Introduction
इस पद्धति के समग्र लक्ष्य के अन्वेषक जल्दी और आसानी से पालन और प्रभाव एक औषधीय एजेंट मधु मक्खियों के दिल की दर पर है कि यों करने की अनुमति है। मधुमक्खियों, अन्य कीड़ों की तरह, एक खुला संचार प्रणाली है कि hemolymph, खून की कीट बराबर प्रसार, शरीर गुहा, hemocoel के रूप में जाना भर है। Hemolymph का प्रचलन पोषक तत्वों, प्रतिरक्षा कारकों, अपशिष्ट उत्पादों, साथ ही neurohormones और अन्य संकेतन अणुओं 1 के परिवहन के लिए आवश्यक है। सर्कुलेशन पृष्ठीय जहाज है, जो कीट के पृष्ठीय midline, साथ ही गौण गुणवाला अंगों के साथ फैली से मदद की है। पृष्ठीय पोत, दो कार्यात्मक अलग वर्गों में बांटा गया है पेट में दिल और छाती और सिर में महाधमनी नामित। छाती और सिर की ओर हृदय पंप hemolymph में प्रचारित संकुचन, सहायक गुणवाला अंगों पांव को hemolymph प्रवाह को सुनिश्चित करते हुए।
एक और दृष्टिकोण है कि मधुमक्खी के हृदय की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है आंशिक रूप से आदेश दिल को बेनकाब करने के लिए, तो उपाय के एक बल विस्थापन ट्रांसड्यूसर 7 का उपयोग कर पृष्ठीय पोत संकुचन में कीट टुकड़े करना है। इस प्रोटोकॉल में, दिल लगातार चल रहे शारीरिक खारा और परीक्षण सह के साथ नहाया हैmpounds विषय से 7 आवेदन के लिए इस समाधान में भंग किया जा सकता है। इस विधि और उन पहले से वर्णित के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर यह है कि उदर तंत्रिका कॉर्ड निकाल दिया जाता है, भूमिका है कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र दिल की दर 5 नियमन में खेलने के लिए दिखाया गया है को नष्ट करने के लिए है। नतीजा यह है कि आधारभूत दिल की धड़कन है, जो आम तौर पर काफी अनिश्चित है, एक बहुत कम आवृत्ति पर स्थिर है और आयाम की तुलना में आम तौर पर रहने वाले एक कीट 5,7 में मनाया जाता है। क्या इन तरीकों के सभी आम में है कि वे अति विशिष्ट और अक्सर महंगे उपकरण की आवश्यकता होती है, विशेषज्ञता का एक निश्चित स्तर के अलावा, क्रम में आयोजित किया जा रहा है। शायद सबसे बड़ा नुकसान यह है कि इन तरीकों में से कोई भी विशेष रूप से अच्छी प्रयोगों है कि इस तरह के संभावित cardiomodulatory यौगिकों के एक पुस्तकालय स्क्रीनिंग के रूप में विषयों की एक बड़ी संख्या में शामिल परीक्षण, के लिए अनुकूल हैं है।
यहाँ वर्णित दृष्टिकोण की सबसे बड़ी ताकतअपनी सादगी है। प्रोटोकॉल, मास्टर करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है सेटअप कम जगह की आवश्यकता है, और केवल एक न्यूनतम वित्तीय इनपुट आवश्यक है। विधि कुछ मधुमक्खियों, कुछ शल्य चिकित्सा उपकरणों, एक isotonic समाधान की तुलना में थोड़ा अधिक है और आवश्यकता है, या तो एक डिजिटल माइक्रोस्कोप या एक डिजिटल कैमरे के साथ एक पारंपरिक माइक्रोस्कोप। मधुमक्खियों पृष्ठीय पोत कल्पना करने के लिए विच्छेदित कर रहे हैं और डिजिटल वीडियो से पहले और औषधीय एजेंटों के साथ इलाज के बाद हृदय की दर को रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। हालांकि वीडियो रिकॉर्डिंग नहीं वास्तव में दिल की दर में परिवर्तन का पालन करने के लिए आवश्यक है, यह बहुत throughput में वृद्धि होगी (यानी, विषय है कि समय की दी गई राशि में कार्रवाई की जा सकती की संख्या)। अन्वेषक एक बार में वीडियो की एक बड़ी संख्या में रिकॉर्डिंग और फिर बाद में एक और अधिक सुविधाजनक समय पर इन वीडियो स्कोरिंग द्वारा क्षमता को अधिकतम कर सकते हैं। इस दृष्टिकोण का एक अन्य लाभ यह है कि वीडियो अन्वेषक अधिक शुरू, स्कोरिंग प्रक्रिया बाधित किया जाना चाहिए, और यह V के लिए आसान बनाने के लिए अनुमति हैiewer आदेश पूर्वाग्रह को कम करने के उपचार के लिए अंधा हो जाना है।
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Protocol
1. संग्रह और परीक्षण विषयों की तैयारी
- कॉलोनी से मधुमक्खियों की उपयुक्त संख्या ले लीजिए।
ध्यान दें: संख्या की जरूरत न केवल आकार और प्रयोग की गुंजाइश है, लेकिन यह भी अन्वेषक के कौशल पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, अगर वहाँ समूह प्रति 10 मधुमक्खियों का एक वांछित नमूना आकार के साथ 2 उपचार समूह हैं, एक हद तक कुशल अन्वेषक कम से कम 30 मधुमक्खियों असफल विच्छेदन के लिए खाते और स्कोर करने के लिए 20 उपयोगी वीडियो के साथ खत्म करने के लिए इकट्ठा हो सकता है। - समय है कि संग्रह और विच्छेदन के बीच से गुजरता है की मात्रा को कम।
नोट: मधुमक्खियों दिनों विच्छेदन के लिए पहले के लिए प्रयोगशाला में रखे जा सकते हैं, यद्यपि विच्छेदन की सफलता की दर (यानी, एक विच्छेदित पृष्ठीय पोत में एक स्थिर हृदय की दर को बनाए रखने की संभावना को) समय की राशि के सापेक्ष कम करने के लिए देखा गया है कि मधुमक्खियों की कॉलोनी से दूर रखे जाते हैं।- जबकि प्रयोगशाला में रखे पानी और भोजन के स्रोत के साथ मधुमक्खियों प्रदान करें। EXA के लिएmple, कम से कम, (इस कम से कम 6 घंटे की अवधि के लिए पर्याप्त है) एक 50% (w / v) पानी में सुक्रोज का समाधान करने के लिए पहुँच प्रदान करते हैं। लंबी अवधि के लिए, मधुमक्खी शहद के लिए पहुँच प्रदान करते हैं।
- लगभग 32 डिग्री सेल्सियस और 60-80% सापेक्ष आर्द्रता के तापमान पर प्रयोगशाला में रात भर सदन मधुमक्खियों तनाव कम करने और निर्जलीकरण से बचने के लिए।
- विच्छेदन के लिए पहले, से निपटने में सहायता करने के लिए संक्षेप में मधुमक्खियों anesthetize।
नोट: इस विच्छेदन की सफलता की दर कम होती है और throughput को कम कर सकते हैं।- या तो बर्फ पर उन्हें रखने के द्वारा या अभी काफी लंबा आदेश से निपटने में सहायता करने में आंदोलन को कम करने के लिए एक रेफ्रिजरेटर में मधुमक्खियों टेंशन मत लो।
- वैकल्पिक रूप से, संक्षेप में आदेश से निपटने में सहायता करने में सीओ 2 के लिए मधुमक्खियों को बेनकाब।
नोट: ठंड के लिए बढ़ा जोखिम विच्छेदन की सफलता की दर को कम कर सकते हैं। विस्तारित या सीओ 2 के लिए जोखिम दोहराया भी विच्छेदन की सफलता की दर को कम कर सकते हैं।
2. विच्छेदनपृष्ठीय पेट की दीवार की
नोट: मधुमक्खियों का विच्छेदन के समय में जिंदा होना चाहिए।
- संदंश और / या microdissection कैंची, पैरों को हटाने और पंखों का उपयोग पेट के विच्छेदन की सुविधा के लिए। एक छोटे से बीकर या इसी तरह के कंटेनर विच्छेदन के बीच उपकरणों rinsing के प्रयोजन के लिए पास के आसुत जल से भरा रखें।
- संदंश के साथ मधुमक्खी निरोधक जबकि, पहले और दूसरे tergites के बीच पृष्ठीय पेट की दीवार के साथ laterally कटौती करने के लिए microdissection कैंची का उपयोग (चित्रा 1 देखें)।
चित्रा 1: मधुमक्खी पेट के पृष्ठीय देखें। के रूप में लाल रेखा से चिह्नित प्रारंभिक चीरा, पहली और दूसरी tergites के बीच किया जाना चाहिए। स्केल बार = 1 मिमी। उसकी क्लिक करेंई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।
- जबकि हल्के संदंश के साथ दूसरे tergite के पीछे किनारे मनोरंजक, दंश लिए प्रारंभिक चीरा से मधुमक्खी के प्रत्येक पक्ष के साथ longitudinally कटौती (चित्रा 2 देखें)। सावधानी बरतें जब जठरांत्र पथ puncturing से बचने के लिए काट रहा है।
चित्रा 2: मधुमक्खी पेट के पार्श्व दृश्य। के रूप में लाल रेखा से चिह्नित दूसरे और तीसरे चीरों, पेट के दोनों ओर के साथ किया जाना चाहिए। स्केल बार = 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- ठीक संदंश की एक दूसरे सेट के लिए कैंची एक्सचेंज और उन्हें उपयोग सावधानी से बाकी ओ से पृष्ठीय पेट की दीवार को अलग करने केपेट च। धीरे दंश और जठरांत्र संबंधी मार्ग कि पृष्ठीय पेट की दीवार के साथ जुड़ा रहता के किसी भी हिस्से को हटा दें। आंत फटने से बचें, सामग्री कोट पेट की दीवार सकते हैं और पृष्ठीय पोत के दृश्य में बाधा के रूप में।
चित्रा 3: पृष्ठीय पोत के देखें। एक बार पेट और दंश हटा दिया गया है, पृष्ठीय पोत विच्छेदित पृष्ठीय पेट की दीवार के midline के साथ दिख रहा है। स्केल बार = 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- कैमरा नीचे वांछित अभिविन्यास में पृष्ठीय पेट की दीवार व्यवस्था इतनी है कि पृष्ठीय पोत दिख रहा है (चित्रा 3 देखें)। microdissection कैंची का उपयोग किसी भी अतिरिक्त एबी दूर ट्रिम करने के लिएdominal दीवार कि पृष्ठीय पोत के दृश्य में बाधा उत्पन्न करती। पृष्ठीय पेट की दीवार के आकार एक उथले कप या कटोरा समान होना चाहिए जब ठीक से स्थित है।
- चूंकि पृष्ठीय पोत मधुमक्खी का सब से पिछला पेट खंड में विस्तार नहीं करता है, पृष्ठीय पोत के दृश्य में सुधार करने के क्रम में अंतिम tergite को हटा दें।
- एक समायोज्य मात्रा micropipette का उपयोग, शारीरिक स्थिति को बनाए रखने और एक स्थिर दिल की धड़कन की सुविधा के लिए एक isotonic समाधान के 10 μl के साथ पृष्ठीय पोत को कवर किया।
नोट: सिफारिश समाधान है तिमाही ताकत घंटी समाधान (0.120 छ / एल कैल्शियम क्लोराइड, 0.105 छ / एल पोटेशियम क्लोराइड, 0.050 छ / एल सोडियम बाइकार्बोनेट, और 2.250 छ / एल सोडियम क्लोराइड), एक स्थिर की सुविधा के लिए पाया गया है जो, निरंतर दिल की धड़कन।
3. अवलोकन और हृदय की दर की मॉड्यूलेशन
- पृष्ठीय पोत अबाधित बैठने की अनुमति दें जब तक एक स्थिर, निरंतर दिल की धड़कन हासिल की है(आमतौर पर 300 सेकंड के भीतर)।
नोट: दिल की धड़कन पृष्ठीय पोत की लयबद्ध संकुचन के रूप में कल्पना की है। प्रारंभ में, वहाँ कोई दिल की धड़कन हो, खासकर अगर मधुमक्खी anesthetized गया था, यह समाधान में नहाया रहता है प्रदान की प्रकट हो सकता है, लेकिन दिल आमतौर पर कई मिनट के लिए isotonic समाधान में आराम के बाद पिटाई फिर से शुरू होगा और घंटे के लिए मार जारी कर सकते हैं। - मिनट (बीपीएम) प्रति धड़क रहा है की संख्या के मामले में दिल की दर को मापने।
- एक 60 सेकंड की अवधि के दौरान मनाया संकुचन की संख्या रिकॉर्ड। इस प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए एक हाथ मिलान काउंटर और एक टाइमर का प्रयोग करें।
- पहले और एक cardiomodulatory परिसर के साथ उपचार के बाद मनाया बीपीएम रिकॉर्डिंग से दिल की दर में परिवर्तन को मापने।
नोट: हालांकि समय से दिल की दर पर असर निरीक्षण करने के लिए परिसर के आधार पर परीक्षण किया जा रहा भिन्न हो सकते आवश्यक है, दिल की दर में परिवर्तन के लिए आम तौर पर मिनट के भीतर देखा जा सकता है।- आधारभूत हृदय की दर को तुरंत करने के लिए पूर्व निर्धारित बनाने के लिएकिसी भी परीक्षा परिसर के अलावा।
नोट: उपचार के बाद दिल की दर आम तौर पर 90 से 120 सेकंड के बाद निर्धारित किया जा सकता है। - पृष्ठीय पोत स्नान करने के लिए इस्तेमाल एक ही isotonic समाधान में यौगिक भंग द्वारा संभावित cardiomodulators (जैसे, octopamine) तैयार करें।
- एक micropipetter उपयोग करके पृष्ठीय पोत आसपास के समाधान के लिए परीक्षण यौगिकों जोड़ें।
- आधारभूत हृदय की दर को तुरंत करने के लिए पूर्व निर्धारित बनाने के लिएकिसी भी परीक्षा परिसर के अलावा।
- अधिक से अधिक सटीकता और उच्च throughput के लिए, प्रत्येक विषय की परीक्षा का एक वीडियो रिकॉर्डिंग बनाने के लिए और फिर एक बाद में समय पर दिल की दर स्कोर करने के लिए वीडियो का उपयोग करें।
नोट: यह आदेश वीडियो के लगभग निरंतर उत्पादन की सुविधा के लिए विच्छेदन डगमगाते के लिए एक एकल अन्वेषक की अनुमति देता है। वीडियो रिकॉर्डिंग है, कम से कम लंबाई की सिफारिश की किसी भी परीक्षा परिसर के साथ लगभग 240 सेकंड 60 सेकंड के निशान पर जोड़ा जा रहा है। यह सुनिश्चित करता है अन्वेषक आधारभूत दिल की दर और फिर बाद इलाज दिल की दर 120 सेकंड स्कोरिंग के लिए एक और 60 सेकंड खिड़की स्कोरिंग के लिए एक 60 सेकंड खिड़की है किइलाज के बाद।
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Representative Results
चूंकि औषधीय सक्रिय यौगिकों कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग परीक्षण किया जा सकता है की कई पानी में घुलनशील नहीं कर रहे हैं, यह एक विश्वसनीय विलायक कि परीक्षण यौगिकों isotonic पृष्ठीय पोत स्नान करने के लिए इस्तेमाल किया समाधान के माध्यम से वितरित किया जा करने की अनुमति देगा के लिए आवश्यक है। डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) एक विलायक है कि आमतौर पर जानवरों 8 में प्रायोगिक दवाओं और अन्य यौगिकों देने के लिए एक वाहन के रूप में इस्तेमाल किया जाता है, और यह मधु मक्खी हृदय की गतिविधि 9 पर कीटनाशकों के प्रभाव की जांच के अध्ययन में इस उद्देश्य के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है। नतीजतन, DMSO पृष्ठीय जहाज है, जो आवश्यक है कि यह पहली cardiomodulatory गतिविधि के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए परीक्षण यौगिकों देने के लिए एक संभावित वाहन के रूप में चयनित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में, विच्छेदित पृष्ठीय पोत शुरू में तिमाही ताकत घंटी समाधान के 10 μl में नहाया है और फिर दिल की दर परीक्षण यौगिकों जोड़ने से पहले निर्धारित किया जाता है। परीक्षण यौगिकों की गिरफ्तारीई तिमाही ताकत घंटी समाधान में भंग DMSO के 10 μl में एक ज्ञात एकाग्रता में दिया और फिर पृष्ठीय पोत दिल की दर में बाद में परिवर्तन के लिए मनाया जाता है।
किसी भी यौगिकों का परीक्षण करने से पहले, DMSO के एक एकाग्रता रेंज दिल की दर, 0% DMSO के साथ तिमाही ताकत घंटी समाधान के सापेक्ष पर कोई असर के लिए परीक्षण किया गया था। DMSO 0.2%, 2%, 10% पर भंग कर दिया गया है, और जब के बराबर मात्रा में जोड़ा 20% v / आदेश 0.1%, 1%, 5%, और 10% की एक अंतिम एकाग्रता का परीक्षण करने में तिमाही ताकत घंटी समाधान में v पहले से ही समाधान पृष्ठीय पोत स्नान। यह दृष्टिकोण, के रूप में इस्तेमाल किया गया था पृष्ठीय पोत स्नान करने के लिए इस्तेमाल किया प्रारंभिक 10 μl में वांछित एकाग्रता में DMSO जोड़ने का विरोध किया, क्योंकि हर विच्छेदन एक स्थिर दिल की धड़कन अर्जित करता है। DMSO के दिल की दर पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है, तो इस आशय का एक असफल विच्छेदन से अलग पहचाना नहीं हो सकता है। दिल की दर से पहले तुरंत मूल्यांकन किया गया थाDMSO जोड़ने, और उसके बाद फिर से 120 सेकंड बाद में। चित्रा 4, इस प्रयोग के परिणाम से पता चलता है कि प्रदर्शन में 0.1% और 1% DMSO के समाधान में दिल की दर पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव, तिमाही ताकत DMSO के बिना घंटी समाधान के सापेक्ष था, जबकि 5% और 10% DMSO काफी दिल की दर में कमी आई है।
चित्रा 4: मधुमक्खी दिल की दर पर DMSO का प्रभाव। के रूप में प्रति मिनट धड़कता में मापा ग्राफ़, बेसल दिल की दर में प्रतिशत परिवर्तन को दर्शाता है। 0.1% या तिमाही ताकत घंटी समाधान में काफी वृद्धि नहीं करता है या हृदय गति, DMSO के बिना तिमाही ताकत घंटी समाधान के सापेक्ष कमी में 1% DMSO वी / वी के साथ मधु मक्खी पृष्ठीय पोत का उपचार। समाधान में 5% या 10% DMSO के साथ उपचार के दिल की दर में एक महत्वपूर्ण कमी का कारण बनता है। परिणाम के रूप में व्यक्त ± SEM (एन = 10) से मतलब है। * पी <0.05 बनाम 0% DMSO नियंत्रण (Kruskal वालिस डन एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ परीक्षण)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
के लिए इस परख प्रासंगिक हो करने के लिए, यह cardiomodulatory यौगिकों के साथ इलाज के बाद हृदय की दर में परिवर्तन निरीक्षण करने के लिए संभव होगा। Biogenic अमाइन octopamine अकशेरुकी 10 में एक neuromodulator के रूप में कार्य करने के लिए जाना जाता है और दोनों के रूप में फल में एक cardioaccelerant 11 और मधु मक्खियों 7 मक्खियों कार्य करने के लिए दिखाया गया है। Octopamine वाहन (तिमाही ताकत घंटी समाधान में 1% DMSO) के खिलाफ परीक्षण किया गया था के रूप में 100 एनएम, 10 माइक्रोन, और 100 माइक्रोन की सांद्रता में ऊपर वर्णित है। चित्रा 5, इस प्रयोग के परिणाम से पता चलता है कि प्रदर्शन 10 माइक्रोन और octopamine के 100 माइक्रोन के सांद्रता काफी दिल की दर में वृद्धि हुई।
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चित्रा 5: मधुमक्खी दिल की दर पर octopamine का प्रभाव। के रूप में प्रति मिनट धड़कता में मापा ग्राफ़, बेसल दिल की दर में प्रतिशत परिवर्तन को दर्शाता है। 100 एनएम octopamine साथ मधु मक्खी पृष्ठीय पोत के उपचार में काफी वृद्धि नहीं करता है या (तिमाही ताकत घंटी समाधान में 1% DMSO वी / वी) वाहन के लिए दिल की दर रिश्तेदार कमी। 10 माइक्रोन और 100 माइक्रोन के octopamine के साथ उपचार काफी वाहन को दिल की दर रिश्तेदार वृद्धि हुई है। परिणाम के रूप में व्यक्त ± SEM (एन = 10) से मतलब है। * पी <0.05 बनाम वाहन नियंत्रण (डन एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ Kruskal वालिस परीक्षण)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dino-Lite Edge digital USB microscope | Dino-Lite | AM4815ZT | Any digital microscope or similar setup will suffice |
| Microscope stand | Dino-Lite | RK-10 | Any stand appropriate for the digital microscope |
| Laptop or PC | Necessary for digital microscope | ||
| Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades) | World Precision Instruments | 14003 | Any similar scissors suitable for microdissection will suffice |
| Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair) | World Precision Instruments | 504482 | Any similar forceps suitable for microdissection will suffice |
| Ringers solution 1/4 strength tablets | Sigma-Aldrich | 96724-100TAB | |
| Dissecting tray | Any surface suitable for microdissection | ||
| Single channel 10 µl pipette | Any device capable of accurately delivering 10 µl volume | ||
| Pipette tips | |||
| Small beaker or container of water | Used to rinse instruments between subjects | ||
| Hand tally counter | Office Depot | 295033 | Any similar product will suffice |
| Timer | Office Depot | 644219 | Any similar product will suffice |
| Deionized water | Preparation of Ringers solution and rinsing instruments |
References
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