Abstract
Benbildande osteoblaster interagerar med benresorberande osteoklaster att samordna omsättning benvävnad och för att kontrollera skelett homeostas. Medaka och zebrafisk larver används ofta för att analysera beteendet hos benceller under benbildning, degeneration, och reparation. Deras optiska klarhet tillåter visualisering av fluorescerande benceller och fluorescerande färgämnen bundna till den mineraliserade skelettmatrisen. Vårt laboratorium har genererat transgena medaka fisk som uttrycker osteoklast-inducerande faktor Receptor Activator of Nuclear-faktor kB Ligand (RANKL) under kontroll av en värmechock-inducerbar promotor. Ektopiskt uttryck av RANKL resulterar i den överskjutande bildningen av aktiverade osteoklaster, vilka kan visualiseras i reporter linjer med nlGFP expression under kontroll av den katepsin K (ctsk) promotor. RANKL induktion och ektopisk osteoklastbildning leder till allvarliga osteoporosliknande fenotyper. Förening transgen medaka lines som uttrycker ctsk: nlGFP i osteoklaster, såväl som mCherry under kontroll av den osterix (osx) promotor i tidigt födda osteoblaster, kan användas för att studera interaktionen av båda celltyperna. Detta underlättar observation in vivo av cellulärt beteende under förhållanden ben degeneration och reparation. Här beskriver vi användningen av detta system för att testa ett läkemedel som vanligen används inom human osteoporos terapi och beskriver ett protokoll för levande avbildning. Den medaka modell kompletterar studier i cellodling och möss, och erbjuder ett nytt system för analys in vivo av läkemedelsverkan i skelettsystemet.
Introduction
Ryggradsdjur skelettet ger strukturellt stöd och skydd för organ, medger rörlighet och fungerar som en källa till kalcium. Hela livet, är den extracellulära benmatrisen kontinuerligt överlämnas till upprätthålla ben stabilitet och styvhet. Denna process kräver tätt samordnad verksamhet och samspel av benbildande osteoblaster och benresorberande osteoklaster. Osteoblaster är härledda från multipotenta mesenkymala stamceller och producerar kollagen för att bilda osteoid, den proteinhaltiga delen av benmatris 10. Osteoblaster interagera med osteoklaster för att uppnå en balanserad verksamhet av båda celltyperna, som krävs för att styra benhomeostas 7. På grund av dessa intrikata reglerande interaktioner svar på läkemedelsbehandling och benhomeostas kan inte till fullo undersökas med hjälp av in vitro-studier. Därför finns det en stark efterfrågan på djurmodeller. Jämfört med de cellodlingsinställningar, in vivo-modeller kan gevärdefull inblick i flercelliga nätverk inom benet miljön.
Ett stort antal musmodeller finns för en mängd olika mänskliga bensjukdomar inklusive osteoporos 16. Men storleken på och tillgängligheten till musembryon representerar betydande begränsningar för levande avbildning av skelett processer. Små teleost fisk, å andra sidan, fungerar som ett attraktivt alternativ för in vivo imaging. Zebrafisk (Danio rerio) och medaka (Oryzias latipes) har blivit populära djurmodeller för skelett forskning under de senaste två årtiondena 17, 19, 22, 24. Ben teleost fisk och däggdjur är mycket lika, både på strukturell och på en fysiologisk nivå, och många av de viktigaste reglerande gener och signalvägar bevaras tre. Som i däggdjur, teleost fisk reglerar noggrant aktiviteten hos osteoblaster och osteoklaster att balansera benbildning och resorption 26. Viktigast av allt, den optiska klarheten hos fish larver tillåter användningen av fluorescerande reportrar för att märka benceller och det förkalkade skelettmatrisen 8, 9, 12, 21, 23, vilket underlättar observation av cellulära processer i det levande djuret. Dessutom har en rad genetiska verktyg tagits fram för att underlätta biomedicinskt relevant forskning i fisk. För medaka i synnerhet metoder för riktad genmutationer av crispr / Cas9 2, cell härstamning spårning 6, och platsspecifika genmodifiering 14 har nyligen etablerats och är nu allmänt används 15.
Små teleost larver har med framgång använts för kemiska skärmar, som ledde till upptäckten av flera farmakologiskt relevanta läkemedel 1, 18.
Fisklarver är toleranta mot låga koncentrationer av DMSO och kan absorbera föreningar från deras vattenmiljön, antingen genom huden eller genom mag-tarmkanalen 1, 5. Vårt labb tidigare reported transgena medaka linjer som uttrycker fluorescerande reportrar i benceller under kontroll av olika osteoblast- och osteoklast specifika promotorer. Dessa inkluderar prematura osteoblaster (kollagen 10A1, col10a1, osterix, OSX) 20, 21, mogna osteoblaster (osteocalcin, OSC) 27, och osteoklaster (cathepsin K, ctsk) 24. Vi genererade också en transgen linje som uttrycker osteoklast-inducerande faktor Receptor Activator of Nuclear-faktor kB Ligand (RANKL) under kontroll av en värmechock-inducerbar promotor 24.
Induktion av RANKL i detta system resulterar i ektopisk bildandet av aktiva osteoklaster. Detta leder till ökad benresorption och en svår osteoporos liknande fenotyp, med drastiskt minskat mineralisering i de vertebrala kropparna. Vi visade nyligen att osteoklastaktivitet i denna modell kan blockeras av bisfosfonater etidronat och alendronat, two läkemedel som vanligen används inom humanosteoporosbehandling, vilket validera medaka som ett lämpligt modellsystem för benskörhet 27.
På grund av sin stora kull storlek, snabb utveckling, och liten storlek av embryon, transgena medaka larver är unikt lämpade för storskalig screening av benskörhet läkemedel och för analys av ben cellens beteende in vivo. Studier i medaka därmed kan effektivt komplettera experiment i cellkulturer och i möss som syftar till att upptäcka nya terapeutiska mål och nya terapier för mänskliga bensjukdomar.
I den aktuella studien beskriver vi ett protokoll för att behandla medaka ben reporter larver med den gemensamma osteoporos läkemedel, alendronat. Vi beskriver också i detalj hur Behandlade larver monteras och förbereds för levande avbildning av benvävnad och benceller. Dessa protokoll kan lätt anpassas till andra små kemiska föreningar som antingen arbete som ben anabola eller antiresorptiv droger. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med godkända Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) protokoll från National University of Singapore (R14-293).
1. Fisk Lantbruks och indrivning av embryon
- Höj WT, ctsk: nlGFP 24, RANKL: HSE: CFP 24 och osx: mCherry 21 enkel- eller förening-transgen medaka fisk vid 26 ° C under en kontrollerad ljuscykel (14 timmar ljus, 10 h mörker) för att inducera lek.
- Daglig lek äger rum under den första 30 min efter att ljuset slås på. Äggen hålla ihop genom trådar och fäster kvinnans buk under flera timmar. Använder ett finmaskigt nät för att fånga en kvinnlig vuxen som bär ett ägg kluster. Låt fisken vila kort i nätet och sedan massera fiskens buk att noggrant tömma det befruktade ägget klustret från buken av den kvinnliga.
OBS: En frisk medaka honakan producera 10 - 20 ägg varje dag under ca 5 månader. - Placera äggen i en 60 mm plastpetriskål. Använda en plast-pipett för att skölja embryona med 5-10 ml 0.3x Danieau lösning (fiskmedium; 19,3 mM NaCl, 0,23 mM KCl, 0,13 mM MgSO 4, 0,2 mM Ca (NO3) 2, och 1,7 mM HEPES, pH 7,0). Tillsätt 1 ml av en 0,25% (vikt / volym) metylenblått stamlösning till 2,5 L av fisk-medium för att förhindra svamptillväxt.
- Rulla försiktigt ägg kluster för att bilda en knut av fästtrådar. Använd pincett för att försiktigt ta bort fäst trådarna från det befruktade ägget kluster för att erhålla individuella embryon (figur 1A).
- Skede embryon enligt Iwamatsu 2004 13.
- Kultur 20 - 30 embryon per 60 mm plast petriskål i en 28 ° C inkubator. Ändra mediet dagligen för att säkerställa en normal utveckling av embryona.
OBS: Tiden runt kläckning stadiet (8-9 d postfertilization,DPF) är särskilt viktigt för överlevnad. Ta bort fritt flytande chorions att hålla mediet ren och att säkerställa goda larver överlevnad.
2. Transgen Embryo Screening
- Använd en stereomikroskop utrustad med en kvicksilverlampa för fluorescens avbildning och GFP, RFP och GFP filter för att screena transgena embryon för fluorescerande reporter uttryck med hjälp av 40X förstoring.
- Visuellt identifiera osx: mCherry embryon genom mCherry reporterexpression i den tidiga bildande skallbenen, såsom cleithrum, på båda sidor av den bakre huvudet (Figur 1B, pil), och parasphenoid, vid en central position i den ventrala kraniet ( Figur 1B, pilspets).
OBS: Reporter expression startar från 5 DPF och framåt 21. - Identifiera ctsk: nlGFP embryon genom stark nlGFP uttryck i huvudet (Figur 1C, pil) och svans (Figur 1C, pilspets), utgående från6 DPF.
OBS: Endogena osteoklaster endast bildas efter 21 DPF. nlGFP-uttryckande celler i detta tidiga skede (6 DPF) är inte osteoklaster men andra, hittills okaraktäriserat, ctsk -positiva celler 24. - Identifiera RANKL: HSE: GFP transgena embryon genom allestädes närvarande GFP uttryck efter en kort värmechockbehandling under 20 minuter vid 39 ° C, genomfördes vid två DPF eller senare för screening.
OBS: Den RANKL och GFP transgener är under kontroll av samma dubbelriktade Heat Shock Element (HSE). GFP uttryck indikerar framgångsrik RANKL induktion 24. - Utför en 1,5-2 h värmechockbehandling vid 9 DPF eller senare för att framkalla ett stort antal ektopiska osteoklaster i bagageområdet, vilket följaktligen resulterar i en osteoporos-liknande fenotyp 24.
OBS: Transgen RANKL uttryck induceras vid 9 DPF resulterar i en ektopisk aktivering av vilande osteoklaster progenitorceller, som endogent inte utlösesföre den 21 DPF. Använda ett vattenbad för att erhålla stabila 39 ° C förhållanden. Låt petriskål innehållande medaka embryon flyter på vattenytan. Se till locket på petriskål är torr för att förhindra sänkningen av skålen. - Skärm embryon från sammansatta linjer, såsom RANKL: HSE: GFP / ctsk: nlGFP dubbeltransgena och osx: mCherry / RANKL: HSE: GFP / ctsk: nlGFP triple-transgena, enligt uttrycket mönster av varje individuell transgenen.
OBS: hemizygot och homozygota transgena embryon kännetecknas av olika fluorescensnivåer reporter transgen. Homozygota embryon hade en fluorescensintensiteten som blev ungefär fördubblad jämfört med den hos hemizygot transgener. Sammansatta linjer som var homozygota för både RANKL: HSE: CFP och ctsk: nlGFP erhölls genom upprepad incrossing över flera generationer. För triple-transgen OSX: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP fisk, homozygot RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP fisk korsades med homozygot osx: mCherry bärare. Den resulterande heterozygot trippel transgen avkomma höjdes och incrossed att erhålla embryon homozygota för RANKL: HSE: GFP. Den RANKL: HSE: GFP transgen måste vara homozygot för att erhålla en effektiv induktion av ektopisk osteoklaster.
Figur 1: WT och transgena Medaka embryon vid 7 D Postfertilization (DPF). A. WT embryon observerades med bright belysning. B. Transgena embryon som visar OSX: mCherry uttryck runt cleithrum (pilen) och parasphenoid (pilspets). C. Transgena embryon visar ctsk: nlGFP uttryck i huvudet (pilen) och svans (pilspets). Skalstrecken: 500 ^ M.025 / 55025fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. bisfosfonatbehandling av Medaka Larver
- Bereds lösningar som innehåller olika koncentrationer av bisfosfonater (BP) för dosresponsstudier.
OBS: Den exemplifierande BP används i detta protokoll är alendronat.- Upplösa alendronat i fisk-medium vid en koncentration av 100 mikrogram / ml för att framställa en förrådslösning.
- Använda en vortexblandare för att säkerställa fullständig upplösning. Lagra förrådslösningen vid 4 ° C.
- Förbereda olika arbetslösningar genom att späda stamlösningen med fisk medium till en serie av koncentrationer (dvs., 25, 37,5, 50, 62,5 och 75 ug / ml).
OBS: Olika läkemedel kan ha olika absorption, distribution, metabolism och utsöndring (ADME) parametrar, som måste beaktas vid testning med denna medaka larver systemet. Dessutom kan läkemedlets löslighet och stabilitet variera närappliceras som en vattenhaltig lösning. Mindre vattenlösliga föreningar kan behöva först lösas i organiska lösningsmedel, såsom DMSO. I detta fall är en stamlösning framställd i DMSO, som därefter spädes ytterligare i fiskmedium. Observera att arbetslösningar i vatten (fisk medium) kan förvaras i kylskåp för flera wk. Dock måste lösningar innehållande DMSO förvaras vid RT för att förhindra kristallisation.
- Överförings medaka larver in i sex-brunnars plattor (sex larver / brunn) för efterföljande BP (alendronat) behandling.
- Ta bort fisken mediet försiktigt med en ren plast pipett och tillsätt en liten volym (ca. 0,5 ml) av alendronat lösning till varje brunn.
- Undvik överblivna fisk medium, som tillsätts BP lösning kan spädas, vilket är särskilt viktigt för mindre koncentrerade alendronat lösningar.
- Avlägsnande av en liten volym av alendronat-lösning (upp till 0,5 ml) från varje brunn med en ren plastpipett och ersätta den med en större VOLUmig (4 ml) av alendronat lösning.
- Ändra medel dagligen för att säkerställa normal embryon utveckling.
4. Live Färgning av Mineraliserad-benmatris
- Lös upp 0,5 g av Alizarin complexone (ALC; alizarin-3-metyliminodiättiksyra) eller 0,05 g av kalcein i 50 ml av fisk-medium för att framställa en% och 0,1% stamlösningar, respektive. Använda en vortexblandare för att säkerställa fullständig upplösning.
OBS: Fish medium utan tillsats av metylenblått användes i detta och de efterföljande stegen för att minska autofluorescens i larver. - Använd en spruta och engångsfilter (0,2 pm) för att filtrera färglösningen. Lagra den filtrerade lösningen i mörker vid RT.
OBS: Färgen på den filtrerade, klar ALC färgningslösning är mörkt gult till orange. Färgen på den filtrerade, klar kalcein lösning är ljust gul. Lösningar kan användas i flera månader. - Späd den filtrerade ALC eller calcein stamlösningen 1:10 i fisk medietoch inkubera medaka larver under 1,5 - 2 h (0,1% ALC lösning) eller 2 - 2,5 timmar (0,01% kalcein lösning) i en 28 ° C inkubator om larver mellan 9 och 17 DPF används. Förvara proverna i mörker.
- Överför larver till färsk fisk medium med användning av en ren plast pipett.
- Ta bort fisken medium med en ren plast pipett och tillsätt färsk fisk medium. Upprepa detta steg för 3 - 4 gånger tills ingen röd- eller gul-färgade lösningen (ALC eller calcein, respektive) är kvar. Låt larver i fisk medium för 30 - 60 minuter före montering dem för avbildning att undvika epifluorescence från mediet.
OBS: 0,1% ALC färglösningen är skadligt för medaka larver under längre exponeringstider. Inkubationstider av längre än 2 h påverka överlevnaden av larverna. Koncentration och färgning tid måste därför optimeras för olika steg för att uppnå optimala embryo överlevnad och färgningsresultat.
5. Levande Fluorescens Imaging p>
- Söva medaka larver med 0,01% Tricaine (etyl 3-aminobensoat-metansulfonat) i fisk medium.
OBS: sövda larver blir immobiliserade efter 5-10 minuter i Tricaine lösning och vanligtvis ligger antingen på sina sidor eller ryggen. - Använda en plast micro att orientera larverna enligt den region av intresse. Orienteringen av larverna som används i detta protokoll är i sidled.
- Använd en stereomikroskop med fluorescens belysning för avbildning. Använd hög förstoring när du tar bilder, med fokus på olika delar av larver (huvud, främre bagageutrymme, bakre bagageutrymmet, och svans). Sy enskilda bilder tillsammans på överlappande områden med hjälp av en lämplig bildbehandlingsprogram (inlägg i figur 3G).
OBS: Detta bidrar till att förbättra bildkvaliteten på alla relevanta kroppsdelar i rätt fokalplanet. - Återgå larverna till fisk medium för återhämtning efter avbildning.
- Söva larver med 0,01% Tricaine i fisk medium för 5-10 minuter tills de blir immobiliserade.
- Lös lågsmältande agaros till 1,5% i fiskmediet genom upphettning i en mikrovågsugn. Kyla denna lösning till ungefär 30 ° C.
- Lägga 0,5-1 ml vätska 1,5% lågsmältande agaros i fisk medium till en glasbottnad petriskål. Överför sövs larver i lösningen med hjälp av en ren plast pipett.
OBS: Var särskilt försiktighetsåtgärd att temperaturen hos den vätskeformiga lågsmältande agaros är tillräckligt låg för att inte skada den larver. - Innan agarosen stelnar, använda en plast micro att driva larverna till botten av petriskålen och orientera larverna enligt den region av intresse. Orienteringen av larverna som används i detta protokoll är i sidled.
OBS: Proverna är redo för konfokala Bildproduktion efter agarosen helt stelnar. - Använd ett konfokalmikroskop att ACQuire bilder.
- Använd en 543 nm laserlinjen för mCherry och ALC färgning analyser. Använd en 488 nm laserlinjen för nlGFP och kalcein färgning analyser.
- Efter bildbehandling, lägga fisk medium till petriskål och använda ett par fina kanyler (27 G x 1 ½ ") för att försiktigt ta bort larverna från agarosen. Överför larver med residualt fäst agaros till en petriskål med fisk medium för att återhämta sig .
- Bearbeta bilderna med hjälp av en mjukvara för bildanalys 27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rik ägg tal, liksom den lilla storleken av larverna, gör medaka en utmärkt modell för läkemedelsscreening. En enda sex-brunnsplatta användes för att kulturen upp till 36 larver, som var tillräcklig för att ge statistiskt signifikanta data. En annan stor fördel med att använda fisk för skelett analys är möjligheten att göra levande avbildning. Öppenheten i fisklarver tillåter användningen av fluorescerande proteiner för att märka benceller, liksom användningen av färgämnen som binder till benmatris för att visualisera mineralisering. Fisklarver är lätta att hantera, och provberedningen för avbildning är enkel (figur 2).
En RANKL: HSE: GFP / ctsk: nlGFP dubbel transgen linje användes för att visualisera den ektopiska bildningen av RANKL-inducerad osteoklaster. Dessutom osx: mCherry / RANKL: HSE: GFP / ctsk: nlGFP trippel-transgen larver användes för samtidig detekteringion av för tidigt födda osteoblaster och differentierade osteoklaster (Figur 3). Översikt bilder togs med ett stereomikroskop (Figur 3A - C och F - H), medan konfokalmikroskopi användes för att visualisera processer på cellnivå (Figur 3D, E, I, J pilspetsar). ALC-färgade benmatris längs de neurala valv (na) och centra (c) (Figur 3D) användes som en referens för att bestämma positionen för fluorescensmärkta benceller (figur 3D och I).
En fördel med att samtidigt visualisera osteoklaster och osteoblaster i samma intakt larver är att antiresorptiva vs ben anabola verksamhet en testad förening kan urskiljas. För detta är fördelningen av osteoklaster och osteoblaster bestäms längs befintlig och nybildade mineraliserad benmatris. Successive färgning av benvävnad med ALC (röd) (Figur 4A, B) följt av calcein (grön) (Figur 4C, D) avslöjar de novo mineraliserad benmatris (grön) (Figur 4E, F pilspetsar). Denna analys gör det möjligt för kvantifiering av hastigheten för benbildning. Ökade de novo priser efter läkemedelsbehandling tyder på ett ben-anabola effekten av den testade föreningen. Däremot kvarstår befintliga benvävnad pekar på en antiresorptiv aktivitet av läkemedlet 27. Både ALC och kalcein etiketter i larverna är stabila under minst två veckor, vilket gör att en ständig kontroll av ny benbildning i medaka larver in vivo.
Figur 2: Schematisk beskrivning av missbruksbehandling, Live ALC färgning och montering för Confocal Live Imaging. A. En sex-brunnaranvänds för läkemedelsbehandling för att säkerställa tillräckligt utrymme för larverna. Matrisen mineraliserade-bone färgas genom inkubation medaka larver i 0,1% ALC 1,5 - 2 timmar i mörker. Målat larver sköljs flera gånger med fisk medium. 0,01% Tricaine används för att söva larver. B. Efter överföringen av sövda larver till ljumma och vätska 1,5% lågsmältande agaros, är deras position justeras med en plastmicro. Larverna är sedan monteras enligt regionen av intresse (t.ex., är ryggradsdjuret kolumnen bäst avbildas i sidovy). Efter agarosen har stelnat, är det monterade provet redo för konfokal avbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:
Figur 4: Analys av De Novo mineralisering av benvävnad genom successiv Färgning av larver med ALC och kalcein vid 12 och 15 DPF, Respektive. A, B. ALC-färgade skelett matris på 12 DPF. C, D. Kalcein-färgade skelett matris på 15 DPF i samma larver. E, F. Sammanslagna bilden som visar den nyligen mineraseras benmatris på spetsarna av neurala valv (grön, pilar). B, D och F. Konfokal stapel av området boxed i A, C och E, respektive. Skalstrecken i A, C och E: 100 | im. Skalstrecken i B, D och F: 50 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa bilder som visar ett misslyckat och en framgångsrik Montering för Confocal Imaging. AC. Misslyckat montering i lågsmältande agaros resulterar i en del av provet (till vänster), som ligger utanför fokalplanet. DF. Framgångsrika montering visar alla regions av intresse i samma fokalplan. Skalstrecken: 50 ^ M. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Alendronate behandling förebygger benresorption. ALC-färgade skelettmatris och ctsk: nlGFP-uttryck osteoklaster i transgen medaka larver utan RANKL induktion (AC), med värmechockframkallad RANKL expression (DF), och med tillägg av alendronat på samma dag som RANKL induktion (GI) . C, F och I. Konfokala staplar av de områden boxed i A och B, D och E, G och H, respektive.C. ALC-färgade intakta ryggraden utan RANKL induktion. F. RANKL-inducerad, ctsk -uttryckande osteoklaster formen runt de neurala husen och de centra, vilket resulterar i den fullständiga resorption av mineraliserad matrix av de neurala bågar (pilar) och i defekter till centra (pilhuvuden). G. Tillsatsen av alendronat har ingen effekt på bildningen av ctsk: nlGFP-uttryck osteoklaster, men det blockerar benresorption och lämnar de neurala valv och den centra intakt. Skalstrecken i A, B, D, E, G och H: 100 | j, m. Skala barer i C, F och I: 50 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i protokollet
Det är väsentligt att villkoren för värmechockbehandling är konsekvent och stabil vid jämförelse mellan olika prover. Stabila temperaturförhållanden garanterar liknande nivåer av RANKL-induktion i den transgena larver och följaktligen jämförbar osteoklastbildning, vilket kan bekräftas genom screening med avseende ctsk: nlGFP uttryck. I slutändan leder detta till en liknande grad av inducerad ektopisk benresorption och osteoporos liknande lesioner, som godkänts av ALC färgning. En sådan experimentell design tillåter sedan för bestämning och jämförelse av effekterna av olika antiresorptiva läkemedel eller samma läkemedel appliceras vid olika koncentrationer.
Ändringar och felsökning
Fisklarver är mycket bräcklig och måste hanteras varsamt under monteringsprocessen för avbildning. För optimal levande konfokal avbildning, larver är noga positioned med en plast micro, snarare än pincett, för att undvika skador (figur 2b). Äggulan förlängning är mindre känslig för beröring stimuli och kan användas för att orientera larverna med en micro och därigenom undvika larver rörelse under montering. Regionen intresse bör monterad platt för att säkerställa att provet kan fokuseras på ett fokalplan under avbildning (Figur 5). Bone cellens beteende är mycket dynamisk och kräver hög tids- och rumsupplösning under live-avbildning. Optimalt är tidsförlopp avbildning av konfokala analys önskvärt att följa osteoblastliknande osteoklaster interaktioner under loppet av flera timmar i vardags larver. Men kräver detta särskilda villkor för att hålla larver levande och i ett fast läge. För långvarig anestesi, är en lösning av 0,001% Tricaine i fisk-medium tillsätts för att täcka den stelnade agarosen under avbildning. Detta förhindrar agarosen från att torka ut och förhindrar plötsliga ryckningar av larverna under imaging under flera timmar.
Begränsningar av tekniken
Osteoporos är en sjukdom som främst drabbar äldre människor. Därför bör en ideal in vivo modell för osteoporos läkemedelsscreening innebär vuxen fisk. Hittills har emellertid tekniken med levande avbildning som beskrivs i denna rapport begränsad till de embryonala och larvstadier. För närvarande finns konfokal avbildning inte tillåter levande avbildning av genetiskt märkta benceller i vuxen fisk på grund av begränsningar i penetrationsdjupet. Den senaste tidens utveckling av ljus Sheet fluorescensmikroskopi (LSFM), vilket möjliggör avbildning djupt in levande vävnad, tillsammans med tillgången på mindre pigmente "se igenom" medaka stammar, gör det möjligt att denna begränsning snart kommer att övervinnas, och levande avbildning av benceller i vuxen medaka fisk efter läkemedelsscreening kommer att vara möjligt.
Betydelsen av teknik avseende befintliga / Alternative Metoder
En unik kombination av levande avbildning och avancerade genetiska verktyg har gjort små teleost fisk populär för biomedicinsk forskning - ben forskning i synnerhet - och in vivo-modeller för läkemedelsscreening. Med möjlighet att analysera cell-cell interaktioner inom en intakt organism, transgena medaka linjer är unikt lämpade för levande avbildning av dynamiska cellulära processer under ben modellering och ombyggnad. Eftersom de delar många gen reglerande nätverk för att styra benhomeostas med däggdjur, in vivo-studier i medaka kan komplettera och med överträffa in vitro studier med däggdjurs osteoblaster och osteoklast cellkulturanalyser.
Framtida tillämpningar eller riktningar efter behärska denna teknik
Annat än att testa enskilda föreningar i en transgen bakgrund, som beskrivs i detta protokoll, fisk erbjuder också enkla metoder för att undersöka kombinationer av various läkemedel för eventuella synergieffekter eller störningar av föreningar. Vidare har användningen av en kombination av olika reporter linjer, till exempel, inom ramen för en viss mutant bakgrund, ger goda möjligheter att studera beteendet hos benceller under olika skeden av ben degeneration och reparation, eller i närvaro av ett ben -modulating drog. Med sina unika egenskaper som kompletterar mus analyser ger medaka benskörhet modellen ett utmärkt in vivo metod för att testa och kvantifiera anabola och antiresorptiv effekter av nya ben modulerande föreningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande eller ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta projekt har finansierats med bidrag från Singapore undervisningsministeriet (MOE, licensnummer 2013-T2-2-126) och National Institute of Health, USA (NIH bevilja nummer 1R21AT008452-01A1). TY fick en examen stipendium från NUS Department of Biological Sciences. Vi tackar konfokala enhet NUS Centre for Bioimaging Sciences (CBIS) för deras ständiga stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alendronate | Sigma | A4978 | |
| alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
| LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
| Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μL |
| NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
| Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
| SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |
References
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).
- Ansai, S., Kinoshita, M. Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka. Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).
- Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research. Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).
- Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis. Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).
- Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina. Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).
- Charles, J. F., Aliprantis, A. O. Osteoclasts: more than 'bone eaters. Trends Mol Med. 20 (8), 449-459 (2014).
- DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).
- Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein. Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).
- Eriksen, E. F. Cellular mechanisms of bone remodeling. Rev Endocr Metab Disord. 11 (4), 219-227 (2010).
- Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
- Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish. Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).
- Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase. Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).
- Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes). Genetics. 199 (4), 905-918 (2015).
- Komori, T. Animal models for osteoporosis. Eur J Pharmacol. 759, 287-294 (2015).
- Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. A bone to pick with zebrafish. Bonekey Rep. 2, 445 (2013).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
- Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization. Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).
- Renn, J., Winkler, C. Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation. Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model. Development. 139 (1), 141-150 (2012).
- Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).
- Witten, P. E., Huysseune, A. A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function. Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).
- Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model. Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).
