דיסקציה תצפית של כלי דבש דבורים הגבי ללימודים של תפקוד הלב

Introduction

המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא לאפשר לחוקר במהירות ובקלות להתבונן לכמת את ההשפעה כי סוכן תרופתי יש על קצב הלב של דבורי דבש. דבורים, כמו חרקים אחרים, יש מערכת דם פתוחה מפיצת hemolymph, מקבילת החרק של דם, בכל חלל הגוף, המכונה hemocoel. תפוצתו של hemolymph חיוני להובלת חומרים מזינים, גורמי החיסון, פסולת, כמו גם neurohormones ומולקולות איתות אחרות ^1. מחזור הוא הקל על ידי כלי הגבי, המשתרע לאורך קו האמצע הגבי של חרקים, כמו גם איברים pulsatile אביזר. הכלי הגבה מחולק לשני חלקים נפרדים מבחינה תפקודית, המיועד בלב בבטן ואת אבי העורקים בבית החזה והראש. התכווצויות מופצות ב hemolymph משאבת הלב לכיוון החזה והראש, בעוד איברים pulsatile אביזר להבטיח זרימת hemolymph בגפיים.

ניתן לצפות class = "jove_content"> תפקוד לב חרקים באמצעות מגוון של שיטות, בהתאם לשלב הגודל, פיזיולוגיה, או חיים של החרק. גישה משותפת התבוננות קצב לב זחלים או חרקים קטנים היא השימוש הדמית intravital ^2. שיטה זו היא פחות שימושית דבורים בוגרים, אולם, כפי שהוא יכול להיות קשה כדי להציג כלי הגבה בבירור דרך דופן הבטן. גישה הוקמה להקלטת קצב לב במגוון חרקים, דבורים כלל, היא השימוש של תרמוגרפיה קשר, אשר מנצלת תרמיסטורים להחיל את החלק החיצוני של החרקים כדי לזהות פעימות לב ^3,4. קצב לב דבורים בוגרות גם נרשם באמצעות טכניקה אלקטרו למדוד ^4,5 אות עכבה חשמלית. טכניקה זו דורשת החדרה של אלקטרודות לתוך החיה ליד הלב ושימוש ממיר עכבה להקליט פעימות ^4. באופן דומה, אק"ג שמש detect אותות חשמליים המיוצרים על ידי הלב בשילוב עם הקלטת וידאו של הדבורה לצפות לשינויים בפעילות הלב ^6. יתרון בולט לגישות אלה הוא כי קצב לב נבחן דבורה שלמה, חייה, ולא בתוך דגימה גזורה, אשר מסייעת להבטיח את הזמינות של המגוון הרחב של תגובות פיסיולוגיות בנושא. האתגרים של גישות אלה כוללים חשבונאי קיבוע או הרדמה של הנושא, את הצורך להגביל משתנה גירויים חיצוניים שעשויים לשנות את קצב לב, כמו גם קביעת שיטת הצגה מתאימה כאשר בודקים סוכנים תרופתיים.

גישה נוספת, שבו נעשה שימוש ללימוד פעילות דבורת לב היא לנתח את החרק חלקית כדי לחשוף את הלב, אז למדוד התכווצויות כלי הגבו באמצעות מתמר עקירה בכוח ^7. בפרוטוקול זה, בלב טובל הרף עם תמיסת מלח פיזיולוגית ריצה ושיתוף מבחןmpounds יכול להיות מומס פתרון זה עבור יישום לנושא ^7. הבדל משמעותי בין שיטה זו לבין אלה שתוארו לעיל הוא כי חוט עצב הגחון מוסר, ומבטל את התפקיד שמערכת העצבים המרכזית הוכחה לשחק ויסות קצב לב ^5. התוצאה היא כי דופק הבסיס, שהיא בדרך כלל די יציבה, מייצב בתדר נמוך בהרבה משרעת מ הוא ציין בדרך כלל חרק חי ^5,7. מה כל אחת מהשיטות הללו יש מכנה משותף הוא שהם דורשים ציוד מיוחד מאוד ולעתים קרובות יקר, בנוסף לרמה מסוימת של מומחיות, כדי להתנהל. אולי החסרון הגדול הוא שאף אחד גישות אלו גם מתאימים במיוחד לניסויים כרוכים בדיקה של מספר רב של נושאים, כגון הקרנת ספרייה של תרכובות cardiomodulatory הפוטנציאלי.

נקודת הכח החזק ביותר של הגישה המתוארת כאןהפשטות היא שלה. הפרוטוקול הוא יחסית קל לשלוט, ההתקנה דורשת שטח קטן, ורק קלט פיננסי מינימלי הכרחי. השיטה מחייבת קצת יותר דבורים כמה, כמה מכשירי ניתוח, פתרון איזוטוני, ואו מיקרוסקופ דיגיטלי או מיקרוסקופ מסורתי עם מצלמה דיגיטלית. דבורים הם גזורים לדמיין כלי הגבה וסרטי וידאו דיגיטלי משמשים כדי להקליט קצב לב לפני ואחרי טיפול עם סוכנים תרופתיים. למרות הקלטת וידאו הוא לא באמת הכרחי כדי לצפות לשינויים בקצב הלב, זה יגביר את התפוקה באופן משמעותי (כלומר, מספר הנבדקים כי ניתן לעבד כמות של זמן נתון). החוקר יכול למקסם את היעילות על ידי הקלטת מספר רב של קטעי וידאו בו-זמנית ולאחר מכן מאוחר יותר הבקיע את סרטי הווידאו האלה בזמן שנוח יותר. יתרון נוסף של גישה זו הוא כי קטעי וידאו לאפשר החוקר להתחיל מחדש, צריך תהליך הניקוד יופרע, ולהקל על נiewer לדעת מה הם מקבלים את הטיפול על מנת לצמצם הטיה.

Protocol

איסוף 1. הכנת הנבדקים מבחן

1. אסוף את המספר המתאים של דבורים מהמושבה.
   הערה: המספר הדרוש תלוי לא רק את הגודל וההיקף של הניסוי, אלא גם את המיומנות של החוקר. לדוגמא, אם יש 2 קבוצות טיפול עם גודל מדגם רצוי של 10 דבורים לכל קבוצה, חוקר מיומן סביר עשוי לאסוף לפחות 30 דבורים לתת דין וחשבון על וניתוחים מוצלחים בסופו של דבר עם 20 קטעי וידאו שימושיים להבקיע.
2. יקטין את כמות הזמן שעובר בין איסוף לנתיחה.
   הערה: למרות דבורים ניתן שוכן במעבדה במשך ימים לפני לנתיחה, שיעור ההצלחה של וניתוחים (כלומר, הסיכוי של שמירה על קצב לב יציב בתוך כלי הגבה גזור) נצפה ירידה ביחס לכמות זמן דבורים שוכנות במרחק מהמושבה.
   1. ספק דבורים עם מקור מים ומזון תוך שוכן במעבדה. עבור EXAmple, לכל הפחות, לספק גישה 50% (w / v) של סוכרוז במים (זה מספיק עבור משכי זמן של פחות מ -6 שעות). לפרקי זמן ארוכים יותר, לספק דבורים לגשת לדבש.
   2. דבורי הבית למשך הלילה במעבדה בטמפרטורה של כ -32 מעלות צלזיוס, 60-80% לחות יחסית כדי להפחית את הלחץ ולמנוע התייבשות.
3. לפני לנתיחה, להרדים דבורים בקצרה כדי לסייע בטיפול.
   הערה: זה יכול להפחית את שיעור ההצלחה של וניתוחים ולצמצם תפוקה.
   1. צ'יל הדבורים או על ידי הצבת אותם על הקרח או לתוך מקרר ובמשך מספיק זמן כדי להפחית התנועה על מנת לסייע בטיפול.
   2. לחלופין, לחשוף דבורים בקצרה CO ₂ על מנת לסייע בטיפול.
      הערה: חשיפה ממושכת לקור יכולה להפחית את השיעור וניתוחי ההצלחה. Extended או חשיפה חוזרת כדי CO ₂ יכול גם להפחית את שיעור ההצלחה של וניתוחים.

2. Dissectionהגבה בטן קיר

הערה: דבורים צריכים להיות בחיים בזמן הניתוח.

1. בעזרת מלקחיים ו / או מספרי microdissection, להסיר רגליים וכנפיים כדי להקל דיסקציה של הבטן. שמור מבחנה קטנה או מכל דומה מלא מים מזוקקים הסמוכים לצורך שטיפת מכשירים בין וניתוחים.
2. בעוד הרחקת הדבורה עם מלקחיים, לנצל את מספרי microdissection לחתוך רוחבי לאורך דופן הבטן מגבה בין tergites הראשון והשני (ראה איור 1).

איור 1: תצוגת הגבי של בטן דבורה. החתך הראשוני צריך להתבצע בין tergites הראשון והשני, כמו כונה על ידי הקו האדום. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ אותהדואר כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. בעוד בקלילות ונאחזת בזיז האחורי של tergite השני עם מלקחיים, לחתוך longitudinally לאורך כל צד של הדבורה מן החתך הראשוני על העוקץ (ראה איור 2). היזהר בעת החיתוך כדי למנוע ניקוב מערכת העיכול.

איור 2: נוף צדדי של בטן דבורה. החתכים השניים ושלישיים צריכים להיעשות משני צדי הבטן, כמו כונו על ידי הקו האדום. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

4. להחליף את המספריים עבור סט שני של מלקחיים בסדר לנצל אותם כדי להפריד את דופן הבטן הגב בזהירות משאר of הבטן. הוצא בעדינות את העוקץ וכל חלק של מערכת העיכול כי נשאר מחוברת דופן בטן הגב. הימנע פקיעת במעיים, כמו תוכן יכול לצפות את דופן הבטן ואת לעכב הדמיה של כלי הגבי.

איור 3: מראה כללי של כלי הגבה. לאחר במעיים העוקצים הוסרו, הכלי הגבה גלוי לאורך קו האמצע של דופן הבטן מגבה הגזורה. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

5. מסדר את דופן הבטן גב בכיוון הרצוי מתחת המצלמה כך הכלי הגבה גלוי (ראה איור 3). לנצל את מספרי microdissection לקצץ משם כל עודף abקיר dominal כי מעכב להדמיה של הכלי הגבה. הצורה של דופן בטן הגב צריכה להיות דומה כוס או קערה רדודה כאשר ממוקם כראוי.
   1. מאז הכלי הגבה לא להאריך לתוך קטע הבטן האחורי ביותר של הדבורה, להסיר את tergite הסופי על מנת לשפר להדמיה של הכלי הגבה.
6. ניצול micropipette נפח מתכווננת, לכסות כלי הגבה עם 10 μl של פתרון איזוטוני כדי לשמור על תנאים פיסיולוגיים להקל דופק יציב.
   הערה: הפתרון המומלץ הוא רבע כוח בתמיסת רינגר (0.120 g / L סידן כלורי, 0.105 g / L אשלגן כלורי, 0.050 g / L סודיום ביקרבונט, ו 2.250 g / L נתרן כלורי), אשר כבר נמצא כדי להקל על יציבות, דופק רציף.

תצפית אפנון 3. Heart Rate

1. אפשר הכלי מגבה לשבת באין מפריע עד פעימה יציבה ורציפה מושגת(בדרך כלל תוך 300 שניות).
   הערה: Heartbeat היא דמיינה כמו התכווצויות קצובות של הכלי הגבה. בתחילה, ייתכנו נראה כי אין דופק, במיוחד אם הדבורה מורדמת, אבל הלב בדרך כלל יתחדש מכות אחרי מנוחה בתמיסה איזוטונית במשך כמה דקות והוא יכול להמשיך לפעום למשך שעות, בתנאי שהוא נשאר שטוף פתרון.
2. מדדו את קצב הלב במונחים של מספר פעימות לדקה (BPM).
   1. רשום את מספר הצירים שנצפו במהלך תקופה של 60 שניות. השתמש מונה נקודות יד טיימר כדי להקל על תהליך.
3. מודדים את השתנות קצב הלב על ידי הקלטה והנצפה BPM לפני ואחרי הטיפול עם תרכובת cardiomodulatory.
   הערה: למרות הזמן נדרש במציאת השפעה על קצב לב עשוי להשתנות בהתאם למתחם נבדק, שינויים בקצב לב ניתן לבצע בדרך כלל נצפו בתוך דקות.
   1. לקבוע את קצב לב הבסיס ערבהתוספת של כל מתחם בדיקה.
      הערה: קצב הלב לאחר הטיפול ניתן בדרך כלל ייקבע לאחר 90 עד 120 שניות.
   2. כן cardiomodulators פוטנציאל (למשל, octopamine) על ידי המסה במתחם באותו הפתרון איזוטוני נהג להתרחץ כלי הגבה.
   3. מוסיף את תרכובות בדיקה לפתרון המקיף הכלי הגבה על ידי ניצול micropipetter.
4. לקבלת דיוק רב יותר ותפוקה גבוהה יותר, לבצע הקלטת וידאו של כל נושא בדיקה ולאחר מכן להשתמש קטעי הווידאו כדי לצבור קצב לב במועד מאוחר יותר.
   הערה: פעולה זו מאפשרת חוקר יחיד מתנודד וניתוחים על מנת להקל כמעט לייצור רציף של קטעי וידאו. בעת הקלטת סרטוני וידאו, אורך המינימום המומלץ הוא כ 240 שניות עם כל תרכובת מבחן להתווסף ב סימן 60 שניות. הדבר מבטיח כי החוקר יש חלון 60 שניות בקיע קצב לב מחקר ולאחר מכן עוד 60 חלון שניות בקיע קצב לב שלאחר טיפול 120 שניותאחרי טיפול.

Representative Results

מאחר ורבים מן הרכיבים פעילים מהבחינה פרמקולוגית שעשויים להיבדק באמצעות פרוטוקול זה אינם מסיסים במים, זה הכרחי כדי לקבל ממס אמין שיאפשר תרכובות בדיקה תועברנה באמצעות הפתרון איזוטוני נהג להתרחץ כלי הגבה. Sulfoxide דימתיל (DMSO) הוא חומר ממיס כי הוא נפוץ כמו רכב להובלת תרופות ניסיוניות ותרכובות אחרות חיות ^8, וזה נוצל בהצלחה למטרה זו במחקרים הבודקים את השפעת חומרי הדברה על פעילות הלב דבורת הדבש ^9. כתוצאה מכך, DMSO נבחרה כרכב פוטנציאל לאספקת תרכובות בדיקה כדי כלי הגבי, אשר נדרש שזה ראשון להיבדק לפעילות cardiomodulatory. בפרוטוקול זה, הכלי הגבה גזור בתחילה טובל 10 μl של הפתרון של רבעון כוח רינגר ואז קצב לב נקבע לפני הוספת תרכובות בדיקה. תרכובות מבחן arדואר נמסר בריכוז ידוע ב 10 μl של DMSO מומס כוח ברבעון בתמיסת רינגר ולאחר מכן כלי הגבי הוא ציין לשינויים הבאים בקצב הלב.

לפני בדיקת כל תרכובות, מגוון ריכוז DMSO נבדק עבור כל השפעה על קצב הלב, ביחס לרבעון כוח בתמיסת רינגר עם 0% DMSO. DMSO פורק ב 0.2%, 2%, 10%, ו -20% v / v בחוזק ברבעון בתמיסת רינגר כדי לבדוק ריכוז סופי של 0.1%, 1%, 5%, ו -10% כאשר הוסיף בנפח שווה כבר הפתרון רחץ כלי הגבה. גישה זו שמשה, בניגוד הוספת DMSO בריכוז הרצוי ב 10 μl הראשוני נהג לרחוץ כלי הגבי, כי לא כל לנתיחה מניבה דופק יציב. אם DMSO יש השפעה שלילית על קצב לב, את האפקט הזה אולי לא יהיה להבחין ביניהם לנתיחה נכשלה. קצב לב הוערך ערבהוספת DMSO, ולאחר מכן שוב 120 שניות מאוחר יותר. איור 4 מראה את התוצאות של הניסוי הזה, הוכחה כי 0.1% ו -1% DMSO בתמיסה לא היה השפעה משמעותית על קצב לב, ביחס לחוסנה ברבעון בתמיסת רינגר ללא DMSO, ואילו 5% ו -10% DMSO משמעותיים ירד קצב לב.

איור 4: השפעת DMSO על קצב לב דבורה. גרף המציג את אחוז השינוי בקצב הלב הבסיסי, כפי שהיא נמדדת פעימות לדקה. טיפול של כלי הגבי דבורת הדבש עם 0.1% או 1% DMSO v / v ברבעון כוח רינגר של הפתרון אינו משמעותי להגדיל או להקטין את קצב הלב, ביחס לרבעון כוח בתמיסת רינגר ללא DMSO. טיפול עם 5% או 10% DMSO בתמיסה גורמת לירידה משמעותית בקצב הלב. תוצאות המבוטאות ממוצעות ± SEM (n = 10). * P <0.05 לעומת 0% שליטה DMSO (Kruskal-Wallis לבדוק עם מבחן ההשוואות המרובה של דאן). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

על מנת assay זה להיות רלוונטי, הוא חייב להיות אפשרי לצפות לשינויים בקצב הלב בעקבות טיפול עם תרכובות cardiomodulatory. Octopamine אמין ביוגני ידוע לשמש neuromodulator ב חסרי חוליות ¹⁰ ו הוכח לשמש cardioaccelerant בשני זבובי פירות ¹¹ ודבש דבורים ^7. Octopamine נבדק נגד רכב (DMSO 1% ברבעון כוח בתמיסת רינגר) כמתואר לעיל בריכוזים של 100 ננומטר, 10 מיקרומטר, ו -100 מיקרומטר. איור 5 מראה את התוצאות של הניסוי הזה, הוכחה כי 10 מיקרומטר ו -100 מיקרומטר ריכוזיים octopamine גדלו באופן משמעותי את קצב לב.

t "FO: keep-together.within-page =" 1 ">
איור 5: השפעת octopamine על קצב לב דבורה. גרף המציג את אחוז השינוי בקצב הלב הבסיסי, כפי שהיא נמדדת פעימות לדקה. טיפול של כלי מגבה דבורת דבש עם octopamine 100 ננומטר אינו מגדיל באופן משמעותי או להקטין ביחס קצב לב לרכב (1% DMSO V / V כוח ברבעון בתמיסת רינגר). טיפול עם 10 מיקרומטר ו -100 octopamine מיקרומטר גדל באופן משמעותי ביחס קצב לב לרכב. תוצאות המבוטאות ממוצעות ± SEM (n = 10). * P <0.05 לעומת שליטה ברכב (Kruskal-Wallis הבדיקה עם בדיקה להשוואות מרובות של דאן). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments