Introduction
Питание имеет важное значение; Тем не менее, дерегулирование приема пищи , что приводит к расстройствами пищевого поведения , такие как булимия, анорексия или общей тенденции к переедать требует затрат на отдельных людей и общества в целом 1, 2, 3. Цель настоящего исследования заключается в раскрытии механизмов регуляции потребления пищи и обеспечить стратегию обхода образование расстройства. Многочисленные исследования с использованием модельных организмов млекопитающих обеспечили новые проникновения в суть схемы и роли сигнальных систем в расстройств пищевого поведения 4, 5, 6. Тем не менее, наши знания о нейронных и молекулярных основ, лежащих в основе этих нарушений остается далека от завершения. В последние годы плодовой мушки дрозофилы стал ценным модельной системой для распутывания основных механистических понимание регуляции metabolisм 7, 8, 9. Капилляра Feeder (CAFE) тест для дрозофилы был создан в лаборатории Сеймура Бензером в 2007 году , вдохновленный более ранней работе Dethier в Blowfly 10, 11. Анализ КАФЕ позволило непосредственно измерить потребление пищи в дрозофилы. В этой поведенческой тестовой системе, мухи питаются жидкой пищей, представленной в градуированных стеклянных капилляров, помещенных внутри флакона. Снижение капиллярной мениска указывает на потерю раствора пищи через испарение и потребление продуктов питания. Определение скорости испарения по флаконах без мух позволяет точно количественно оценить потребление пищи.
Анализ CAFE является одним из нескольких поведенческих парадигм , используемых для измерения кормления в дрозофилы и исследователи должны выбрать наиболее подходящий для их конкретныхвопрос. Решение об использовании определенного анализа следует учитывать следующие моменты: характер пищи при условии; условие кормления; измерение потребления или поглощение питательных веществ и потребления продуктов питания по расследованию или ответ на питание.
Анализ CAFE, как описано в настоящем докладе, идеально подходит для приема пищи следующие жидкого источника питания при вертикальном состоянии питания. В качестве альтернативы прием пищи может быть измерена для летучей группы на цветном источника питания во флаконе или на тарелку. Мухи, как правило, погибают или под наркозом после кормления и количество съеденной красителя определяется с помощью спектрофотометрии или визуального осмотра окрашенном живота. Мухи начинают экскретировать съеденной пищи только через 30 минут после приема, поэтому такой подход трудно использовать для анализа непрерывного длительного кормления поведения , 12, 13.
В отличие от мух сохраняются при рассасывающиеся красителяс с радиоактивной метки используются и их потребление радиоизотопом оценивается в сцинтилляционном счетчике 14, 15. Поглощение радиоактивной системой муха пищеварительном делает возможным долгосрочное измерение поглощения пищи, но может привести к недооценке потребления из-за непоглощаемой и выводится из организма молекул трассеров. Другой подход для измерения реакции на продукты питания в дрозофилы является ответом расширение хоботок (PER), который обычно имеет место для приема пищи 16. Этот элегантный метод измеряет первоначальный ответ на пищевой стимул, но не записывает количество потребления. Прием пищи динамически изменяется во время кормления с использованием нескольких пост-пищеварительные сигналы обратной связи , которые имеют решающее значение для регулирования подачи 17, 18. Несколько попыток было сделано в последние годы для сбора данных полуавтомат в анализе PER
Анализ КАФЕ позволяет избежать некоторых недостатков других анализов, описанных выше, и сочетает в себе простоту использования с надежного измерения потребления пищи. Здесь приводится подробное описание анализа CAFE обеспечивается, и мы покажем простой модификации установки, чтобы уменьшить испарение. Типичные результаты анализа, включая два пищевого выбора (краткосрочной и долгосрочной), а также поглощение сахарозы мух демонстрируется. В ходе обсуждения мы сравним наш метод, описанный с альтернативными способами для выполнения анализа CAFE, и выдвигают на первый план потенциальные ограничения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. КАФЕ Пробирной
Примечание: Анализ состоит из трех компонентов: экспериментальное флакон, специфическим крышкой и микро- капилляры. Пластиковая коробка с крышкой используется для транспортировки подготовленных ампул и более эффективно контролировать влажность.
- Используйте дрозофилы культуры пластиковый флакон ( по желанию высота 8 см, 3,3 см в диаметре) в виде трубки для анализа.
- Уплотнение флакона с помощью изготовленного из оргстекла крышкой , содержащей уплотнительное кольцо (фигуры 1А, 1В). Нагрузка летит, нажав или с паяльной трубкой через центральное отверстие в крышке (0,9 см диаметром), который также позволяет для циркуляции воздуха и водоснабжения, а также закрыть отверстие с губкой затычкой. Шесть меньших конических отверстий (0,4 см верхний диаметр, 0,3 см внутренний диаметр) окружают центральное отверстие и установите пипеток из 2 - 20 мкл объем для хранения капилляры на месте. (См дополнительные показатели для технических деталей крышки.)
Примечание: Использованиегубки пробкой с отверстиями для капилляров вместо заказного крышки, используемой в нашей рукописи возможно. Наша настроена крышка обеспечивает безопасную обработку готовых флаконов, минимизирующих риск капилляры падения. - Представить жидкую пищу, используют 5 мкл микрокапиллярах с 1 мкл меток. Поместите капилляры в конических отверстий в крышке, отрезав верхнюю часть 2 - 20 мкл кончика пипетки и вставить наконечник в отверстие (Рисунок 1В, отмеченные красным краем). Для того, чтобы предотвратить мух от побега, вставить режиссерский 2 - 20 мкл наконечник пипетки в то же отверстие.
- Для того, чтобы безопасно работать с несколькими подготовленными чаш, поместите их в пластиковый ящик с инкрустацией ( с координатной привязкой Рисунок 2А).
2. Подготовка Мух
- Держите мух на стандартной пищи при температуре 25 ° С, относительной влажности 60% и 12 ч / 12 ч свет-темнота цикла.
- Для контроля условий размножения, ввести 35 девственных самокD 15 мужчин для каждой экспериментальной группы в ампулу пластической культуры (высота 9,8 см, диаметр 4,8 см), содержащую 50 мл полететь пищи. Разрешить мухи откладывают яйца в течение первых 3-х дней, а затем перенести взрослых мух в свежих пищевых флаконах, и пусть они откладывают яйца в течение еще двух дней. После этого повторить передачу снова. Отбросить взрослых мух после того, как более 2-х дней.
- Поскольку потребление пищи зависит от размера мухи, определить вес группы 100 мух обезболивающее 2- до 3-дневного возраста взрослых мух с помощью CO 2 летать площадку и собрать их в 1,5 мл пластиковую трубку и измерения со стандартным лабораторного масштаба. Определить мокрую массу по меньшей мере четырех независимых групп мух , отсортированных по полу (таблица 1); использовать для расчета веса мкл потребления продуктов питания на мг лету. Используйте значение, чтобы определить количество пищи, которая кормит один муха на эксперимент и регулировать количество пищевых заполненных капилляров, соответственно, чтобы избежать опустошения капилляров путем подачи.
- Для 3 ч для анализа, использования20 мух и два заполненных капиллярах. Для длительного эксперимента (> 3 ч и до 9 дней), использовать группу из восьми мух с запасом четырех заполненных капилляров (надежные результаты не могут быть получены с помощью менее чем за восемь мух при описанных условиях).
- Отдельные мух на группы (8 или 20 мух) после измерения веса под воздействием CO 2. Перенести группу в новый флакон пищи (содержащей 15 мл стандартной пищи) , чтобы обеспечить восстановление от CO 2 седации в течение 48 часов до начала эксперимента. Используйте 4- до 6-дневных мух для анализа CAFE.
- В качестве не голодали мух дикого типа питаются лишь незначительно 19, 21, предварительно голодают мух для экспериментов кормления 3 ч. Ни один пост не требуется, когда потребление пищи контролируется в течение нескольких дней. Для поста, передача мух от 16 до 20 ч до тестирования, осторожно коснувшись их в пробирку, содержащую только диаметр сложенная фильтровальная бумага 45 мм, смоченную ~ 0,5 мл DDH2 O (дважды дистиллированной воды), а также рядом с подключенным КАФЕ анализа крышкой.
3. Подготовка жидких пищевых продуктов
- Приготовьте 3 М (10%, вес / объем) сахарозы маточного раствора путем заполнения 102,6 г сахарозы (C 12 H 22 O 11) до 100 мл DDH 2 O. пипеток 3 мкл, 33 мкл, 333 мкл, 3,3 мл и 6,6 мл маточного раствора в пластиковую пробирку 15 мл; добавить 2 мл пищевой краситель (для красного: кошениль [E124]; для синего: индиго кармин [E132]) и заполнить до 10 мл с DDH 2 O. Полученные концентрации 0,001, 0,01, 0,1, 1 и 2 М сахарозы ,
ПРИМЕЧАНИЕ: пищевой краситель позволяет визуализировать мениск более легко. Однако краситель может оказать влияние на потребление пищи. Для того, чтобы избежать смещения из-за красителя дозировать пищевой краситель или рандомизированные использование красителей в пищевых образцах в течение эксперимента и групп. - Для тестирования спирта предпочтение пипетку 333 мкл 3 М сахарозы маточного раствора в 15 мл пластиковую пробирку.Добавить 1,5 мл (2,3 мл) 100% EtOH (этанола) и добавляют DDH 2 O до 10 мл , чтобы привести к 15% (0,25 мМ) и 23% (0,39 мМ) рабочих растворов.
- Хранить растворы при -20 ° С и рабочих растворов при 4 ° С; использовать в течение 1 недели.
- Наполните до 10 капилляров, в то же время с цветным раствором пищевой, под действием капиллярных сил. Вставьте концы капилляров в раствор сахарозы (холдинг капилляры на углом 45 ° к раствору). Стоп, если жидкость достигает вершины (5 мкл) отметки капилляра, и удаления избытка раствора снаружи и внутри бумажной салфеткой.
4. Монтаж и проведения анализа капиллярных Feeder
- Если пост не требуется, передача экспериментальных мух в анализе, нажав или продувкой трубы. Убедитесь в том, чтобы включать в себя три контрольных чаш без мух для количественного испарения.
- Осторожно снимите наконечник пипетки (2 - 20 мкл объем), который закрывает один из внешних шторамиГ.С., и вставить заполненный стеклянный капилляр, снизу конец первой. Закрепите капилляр, помещая кончик пипетки назад рядом с капилляра. Если несколько продуктовых решений проходят испытания, то повторите эту процедуру соответствующим образом.
- Поместите капилляр заканчивается внутри всех флаконах на том же уровне, чтобы избежать смещения, которые могут возникнуть, если пищевые источники располагались на разной высоте (3 - 4 см от крышки); держать дистанцию с фильтровальной бумагой для предотвращения капиллярной утечки путем случайного прикосновения к фильтровальной бумаги или различные вязкости источников пищи.
- Этикетка верхний конец окрашенной жидкости с помощью маркера перо (знак начала). Для того, чтобы обеспечить различные капилляры могут быть идентифицированы, маркировать их по отдельности с помощью цвета или полосок кода.
- Поместите несколько подготовленных CAFE анализов внутри пластиковой коробке с сетчатой вставкой и передать коробку (рис 2A) в безопасное положение в лабораторных условиях или в температурно, свето- и контролируемой влажностью Климапоел камеры (параметры: 25 ° C, относительной влажности 60%, 12 ч / 12 ч светло-темного цикла) для экспериментального периода (например , 3 часа или дней).
- В качестве нижней части фильтровальной бумаги высыхает , если анализ выполняется в течение нескольких дней, применять свежую воду через каждые 24 ч через шприцевой затычкой (100 мкл) , чтобы сохранить влажность постоянную внутри теста. Используйте четыре отдельных флаконах (8 см в высоту, диаметр 3,3 см) , заполненную 30 мл DDH 2 O в качестве устройств влажности и поместите их рядом с CAFE анализов в пластиковой коробке. Используйте крышку для пластиковой коробки для создания влажности контролируемой среды во время эксперимента (рис 2А).
Примечание: Более широкая изменчивость происходит в лабораторных условиях; Тем не менее, целесообразно проводить определения CAFE при комнатной температуре (например., в классе). Использование увлажнителя устройства (фильтровальная бумага, с или без мокрой губкой затычкой, заполненный водой флаконы и крышки для пластиковой коробки) настоятельно рекомендуем, чтобы уменьшить испарение (- Заменить капилляры со свежеприготовленными наполненных для длительных экспериментов каждые 24 часа. Обратите внимание на мертвых мух перед каждым 24 часового интервала и использовать количество живых мух для расчета потребления на лету на следующий период. Выбросьте старые капилляры после измерения спада мениска (см 5.1).
Примечание: В течение 3 ч эксперимента мы едва видим никаких мертвых мух. В ходе исследования в течение 4 дней мы обычно находим 1 - 3 мертвых мух.- В конце анализа или перед заменой капиллярной, к нижнему мениске капиллярную (метки конца) с маркером в то время как анализ КАФЕ все еще находится в вертикальном положении. Откажитесь данные , если метка окончания не ниже начальной метки (метки начала). Не снимайте крышку, так как это может изменить мениск.
- Осторожно удалите капилляры из анализа и хранить их для сбора данных. Проверьте, если жидкость внутри капилляра при достижении нижнего конца, если не discard данные, как и пища была не доступна для мух. Собрать все капилляры в пузырек в качестве группы. Вставьте режиссерский наконечники пипеток во все отверстия, чтобы предотвратить мух от побега. Разобрать установку и мыть флаконы, крышки и губки в заглушки мыльной ванне и сухой в течение ночи при комнатной температуре для дальнейшего использования.
Примечание: Мухи могут быть дополнительно проанализированы после анализа. Подтвердить поглощение пищи глазом или под микроскопом рассечение.- Повторные эксперименты с теми же генотипами по крайней мере три разные дни.
- Заменить капилляры со свежеприготовленными наполненных для длительных экспериментов каждые 24 часа. Обратите внимание на мертвых мух перед каждым 24 часового интервала и использовать количество живых мух для расчета потребления на лету на следующий период. Выбросьте старые капилляры после измерения спада мениска (см 5.1).
5. Сбор и анализ данных
- Измерьте расстояние между началом и знак конца на капилляр , используя штангенциркуль или линейку. Для передачи данных непосредственно в электронную таблицу, используйте USB (Universal Serial Bus) , подключенный цифровой штангенциркуль (рис 1E). Откажитесь капилляры после измерения.
- Счет для размера капилляра для расчета поглощения пищи или испарения. Например, рассмотрим колпачокIllary, что составляет 73 мм в длину и содержит 5 мкл раствора пищи. Уменьшение 14,6 мм в мениске отражает поглощение 1 мкл раствора. Расчет поглощения пищи с использованием следующей формулы:
Потребление пищевых продуктов (мкл) = измеренное расстояние (мм) / 14,6 мм - Для того, чтобы исключить влияние испарения на потребление пищи, Посчитаем среднее испарение в пузырьках контрольных трех (как минимум) без мух. Вычтите это среднее значение из значения, полученного для потребления пищи с помощью мух.
- Используйте следующую формулу для определения общего потребления на лету:
Потребление пищи (мкл) = (поглощение еды [мкл] - Улетучивание [мкл]) / общее количество мух в ампуле. Для долгосрочных экспериментов используют число мух живыми до начала 24-часового интервала. - Для учета различий в размерах тела, таких как между мужчинами и женщинами мух, нормализовать потребление пищи к массе тела (мкл пищи / мг муха).
- С помощью статистического программного обеспечения для анализа данных. Для нормысоюзник распределенных данных, T - тестов использования студентами, чтобы определить различия между двумя группами мух, а также использовать ANOVA (дисперсионный анализ) с постфактум тестов Тьюки Cramer более двух групп. В ситуации выбора, анализировать отличия от случайного выбора с помощью непараметрического критерия знака одного образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мухи ж 1118 генотипа используются для демонстрации того, как выполняется анализ. Ш 1118 мутанты обычно используются для генерации трансгенных линий и контролировать генетический фон трансгенов , отмеченные белым геном. Как правило, для поведенческих экспериментов, все трансгенные линии возвратное скрещивание в течение пяти поколений в то же W 1118 запаса, который используется в качестве экспериментального контроля. Мы показываем различные эксперименты: сравнение потери испарения для нашей модифицированной установки, эксперимент краткосрочный выбор продуктов питания, долгосрочного потребления пищи эксперимент, и эксперимент на различных разведениях сахарозы.
Испарение играет решающую роль в выполнении анализа CAFE. Мы включили дополнительные подходы к нашему анализа для уменьшения испарения: я) центральная губка закупоривать перезаправлять с водой каждые 24 ч; б) дополниной воды заполнены ампул в транспортном ящике и III) использование крышки для коробки, чтобы создать корпус влажности (см 4.6). Сравнивая испарение между установкой без и с упомянутыми выше устройств, значительное уменьшение испарения наблюдается. Даже влияние более высокой волатильности этанол раствор, содержащий не обнаруживается с помощью новой установки.
В двух выбора эксперимента пищи группа из 20 мух могут питаться в течение 3 ч. В естественных условиях, фруктовые мухи питаются преимущественно на ферментацию плодов с алкоголем 22, и было показано, используя аналогичные установки, что мухи предпочитают дрожжами сахарозы растворы с этанолом в течение дрожжеподобных сахарозу растворов без этанола 23. При этом возможны два варианта еды предлагаются, раствор 0,1 М сахарозы маркированы красным пищевым красителем и 0,1 М раствором сахарозы с 15% этанола помечены синим цветом пищи (рис 1А, С). Визуальный ехаминирование брюшной полости указывает на то, что мухи питаются обоих растворах (рис 1D). Потребление продуктов питания на лету значительно больше (почти в 2 раза) для раствора сахарозы , содержащего EtOH (фиг.3А).
В следующем эксперименте, долгосрочного исследования, группа из восьми мух имеет доступ к подобным источникам пищи в течение 4 -х дней, и мухи потребляют больше этанола , содержащего продукты питания на каждый день (рис 3B). Индекс предпочтения этанола ([Suc + EtOH] - [Suc] / общее потребление) остается постоянным в течение этого периода ( в среднем = 0,29, таблица 4). Наблюдаемое предпочтение этанол согласуется с рядом других публикаций и показывает , что мухи могут различать между различными источниками пищевых 24, 25, 26. Наблюдаемое притяжение этанол может быть результатом различного содержания калорийнуюпредлагаемые решения и о награждении свойства этилового спирта 24. Анализ также может быть использован для измерения отрицательных последствий пищевых добавок. Ja и его коллеги показали в первой публикации этого метода , что применение параквата (окислительный наркотиков) уменьшает потребление пищи 10.
В следующем эксперименте, разница в потреблении пищи между полами проявляется. Метаболические требования отличаются между мужским и женским дрозофилы. Например, в то время как самцы мух предпочитают богатых углеводами пищу, во время производства яиц, фазу , которая требует повышенного биосинтез белка, самки предпочитают богатых белком диеты более богатых углеводами диеты 27. Соединяемый мужские и женские мухи были использованы в этом эксперименте. Для анализа различий в потреблении пищи между 20 самцов и 20 самок мух в пределах интервала подачи 3 ч, пробирного КАФЕ проводят с использованием ОБОГАЩЕНИЯ сахарозыРацион серии. Были предоставлены пять капилляры, с решениями в диапазоне от 10 - от 3 до 2 М сахарозы, и потребление каждого раствора измеряли (фиг.4А). Результаты показали , что оба пола предпочтительны растворы сахарозы высокой концентрации в качестве источника пищи (рис , 4А). Тем не менее, женщины потребляли значительно больше двух растворов сахарозы наименьшей концентрации по сравнению с мужчинами (р <0,05); с другой стороны, мужчины потребляется значительно большее количество высших концентраций растворов (p <0,001). Обратите внимание, что эти данные не учитывают различий в размерах тела. Женщины дрозофилы, как правило , больше и тяжелее , чем у мужчин (таблица 1). Когда потребление пищи нормализуется летать массы, различия между мужчинами и женщинами в потреблении низкой сахарозы решений больше не являются существенными. Таким образом, мужчины потребляют больше, чем раствор сахарозы спаренных самок, в соответствии с предыдущими данными, REFLразличные возможные выполнения над каждым метаболических потребностей, питательных предпочтений или простые различия в способности питаться капилляров между двумя полами.
Рисунок 1: дрозофилы капиллярных фидерных Анализ. А) Анализ кормления с мухами. Увлажненной фильтровальной бумаги обеспечивает подачу воды в нижней части флакона. Четыре капилляры предусмотрены во время эксперимента (красно- и синего цвета пищи в противоположных капилляров). Обратите внимание, что капилляры закреплены в положении с помощью второго наконечника пипетки, и неиспользованные позиции закрываются с помощью пипеток. Вспененный пробка в центре крышки позволяет воздухообмен. Б) Детальный вид крышки. Вырезать пипеток (2 - 20 мкл, красной границы) вставлены в конические отверстия Неиспользуемые позиции, а второй рPette наконечник вставляется в наконечник вырезать, чтобы закрыть отверстие. Кончики пипеток вырезать используются для контроля размещения микрокапиллярах, и режиссерский советы используются для хранения капилляры плотно. C) дрозофилы муха питается капилляра. D) После кормления, цвет пищи хорошо видна в летучей части живота. E) Цифровой измеритель используется для измерения расстояния между отметкой начала и отметить конец мениска. Данные передаются непосредственно в электронную таблицу Excel с помощью USB. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Влияние испарения в капилляре Feeder анализе. A) множественный анализ КАФЕ помещен внутрьпластиковая коробка с сетчатой вставкой. Для контроля влажности в ходе эксперимента четырех заполненных водой флаконов (красные диски) помещаются внутри сетки. Элементы управления испарительные расположены в непосредственной близости от этих ампул. Крышка для всей установки показана на заднем плане. Б) Сравнение потери объема в результате испарения. Среднее значение для испарения в течение 4 дней показано. Влажность контролируется (I) подачи воды к центральной губки затычкой (24 ч интервал); (II) добавление четырех заполненных водой ампул в сетку; и (III), используя пластиковую крышку для всей установки. Испарение значительно ниже , если влажность контролируется для обоих растворов тестируемых (*** Р ≤ 0,001, N = 48). Никаких различий в летучести между EtOH содержащих и не содержащих раствор сахарозы не обнаруживается с устройствами влажности используются. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версиюэта фигура.
Рисунок 3: Предпочтение для этилового спирта (этанола) , содержащей сахарозу над раствором сахарозы. A) Потребление продуктов питания для мужчины ж 1118 мух показано. Мужчины потребляют значительно больше 15% этанола, содержащего раствор сахарозы, чем из обычного раствора сахарозы. *** Р ≤ 0,001; N = 27. В) Мухи значительно предпочитают раствор сахарозы , содержащий 23% этанола в течение 4-дневного испытания. *** Р ≤ 0,001; ** P ≤ 0,01; N = 16. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Consumption (мкл / летать и мкл / мг муха) различных концентраций сахарозы мужчинами и женщинами , вес 1118 Мух. А) Потребление различных концентраций растворов сахарозы значительно отличается между мужчинами и женщинами. Женский мух потребляют больше при более низких концентрациях сахарозы, а самцы мух потребляют больше при более высоких концентрациях. * Р <0,05; *** Р <0,001; N = 27 испытаний с 20 мужчин каждый, N = 30 испытаний с 20 женщин каждый). Б) Потребление пищевых продуктов на основе массы. Значительное увеличение потребления происходит между мужчинами и женщинами мух для 0,1 до 2 М растворов сахарозы при нормализованы полететь массы. *** Р ≤ 0,001; N = 27 мужчин, N = 30 женщин. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1: Масса тела у мужчин и женщин ж 1118 Мух. были измерены четырех до пяти групп 100 мух, и рассчитывали массу тела (мг / муха). Средние значения (с СТАНДОТКЛОН (стандартное отклонение) и STERROR (стандартная ошибка)) показаны. Средние значения используются для нормализации потребления продуктов питания летать массы (мкл / мг муха). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Испарение Потеря (мкл) в CAFE анализе. Количество жидкости теряется через испарение показано в течение 4 дней. Влажность контролируется (+) или нетт (-) , как описано на фиг.2. Испарительные данные для двух различных растворов (сахарозы и сахарозы плюс этанол) показаны. Средние значения представлены на каждый день и в течение периода (с СТАНДОТКЛОН и STERROR). Потери при испарении эксперимента разведений сахарозы показан под отдельно (среднее значение). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 3: Расход 0,1 М сахарозе с / без 15% этанола самцом W 1118 Мухи Fed в течение 3 ч. Потребление обоих растворов группами по 20 мух измеряли в течение 3 ч на 3-х дней. Значения расхода для мух групп делится на число испытуемых мух оценить поглощение микролитре за лету после вычитания Улетучивание. Средние значения (с СТАНДОТКЛОН и STERROR) показаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 4: Потребление 0,1 М сахарозе и без 23% этанола в течение четырех дней самцом ш 1118 Мух. Потребление обоих растворов группы по 8 мух измеряли в течение 24 ч в течение 4 дней. Индекс Предпочтение этанола рассчитывали по следующей формуле ([Suc + EtOH] - [Suc] / общее потребление). Значения расхода для мух групп делится на число испытуемых мух оценить поглощение мкл на лету после вычитания Улетучивание. Средние значения (с СТАНДОТКЛОН и STERROR) показаны на каждый день..jove.com / файлы / ftp_upload / 55024 / JoVE55024R1-Diegelmann-Table-4.xlsx "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 5: Потребление пяти концентраций сахарозу мужская и женская ж 1118 Мух. Прием каждого раствора, а значение суммы потребления сахарозы, показан. Средние значения для каждой концентрации приведены ниже каждого столбца (с СТАНДОТКЛОН и STERROR). Для расчета потребления , основанный на летучей массы (микролитр поглощения на миллиграмм лету), потребление пищи делится на средний вес мужского или женского пола мух (из таблицы 1, показано справа). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В докладе описывается анализ CAFE в моде шаг за шагом, сосредоточив внимание на технической установке и его успешной работы в лаборатории. Благодаря своей простоте, этот анализ также может быть использован в качестве педагогически школьного эксперимента. Примеры показывают , что анализ позволяет исследовать зондирования пищи, предпочтения и потребления в дрозофилы на короткие и длительные периоды времени (часов до нескольких дней). Анализ КАФЕ широко используется в области для исследования предметов , включая продукты питания и потребления наркотиков, наркомании, энергетического гомеостаза и нейронным контролем подачи 16, 18, 24, 25.
В анализе CAFE, экспериментальные мухи должны успешно выполнить несколько задач для получения пищи, такие как нагула, зондирования и передвижения; невозможность выполнения этих задач может привести к снижению потребления. Длястарение поведение зависит главным образом от состояния голода мух и может быть увеличена на пост 19, 21. Чувствительный, и , таким образом , локализация, источника пищи может оказывать влияние на способность летать на запах или вкус и может косвенно привести к более низкой ставке 28 потребления. Дисплей пищи в конце капилляра заставляет летать спускаться вниз и активно удерживать себя в положении вверх дном, чтобы кормить. Для того, чтобы удержать позицию питьевой на капилляр, муха должна координировать свою мышечное сокращение. Обесценение или гиперактивность локомоции явно скажется поглощение пищи, как это делают локомоции недостатки из-за старения. Кроме того, вмешательство других мух во время этого маневра приводит к преждевременному прекращению приема пищи. Таким образом, количество мух, которые будут использоваться, должны быть определены до начала эксперимента. Это число должно гарантировать, что все мухи могут питаться правильно и должен контролировать для Fплотность LY во флаконе (от 8 до максимум 20 мух в нашем дрозофилы ЧВДЕ флакон для анализа). Питание зависит от питательной ценности пищи, и мух динамически корректировать их прием пищи соответственно 24, 29. Было показано , что мутанты отсутствуют нейромедиатора октопамина имеют нормальные оценки отклика ПЕР , но в то же время показывают значительное снижение потребления пищи 14. Кроме того, во время кормления, мотивация продолжать снижение питания и приводит к прекращению поведения.
Вышеупомянутые соображения применимы не только к анализа CAFE, они влияют на пищевое поведение, измеренное в других тест-систем, а также. Таким образом, способность мух выполнять анализа необходимо принимать во внимание при измерении потребления пищи. Хотя это не является технически сложной задачей, анализ CAFE имеет некоторые потенциальные практические недостатки. Снижение менискавнутри капилляра зависит от потери испарения и приема пищи с помощью мух. Высокое испарение является проблематичным в отношении сигнала к шуму и, следовательно, должно быть сведено к минимуму. Мы применили несколько дополнительных подходов и устройств для контроля влажности в течение экспериментального периода (см 4.6). Эти аксессуары помогли нам уменьшить испарение значительно и даже полностью устранено влияние различных волатильности источников пищи, которые мы использовали. Тем не менее, если нет климатической камере отсутствует анализ можно проводить при комнатной температуре (например , в классе) с более высокими значениями испарения как недостаток.
Как было упомянуто в протоколе, концы капилляров должны быть размещены на том же уровне внутри флакона, чтобы избежать смещения в выборе мухи из-за различных расстояниях от источника питания. Для достижения этой цели, позиция капиллярная фиксируется со вторым наконечником пипетки. Длина капилляра-видимому, не является критерием для кормления в дикоготип мух 10. Любая утечка жидкости может подорвать точное считывание потребления продуктов питания (см 4.3 и 4.9); среда безвибрационная предотвращает разливы. Частицы в блоке раствор капилляра потока и предотвратить потребление пищи. Решение пищи, особенно, если он содержит дрожжи, должен быть полностью растворен, чтобы избежать такой закупорки. Использование растворимых в воде дрожжевой экстракт может решить эту проблему, но как неполный источник питания может повлечь за собой дополнительные расходы на фитнес. Продовольственная доступность должна быть оценена до и после эксперимента. Единственная муха данные, которые должны быть включены в анализ, который получен, когда доступ к пище присутствовала в течение всего эксперимента (см 4.9). Положение подачи вверх-вниз является критической особенностью эксперимента. В естественных условиях это положение кормления не незнаком лету, так как плоды свисают с деревьев, и они могли бы спуститься вниз гнилой плод. Это подтверждается экспериментами COMPARING размеры еды мух , питающихся в положении вверх дном в анализе кафешку (I) горизонтальной еды положения обездвиженных мух в анализе Mafe и (II) а правой стороной вверх подачи позиции с использованием радиоактивно пищи 13, 21 , Хотя дисплей еды вверх-вниз, как представляется, не является проблемой для мух, это может повлиять на состав пищи внутри капилляра. Взвешенные добавки, такие как клетки дрожжей может тонуть под действием силы тяжести на дно капилляра и, следовательно, может быть более концентрированным на дне или могут подключить капилляра. Это будет влиять на поведение мухи и таким образом результаты. Обеспечение того, чтобы компоненты питательного раствора полностью растворяются, и часто введение свежей капилляры во время длительных экспериментов, сводит к минимуму это влияние на потребление пищи.
Использование анализа CAFE, описанного здесь, позволяет проводить измерения потребления пищи в летучей группе с течением времени пролетовчасы или дни. Если более детальный анализ необходим (например., Поведение одного муха или поведение в пределах минут), других анализов кормления, таких как анализ Mafe, являются более подходящими. Это может быть возможным количество мух дополнительно уменьшить с помощью 1,5 мл микроцентрифужных трубку и одну капиллярную 30.
Количество экспериментов , используемых для получения репрезентативных результатов колеблется от 15 до 27, в соответствии с экспериментами , описанными в литературе , 17, 24. Анализ может быть выполнен в классическом слепом, что исключает потенциальное смещение от экспериментатора, и он, как правило, повторяют по меньшей мере четыре-пять раз на каждой из нескольких дней. Данные, полученные с помощью анализа CAFE могут быть нормализованы к массе тела, чтобы учесть различия в пищевом поведении, связанных с размером тела. Результаты, полученные с помощью этого анализа, надежным и воспроизводимым, так что онабыла успешно внедрена в практических курсов для аспирантов.
Анализ КАФЕ широко используется в области обмена веществ и исследования вкуса в дрозофилы; он имеет несколько приложений в тестировании роль пищевых добавок и / или наркотиков на пищевом поведении, и он может быть использован для исследования реакции на дозу для конкретного источника 24 питания. В сочетании с замечательным разнообразием методов , используемых для манипулирования нейронную схему в дрозофилы, этот анализ также позволяет исследователям исследовать роль систем усиления на пищевом поведении 12, 17, 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vials (breeding) | Greiner Bio-One | 960177 | www.greinerbioone.com |
| Vials (CAFE assay) | Greiner Bio-One | 217101 | www.greinerbioone.com |
| Lid-CAFE assay | Workshop | – | – |
| Plastic box, low wall | Plastime | 353 | www.plastime.it |
| Cover for the plastic box | Workshop | – | – |
| Capillaries | BLAUBRAND | REF 7087 07 | www.brand.de |
| Pipette tips | Greiner Bio-One | 771290 | www.greinerbioone.com |
| Filter paper circles | Whatman | 10 311 804 | www.sigmaaldrich.com |
| D(+)-Sucrose | AppliChem | 57-50-1 | www.applichem.com |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 20,821,330 | www.vwr.com |
| Food color (red, E124) | Backfun | 10027 | www.backfun.de |
| Food color (blue, E133) | Backfun | 10030 | www.backfun.de |
| Soap solution (CVK 8) | CVH | 103220 | www.cvh.de |
| Digital caliper | GARANT | 412,616 | www.hoffmann-group.com |
| Vials (breeding) | Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm | ||
| Vials (CAFE assay) | Height 8 cm, diameter 3.3 cm | ||
| Lid-CAFE assay | Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file. |
||
| Plastic box, low wall | A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions | ||
| Cover for the plastic box | Dimensions (37 x 29 x 18 cm) | ||
| Capillaries | DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished | ||
| Pipette tips | Pipettes for the outer circle are cut according to the lid | ||
| Filter paper circles | 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used | ||
| D(+)-Sucrose | Not harmful | ||
| Ethanol absolute | Highly flammable liquid and vapor | ||
| Food color (red, E124) | Not stated | ||
| Food color (blue, E133) | Not stated | ||
| Soap solution (CVK 8) | Odor neutral soap | ||
| Digital caliper | |||
| Standard fly food | (for 20 L) | ||
| Agar | 160 g | ||
| Brewer's Yeast | 299.33 g | ||
| Cornmeal | 1,200 g | ||
| Molasses | 1.6 L | ||
| Propionic acid | 57.3 mL | ||
| Nipagin 30% | 160 mL |
References
- Krauth, C., Buser, J., Vogel, K. How high are the costs of eating disorders - anorexia nervosa and bulimia nervosa - for German society. Eur. J. Health Econ. 3 (4), 244-250 (2002).
- Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity and instrumental variables approach. J. Health Econ. 31, 219-230 (2012).
- PriceWaterhouse Coopers LLP. The costs of eating disorders: Social, health and economic impacts. Assessing the impact of eating disorders across the UK on behalf of BEAT. PwC. , Available from: https://www.beat.co.uk/assets/000/000/302/The_costs_of_eating_disorders_Final_original.pdf (2015).
- Lenard, N. R., Berthoud, H. R. Central and peripheral regulation of food intake and physical activity: pathways and genes. Obesity. 16, S11-S22 (2008).
- Magni, P., et al. Feeding behavior in mammals including humans. Trends in Comp. Endocrinology and Neurobiology. 1163, 221-232 (2009).
- Morton, G. J., Meek, T. H., Schwartz, M. W. Neurobiology of food intake in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 15, 367-378 (2014).
- Bharuchka, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster to study metabolism. Pediatr. Res. 65 (2), 132-137 (2009).
- Smith, W. W., Thomas, J., Liu, J., Li, T., Moran, T. H. From fat fruit fly to human obesity. Physiol. Behav. 136, 15-21 (2014).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, (2013).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Dethier, V. G. The Hungry Fly: A Physiological Study of the Behavior Associated with Feeding. , Harvard Univ Press. Cambridge, MA. (1976).
- Albin, S. D., Kaun, K. R., Knapp, J., Chung, P., Heberlein, U., Simpson, J. H. A subset of serotonergic neurons evokes hunger in adult Drosophila. Curr. Biol. 25, 2435-2440 (2015).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat. Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Geer, B. W., Olander, R. M., Sharp, P. L. Quantification of dietary choline utilization in adult Drosophila melanogaster by radioisotope methods. J. Insect Physiol. 16, 33-43 (1970).
- Thompson, E. D., Reeder, B. A., Bruce, R. D. Characterization of a method for quantitating food consumption for mutation assays in Drosophila. Environ. Mol. Mutagen. 18, 14-21 (1991).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Scheiner, R., Steinbach, A., Classen, G., Strudthoff, N., Scholz, H. Octopamine indirectly affects proboscis extension response habituation in Drosophila melanogaster by controlling sucrose responsiveness. J. Insect Physiol. 69, 107-117 (2014).
- Liu, Y., Luo, J., Carlsson, M. K., Nässel, D. R. Serotonin and insulin-like peptides modulate leucokinin-producing neurons that affect feeding and water homeostasis in Drosophila. J. Comp. Neurol. 523, 1840-1863 (2015).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), e101107 (2014).
- Itskov, P. M. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behavior in Drosophila. Nat. Commun. 5, 4560 (2014).
- Qi, W., Yang, Z., Lin, Z., Park, J. Y., Suh, G. S. B., Wang, L. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol. Brain. 8, 87 (2015).
- Marx, V. Metabolism: feeding fruit flies. Nat. Methods. 12 (7), 609-612 (2015).
- Spieth, H. T. Courtship behavior in Drosophila. Annu. Rev. Entomol. 19, 385-405 (1974).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Curr. Biol. 19 (24), 2126-2132 (2009).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (7), 2498-2503 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Ethanol preference in Drosophila melanogaster is driven by its caloric value. Alcohol Clin. Exp. Res. 36 (11), 1903-1912 (2012).
- Vargas, M. A., Luo, N., Yamaguchi, A., Kapahi, P. A role for S6 kinase and serotonin in postmating dietary switch and balance of nutrients in D. melanogaster. Curr. Biol. 20 (11), 1006-1011 (2010).
- Masek, P., Scott, K. Limited taste discrimination in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (33), 14833-14838 (2010).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr. Opin. Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Luo, J. N., Lushchak, O. V., Goergen, P., Williams, M. J., Nässel, D. R. Drosophila insulin-producing cells are differentially modulated by serotonin and octopamine receptors and affect social behavior. Plos One. 9 (6), e99732 (2014).
