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Neuroscience

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em doi: 10.3791/55024 Published: March 17, 2017

Introduction

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Comer é essencial; no entanto, a desregulamentação da ingestão de alimentos, resultando em transtornos alimentares como bulimia, anorexia ou a tendência geral para comer demais implica custos para os indivíduos ea sociedade 1, 2, 3. O objetivo da presente pesquisa é descobrir mecanismos de regulação da ingestão de alimentos e para fornecer uma estratégia de evasão à formação de desordem. Numerosos estudos utilizando modelos de organismos de mamíferos têm proporcionado novas perspectivas de o circuito eo papel dos sistemas de sinalização em distúrbios 4, 5, 6 comer. No entanto, o nosso conhecimento das bases neuronais e moleculares subjacentes a estes transtornos permanece longe de ser completa. Nos últimos anos, a mosca da fruta Drosophila melanogaster tornou-se um sistema valioso modelo para desvendar idéias mecanicistas básicas para a regulamentação da metabolism 7, 8, 9. O ensaio capilar alimentador (CAFE) Drosophila melanogaster foi criado no laboratório de Seymour Benzer, em 2007, inspirado por um trabalho anterior de Dethier no blowfly 10, 11. O ensaio CAFE tornou possível medir diretamente a ingestão de alimentos em Drosophila melanogaster. Neste sistema de teste comportamental, moscas se alimentam de alimento líquido fornecido em capilares de vidro graduada colocada dentro de um frasco. O declínio do menisco capilar indica perda de solução alimentar através de evaporação e consumo de alimentos. Determinar a velocidade de evaporação por frascos sem moscas permite a quantificação precisa do consumo de alimentos.

O ensaio CAFE é um dos vários paradigmas comportamentais usados para medir a alimentação em Drosophila melanogaster e os investigadores têm de escolher o mais adequado para a sua específicaquestão. A decisão de usar um determinado ensaio deve considerar os seguintes pontos: a natureza do alimento fornecido; a condição de alimentação; a medição da ingestão ou absorção de nutrientes e investigação consumo de alimentos ou a resposta aos alimentos.

O ensaio CAFE, conforme descrito neste relatório é ideal para seguir a ingestão de alimentos de uma fonte de alimento líquido sob uma condição de alimentação vertical. Alternativamente, a ingestão de alimento pode ser medida por um grupo de mosca em uma fonte de alimento colorido num frasco ou numa placa. As moscas são normalmente mortos ou anestesiados após a alimentação e a quantidade de corante ingerida é determinada por espectrometria ou inspeção visual do abdômen manchada. Moscas iniciar a excretar o alimento ingerido apenas 30 minutos após a ingestão, por conseguinte, esta abordagem é difícil de usar, para a análise de mais comportamentos alimentação contínua 12, 13.

Em contraste moscas são mantidas intactas quando corante absorvívels com traçadores radioativos são usados e seu consumo de radioisótopo é marcado num contador de cintilação 14, 15. Absorção do marcador radioactivo pelo sistema digestivo mosca torna a longo prazo de medição possível a absorção de alimentos, mas pode levar a uma subestimação do consumo devido a moléculas não absorvido e excretado marcadoras. Outra abordagem para medir a resposta ao alimento em Drosophila melanogaster, é a resposta extensão tromba (PER), o que normalmente ocorre durante a ingestão de alimentos 16. Este método elegante mede a resposta inicial a um estímulo comida, mas não grava a quantidade de ingestão. A ingestão de alimentos é ajustado dinamicamente durante a alimentação usando vários sinais de retorno pós-digestivos que são fundamentais para a regulação da alimentação 17, 18. Várias tentativas têm sido feitas nos últimos anos para a recolha de dados semi-Automate no ensaio PER 19, 20. O PER é detectado por uma almofada eléctrica ou uma combinação de eléctrodos e contados através do computador. Combinando o ensaio PER com captação do radioisótopo revelou que este ensaio é limitada pela baixa sensibilidade para a detecção de diferenças de alimentação quantidade 18. O ensaio manual de alimentação (MAFE) 21, em que uma mosca é alimentada manualmente com um capilar de vidro, foi recentemente desenvolvido para medir a absorção de alimentos num único mosca imobilizada. O ensaio MAFE elimina as interferências de A alimentar e de alimentação de iniciação e tem uma resolução de tempo de segundos, e iniciação de PER e consumo de alimentos pode ser controlada de forma independente no ensaio. No entanto, a maneira em que a imobilização da mosca afecta determinados aspectos do comportamento alimentar (por exemplo, locomoção, motivação) tem ainda de ser investigada. Para excelentes críticas comparativas de ensaios diferentes para medir o consumo de alimentos em Drosophila melanogaster e ajudar os investigadores encontrar o caminho mais adequado, ver os relatórios por Deshpande e Marx 13, 22.

O ensaio CAFÉ evita algumas das desvantagens de outros ensaios descritos acima e combina a simplicidade de utilização com medição fiável da ingestão de alimentos. Aqui, uma descrição detalhada do ensaio CAFE é fornecido e nós mostrar uma modificação configuração simples para reduzir a evaporação. Os resultados representativos, incluindo um ensaio de dois alimentos escolha (curto e longo prazo) e a absorção de sacarose de moscas é demonstrada. Na discussão, comparamos nosso método descrito com formas alternativas de realizar o ensaio CAFE, e destacar potenciais limitações.

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Protocol

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1. O ensaio CAFÉ

NOTA: O ensaio é composto por três componentes: um frasco experimental, uma tampa específica e capilares micro. Uma caixa de plástico com tampa é utilizado para transportar os frascos preparados e para controlar a humidade de forma mais eficiente.

  1. Usar um Drosophila melanogaster frasco de cultura de plástico (opcional 8 centímetros de altura, 3,3 cm de diâmetro) na forma de um tubo para o ensaio.
  2. Fecha-se o frasco com uma tampa de Plexiglas fabricadas contendo um O-ring (Figuras 1A, 1B). Carga voa tocando ou com um maçarico através da abertura da tampa central (0,9 cm de diâmetro), que também permite a circulação de ar e de água, e fechar o buraco com uma rolha de esponja. Seis aberturas cónicas menores (0,4 cm de diâmetro superior, diâmetro interno de 0,3 cm) cercam o furo central e encaixar as pontas de pipeta de 2-20 volume de mL para manter os vasos capilares no lugar. (Ver figuras suplementares para detalhes técnicos do tampa.)
    NOTA: O usode uma rolha de esponja com aberturas para os capilares em vez da tampa feito por encomenda utilizado no nosso manuscrito é possível. Nossa tampa personalizado permite o manuseio seguro dos frascos preparados minimizando o risco de capilares caindo.
  3. Para apresentar o alimento líquido, usar 5 microcapilares ul com 1 marcas mL. Posicionar os capilares cónicos nas aberturas na tampa, cortando o topo de um 2 - ponta de pipeta 20 ul e a inserção da ponta para o buraco (Figura 1B, marcado com borda vermelha). Para evitar moscas de escapar, inserir um sem cortes 2-20 mL ponta da pipeta na mesma abertura.
  4. Para lidar com segurança com vários frascos preparados, colocá-los em uma caixa de plástico com uma incrustação em grade (Figura 2A).

2. Preparação de Moscas

  1. Manter moscas em alimentos padrão a 25 ° C, 60% de humidade relativa e um / 12 h ciclo de luz-escuro de 12 h.
  2. Para controlar condições de criação, introduzir 35 fêmeas virgens umD 15 machos para cada grupo experimental para um frasco de cultura de plástico (9,8 centímetros de altura, 4,8 cm de diâmetro) contendo 50 mL fly alimentos. Permitir moscas colocar ovos para os primeiros 3 dias, em seguida, transferir adulto voa para frascos de alimentos frescos e deixá-los põem ovos por mais dois dias. Após este repetir a transferência de novo. adulto descarte voa depois de mais 2 dias.
  3. Como a ingestão de alimentos depende do tamanho da mosca, determinar o peso de um grupo de 100 moscas por anestesiar 2- a mediana de 3 dias de idade, utilizando uma almofada moscas mosca CO 2 e juntá-las num tubo de plástico de 1,5 ml e com um padrão de medição escala de laboratório. Determinar o peso líquido de pelo menos quatro grupos de moscas independentes classificadas por sexo (Tabela 1); usar o peso para calcular mL consumo de alimentos per mg mosca. Utilizar o valor para determinar a quantidade de comida que alimenta uma única mosca por experiência e ajustar o número de capilares cheios de alimentos de acordo com a evitar o esvaziamento dos capilares através da alimentação.
    1. Para um ensaio de 3 h, a utilização20 moscas e duas capilares cheios. Para uma experiência a longo prazo (> 3 h e até 9 dias), utilizar um grupo de oito moscas com um fornecimento de quatro capilares cheios (resultados fiáveis ​​não pode ser obtida com menos do que oito moscas nas condições descritas).
  4. Moscas separados em grupos (8 ou 20 moscas) após a medição de peso sob exposição ao CO 2. Transferir o grupo para um novo frasco de comida (contendo 15 mL de alimentos padrão) para permitir a recuperação a partir de CO 2 sedação durante 48 h antes da experiência. Use moscas de 4 a 6 dias de idade para o ensaio CAFÉ.
  5. Como moscas não sedentos de tipo selvagem alimentar apenas marginalmente 19, 21, pré-starve voa para 3 h experiências de alimentação. Sem o jejum é necessário quando o consumo de alimentos é monitorado ao longo de vários dias. Para jejum, moscas transferência de 16 a 20 horas antes do teste batendo suavemente-los para um frasco contendo apenas um diâmetro dobrado de papel de filtro de 45 mm humedecido com ~ 0,5 mL DDH2 O (bidestilada água), e fechar com uma tampa ensaio CAFE conectado.

3. Preparação de alimentos líquidos

  1. Prepara-se uma (10%, w / v) de 3 M de solução de estoque de sacarose, preenchendo 102,6 g de sacarose (C 12 H 22 O 11) a 100 mL de ddH 2 O. Pipeta 3 ul, 33 ul, 333 ul, 3,3 mL e 6,6 mL da solução de reserva para um tubo de plástico de 15 mL; Adicionar 2 ml de corante alimentar (para o vermelho: Cochonilha [E124]; para o azul: carmim índigo [E132]) e preencher a 10 mL com DDH 2 O. As concentrações resultantes são 0,001, 0,01, 0,1, 1 e 2 M de sacarose .
    NOTA: O corante alimentar permite visualizar o menisco mais facilmente. No entanto, o corante pode ter um impacto sobre a ingestão de alimentos. Para evitar uma tendência devida ao corante dispensar o corante alimentar ou ao acaso, a utilização de corantes para as amostras de alimentos durante a experiência e os grupos.
  2. Para testar para o álcool preferência pipeta 333 uL da solução de stock 3 M de sacarose num tubo de plástico de 15 mL.Adicionar 1,5 mL (2,3 ml) de 100% de EtOH (etanol) e adiciona-se ddH2O até 10 mL para resultar em 15% (0,25 mM) e um 23% (0,39 mM) soluções de trabalho.
  3. Mantenha soluções estoque a -20 ° C e soluções de trabalho a 4 ° C; utilizar no prazo de 1 semana.
  4. Encha até 10 capilares, ao mesmo tempo com uma solução alimentar colorido, por força de capilaridade. Inserir as extremidades dos capilares para a solução de sacarose (segurando os capilares com um ângulo de 45 ° em relação à solução). Pare se o líquido atinge o topo (5 mL) marca do capilar e remover o excesso de solução no exterior e no interior com papel de seda.

4. Montagem e realização do ensaio capilar alimentador

  1. Se o jejum não é necessário, transferir as moscas experimentais para o ensaio tocando ou blow-pipe. Certifique-se de incluir três frascos de controlo sem moscas para quantificar evaporação.
  2. Remova cuidadosamente uma ponteira (2-20 volume de mL), que está fechando uma das abertu exteriorgs, e inserir um capilar de vidro, na base da pirâmide preenchido em primeiro lugar. Fixar o capilar, colocando a ponta da pipeta de volta ao lado do capilar. Se várias soluções alimentares estão sendo testados, repita esse procedimento em conformidade.
  3. Coloque o capilar termina dentro de todos os frascos com o mesmo nível de prevenção de erros que poderiam ocorrer se as fontes de alimento foram localizados em diferentes alturas (3 - 4 cm da tampa); manter uma distância para o papel de filtro para impedir que o capilar de vazamento por acidentalmente tocar o papel de filtro ou diferentes viscosidades de fontes de alimento.
  4. Rotular a extremidade superior do líquido colorido usando uma caneta marcador (ponto de início). Para garantir que os diferentes capilares podem ser identificados, classificá-los individualmente através de um código de cor ou de distribuição.
  5. Coloque vários ensaios de CAFÉ preparados dentro de uma caixa de plástico com incrustações em grade e transferir a caixa (Figura 2A) para uma posição segura em condições de laboratório ou em uma com temperatura, clim luz e humidade controladasComeram câmara (parâmetros: 25 ° C, 60% de humidade relativa, 12 h / 12 h ciclo de luz-escuridão) durante o período experimental (por exemplo, 3 horas ou dias).
  6. Como papel de filtro inferior resseca, se o ensaio for realizado ao longo de vários dias, aplique água fresca a cada 24 h através do bung esponja (100 mL) para manter constante umidade no interior do ensaio. Use quatro frascos separados (8 centímetros de altura, 3,3 cm de diâmetro) preenchidos com 30 mL DDH 2 O como dispositivos de umidade e colocá-los ao lado dos ensaios de café em caixa de plástico. Use uma tampa da caixa de plástico para criar um ambiente de humidade controlada durante o experimento (Figura 2A).
    NOTA: variabilidade Broader ocorre sob condições de laboratório; no entanto, é viável para realizar o ensaio do café na temperatura ambiente (por ex., numa sala de aula). O uso de um dispositivo de humidificação (papel de filtro, com ou sem um tampão de esponja molhada, frascos cheios de água e tampa da caixa de plástico) é altamente recomendável para diminuir a evaporação (
  7. Substitua os capilares com os recém-cheias para experimentos de longa duração a cada 24 h. Anote moscas mortas antes de cada intervalo de 24 h e usar o número de moscas vivas para calcular o consumo per fly para o período seguinte. Descartar as velhas capilares depois de medir o declínio do menisco (ver 5.1).
    NOTA: Durante a 3 h experimento que quase não ver qualquer moscas mortas. Durante um estudo 4 dias que geralmente encontrar 1 - 3 moscas mortas.
  8. No final do ensaio, antes de substituir o capilar, marcar o menisco inferior do tubo capilar (marca final), com uma caneta de marcador, enquanto o ensaio CAFÉ ainda está na posição vertical. Descarte os dados se end marca não está abaixo da marca inicial (ponto de início). Não retire a tampa, pois isso pode alterar o menisco.
  9. Remova cuidadosamente os capilares a partir do ensaio e armazená-los para coleta de dados. Verificar se o líquido no interior do capilar alcançada a extremidade inferior se não discard os dados, como comida não era acessível para as moscas. Recolha todos os capilares por frasco como um grupo. Insira as pontas de pipeta sem cortes em todas as aberturas para evitar moscas de escapar. Desmantelar a instalação e lavar os frascos, tampas e tampões de esponja em um banho de sabão e secar durante a noite à temperatura ambiente para uso posterior.
    NOTA: As moscas podem ser ainda analisados ​​após o ensaio. Confirmar a absorção de alimentos pelo olho ou sob um microscópio de dissecação.
  10. experiências repetidas com os mesmos genótipos em pelo menos três dias diferentes.

5. Recolha e Análise de Dados

  1. Meça a distância entre o início eo fim marca marca no capilar usando uma pinça ou uma régua. Para transferir dados diretamente para uma planilha, use um cabo USB (Universal Serial Bus) ligado paquímetro digital (Figura 1E). Descartar os capilares após a medição.
  2. Conta de tamanho capilar para calcular a absorção de alimentos ou evaporação. Por exemplo, considere uma tampaIllary que é de 73 mm de comprimento e contém 5 uL de solução de alimentação. Uma diminuição 14,6 milímetros no menisco reflecte a absorção de uma solução uL. Calcular a absorção de alimentos com a seguinte fórmula:
    a absorção de alimentos (L) = distância medida (mm) / 14,6 mm
  3. Para excluir o efeito de evaporação na ingestão de alimentos, calcular média de evaporação nos frascos de controlo de três (no mínimo) sem moscas. Subtrair este valor médio a partir do valor obtido para o consumo de alimentos pelas moscas.
  4. Use a seguinte fórmula para determinar o consumo total por mosca:
    consumo de alimentos (L) = (Food captação [mL] - perda por evaporação [mL]) / número total de moscas no frasco. Para longo prazo experiências utilizar o número de moscas vivas antes do início do intervalo de 24 h.
  5. Para explicar as diferenças no tamanho do corpo, como entre moscas macho e fêmea, normalizar o consumo de alimentos com o peso corporal (mL alimentos / mg fly).
  6. Use um software estatístico para análise de dados. por normaDados aliado distribuídos, -Testes T uso do aluno para determinar as diferenças entre dois grupos de moscas, e usar ANOVA (análise de variância) com testes post hoc Tukey Cramer por mais de dois grupos. Em uma situação de escolha, analisar as diferenças de escolha aleatória usando um teste não paramétrico sinal de uma amostragem.

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Representative Results

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As moscas com o genótipo de W 1118 são usados para demonstrar a forma como o ensaio é realizado. Os mutantes W 1118 são comumente usados para gerar linhas transgénicas e para controlar o fundo genético de transgenes marcado com o gene branco. Normalmente, para experiências de comportamento, todos os linhas transgénicas são retrocruzados durante cinco gerações ao mesmo W 1,118 estoque, o qual é utilizado como controlo experimental. Mostramos diferentes experiências: a comparação de perda por evaporação para a nossa configuração modificada, um experimento de escolha alimentar a curto prazo, uma experiência de ingestão de alimentos a longo prazo, e um experimento com diferentes diluições de sacarose.

A evaporação desempenha um papel crítico no desempenho do ensaio CAFÉ. Foram incluídos abordagens adicionais para nosso ensaio para diminuir a evaporação: i) o tampão de esponja central é enchido com água a cada 24 h; ii) addicional de água frascos dentro da caixa de transporte e iii) o uso de uma tampa cheia para a caixa para criar um gabinete de humidade (ver 4.6). Comparando-se a evaporação entre uma configuração de sem e com os dispositivos acima mencionados, uma redução significativa na evaporação é visto. Mesmo o efeito de maior volatilidade de uma solução de etanol contendo não é detectável usando a nova configuração.

Numa experiência de comida de dois a escolha de um grupo de 20 moscas pode alimentar durante 3 h. Em ambientes naturais, moscas da fruta alimentam-se preferencialmente na fermentação de frutas com o álcool 22, e demonstrou-se, utilizando uma configuração semelhante, que as moscas preferem as soluções de levedura-sacarose com etanol em relação às soluções de levedura sem sacarose-etanol 23. Aqui, duas escolhas alimentares são oferecidas, de uma solução 0,1 M de sacarose marcada com corante alimentar vermelho e uma solução 0,1 M de sacarose com 15% de EtOH marcado com corante alimentar azul (Figura 1A, C). ex VisualA aminação do abdómen indica que as moscas se alimentam de ambas as soluções (Figura 1D). O consumo de alimentos por mosca é significativamente maior (cerca de duas vezes) para a solução de sacarose contendo EtOH (Figura 3A).

Numa experiência seguinte, um estudo de longo prazo, um grupo de oito moscas tem acesso a fontes de alimentos semelhantes durante 4 dias, e moscas consumir mais do alimento contendo etanol em cada dia (Figura 3B). O índice de preferência para o etanol ([Suc + EtOH] - [Suc] / consumo total) mantém-se constante ao longo deste período (média = 0,29, Tabela 4). A preferência etanol observada é consistente com diversas outras publicações e programas que as moscas podem distinguir entre diferentes fontes de alimentos 24, 25, 26. A atração etanol observada pode ser resultado dos diferentes teores calóricos deas soluções oferecidas e das propriedades gratificantes de etanol 24. O ensaio também pode ser utilizado para medir os efeitos negativos dos suplementos alimentares. Ja e colegas mostraram na primeira publicação deste método que a aplicação do paraquat (uma droga oxidante) diminui o consumo de alimentos 10.

Na experiência seguinte, a diferença do consumo de alimentos entre os sexos é mostrado. Requisitos metabólicos diferem entre macho e fêmea D. melanogaster. Por exemplo, enquanto moscas macho prefere comida rica em carboidratos, durante a produção de ovos, uma fase que requer maior biossíntese de proteínas, as fêmeas preferem dietas ricas em proteínas sobre dietas ricas em carboidratos 27. moscas de ambos os sexos acasaladas e foram utilizados neste experimento. Para analisar as diferenças na ingestão de alimentos entre 20 do sexo masculino e 20 do sexo feminino moscas dentro de um intervalo de alimentação 3 h, um ensaio de café é realizada utilizando uma concent sacarosesérie ração. Cinco capilares foram fornecidos, com soluções que variam de 10 - 3 a 2 M de sacarose, e o consumo de cada solução foi medida (Figura 4A). Os resultados mostraram que ambos os sexos preferido soluções de sacarose de elevada concentração, tal como uma fonte de alimento (Figura 4A). No entanto, as fêmeas consumido significativamente mais das duas soluções de sacarose de menor concentração em comparação com os machos (P <0,05); Por outro lado, os homens consumiram significativamente mais das soluções de concentração mais elevada (P <0,001). Note-se que estes dados não são responsáveis ​​por diferenças no tamanho do corpo. Feminino D. melanogaster são geralmente maiores e mais pesados do que os homens (Tabela 1). Quando o consumo de alimentos é normalizado para voar em massa, as diferenças entre machos e fêmeas em consumo de soluções de baixo-sacarose não são mais significativos. Em resumo, os homens consomem solução de sacarose mais de fêmeas acasaladas, consistente com os dados anteriores, reflecting possíveis demandas metabólicas diferentes, preferências nutricionais ou simples diferenças na capacidade de alimentar-se os capilares entre os dois sexos.

figura 1
Figura 1: A Drosophila melanogaster capilar alimentador de Ensaio. A) O ensaio de alimentação com moscas. papel de filtro humedecido fornece água na parte inferior do frasco. Quatro capilares são fornecidos durante o experimento (alimentos vermelhos e de cor azul em capilares opostos). Note-se que os capilares são fixados em posição por um segundo ponta da pipeta, e as posições não utilizadas estão fechadas utilizando pontas de pipeta. Um tampão de espuma no centro da tampa permite que a troca de ar. B) Vista detalhada da tampa. pontas de pipeta corte (2-20 ul, bordas vermelhas) são inseridos nas aberturas cónicas de posições não utilizadas, e um segundo PIpette ponta é inserida na ponta de corte para fechar o orifício. As pontas de pipeta corte são usados ​​para controlar o posicionamento das microcapilares, sem cortes e as pontas são usados ​​para segurar os capilares apertados. C) Um melanogaster mosca D. alimenta-se de um capilar. D) Após a alimentação, a cor dos alimentos é claramente visível no abdômen da mosca. E) A paquímetro digital é usado para medir a distância entre o ponto de início e marcar o fim do menisco. Os dados são transferidos diretamente para uma planilha do Excel via USB. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Influência da evaporação no capilar Alimentador de Ensaio. A) Ensaio de CAFÉ múltipla colocado dentrouma caixa de plástico com uma incrustação em grade. Para controlar a umidade durante o experimento quatro frascos cheios de água (aros vermelhos) são colocados dentro da grade. Os controles de evaporação são colocados na proximidade directa a esses frascos. Uma tampa para toda a configuração é mostrada no fundo. B) Comparação da perda de volume por meio de evaporação. O valor médio para evaporação mais de quatro dias é mostrado. Humidade é controlado por: (i) aplicação de água ao tampão com rosca esponja central (24 h de intervalo); (Ii) adição de quatro frascos cheios de água na rede; e (iii) usando uma capa de plástico para toda a instalação. A evaporação é significativamente mais baixa se a humidade é controlado para ambas as soluções testadas (*** P ≤ 0,001; N = 48). Não houve diferença na volatilidade entre EtOH contendo e não contendo solução de sacarose é detectável com os dispositivos de humidade utilizado. Por favor clique aqui para ver uma versão maioresta figura.

Figura 3
Figura 3: Preferência por etanol (EtOH), com sacarose mais de sacarose Solution. A) O consumo de alimentos para o sexo masculino w 1118 moscas é mostrado. Os machos consomem significativamente mais de uma EtOH 15% contendo solução de sacarose do que de uma solução de sacarose simples. *** P ≤ 0,001; N = 27. B) Moscas preferência significativamente uma solução de sacarose contendo 23% de EtOH, durante um ensaio de 4 dias. *** P ≤ 0,001; ** P ≤ 0,01; N = 16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Consumo (mL / voar e ul / mg fly) de diferentes concentrações de sacarose por Masculino e Feminino w 1118 Moscas. A) O consumo de diferentes concentrações de soluções de sacarose difere significativamente entre machos e fêmeas. moscas fêmeas consumir mais em concentrações mais baixas de sacarose, e moscas machos consomem mais em concentrações mais elevadas. * P <0,05; *** P <0,001; N = 27 testes com 20 homens cada, n = 30 estudos com 20 mulheres cada). B) a absorção de alimentos em uma base de massa. Um aumento significativo no consumo ocorre entre moscas macho e fêmea para as soluções de sacarose 0,1 a 2 M quando normalizada para voar em massa. *** P ≤ 0,001; N = 27 homens, n = 30 fêmeas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

tabela 1
Tabela 1: Peso corporal do Masculino e Feminino w 1118 Moscas. De quatro a cinco grupos de 100 moscas foram medidos e calculou-se o peso corporal (mg / mosca). Os valores médios (com DP (desvio-padrão) e STERROR (erro padrão)) são mostrados. Os valores médios são utilizados para normalizar o consumo de alimentos para voar de massa (mL / mg fly). Por favor clique aqui para baixar a planilha.

mesa 2
Tabela 2: Perda de evaporação (L) no café de Ensaio. A quantidade de líquido perdida por evaporação é mostrado por 4 dias. Humidade é controlada (+) ou nenhumat (-), tal como descrito na Figura 2. dados de evaporação para duas soluções diferentes (sacarose e sacarose mais EtOH) são mostrados. Os valores médios são apresentados para cada dia e ao longo do período (com STDEV e STERROR). A perda de evaporação da experiência diluições de sacarose é mostrada por baixo em separado (valores médios). Por favor clique aqui para baixar a planilha.

tabela 3
Tabela 3: O consumo de 0,1 M de sacarose com / sem 15% de EtOH por Masculino 1118 W Moscas Fed durante 3 h. Consumo de ambas as soluções por grupos de 20 moscas foi medida durante 3 h em 3 dias. Os valores de consumo para os grupos de moscas são divididos pelo número de moscas testados para estimar a absorção de microlitro por fly depois de subtrair a perda por evaporação. Os valores médios (com STDEV e STERROR) são mostrados. Por favor clique aqui para baixar a planilha.

tabela 4
Tabela 4: Consumo de 0,1 M de sacarose com e sem 23% EtOH durante quatro dias por Masculino w 1118 Moscas. Consumo de ambas as soluções por grupos de 8 moscas foi medida durante 24 horas durante 4 dias. índice de preferência para o etanol foi calculada usando a seguinte fórmula ([Suc + EtOH] - [Suc] / consumo total). Os valores de consumo para os grupos de moscas são divididos pelo número de moscas testados para estimar a absorção ul por mosca depois de subtrair a perda por evaporação. Os valores médios (com STDEV e STERROR) são mostrados para cada dia..jove.com / files / ftp_upload / 55024 / JoVE55024R1-Diegelmann-Table-4.xlsx "target =" _ blank "> Clique aqui para baixar a planilha.

tabela 5
Tabela 5: Consumo de cinco concentrações de sacarose por Masculino e Feminino w 1118 Moscas. A ingestão de cada solução, e o valor da soma dos consumos de sacarose, é mostrado. Os valores médios para cada concentração são dadas abaixo cada coluna (com STDEV e STERROR). Para calcular o consumo com base na massa mosca (absorção microlitro por miligrama de mosca), o consumo de alimentos está dividido pelo peso médio de moscas macho ou fêmea (da Tabela 1, mostrado à direita). Por favor clique aqui para baixar a planilha.

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Discussion

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O relatório descreve o ensaio CAFE de forma passo-a-passo, com foco na configuração técnica e seu bom desempenho em laboratório. Devido à sua simplicidade, este ensaio também pode ser utilizado como um experimento educacional escola. Os exemplos mostram que o ensaio permite investigação de detecção de alimentos, preferência e consumo em Drosophila melanogaster durante períodos de tempo curtos e mais longos (horas ou dias). O ensaio CAFE tem sido amplamente utilizada no campo para investigar assuntos, incluindo alimentos e consumo de drogas, vícios, homeostase energética e controlo neuronal da alimentação 16, 18, 24, 25.

No ensaio CAFE, moscas experimentais deve executar com sucesso várias tarefas para obter alimentos, como forrageamento, detecção e locomoção; incapacidade de realizar essas tarefas pode resultar em consumo reduzido. Paracomportamento de envelhecimento depende principalmente do estado de fome as moscas e pode ser aumentada por meio de jejum 19, 21. Detecção, localização e, deste modo, da fonte de alimentação pode ser influenciada pela capacidade da mosca de cheiro ou de sabor e pode resultar indirectamente em uma taxa de consumo inferior 28. O mostrador da comida na extremidade de um capilar obriga a voar para descer e activamente manter-se numa posição de cabeça para baixo para alimentar. Para manter a posição de bebida sobre o capilar, a mosca deve coordenar a sua contração muscular. Impairment ou hiperatividade de locomoção claramente afetaria a absorção de alimentos, assim como deficiências de locomoção devido ao envelhecimento. Além disso, a interferência de outras moscas durante esta manobra leva a terminação prematura da ingestão de alimentos. Portanto, o número de moscas para ser usado deve ser determinado antes da experiência. Este número deve assegurar que todas as moscas pode alimentar adequadamente e deve controlar para fdensidade ly no frasco (de 8 até um máximo de 20 moscas em nosso D. melanogaster CAFE frasco de ensaio). A alimentação é influenciado pelo valor nutricional da refeição, e moscas ajustar dinamicamente a sua ingestão de acordo com 24, 29. Foi demonstrado que mutantes em falta a octopamina neurotransmissor têm pontuações normais resposta por, mas ao mesmo tempo mostram uma diminuição significativa na ingestão de comida 14. Além disso, durante a alimentação, a motivação para continuar diminui alimentares e leva à cessação do comportamento.

As considerações acima mencionadas não se aplicam apenas ao ensaio CAFE, eles influenciam o comportamento medido em outros sistemas de teste bem alimentar. Por conseguinte, a capacidade de moscas para realizar o ensaio deve ser tida em conta quando se mede a ingestão de alimentos. Embora não seja tecnicamente desafiador, o ensaio CAFE tem alguns inconvenientes práticos potenciais. O declínio do meniscono interior do capilar depende perda por evaporação e a ingestão de alimentos pelas moscas. Alta evaporação é problemático quanto à relação sinal-ruído e, por conseguinte, deve ser minimizado. Foram aplicados vários métodos e dispositivos adicionais para controlar a humidade durante o período experimental (ver 4.6). Estes acessórios nos ajudado a reduzir a evaporação efeitos significativamente e até mesmo eliminados de diferentes volatilidade das fontes de alimentos que usamos. No entanto, se nenhuma câmara climática está disponível o ensaio pode ser realizado à temperatura ambiente (por exemplo, numa sala de aula) com valores mais elevados de evaporação como uma desvantagem.

Como mencionado no protocolo, as extremidades dos capilares devem ser colocadas ao mesmo nível no interior do frasco para evitar distorções na escolha da mosca devido a diferentes distâncias para a fonte de alimento. Para alcançar este objectivo, a posição é fixa capilar com uma segunda ponta da pipeta. O comprimento do capilar parece não ser um critério para a alimentação em wild-Tipo voa 10. Qualquer derramamento do líquido pode minar a leitura precisa do consumo de alimentos (ver 4.3 e 4.9); um ambiente livre de vibração evita vazamentos. Partículas no capilar bloco de solução de fluxo e evitar o consumo de alimentos. A solução alimentar, especialmente se ela contém levedura, necessita de ser completamente dissolvido para evitar tal obstrução. O uso de extrato de levedura solúvel em água pode superar este problema, mas como uma fonte incompleta de nutrição que pode causar custos adicionais de fitness. acesso aos alimentos deve ser avaliado antes e após o experimento. A única mosca de dados que deve ser incluído na análise que é obtido, em que o acesso à alimentação estava presente durante todo o experimento (ver 4.9). A posição de alimentação de cabeça para baixo é uma característica crítica da experiência. Em condições naturais, esta posição de alimentação não é desconhecido para a mosca, como frutas pendem das árvores e eles podem descer uma fruta podre. Isto é apoiado pelas experiências comparing os formatos de refeição de moscas que alimentam em uma posição de cabeça para baixo no ensaio CAFE para (i) uma posição de alimentação horizontal de moscas imobilizadas no ensaio MAFE e (ii) a-lado-direito até a posição alimentando o uso de alimentos radiomarcado 13, 21 . Embora o indicador do alimento de cabeça para baixo não parece ser um problema para as moscas, poderia afetar a composição dos alimentos no interior do capilar. suplementos em suspensão, tais como células de levedura pode afundar por acção da gravidade para o fundo do tubo capilar e, portanto, pode ser mais concentrado na parte inferior ou pode ligar o capilar. Isso influenciar o comportamento da mosca e, portanto, os resultados. Assegurar que os componentes da solução de alimentação está completamente dissolvido, e com frequência introduzir capilares fresco no decurso de experiências de longo prazo, minimiza esta influência sobre a ingestão de alimentos.

A utilização do ensaio descrito aqui CAFÉ permite a medição do consumo alimentar de um grupo mosca ao longo do tempo se estende dehoras ou dias. Se a análise mais detalhada é necessária (por exemplo., O comportamento de uma única mosca ou comportamento na gama de minutos), outros ensaios de alimentação, tal como o ensaio MAFE, são mais apropriados. Pode ser possível que o número de moscas para ser ainda mais reduzido pelo uso de um tubo de 1,5 mL de microcentrífuga e uma única capilar 30.

O número de experiências utilizadas para obter os resultados representativos varia de 15 a 27, consistente com experiências descritas na literatura 17, 24. O ensaio pode ser realizado de um modo cego clássico que exclui o potencial de polarização do experimentador, e normalmente é repetido pelo menos quatro a cinco vezes em cada um dos vários dias. Os dados obtidos com o ensaio CAFE pode ser normalizada ao peso do corpo para explicar as diferenças no comportamento alimentar relacionado ao tamanho do corpo. Os resultados obtidos com este ensaio são robustos e reprodutível, de modo que elefoi introduzido com sucesso em cursos práticos para estudantes de pós-graduação.

O ensaio CAFE é amplamente utilizado no campo da metabólica e pesquisa gosto em Drosophila melanogaster; tem múltiplas aplicações em testar o papel dos suplementos alimentares e / ou drogas sobre o comportamento alimentar, e pode ser utilizado para investigar a resposta à dose a uma fonte de alimento específico 24. Em combinação com a notável variedade de técnicas usadas para manipular os circuitos neuronais em D. melanogaster, este ensaio também permite aos investigadores para investigar o papel de sistemas de reforço sobre o comportamento de 12, 17, 18 de alimentação.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vials (breeding) Greiner Bio-One 960177 www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay) Greiner Bio-One 217101 www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay Workshop
Plastic box, low wall Plastime 353 www.plastime.it
Cover for the plastic box Workshop
Capillaries BLAUBRAND  REF 7087 07 www.brand.de
Pipette tips Greiner Bio-One 771290 www.greinerbioone.com
Filter paper circles Whatman 10 311 804 www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose AppliChem 57-50-1 www.applichem.com
Ethanol absolute VWR Chemicals 20,821,330 www.vwr.com
Food color (red, E124) Backfun 10027 www.backfun.de
Food color (blue, E133) Backfun 10030 www.backfun.de
Soap solution (CVK 8) CVH 103220 www.cvh.de
Digital caliper GARANT 412,616 www.hoffmann-group.com
Vials (breeding) Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm 
Vials (CAFE assay) Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay Produced in university workshop, technical drawing supplied
Please click here to download this file.
Plastic box, low wall A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions 
Cover for the plastic box Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries DIN ISO 7550 norm,  IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose Not harmful
Ethanol absolute Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124) Not stated
Food color (blue, E133) Not stated
Soap solution (CVK 8) Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food (for 20 L)
Agar 160 g
Brewer's Yeast 299.33 g
Cornmeal 1,200 g
Molasses 1.6 L
Propionic acid 57.3 mL
Nipagin 30% 160 mL

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References

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O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em<em&gt; Drosophila melanogaster</em
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Diegelmann, S., Jansen, A., Jois, S., Kastenholz, K., Velo Escarcena, L., Strudthoff, N., Scholz, H. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (121), e55024, doi:10.3791/55024 (2017).More

Diegelmann, S., Jansen, A., Jois, S., Kastenholz, K., Velo Escarcena, L., Strudthoff, N., Scholz, H. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (121), e55024, doi:10.3791/55024 (2017).

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