BLAUBRAND  REF 7087 07 www.brand.de
Pipette tips Greiner Bio-One 771290 www.greinerbioone.com
Filter paper circles Whatman 10 311 804 www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose AppliChem 57-50-1 www.applichem.com
Ethanol absolute VWR Chemicals 20,821,330 www.vwr.com
Food color (red, E124) Backfun 10027 www.backfun.de
Food color (blue, E133) Backfun 10030 www.backfun.de
Soap solution (CVK 8) CVH 103220 www.cvh.de
Digital caliper GARANT 412,616 www.hoffmann-group.com
Vials (breeding) Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm 
Vials (CAFE assay) Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay Produced in university workshop, technical drawing supplied
Please click here to download this file.
Plastic box, low wall A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions 
Cover for the plastic box Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries DIN ISO 7550 norm,  IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose Not harmful
Ethanol absolute Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124) Not stated
Food color (blue, E133) Not stated
Soap solution (CVK 8) Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food (for 20 L)
Agar 160 g
Brewer's Yeast 299.33 g
Cornmeal 1,200 g
Molasses 1.6 L
Propionic acid 57.3 mL
Nipagin 30% 160 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krauth, C., Buser, J., Vogel, K. How high are the costs of eating disorders - anorexia nervosa and bulimia nervosa - for German society. Eur. J. Health Econ. 3 (4), 244-250 (2002).
  2. Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity and instrumental variables approach. J. Health Econ. 31, 219-230 (2012).
  3. PriceWaterhouse Coopers LLP. The costs of eating disorders: Social, health and economic impacts. Assessing the impact of eating disorders across the UK on behalf of BEAT. PwC. , Available from: https://www.beat.co.uk/assets/000/000/302/The_costs_of_eating_disorders_Final_original.pdf (2015).
  4. Lenard, N. R., Berthoud, H. R. Central and peripheral regulation of food intake and physical activity: pathways and genes. Obesity. 16, S11-S22 (2008).
  5. Magni, P., et al. Feeding behavior in mammals including humans. Trends in Comp. Endocrinology and Neurobiology. 1163, 221-232 (2009).
  6. Morton, G. J., Meek, T. H., Schwartz, M. W. Neurobiology of food intake in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 15, 367-378 (2014).
  7. Bharuchka, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster to study metabolism. Pediatr. Res. 65 (2), 132-137 (2009).
  8. Smith, W. W., Thomas, J., Liu, J., Li, T., Moran, T. H. From fat fruit fly to human obesity. Physiol. Behav. 136, 15-21 (2014).
  9. Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, (2013).
  10. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (20), 8253-8256 (2007).
  11. Dethier, V. G. The Hungry Fly: A Physiological Study of the Behavior Associated with Feeding. , Harvard Univ Press. Cambridge, MA. (1976).
  12. Albin, S. D., Kaun, K. R., Knapp, J., Chung, P., Heberlein, U., Simpson, J. H. A subset of serotonergic neurons evokes hunger in adult Drosophila. Curr. Biol. 25, 2435-2440 (2015).
  13. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat. Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
  14. Geer, B. W., Olander, R. M., Sharp, P. L. Quantification of dietary choline utilization in adult Drosophila melanogaster by radioisotope methods. J. Insect Physiol. 16, 33-43 (1970).
  15. Thompson, E. D., Reeder, B. A., Bruce, R. D. Characterization of a method for quantitating food consumption for mutation assays in Drosophila. Environ. Mol. Mutagen. 18, 14-21 (1991).
  16. Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
  17. Scheiner, R., Steinbach, A., Classen, G., Strudthoff, N., Scholz, H. Octopamine indirectly affects proboscis extension response habituation in Drosophila melanogaster by controlling sucrose responsiveness. J. Insect Physiol. 69, 107-117 (2014).
  18. Liu, Y., Luo, J., Carlsson, M. K., Nässel, D. R. Serotonin and insulin-like peptides modulate leucokinin-producing neurons that affect feeding and water homeostasis in Drosophila. J. Comp. Neurol. 523, 1840-1863 (2015).
  19. Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), e101107 (2014).
  20. Itskov, P. M. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behavior in Drosophila. Nat. Commun. 5, 4560 (2014).
  21. Qi, W., Yang, Z., Lin, Z., Park, J. Y., Suh, G. S. B., Wang, L. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol. Brain. 8, 87 (2015).
  22. Marx, V. Metabolism: feeding fruit flies. Nat. Methods. 12 (7), 609-612 (2015).
  23. Spieth, H. T. Courtship behavior in Drosophila. Annu. Rev. Entomol. 19, 385-405 (1974).
  24. Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Curr. Biol. 19 (24), 2126-2132 (2009).
  25. Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (7), 2498-2503 (2008).
  26. Pohl, J. B., et al. Ethanol preference in Drosophila melanogaster is driven by its caloric value. Alcohol Clin. Exp. Res. 36 (11), 1903-1912 (2012).
  27. Vargas, M. A., Luo, N., Yamaguchi, A., Kapahi, P. A role for S6 kinase and serotonin in postmating dietary switch and balance of nutrients in D. melanogaster. Curr. Biol. 20 (11), 1006-1011 (2010).
  28. Masek, P., Scott, K. Limited taste discrimination in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (33), 14833-14838 (2010).
  29. Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr. Opin. Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
  30. Luo, J. N., Lushchak, O. V., Goergen, P., Williams, M. J., Nässel, D. R. Drosophila insulin-producing cells are differentially modulated by serotonin and octopamine receptors and affect social behavior. Plos One. 9 (6), e99732 (2014).

Tags

Neuroscience gedrag voedselinname interne energiebehoefte diermodel voedselinname mechanismen capillaire voeder, Sucrose voorkeur
De capillaire Feeder test meet voedselinname bij<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diegelmann, S., Jansen, A., Jois,… More

Diegelmann, S., Jansen, A., Jois, S., Kastenholz, K., Velo Escarcena, L., Strudthoff, N., Scholz, H. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (121), e55024, doi:10.3791/55024 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter