Introduction
Общая цель данной методики является возможность следователю быстро и легко наблюдать и количественно эффект, что фармакологическое средство имеет на частоту сердечных сокращений медоносных пчел. Пчелы, как и другие насекомые, имеют открытую кровеносную систему, которая распространяет гемолимфы, эквивалент насекомых крови, по всей полости тела, известного как hemocoel. Циркуляция гемолимфы имеет важное значение для транспортировки питательных веществ, иммунных факторов, отходов производства, а также нейрогормонов и других сигнальных молекул 1. Циркуляционный облегчается спинного сосуда, которая проходит вдоль средней линии спины насекомого, а также вспомогательных органов пульсирующим. Спинной сосуд разделен на две функционально различные секции, обозначенная сердце в животе и аорту в грудной клетке и голове. Размножается схватки в гемолимфе сердце насоса по направлению к грудной клетке и голове, в то время как вспомогательные органы пульсирующие обеспечить гемолимфы поток к конечностям.
Другой подход , который был использован для изучения пчелиный сердечной деятельности является частично рассекают насекомое, чтобы разоблачить сердце, а затем измерить спинные сокращениями сосудов с использованием датчика перемещения силы 7. В этом протоколе, сердце постоянно купались с проточной физиологическим раствором и тест-COmpounds может быть растворен в этом растворе для нанесения на предмет 7. Существенным отличием этого метода и способы , описанные ранее в том , что брюшная нервная цепь удаляется, исключая роль , что центральная нервная система , как было показано , чтобы играть в модуляции сердечного ритма 5. Результатом является то , что базовый уровень сердцебиение, которое, как правило , довольно неустойчива, стабилизируется на более низкой частоте и амплитуде , чем обычно наблюдается в живом насекомого 5,7. Что все эти методы имеют в общем, что они требуют узкоспециализированный и часто дорогостоящего оборудования, в дополнение к определенному уровню знаний, для того, чтобы быть проведены. Возможно, самым большим недостатком является то, что ни один из этих подходов не особенно хорошо подходят для экспериментов, которые предусматривают проверку большого количества предметов, таких как скрининг библиотеки потенциально cardiomodulatory соединений.
Наибольшая сила подхода, описанного здесьявляется его простота. Протокол относительно прост в освоении, установка требует мало места, и лишь минимальный финансовый вклад необходим. Метод требует немного больше, чем некоторые пчелы, несколько хирургических инструментов, изотонический раствор, и либо цифровой микроскоп или традиционный микроскоп с цифровой камерой. Пчелы расчлененный для визуализации спинного сосуда и цифровых видео используются для записи частоты сердечных сокращений до и после лечения с помощью фармакологических средств. Несмотря на то, видеозапись не на самом деле необходимо , чтобы наблюдать изменения в частоте сердечных сокращений, это значительно увеличивает пропускную способность (то есть, количество предметов , которые можно обработать в заданное время). Следователь может максимизировать эффективность путем записи большого количества видео сразу, а потом забил эти видео в более удобное время. Еще одно преимущество этого подхода заключается в том, что видео позволяет следователю начать все сначала, должен процесс подсчета очков быть прерван, и сделать его проще для Viewer ослепить к лечению с целью уменьшения систематической ошибки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Сбор и подготовка испытуемых
- Собрать необходимое количество пчел из колонии.
Примечание: Количество зависит от того, требуется не только от размера и рамки эксперимента, но и от мастерства исследователя. Например, если есть 2 группы лечения с желаемым размером выборки 10 пчел в каждой группе, разумно опытный исследователь может собрать не менее 30 пчел, чтобы объяснить неудачные вскрытий и в конечном итоге с 20 полезных видео, чтобы забить. - Сведите к минимуму количество времени, которое проходит между сбором и рассечение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, пчелы могут быть размещены в лаборатории в течение нескольких дней до рассечения, вероятность успеха вскрытий (то есть, вероятность поддержания стабильного сердечного ритма в расчлененный спинного сосуда) наблюдается для уменьшения относительно количества времени, пчелы расположены далеко от колонии.- Обеспечить пчел с источником воды и пищи, в то время размещались в лаборатории. Для EXAmple, как минимум, обеспечить доступ к 50% (вес / объем) раствора сахарозы в воде (этого достаточно для длительностей менее 6 ч). Для более длительных периодов, обеспечивают доступ к пчелам меда.
- Дома пчел в лаборатории в течение ночи при температуре около 32 ° C и 60-80% относительной влажности, чтобы уменьшить стресс и избежать обезвоживания.
- Перед вскрытием, обезболивают пчел на короткое время, чтобы помочь в обработке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может уменьшить вероятность успеха вскрытий и уменьшить пропускную способность.- Холод пчел либо путем размещения их на льду или в холодильнике достаточно долго, чтобы уменьшить движение с целью оказания помощи при погрузке и выгрузке.
- В качестве альтернативы, на короткое время подвергнуть пчел CO 2 для того , чтобы помочь в обработке.
Примечание: Сильное воздействие холода может уменьшить вероятность успеха вскрытий. Extended или повторяющееся воздействие CO 2 может также уменьшить вероятность успеха вскрытий.
2. Вскрытиеспинномозговых брюшной стенки
Примечание: Пчелы должны быть живы в момент рассечения.
- Использование щипцов и / или микродиссекции ножницы, удалить ноги и крылья, чтобы облегчить рассечение живота. Сохранить небольшой химический стакан или аналогичный контейнер, заполненный дистиллированной водой рядом с целью промывки инструментов между вскрытий.
- В то время как сдерживая пчела с пинцетом, использовать микродиссекции ножницы , чтобы вырезать в боковом направлении вдоль спинной брюшной стенки между первым и вторым тергитах (см рисунок 1).
Рисунок 1: Спинной вид пчелиной живота. Первоначальный Разрез должен быть между первым и вторым тергитами, как обозначено красной линией. Шкала бар = 1 мм. Пожалуйста , нажмите еее, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
- Слегка захватывая заднего края второго тергита с пинцетом, разрезанные продольно вдоль каждой стороны пчелы от первоначального разреза до жалом (см рисунок 2). Соблюдайте осторожность при резке, чтобы избежать прокалывания желудочно-кишечного тракта.
Рисунок 2: Вид сбоку пчелиного живота. Второй и третий разрезы должны быть сделаны по обе стороны от живота, как обозначено красной линией. Шкала бар = 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Обмен ножницы для второго набора тонких щипцов и использовать их, чтобы тщательно отделить спинной брюшной стенки от остальной Oе живота. Осторожно удалить жало и любую часть желудочно-кишечного тракта, который остается прикрепленной к спинной брюшной стенки. Избегайте разрывая кишки, а содержимое может покрыть брюшной стенки и препятствуют визуализации спинного сосуда.
Рисунок 3: Вид спинного сосуда. После того, как кишечник и Стингер были удалены, спинной сосуд виден вдоль средней линии расчлененный спинного брюшной стенки. Шкала бар = 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Устройте спинной брюшной стенки в нужной ориентации под камерой так , что спинной сосуд видна (смотри рисунок 3). Использовать микродиссекции ножницы, чтобы обрезать лишнюю абdominal стена, которая препятствует визуализации спинного сосуда. Форма спинном брюшной стенки должна напоминать неглубокую чашку или миску, когда правильно расположен.
- Поскольку спинной сосуд не распространяется на стопы заднего сегмента брюшка пчелы, удалить окончательный тергит с целью улучшения визуализации спинного сосуда.
- Используя регулируемый объем микропипетки, накрыть спинной сосуд с 10 мкл изотонического раствора для поддержания физиологических условий и облегчения устойчивый сердцебиение.
Примечание: Рекомендуемое решение прочности четверть раствор Рингера (0,120 г хлорида / л кальция, 0,105 г / л хлорида калия, 0,050 г / л бикарбоната натрия и 2,250 г / л хлорида натрия), которое было установлено для облегчения стабильной, непрерывное сердцебиение.
3. Наблюдение и модуляция частоты сердечных сокращений
- Разрешить спинной сосуд, чтобы сидеть спокойно, пока стабильное, непрерывное сердцебиение не будет достигнуто(Как правило, в течение 300 сек).
ПРИМЕЧАНИЕ: Heartbeat визуализируется как ритмических сокращений спинного сосуда. Первоначально может возникнуть, нет сердцебиение, особенно если пчела наркоз, а сердце, как правило, после того, как возобновить биение отдыхает в изотоническом растворе в течение нескольких минут и может продолжаться в течение нескольких часов избивать, при условии, что по-прежнему купаются в растворе. - Измерьте частоту сердечных сокращений с точки зрения количества ударов в минуту (BPM).
- Записывают число сокращений, наблюдаемых в течение периода 60 сек. Используйте счетчик бирки руки и таймер, чтобы облегчить этот процесс.
- Измерить изменение частоты сердечных сокращений путем записи наблюдаемого ВРМ до и после лечения с cardiomodulatory соединением.
Примечание: Несмотря на то, время, необходимое для наблюдения эффекта на частоту сердечных сокращений, может изменяться в зависимости от соединения испытывается, изменение частоты сердечных сокращений, как правило, можно наблюдать в течение нескольких минут.- Определить базовую частоту сердечных сокращений непосредственно переддобавление любого испытуемого соединения.
ПРИМЕЧАНИЕ: После лечения частота сердечных сокращений обычно может быть определена после того, как от 90 до 120 сек. - Подготовка потенциальных cardiomodulators (например, октопамина) путем растворения соединения в той же изотоническом растворе купалась спинного сосуда.
- Добавьте тестируемые соединения в растворе, окружающем спинного сосуда путем использования micropipetter.
- Определить базовую частоту сердечных сокращений непосредственно переддобавление любого испытуемого соединения.
- Для большей точности и высокой пропускной способности, сделать видеозапись каждого испытуемого, а затем использовать видео, чтобы набрать частоту сердечных сокращений в более позднее время.
Примечание: Это позволяет одному исследователю шататься диссекции, с тем, чтобы облегчить почти непрерывное производство видео. При записи видео, минимальная рекомендуемая длина составляет примерно 240 сек с любым тестируемым соединением добавляется на отметке 60 сек. Это гарантирует, что следователь имеет окно 60 сек для озвучивания базовой частоты сердечных сокращений, а затем еще одно окно 60 сек для озвучивания после лечения частота сердечных сокращений 120 секпосле лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Так как многие из фармакологически активных соединений, которые могут быть испытаны с использованием этого протокола, не растворимы в воде, необходимо иметь надежный растворитель, который позволит тестируемые соединения должны быть доставлены с помощью изотонического раствора купалась спинного сосуда. Диметилсульфоксид (ДМСО) является растворителем , который обычно используется в качестве средства для доставки экспериментальных лекарственных препаратов и других соединений у животных 8, и она была успешно использована для этой цели в исследованиях изучения влияния пестицидов на медоносных пчел сердечной деятельности 9. Следовательно, ДМСО был выбран в качестве потенциального средства для доставки испытуемых соединений спинного сосуда, который требует, чтобы он сначала быть проверены на cardiomodulatory активности. В этом протоколе, рассекали спинной сосуд первоначально купались в 10 мкл раствора прочности четверть Рингера, а затем частота сердечных сокращений определяется перед добавлением тестируемых соединений. Тестируемые соединения арЕ, поступающая в известной концентрации в 10 мкл ДМСО, растворенного в -ном растворе четверть Рингера, а затем спинного сосуда наблюдается для последующих изменений в частоте сердечных сокращений.
Перед тестированием любых соединений, в диапазоне концентраций ДМСО тестировали на какого-либо эффекта на частоту сердечных сокращений, по отношению к -ной четверти Рингера с 0% ДМСО. ДМСО растворяют в 0,2%, 2%, 10%, а 20% об / об в -ном растворе четверть Рингера для того, чтобы испытать конечной концентрации 0,1%, 1%, 5% и 10%, при добавлении в равном объеме к решение уже купании спинного сосуда. был использован этот подход, в отличие от добавления ДМСО в желаемой концентрации в исходных 10 мкл купалась спинного сосуда, так как не каждый рассечение дает стабильное сердцебиение. Если ДМСО оказывает неблагоприятное влияние на частоту сердечных сокращений, этот эффект не может быть отличимы от неудачной диссекции. Частота сердечных сокращений оценивали непосредственно переддобавление ДМСО, а затем снова через 120 секунд позже. На рисунке 4 показаны результаты этого эксперимента, что свидетельствует , что 0,1% и 1% ДМСО в растворе не оказывает существенного влияния на частоту сердечных сокращений, по отношению к прочности четверти раствора Рингера без ДМСО, в то время как 5% и 10% ДМСО значительно снижение частоты сердечных сокращений.
Рисунок 4: Влияние ДМСО на пчелиный частоты сердечных сокращений. График показывает процентное изменение базальной частоты сердечных сокращений, как измеряется в ударах в минуту. Лечение медоносных пчел спинного сосуда с 0,1% или 1% ДМСО об / об в -ном растворе четверть Рингера не оказывает существенного увеличения или уменьшения частоты сердечных сокращений, по отношению к прочности раствора четверти Рингера без ДМСО. Лечение с помощью 5% или 10% ДМСО в растворе вызывает значительное снижение частоты сердечных сокращений. Результаты выражены в виде среднего ± SEM (n = 10). * Р <0,05 по сравнению с 0% контроль ДМСО (Крускала-Уоллиса с несколькими тестовыми сравнений Данна). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Для того, чтобы этот анализ, чтобы иметь значение, должна быть обеспечена возможность наблюдать изменения частоты сердечных сокращений после обработки cardiomodulatory соединениями. Биогенные амины октопамина , как известно, выступают в качестве нейромодулятор беспозвоночных 10 и было показано, действуют как cardioaccelerant в обоих плодовых мушек 11 и пчелам 7. Октопамина испытано в соответствии с транспортным средством (1% ДМСО в -ном растворе четверть Рингера), как описано выше при концентрации 100 нМ, 10 мкМ и 100 мкМ. На рисунке 5 показаны результаты этого эксперимента, что свидетельствует , что 10 мкМ и 100 мкМ концентрации октопамину значительно увеличилась частота сердечных сокращений.
т "ВОК: Keep-together.within-страница =" 1 ">
Рисунок 5: Влияние октопамину на пчелиный частоты сердечных сокращений. График показывает процентное изменение базальной частоты сердечных сокращений, как измеряется в ударах в минуту. Лечение медоносных пчел спинного сосуда с 100 нМ октопамину не приводит к существенному увеличения или уменьшения частоты сердечных сокращений относительно транспортного средства (1% ДМСО об / об в -ном растворе четверть Рингера). Лечение с помощью 10 мкМ и 100 мкМ октопамину значительно увеличилась частота сердечных сокращений относительно транспортного средства. Результаты выражены в виде среднего ± SEM (n = 10). * P <0,05 по сравнению с контролем транспортного средства (тест Крускала-Уоллиса с несколькими тестовыми сравнений Данна). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dino-Lite Edge digital USB microscope | Dino-Lite | AM4815ZT | Any digital microscope or similar setup will suffice |
| Microscope stand | Dino-Lite | RK-10 | Any stand appropriate for the digital microscope |
| Laptop or PC | Necessary for digital microscope | ||
| Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades) | World Precision Instruments | 14003 | Any similar scissors suitable for microdissection will suffice |
| Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair) | World Precision Instruments | 504482 | Any similar forceps suitable for microdissection will suffice |
| Ringers solution 1/4 strength tablets | Sigma-Aldrich | 96724-100TAB | |
| Dissecting tray | Any surface suitable for microdissection | ||
| Single channel 10 µl pipette | Any device capable of accurately delivering 10 µl volume | ||
| Pipette tips | |||
| Small beaker or container of water | Used to rinse instruments between subjects | ||
| Hand tally counter | Office Depot | 295033 | Any similar product will suffice |
| Timer | Office Depot | 644219 | Any similar product will suffice |
| Deionized water | Preparation of Ringers solution and rinsing instruments |
References
- Klowden, M. J. Circulatory Systems. Physiological Systems in Insects, 3rd Edition. , 3rd, 365-413 (2013).
- League, G. P., Onuh, O. C., Hillyer, J. F. Comparative structural and functional analysis of the larval and adult dorsal vessel and its role in hemolymph circulation in the mosquito Anopheles gambiae. J Exp Biol. 218 (Pt 3), 370-380 (2015).
- Wasserthal, L. T. Oscillating Hemolymph Circulation in the Butterfly Papilio-Machaon L Revealed by Contact Thermography and Photocell Measurements. J Comp Physiol. 139 (2), 145-163 (1980).
- Wasserthal, L. T. Interaction of circulation and tracheal ventilation in holometabolous insects. Adv Insect Physiol. 26, 297-351 (1996).
- Schwab, E. R., Chilson, R. A., Eddleman, C. D. Heartbeat Rate Modulation Mediated by the Ventral Nerve Cord in the Honey-Bee, Apis-Mellifera. J Comp Physiol B-Biochem Syst Environ Physiol. 161 (6), 602-610 (1991).
- Kaiser, W., Weber, T., Otto, D., Miroschnikow, A. Oxygen supply of the heart and electrocardiogram potentials with reversed polarity in sleeping and resting honey bees. Apidologie. 45 (1), 73-87 (2014).
- Papaefthimiou, C., Theophilidis, G. Octopamine--a single modulator with double action on the heart of two insect species (Apis mellifera macedonica and Bactrocera oleae): Acceleration vs. inhibition. J Insect Physiol. 57 (2), 316-325 (2011).
- Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. Behavioral-Effects of Vehicles - Dmso, Ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620. Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).
- Papaefthimiou, C., Papachristoforou, A., Theophilidis, G. Biphasic responses of the honeybee heart to nanomolar concentrations of amitraz. Pestic Biochem Phys. 107 (1), 132-137 (2013).
- Roeder, T. Octopamine in invertebrates. Prog Neurobiol. 59 (5), 533-561 (1999).
- Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. Modulation of Drosophila heartbeat by neurotransmitters. J Comp Physiol B. 167 (2), 89-97 (1997).
