Introduction
Mangiare è essenziale; tuttavia, la deregolamentazione di assunzione di cibo con conseguente disturbi alimentari come la bulimia, l'anoressia o la tendenza generale a mangiare troppo impone costi sugli individui e sulla società 1, 2, 3. L'obiettivo della presente ricerca è quello di scoprire meccanismi di regolazione dell'assunzione di cibo e di fornire una strategia per eludere la formazione di disturbo. Numerosi studi che utilizzano organismi modello mammiferi hanno fornito nuove intuizioni del circuito e il ruolo dei sistemi di segnalamento in disturbi alimentari 4, 5, 6. Tuttavia, la nostra conoscenza delle basi neuronali e molecolari alla base di questi disturbi è lungi dall'essere completa. Negli ultimi anni, la mosca della frutta Drosophila melanogaster è diventato un sistema modello valido per svelare intuizioni meccanicistici di base nella regolamentazione dei metabolism 7, 8, 9. Il test capillari alimentatore (CAFE) per Drosophila melanogaster è stato istituito nel laboratorio di Seymour Benzer nel 2007 ispirato da un precedente lavoro di Dethier in blowfly 10, 11. Il saggio CAFE ha permesso di misurare direttamente l'assunzione di cibo in Drosophila melanogaster. In questo sistema di test comportamentali, le mosche si nutrono di alimenti liquidi forniti nei capillari di vetro graduati posti all'interno di un flaconcino. Il declino del menisco capillare indica la perdita della soluzione di alimentare attraverso l'evaporazione e il consumo di cibo. La determinazione del tasso di evaporazione da fiale senza linea consente la quantificazione accurata di assunzione di cibo.
Il saggio Café è uno dei diversi paradigmi comportamentali utilizzati per misurare l'alimentazione in Drosophila melanogaster e ricercatori devono scegliere quello più appropriato per la loro specificadomanda. La decisione di utilizzare un certo dosaggio devono considerare i seguenti punti: la natura del cibo fornito; la condizione di alimentazione; la misura di assunzione o l'assorbimento delle sostanze nutritive e consumo di cibo indagini o risposta al cibo.
Il saggio CAFE, come descritto in questo rapporto è ideale per seguire l'assunzione di cibo di una fonte di cibo liquido sotto una condizione di alimentazione in posizione verticale. Alternativamente l'assunzione di cibo può essere misurata per un gruppo mosca su una fonte di cibo colorato in una fiala o su una placca. Le mosche sono normalmente uccisi o anestetizzati dopo l'alimentazione e la quantità di colorante ingerita è determinato per spettrofotometria o ispezione visiva dell'addome macchiato. Mosche iniziano a espellere cibo ingerito solo 30 minuti dopo l'assunzione, quindi questo approccio è difficile da usare per l'analisi di alimentazione più continuo comportamenti 12, 13.
In contrasto con le mosche sono mantenuti intatti quando colorante assorbibiles con traccianti radioattivi vengono utilizzati e il loro consumo di radioisotopi è segnato in un contatore a scintillazione 14, 15. L'assorbimento di radiomarcato da parte del sistema digestivo fly rende possibile la misurazione alimentare l'assorbimento a lungo termine, ma potrebbe portare a sottovalutare il consumo a causa di molecole non assorbita ed escreta tracciante. Un altro approccio per misurare la risposta al cibo in Drosophila melanogaster è la risposta proboscide estensione (PER), che normalmente si verifica per l'assunzione di cibo 16. Questo metodo elegante misura la prima risposta a uno stimolo cibo, ma non registra la quantità di assunzione. L'assunzione di cibo viene regolato in modo dinamico durante l'alimentazione utilizzando diversi segnali di feedback post-digestive che sono fondamentali per la regolazione di alimentazione 17, 18. Diversi tentativi sono stati fatti negli ultimi anni per la raccolta di dati semi-automatizzare nel saggio PER
Il saggio CAFE evita alcuni degli svantaggi di altri saggi descritti sopra e combina semplicità d'uso con misurazione affidabile di assunzione di cibo. Qui, una descrizione dettagliata del saggio CAFE è fornito e mostriamo una semplice modifica di configurazione per ridurre l'evaporazione. I risultati rappresentativi, tra cui un test di due alimenti scelta (a breve e lungo termine) e l'assorbimento di saccarosio di mosche è dimostrata. Nella discussione si confronta il nostro metodo descritto con modi alternativi per eseguire il test CAFE, ed evidenziare potenziali limitazioni.
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Protocol
1. Il test CAFE
NOTA: Il saggio è costituito da tre componenti: un flaconcino sperimentale, un coperchio specifico e capillari micro. Una scatola di plastica con coperchio viene utilizzato per trasportare i flaconi preparati e per controllare l'umidità in modo più efficiente.
- Utilizzare un Drosophila melanogaster fiala di cultura plastica (opzionale altezza 8 cm, 3,3 centimetri di diametro) come un tubo per il saggio.
- Sigillare la fiala con un coperchio in plexiglas prodotto contenente un O-ring (figure 1A, 1B). Carico vola toccando o con un cannello attraverso l'apertura del coperchio centrale (0,9 cm di diametro), che consente anche di circolazione di aria e acqua, e chiudere il foro con un tappo spugna. Sei aperture coniche più piccoli (0,4 cm di diametro superiore, diametro interno 0,3 cm) circondano il foro centrale e si inseriscono le punte delle pipette di 2 - 20 volumi microlitri per tenere i capillari a posto. (Vedi figure supplementari per i dettagli tecnici del coperchio.)
NOTA: l'usodi un tappo di spugna con aperture per i capillari invece del coperchio misura utilizzata nel nostro manoscritto è possibile. Il nostro coperchio personalizzata permette una manipolazione sicura delle fiale preparati minimizzando il rischio di capillari cadere. - Per presentare il cibo liquido, usare 5 microcapillari microlitri con 1 marchi microlitri. Posizionare i capillari nelle aperture coniche nel coperchio tagliando la parte superiore di un 2 - 20 microlitri punta della pipetta e inserendo la punta nel foro (Figura 1B, contrassegnato con bordo rosso). Per evitare che le mosche di fuggire, inserire un uncut 2 - 20 microlitri punta della pipetta nella stessa apertura.
- Per gestire in modo sicuro più flaconi preparati, metterli in una scatola di plastica con un intarsio a griglia (Figura 2A).
2. Preparazione di mosche
- Mantenere mosche sul cibo standard a 25 ° C, 60% umidità relativa e un ciclo luce-buio / 12 h 12 h.
- Per controllare le condizioni di allevamento, introdurre 35 femmine vergini unD 15 maschi per ogni gruppo sperimentale in un flacone di plastica cultura (altezza 9,8 centimetri, 4,8 centimetri di diametro) contenente 50 ml volare cibo. Consentire mosche per deporre le uova per i primi 3 giorni, poi il trasferimento adulto vola a fiale cibo fresco e far loro deporre le uova per altri due giorni. Dopo questa ripetere il trasferimento. adulto Eliminare vola dopo altri 2 giorni.
- Poiché l'assunzione di cibo dipendono dalle dimensioni fly, determinare il peso di un gruppo di 100 mosche dal anestetizzante 2 a 3 giorni di età adulta mosche con un tampone fly CO 2 e raccoglierli in un tubo di plastica da 1,5 ml e misurazione con uno standard scala di laboratorio. Determinare il peso umido di almeno quattro gruppi fly indipendenti filtrate per sesso (Tabella 1); utilizzare il peso per calcolare il consumo di cibo microlitri per volare mg. Utilizzare il valore per determinare la quantità di cibo che una mosca alimenta per esperimento e regolare il numero di capillari alimentare riempito conseguenza per evitare lo svuotamento dei capillari alimentando.
- Per un 3 ore di analisi, l'uso20 mosche e due capillari riempiti. Per un esperimento a lungo termine (> 3 ore e fino a 9 giorni), utilizzare un gruppo di otto mosche con una fornitura di quattro capillari riempiti (risultati attendibili non possono essere ottenuti con meno di otto linea nelle condizioni descritte).
- Mosche separare in gruppi (8 o 20 mosche) dopo la misurazione di peso sotto l'esposizione di CO 2. Trasferire il gruppo in un flaconcino alimentare (contenente 15 mL cibo standard) per consentire il recupero di CO 2 sedazione per 48 ore prima dell'esperimento. Utilizzare da 4 a 6 giorni di età mosche per il saggio CAFE.
- In linea non-fame wild-type si nutrono solo marginalmente 19, 21, pre-morire di fame vola per esperimenti di alimentazione 3 h. Nessun digiuno è richiesto quando il consumo di cibo è monitorato per diversi giorni. Per il digiuno, il trasferimento vola da 16 a 20 ore prima del test da loro toccando dolcemente in una fiala che contiene solo un diametro piegato carta da filtro da 45 mm inumidito con ~ 0,5 mL DDH2 O (doppio acqua distillata), e chiudere con un coperchio test CAFE collegato.
3. Preparazione del liquid food
- Preparare una 3 M (10%, w / v) stock soluzione di saccarosio compilando 102,6 g di saccarosio (C 12 H 22 O 11) a 100 mL DDH 2 O. Dispensare 3 ml, 33 ml, 333 ml, 3,3 ml e 6,6 ml della soluzione in un tubo di plastica da 15 ml; aggiungere 2 ml di colorante alimentare (per il rosso: cocciniglia [E124]; per il blu: Indaco carminio [E132]) e riempire a 10 ml con DDH 2 O. Le concentrazioni risultanti sono 0.001, 0.01, 0.1, 1, 2 e M di saccarosio .
NOTA: Il colorante alimentare permette di visualizzare il menisco più facilmente. Tuttavia il colorante può avere un impatto sulla assunzione di cibo. Per evitare una distorsione dovuta al colorante erogare il colorante alimentare o randomizzata l'utilizzo di coloranti ai campioni alimentari durante l'esperimento e gruppi. - Per eseguire il test per l'alcol preferenza pipetta 333 ml di 3 M di saccarosio soluzione di riserva in un tubo di plastica da 15 ml.Aggiungere 1,5 mL (2,3 mL) di 100% EtOH (etanolo) e aggiungere DDH 2 O fino a 10 mL di provocare 15% (0,25 mM) e 23% (0.39 mM) soluzioni di lavoro.
- Mantenere soluzioni stock a -20 ° C e soluzioni di lavoro a 4 ° C; utilizzare entro 1 settimana.
- Riempire fino a 10 capillari allo stesso tempo con una soluzione alimentare colorata, con la forza capillare. Inserire le estremità dei capillari nella soluzione di saccarosio (tiene i capillari ad un angolo di 45 ° rispetto alla soluzione). Stop se il liquido raggiunge la parte superiore (5 ml) marchio del capillare, e rimuovere la soluzione in eccesso all'esterno e all'interno con carta velina.
4. Montaggio e l'esecuzione del saggio capillare alimentatore
- Se non è necessario il digiuno, trasferire le mosche sperimentali per l'analisi toccando o blow-pipe. Assicurati di includere tre fiale di controllo senza mosche per quantificare l'evaporazione.
- Rimuovere con attenzione un puntale (2 - 20 volumi mL) che si sta chiudendo una delle openin esternogs, e inserire un capillare di vetro, bottom-end pieno di prima. Fissare il capillare posizionando la punta della pipetta di nuovo accanto alla capillare. Se diverse soluzioni alimentari sono in fase di test, ripetere la procedura di conseguenza.
- Posizionare l'estremità del capillare all'interno di tutte le fiale allo stesso livello per evitare distorsioni che potrebbero verificarsi se le fonti di cibo erano situati a diverse altezze (3 - 4 cm dal coperchio); mantenere la distanza per la carta da filtro per impedire il capillare fuoriuscita dal accidentalmente toccando la carta filtro o diverse viscosità di fonti alimentari.
- Etichettare l'estremità superiore del liquido colorato con un pennarello (segno di inizio). Per garantire le diverse capillari possono essere identificati, etichettare singolarmente utilizzando un codice colore o striscia.
- Inserire più saggi di Caffè preparati all'interno di una scatola di plastica con inserto a griglia e trasferire la scatola (Figura 2A) per una posizione sicura in condizioni di laboratorio o in un a temperatura, clim luce e umidità controllatamangiato da camera (parametri: 25 ° C, 60% di umidità relativa, 12 h / 12 h ciclo luce-buio) per il periodo sperimentale (ad esempio, 3 ore o giorni).
- Come carta da filtro di fondo si asciuga se il test viene fatto per diversi giorni, applicare acqua fresca ogni 24 ore tramite il tappo spugna (100 ml) per mantenere costante l'umidità all'interno del test. Utilizzare quattro flaconcini separati (8 cm Altezza, 3,3 centimetri di diametro) riempito con 30 ml di DDH 2 O come dispositivi di umidità e metterli accanto ai saggi CAFE nella scatola di plastica. Utilizzare un coperchio per la scatola di plastica per creare un ambiente ad umidità controllata durante l'esperimento (Figura 2A).
NOTA: la variabilità più ampia si verifica in condizioni di laboratorio; tuttavia, è fattibile per eseguire il test CAFE a temperatura ambiente (ad es., in una classe). L'uso di un dispositivo di umidificazione (carta da filtro, con o senza un tappo spugna bagnata, riempiti flaconi acqua e coperchio della scatola di plastica) è fortemente incoraggiato a diminuire l'evaporazione (- Sostituire i capillari con quelli appena riempiti per esperimenti a lungo termine ogni 24 h. Prendere nota di mosche morte prima di ogni intervallo h 24 e utilizzare il numero di mosche in tempo reale per calcolare il consumo di Per Fly per il periodo successivo. Eliminare i vecchi capillari dopo aver misurato il declino del menisco (vedi 5.1).
NOTA: durante un esperimento di 3 ore abbiamo quasi visto alcun mosche morte. Durante uno studio di 4 giorni di solito troviamo 1 - 3 mosche morte.- Al termine del dosaggio o prima di sostituire il capillare, contrassegnare il menisco inferiore del capillare (fine mark) con un pennarello mentre il saggio CAFE è ancora in posizione verticale. Eliminare i dati se fine marchio non è sotto il segno iniziale (mark inizio). Non rimuovere il coperchio, poiché questo potrebbe cambiare il menisco.
- Rimuovere con attenzione i capillari dal saggio e conservarli per la raccolta dei dati. Controllare il liquido all'interno del capillare raggiunto l'estremità inferiore se non Discard i dati, come il cibo non era accessibile alle mosche. Raccogliere tutti i capillari per flaconcino come gruppo. Inserire i puntali delle pipette non tagliati in tutte le aperture per evitare che le mosche di fuggire. Smontare la messa a punto e lavare le fiale, coperchi e tappi di spugna in un bagno di sapone e asciugare per una notte a temperatura ambiente per un ulteriore uso.
NOTA: Le mosche possono essere ulteriormente analizzati dopo il test. Confermare l'assorbimento di cibo ad occhio nudo o al microscopio dissezione.- Ripetere gli esperimenti con gli stessi genotipi su almeno tre giorni diversi.
- Sostituire i capillari con quelli appena riempiti per esperimenti a lungo termine ogni 24 h. Prendere nota di mosche morte prima di ogni intervallo h 24 e utilizzare il numero di mosche in tempo reale per calcolare il consumo di Per Fly per il periodo successivo. Eliminare i vecchi capillari dopo aver misurato il declino del menisco (vedi 5.1).
5. Raccolta dati e analisi
- Misurare la distanza tra l'inizio e la fine marchio segno sulla capillare utilizzando una pinza o di un righello. Per trasferire i dati direttamente in un foglio di calcolo, usare un USB (Universal Serial Bus) collegato calibro digitale (Figura 1E). Eliminare i capillari dopo la misurazione.
- Conto per dimensioni capillare per calcolare l'assorbimento di cibo o evaporazione. Ad esempio, si consideri un tappoIllary che è di 73 mm e contiene 5 ml di soluzione di cibo. Una diminuzione 14,6 mm di menisco riflette l'assorbimento di 1 ml soluzione. Calcolare uptake cibo utilizzando la seguente formula:
l'assorbimento alimentare (ml) = distanza misurata (mm) / 14.6 mm - Per escludere l'effetto dell'evaporazione sulla assunzione di cibo, calcolare significare l'evaporazione nelle fiale di controllo a tre (come minimo) senza mosche. Sottrarre questo valore medio dal valore ottenuto per il consumo di cibo dalle mosche.
- Utilizzare la seguente formula per determinare il consumo totale per volare:
Consumi alimentari (ml) = (Food assorbimento [ml] - perdite per evaporazione [ml]) / numero totale di mosche nel flacone. Per lungo termine esperimenti usa il numero di mosche vivi prima dell'inizio dell'intervallo 24 h. - Per tenere conto delle differenze in termini di dimensioni del corpo, come ad esempio tra le mosche maschio e femmina, normalizzare il consumo di cibo al peso corporeo (microlitri cibo / fly mg).
- Utilizzare il software statistico per l'analisi dei dati. per normadati alleato distribuiti, -test T uso degli studenti per determinare le differenze tra due gruppi di volo, e utilizzano ANOVA (analisi della varianza), con i test post hoc Tukey Cramer per più di due gruppi. In una situazione di scelta, analizzare le differenze di scelta casuale usando un test non parametrico segno di un campione.
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Representative Results
Le mosche del w 1118 genotipi sono utilizzati per dimostrare come viene eseguito il test. I w 1118 mutanti sono comunemente usati per generare le linee transgeniche e di controllare il background genetico di transgeni contrassegnato con il gene bianco. Normalmente, per esperimenti comportamentali, tutte le linee transgeniche sono reincrociata per cinque generazioni alla stessa w 1118 magazzino, che viene utilizzato come controllo sperimentale. Mostriamo diversi esperimenti: un confronto tra perdita di evaporazione per la nostra installazione modificata, un esperimento di scelta alimentare a breve termine, un esperimento di assunzione di cibo a lungo termine, e un esperimento su diverse diluizioni di saccarosio.
Evaporazione svolge un ruolo fondamentale nello svolgimento del saggio CAFE. Sono stati inclusi approcci complementari al nostro test per ridurre l'evaporazione: i) il tappo spugna centrale è riempito con acqua ogni 24 ore; ii) addizionale acqua fiale dopo l'altro trasporto e iii) l'uso di una copertura sostituito per la casella per creare un involucro di umidità (vedi 4.6). Confrontando l'evaporazione tra una configurazione senza e con i dispositivi sopra menzionati, una riduzione significativa evaporazione è visto. Anche l'effetto della maggiore volatilità di una soluzione di etanolo contenente non è rilevabile utilizzando la nuova configurazione.
In un esperimento alimentare due scelta un gruppo di 20 mosche può alimentare per 3 ore. Negli ambienti naturali, moscerini della frutta si nutrono preferibilmente sulla fermentazione di frutta con alcool 22, ed è stato dimostrato, utilizzando una configurazione simile, che le mosche preferiscono soluzioni di lievito-saccarosio con etanolo rispetto alle soluzioni di lievito-saccarosio, senza aggiunta di etanolo 23. Qui, due scelte alimentari sono offerti, una soluzione 0,1 M di saccarosio marcato con colorante alimentare rosso e una soluzione 0,1 M di saccarosio con il 15% EtOH marcato con colore blu cibo (Figura 1A, C). visiva examminazione dell'addome indica che le mosche nutrono entrambe le soluzioni (Figura 1D). Consumi alimentari per mosca è significativamente maggiore (quasi 2 volte) per la soluzione di saccarosio contenente EtOH (Figura 3A).
In un seguente esperimento, uno studio a lungo termine, un gruppo di otto mosche ha accesso a fonti alimentari simili per 4 giorni, e mosche consumano più del cibo contenente etanolo ogni giorno (Figura 3B). L'indice di preferenza per l'etanolo ([Suc + EtOH] - [Suc] / consumo totale) rimane costante in questo periodo (media = 0,29, tabella 4). La preferenza etanolo osservato è coerente con numerose altre pubblicazioni e spettacoli che vola grado di distinguere tra le diverse fonti di cibo 24, 25, 26. L'attrazione etanolo osservata potrebbe essere il risultato di diversi contenuti calorichele soluzioni offerte e delle proprietà gratificanti di etanolo 24. Il test può essere utilizzato anche per misurare gli effetti negativi di integratori alimentari. Ja e colleghi hanno dimostrato nella prima pubblicazione di questo metodo che l'applicazione di paraquat (un farmaco ossidante) riduce il consumo di cibo 10.
Nel prossimo esperimento, viene mostrata la differenza di assunzione di cibo tra i sessi. Esigenze metaboliche differiscono tra maschio e femmina D. melanogaster. Per esempio, mentre le mosche di sesso maschile preferiscono alimenti ricchi di carboidrati, durante la produzione di uova, una fase che richiede maggiore biosintesi delle proteine, le femmine preferiscono diete ricche di proteine su diete ricche di carboidrati 27. maschio Accoppiato e le mosche di sesso femminile sono stati utilizzati in questo esperimento. Per analizzare le differenze di assunzione di cibo tra i 20 maschi e 20 femmine mosche all'interno di un intervallo di alimentazione 3 ore, un test CAFE viene eseguita utilizzando un concent di saccarosioSerie razione. Cinque capillari sono stati forniti, con soluzioni che variano da 10 - 3 a 2 M di saccarosio, e il consumo di ciascuna soluzione è stata misurata (Figura 4A). I risultati hanno mostrato che entrambi i sessi preferiscono soluzioni di saccarosio ad alta concentrazione come fonte di cibo (Figura 4A). Tuttavia, femmine consumato significativamente più delle due soluzioni di saccarosio basso-concentrazione rispetto ai maschi (P <0,05); d'altra parte, i maschi consumato significativamente più delle soluzioni più alta concentrazione (P <0.001). Si noti che questi dati non rappresentano le differenze di dimensioni del corpo. Female D. melanogaster sono solitamente più grandi e più pesanti rispetto ai maschi (Tabella 1). Quando il consumo di cibo è normalizzata a volare di massa, le differenze tra maschi e femmine nel consumo di soluzioni a basso-saccarosio non sono più significativi. In sintesi, i maschi consumano più soluzione di saccarosio rispetto alle femmine accoppiate, in linea con i dati precedenti, riflantiriflesso possibili richieste metaboliche diverse, preferenze nutritiva o semplici differenze nella capacità di nutrirsi capillari tra i due sessi.
Figura 1: La Drosophila melanogaster capillare alimentatore Assay. A) Il test di alimentazione con le mosche. carta da filtro inumidita fornisce acqua sul fondo della fiala. Quattro capillari sono forniti durante l'esperimento (cibo rossi e blu di colore in capillari opposte). Si noti che i capillari sono fissati in posizione da una seconda punta della pipetta, e le posizioni non utilizzate vengono azionati mediante puntali delle pipette. Una spina di schiuma al centro del coperchio permettere il ricambio dell'aria. B) Vista dettagliata del coperchio. punte di taglio delle pipette (2 - 20 microlitri, bordi rossi) sono inseriti nelle aperture coniche di posizioni non utilizzate, e un secondo piPette punta viene inserito in punta di taglio per chiudere il foro. Le punte per pipette taglio vengono utilizzati per controllare il posizionamento dei microcapillari, e le punte non tagliati vengono utilizzati per tenere i capillari stretti. C) Un D. melanogaster mosca si nutre di un capillare. D) Dopo l'alimentazione, cibo colore è chiaramente visibile nell'addome mosca. E) un calibro digitale viene utilizzato per misurare la distanza tra la tacca inizio e contrassegnare la fine del menisco. I dati vengono trasferiti direttamente a un foglio di calcolo Excel tramite USB. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Influenza della evaporazione nel capillare Feeder Assay. A) saggio CAFE multipli inseriti all'internouna scatola di plastica con un intarsio reticolata. Per controllare l'umidità durante l'esperimento quattro flaconi riempiti con acqua (cerchi rossi) sono posizionati all'interno della griglia. I comandi di evaporazione sono posti nelle immediate vicinanze di queste fiale. Una copertura per tutta la configurazione è mostrata in background. B) Il confronto della perdita di volume attraverso l'evaporazione. Viene visualizzato il valore medio per l'evaporazione più di 4 giorni. Umidità è controllata da (i) applicazione di acqua al tappo spugna centrale (24 h intervallo); (Ii) l'aggiunta di quattro fiale di acqua riempita in rete; e (iii) con una copertura di plastica per l'intero setup. L'evaporazione è significativamente inferiore se l'umidità è controllata per entrambe le soluzioni testate (*** P ≤ 0,001; N = 48). Non ci sono differenze di volatilità tra EtOH contenente e non contenente soluzione di saccarosio è rilevabile con i dispositivi di umidità utilizzati. Clicca qui per vedere una versione più grandequesta figura.
Figura 3: Rapporto con etanolo (EtOH) contenenti saccarosio sopra saccarosio soluzione. Viene mostrato un) il consumo di cibo per il maschio w 1118 mosche. Maschi consumano molto più di un EtOH 15% contenente soluzione di saccarosio di una soluzione di saccarosio pianura. *** P ≤ 0,001; N = 27. B) Flies preferiscono in modo significativo una soluzione di saccarosio contenente il 23% EtOH durante una prova di 4 giorni. *** P ≤ 0,001; ** P ≤ 0,01; N = 16. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: CONSUMO (ml / volare e ml / mg volo) di diverse concentrazioni di saccarosio di maschio e femmina w 1118 mosche. A) Il consumo di diverse concentrazioni di soluzioni di saccarosio differisce significativamente tra maschi e femmine. mosche femmina consumano più a concentrazioni di saccarosio inferiori, e le mosche maschi consumano più a concentrazioni più elevate. * P <0,05; *** P <0.001; N = 27 prove con 20 maschi ciascuno, n = 30 prove con 20 femmine ciascuno). B) l'assorbimento alimentare su una base di massa. Un significativo aumento dei consumi avviene tra mosche maschili e femminili per le 0.1 a 2 m soluzioni di saccarosio quando normalizzata a volare di massa. *** P ≤ 0,001; N = 27 maschi, n = 30 femmine. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Peso corporeo del maschio e femmina w 1118 mosche. Quattro o cinque gruppi di 100 mosche sono stati misurati, e il peso corporeo (mg / volo) è stato calcolato. sono riportati i valori medi (con STDEV (deviazione standard) e STERROR (errore standard)). I valori medi sono utilizzati per normalizzare il consumo di cibo a volare di massa (ml / mg fly). Clicca qui per scaricare questo foglio di calcolo.
Tabella 2: Perdita di evaporazione (mL) nel caffè Assay. La quantità di liquido perso per evaporazione è indicata per 4 giorni. Umidità è controllata (+) o not (-) come descritto nella Figura 2. sono riportati i dati di evaporazione per due diverse soluzioni (saccarosio e saccarosio EtOH). I valori medi sono presentati per ogni giorno e nel corso del periodo (con STDEV e STERROR). La perdita di evaporazione dell'esperimento diluizioni di saccarosio è mostrato sotto separatamente (valori medi). Clicca qui per scaricare questo foglio di calcolo.
Tabella 3: Il consumo di 0,1 M saccarosio con / senza il 15% EtOH da Male w 1118 Flies Fed per 3 ore. Il consumo di entrambe le soluzioni da parte di gruppi di 20 mosche è stata misurata per 3 ore su 3 giorni. Valori di consumo per i gruppi di mosca sono divisi per il numero di mosche testati per stimare microlitro assorbimento Per Fly dopo aver sottratto la perdita per evaporazione. sono indicati valori medi (con STDEV e STERROR). Clicca qui per scaricare questo foglio di calcolo.
Tabella 4: Il consumo di 0,1 M saccarosio con e senza il 23% EtOH per quattro giorni da Male w 1118 mosche. Il consumo di entrambe le soluzioni per gruppi di 8 linea è stata misurata per 24 h per 4 giorni. Indice di preferenza per l'etanolo è stato calcolato utilizzando la seguente formula ([Suc + EtOH] - [Suc] / consumo totale). Valori di consumo per i gruppi di mosca sono divisi per il numero di mosche testati per stimare microlitri assorbimento per volare dopo aver sottratto la perdita per evaporazione. Valori medi (con STDEV e STERROR) sono indicati per ogni giorno..jove.com / files / ftp_upload / 55024 / JoVE55024R1-Diegelmann-Table-4.xlsx "target =" _ blank "> Clicca qui per scaricare questo foglio di calcolo.
Tabella 5: Il consumo di cinque concentrazioni di saccarosio maschio e femmina w 1118 mosche. L'assunzione di ciascuna soluzione, e il valore della somma delle assunzioni di saccarosio, è mostrato. I valori medi per ciascuna concentrazione sono riportati di seguito ogni colonna (con STDEV e STERROR). Per calcolare l'assunzione sulla base di massa fly (microlitri assorbimento per milligrammo di volo), il consumo di cibo viene diviso per il peso medio di mosche maschio o femmina (dalla tabella 1, indicati a destra). Clicca qui per scaricare questo foglio di calcolo.
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Discussion
La relazione descrive il saggio CAFE in modo passo-passo, concentrandosi sulla configurazione tecnica e le sue prestazioni di successo in laboratorio. Grazie alla sua semplicità, questo dosaggio potrebbe anche essere usato come educativo esperimento scuola. Gli esempi mostrano che il saggio permette di indagine di cibo rilevamento, privilegiate e di consumo in Drosophila melanogaster per periodi di tempo brevi e più lunghi (ore o giorni). Il saggio CAFE è stato utilizzato ampiamente nel campo di indagare temi, tra cui cibo e il consumo di droga, dipendenze, omeostasi energetica e il controllo neuronale di alimentazione 16, 18, 24, 25.
Nel saggio CAFE, mosche sperimentali devono eseguire con successo diverse operazioni per ottenere cibo, come il foraggiamento, il rilevamento e la locomozione; incapacità di eseguire queste attività potrebbe comportare consumi ridotti. Perinvecchiamento comportamento dipende principalmente dallo stato fame dei mosche e può essere aumentata digiuno 19, 21. Sensing, e quindi la localizzazione, la fonte di cibo può essere influenzata dalla capacità della mosca di odore o sapore e possono indirettamente causare un consumo inferiore 28. La visualizzazione del cibo alla fine di un capillare costringe al volo per scendere e attivamente stesso tenere in posizione capovolta per alimentare. Per tenere la posizione a bere sul capillare, la mosca deve coordinare la sua contrazione muscolare. Impairment o iperattività di locomozione chiaramente interesserebbero l'assorbimento di cibo, così come le carenze di locomozione dovuti all'invecchiamento. Inoltre, l'interferenza da parte di altri mosche durante questa manovra porta alla cessazione anticipata di assunzione del cibo. Pertanto, il numero di mosche da utilizzare deve essere determinata prima dell'esperimento. Questo numero dovrebbe garantire che tutte le mosche possono alimentare correttamente e dovrebbe controllare per fDensità ly nel flacone (da 8 fino ad un massimo di 20 mosche nel nostro D. melanogaster CAFE dosaggio flaconcino). L'alimentazione è influenzata dal valore nutrizionale del pasto, e le mosche regolare dinamicamente la loro ingestione conseguenza 24, 29. E 'stato dimostrato che i mutanti manca il octopamina neurotrasmettitore hanno normali punteggi risposta per, ma allo stesso tempo mostrano una significativa diminuzione dell'assunzione di cibo 14. Inoltre, durante l'allattamento, la motivazione per continuare a mangiare diminuisce e porta alla cessazione del comportamento.
Le considerazioni di cui sopra si applicano non solo al test CAFE, influenzano il comportamento alimentare misurata in altri sistemi di test pure. Pertanto, la capacità di mosche per eseguire il test deve essere preso in considerazione quando si misura l'assunzione di cibo. Anche se non è tecnicamente impegnativo, il saggio CAFE ha alcuni svantaggi potenziali pratici. Il declino del meniscoall'interno del capillare dipende perdita evaporazione e l'assunzione di cibo dalle mosche. Alta evaporazione è problematica riguardante il rapporto segnale rumore e dovrebbe pertanto essere ridotto al minimo. Abbiamo applicato diversi approcci e dispositivi aggiuntivi per controllare l'umidità durante il periodo di sperimentazione (vedi 4.6). Questi accessori ci hanno aiutato a ridurre l'evaporazione effetti in modo significativo e addirittura eliminati di diversa volatilità dei fonti di cibo che abbiamo usato. Tuttavia, se nessuna camera climatica è disponibile l'analisi può essere eseguita a temperatura ambiente (ad esempio in una classe) con valori superiori evaporazione come un inconveniente.
Come indicato nel protocollo, le estremità dei capillari devono essere poste allo stesso livello all'interno del flacone per evitare distorsioni nella scelta del volo a causa delle diverse distanze la fonte di cibo. Per raggiungere questo obiettivo, la posizione capillare è fissato con una seconda punta della pipetta. La lunghezza del capillare non sembra essere un criterio per l'alimentazione in Wild-Tipo di mosche 10. Qualsiasi fuoriuscita del liquido può minare la lettura accurata del consumo di cibo (vedi 4.3 e 4.9); un ambiente privo di vibrazioni impedisce fuoriuscite. Le particelle nel capillare soluzione bloccare il flusso e prevenire il consumo di cibo. La soluzione cibo, specialmente se contiene lievito, deve essere completamente dissolta per evitare un tale blocco. L'uso di estratto di lievito acqua solubile può superare questo problema, ma come fonte di nutrimento incompleta può causare costi aggiuntivi di fitness. accessibilità alimentare deve essere valutato prima e dopo l'esperimento. L'unico dato mosca che dovrebbero essere inclusi nell'analisi è quello ottenuto in cui l'accesso al cibo era presente durante l'intero esperimento (vedi 4.9). La posizione di alimentazione a testa in giù è una caratteristica fondamentale di questo esperimento. In condizioni naturali, questa posizione di alimentazione, non è sconosciuto al fly, come frutta pendono dagli alberi e potrebbero scendere un frutto marcio. Questo è supportato da esperimenti Comparing le dimensioni del pasto di mosche alimentazione in una posizione a testa in giù nel saggio CAFE a (i) una posizione di mangiare orizzontale di mosche immobilizzati nel test MAF e (ii) un diritto-side-up posizione di alimentazione con il cibo radioattivo 13, 21 . Anche se il display cibo capovolta non sembra essere un problema per le mosche, potrebbe influenzare la composizione del cibo all'interno del capillare. integratori sospesi come le cellule di lievito potrebbe affondare per gravità sul fondo del capillare e quindi potrebbe essere più concentrato in basso o potrebbero collegare il capillare. Ciò influenzare il comportamento mosca e quindi i risultati. Assicurare che i componenti della soluzione di alimentazione è completamente disciolto, e introducendo frequente capillari freschi durante esperimenti di lunga durata, minimizza l'influenza sulla assunzione di cibo.
L'utilizzo del test CAFE qui descritto permette di misurare l'assunzione di cibo in un gruppo mosca nel tempo si estende diore o giorni. Se è necessaria un'analisi più dettagliata (per es., Il comportamento di una mosca o un comportamento nell'intervallo minuti), altri saggi di alimentazione, quali il test MAFE, sono più appropriati. Potrebbe essere possibile per il numero di mosche essere ulteriormente ridotto utilizzando una provetta da microcentrifuga da 1,5 e un singolo capillare 30.
Il numero di esperimenti utilizzati per ottenere i risultati rappresentativi varia da 15 a 27, in linea con esperimenti descritti in letteratura 17, 24. L'analisi può essere eseguita in modo cieco classico che esclude potenziale di polarizzazione dal sperimentatore, ed è normalmente ripetuta almeno quattro a cinque volte su ciascuno dei diversi giorni. I dati ottenuti con il test CAFE possono essere normalizzati al peso corporeo per tenere conto di differenze nel comportamento alimentare relativi alle dimensioni del corpo. I risultati ottenuti con questo test sono robusti e riproducibili, in modo cheè stato introdotto con successo in corsi pratici per gli studenti universitari.
Il test CAFE è ampiamente usato nel campo della ricerca metabolica e gusto in Drosophila melanogaster; ha molteplici applicazioni nel testare il ruolo di integratori alimentari e / o farmaci sul comportamento alimentare, e può essere usato per studiare la risposta alla dose per una determinata fonte alimentare 24. In combinazione con la notevole varietà di tecniche utilizzate per manipolare circuiti neuronali in D. melanogaster, questo test permette anche ai ricercatori di indagare il ruolo dei sistemi di rinforzo sul comportamento alimentare 12, 17, 18.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vials (breeding) | Greiner Bio-One | 960177 | www.greinerbioone.com |
| Vials (CAFE assay) | Greiner Bio-One | 217101 | www.greinerbioone.com |
| Lid-CAFE assay | Workshop | – | – |
| Plastic box, low wall | Plastime | 353 | www.plastime.it |
| Cover for the plastic box | Workshop | – | – |
| Capillaries | BLAUBRAND | REF 7087 07 | www.brand.de |
| Pipette tips | Greiner Bio-One | 771290 | www.greinerbioone.com |
| Filter paper circles | Whatman | 10 311 804 | www.sigmaaldrich.com |
| D(+)-Sucrose | AppliChem | 57-50-1 | www.applichem.com |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 20,821,330 | www.vwr.com |
| Food color (red, E124) | Backfun | 10027 | www.backfun.de |
| Food color (blue, E133) | Backfun | 10030 | www.backfun.de |
| Soap solution (CVK 8) | CVH | 103220 | www.cvh.de |
| Digital caliper | GARANT | 412,616 | www.hoffmann-group.com |
| Vials (breeding) | Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm | ||
| Vials (CAFE assay) | Height 8 cm, diameter 3.3 cm | ||
| Lid-CAFE assay | Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file. |
||
| Plastic box, low wall | A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions | ||
| Cover for the plastic box | Dimensions (37 x 29 x 18 cm) | ||
| Capillaries | DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished | ||
| Pipette tips | Pipettes for the outer circle are cut according to the lid | ||
| Filter paper circles | 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used | ||
| D(+)-Sucrose | Not harmful | ||
| Ethanol absolute | Highly flammable liquid and vapor | ||
| Food color (red, E124) | Not stated | ||
| Food color (blue, E133) | Not stated | ||
| Soap solution (CVK 8) | Odor neutral soap | ||
| Digital caliper | |||
| Standard fly food | (for 20 L) | ||
| Agar | 160 g | ||
| Brewer's Yeast | 299.33 g | ||
| Cornmeal | 1,200 g | ||
| Molasses | 1.6 L | ||
| Propionic acid | 57.3 mL | ||
| Nipagin 30% | 160 mL |
References
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