Dissectie en observatie van Honey Bee Dorsale Vessel voor Studies van de hartfunctie

Introduction

Het algemene doel van deze methode is om de onderzoeker om snel en gemakkelijk te observeren en het effect dat een farmacologisch middel heeft op de hartslag van de honingbijen te kwantificeren. Bijen, zoals andere insecten, hebben een open bloedsomloop dat hemolymfe, het insect equivalent van bloed verspreidt gehele lichaamsholte, zogenaamde hemocoel. De circulatie van hemolymfe is essentieel voor het transport van voedingsstoffen, immuunfactoren, afvalproducten, en neurohormonen en andere signaalmoleculen ^1. Circulatie wordt vergemakkelijkt door de dorsale vat, die zich langs de dorsale middellijn van het insect, en pulsatiele accessoire organen. De dorsale vat is verdeeld in twee functioneel verschillende secties, aangeduid als het hart in de buik en de aorta in de borst en het hoofd. Gepropageerd contracties in het hart pomp hemolymfe in de richting van de borstkas en hoofd, terwijl het accessoire pulserende organen te garanderen hemolymfe stroom naar de extremiteiten.

2. Deze methode is minder nuttig bij volwassen bijen, echter, aangezien het moeilijk kan zijn om duidelijk te zien de dorsale vat via de buikwand. Een gevestigde benadering voor het opnemen hartslag diverse insecten zoals bijen, is het gebruik van contact thermografie, die thermistors toegepast op de buitenkant van het insect cardiale pulsaties ^3,4 detecteren gebruikt. Hartslag bij volwassen bijen is ook opgenomen met behulp van een elektrofysiologische techniek om een elektrisch impedantiesignaal ^4,5 meten. Deze techniek vereist het inbrengen van de elektroden in het dier naast het hart en het gebruik van een impedantie converter hartslagen ⁴ opnemen. Zo hebben elektrocardiogrammen gebruikt om DETECt elektrische signalen die door het hart en gecombineerd met video-opname van de bij veranderingen in hartactiviteit ⁶ observeren. Een duidelijk voordeel van deze aanpak is dat de hartslag wordt geëvalueerd in een intacte, levende bij, in plaats van in een ontlede monster, waardoor de beschikbaarheid van het volledige spectrum van fysiologische reacties in het onderwerp te verzekeren. De uitdagingen van deze benaderingen zijn onder verantwoording van immobilisatie of verdoving van het onderwerp, de behoefte om buiten variabelen en prikkels die de hartslag kunnen veranderen, evenals het bepalen van een geschikte levering methode bij het testen van farmacologische middelen te beperken.

Een andere aanpak die is gebruikt voor het bestuderen bij hartactiviteit is het insect gedeeltelijk ontleden om het hart bloot te leggen, meet dorsale vat contracties bij een kracht verplaatsingstransductor ^7. In dit protocol wordt het hart voortdurend gebaad met hardlopen fysiologische zoutoplossing en test compounds kunnen worden opgelost in deze oplossing voor toepassing aan de patiënt ^7. Een belangrijk verschil tussen deze methode en de eerder beschreven is dat de ventrale zenuwkoord wordt verwijderd, waardoor de rol van het centrale zenuwstelsel is aangetoond spelen bij het moduleren hartfrequentie ^5. Het resultaat is dat de basislijn hartslag, die meestal zeer grillig, stabiliseert op een veel lagere frequentie en amplitude dan wordt meestal waargenomen bij een levende insecten ^5,7. Wat al deze werkwijzen hebben gemeen dat ze zeer gespecialiseerde en vaak dure apparatuur vereisen, naast een bepaald niveau van deskundigheid, om te worden uitgevoerd. Misschien wel het grootste nadeel is dat geen van deze benaderingen zijn bijzonder goed geschikt voor experimenten die omvatten het testen van een groot aantal onderwerpen, zoals het screenen van een bibliotheek van potentieel cardiomodulatory verbindingen.

De grootste kracht van de hier beschreven benaderingis de eenvoud. Het protocol is relatief eenvoudig te beheersen, de installatie vereist weinig ruimte, en slechts een minimale financiële inspanning nodig. De werkwijze is meer nodig dan sommige bijen, een paar chirurgische instrumenten, een isotone oplossing en ofwel een digitale microscoop of een traditionele microscoop met een digitale camera. Bijen worden ontleed aan de dorsale vat visualiseren en digitale video's worden gebruikt om de hartslag op te nemen voor en na de behandeling met farmacologische middelen. Hoewel de video-opname is eigenlijk niet nodig is om veranderingen in de hartslag te observeren, zal het throughput sterk toenemen (dat wil zeggen, het aantal onderwerpen die in een bepaalde hoeveelheid tijd kan worden verwerkt). De onderzoeker kan de efficiëntie te maximaliseren door het opnemen van een groot aantal video's in een keer en dan later scoren deze video's op een meer geschikte tijd. Een ander voordeel van deze benadering is dat video kan de onderzoeker beginnen, moet het scoren onderbroken, en maakt het gemakkelijker voor de viewer worden blind voor de behandeling om vertekening te verminderen.

Protocol

1. Verzameling en bereiding van Proefpersonen

1. Verzamel het juiste aantal bijen uit de kolonie.
   OPMERKING: Het aantal benodigde afhankelijk van niet alleen de omvang en reikwijdte van het experiment, maar ook de vaardigheid van de onderzoeker. Bijvoorbeeld, als er 2 behandelgroepen met een gewenste steekproefomvang van 10 bijen per groep, kan een redelijk bekwame onderzoeker laat tenminste 30 bijen te verantwoorden mislukte ontledingen en eindigen met 20 nuttige video te scoren.
2. Het minimaliseren van de hoeveelheid tijd die verstrijkt tussen het verzamelen en dissectie.
   Opmerking Hoewel bijen kunnen worden ondergebracht in het lab dagen voorafgaand aan dissectie het slagingspercentage van dissecties (dwz, de waarschijnlijkheid van een stabiel hartritme in een ontleed dorsale vat) waargenomen relatieve dalen tot de hoeveelheid tijd die bijen zijn weg uit de kolonie gevestigd.
   1. Zorg voor bijen met een bron van water en voedsel, terwijl gehuisvest in het lab. voor EXAmple ten minste toegang tot een 50% (w / v) oplossing van sucrose in water (voldoende voor een duur van minder dan 6 uur). Voor langere periodes, leveren bijen toegang tot honing.
   2. Huis bijen in het lab nacht bij een temperatuur van ongeveer 32 ° C en 60-80% relatieve vochtigheid te verminderen stress en uitdroging te voorkomen.
3. Voorafgaand aan de dissectie, verdoven bijen kort om te helpen bij de behandeling.
   LET OP: Dit kan het slagingspercentage van ontledingen verminderen en throughput te verminderen.
   1. Koel de bijen ofwel door ze op ijs of in een koelkast net lang genoeg om beweging om te helpen bij de behandeling verminderen.
   2. Als alternatief kort bloot bijen om de CO ₂ om te helpen bij de behandeling.
      LET OP: Langdurige blootstelling aan koude kan de slaagkans van dissecties te verminderen. Verlengde of herhaalde blootstelling aan CO ₂ kan verminderen ook de slaagkans van dissecties.

2. Dissectiondorsale buikwand

OPMERKING: bijen opengehouden ten tijde van dissectie.

1. Gebruik pincet en / of microdissectie schaar, verwijder poten en vleugels dissectie van de buik te vergemakkelijken. Houd een kleine beker of dergelijke bak met gedestilleerd water omgeving ten behoeve van het spoelen tussen instrumenten dissecties.
2. Terwijl de beteugeling bij met forceps, gebruik de microdissectie schaar lateraal snijden langs de dorsale buikwand tussen de eerste en tweede tergieten (zie figuur 1).

Figuur 1: Dorsal weergave van bee buik. De eerste snede moet worden gemaakt tussen de eerste en tweede tergieten, zoals aangegeven door de rode lijn. Schaal bar = 1 mm. Klik op haare voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Terwijl licht vastgrijpen van de achterrand van de tweede tergiet met de tang, snijden lengterichting langs elke kant van de bij de eerste insnijding op de stinger (zie figuur 2). Wees voorzichtig bij het snijden om te voorkomen dat aanprikken van het maag-darmkanaal.

Figuur 2: Zij mening van bijen buik. De tweede en derde insnijdingen moeten worden aangebracht ter weerszijden van de buik, zoals aangegeven door de rode lijn. Schaal bar = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Vervang de schaar voor een tweede set van fijne pincet en ze gebruiken om de dorsale buikwand zorgvuldig te scheiden van de rest of de buik. Verwijder de stinger en een gedeelte van het maagdarmkanaal dat voor het dorsale buikwand bevestigd blijft. Voorkomen scheuren de darm, de inhoud visualisatie van de dorsale vacht vaartuig de buikwand en belemmeren.

Figuur 3: Uitzicht op de dorsale vat. Zodra de darm en stinger zijn verwijderd, de dorsale vat zichtbaar langs de middellijn van het ontlede dorsale buikwand. Schaal bar = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Rangschik de dorsale buikwand in de gewenste oriëntatie onder de camera zodat de dorsale vaartuig toegankelijk (zie figuur 3). Gebruik maken van de microdissectie schaar om weg te trimmen overtollige abdominal muur die visualisatie van de dorsale vat belemmert. De vorm van de dorsale buikwand moet een ondiepe beker of kom lijken op de juiste wijze gelegen.
   1. Omdat de dorsale schip niet uit te breiden naar de achterste abdominale segment van de bij, verwijder de laatste tergiet om visualisatie van de dorsale schip te verbeteren.
6. Gebruik makend van een regelbaar volume micropipet, bedek de dorsale vat met 10 gl van een isotone oplossing van fysiologische omstandigheden te handhaven en een constante hartslag vergemakkelijken.
   OPMERKING: De voorgestelde oplossing is H sterkte Ringers oplossing (0,120 g / l calciumchloride, 0,105 g / L kaliumchloride, 0,050 g / l natriumbicarbonaat en 2,250 g / l natriumchloride), waarvan bij een stabiele vergemakkelijken, continue hartslag.

3. observatie en Modulatie van Heart Rate

1. Laat de dorsale vat te zitten ongestoord tot een stabiele, continue hartslag wordt bereikt(Meestal binnen 300 sec).
   LET OP: Heartbeat wordt gevisualiseerd als ritmische samentrekkingen van de dorsale vat. Aanvankelijk kan er blijken geen hartslag, vooral als de bijen werd verdoofd, maar het hart meestal weer slaan na rust in een isotone oplossing gedurende enkele minuten en kan blijven kloppen uren, mits blijft gebaad in oplossing.
2. Meet de hartslag in termen van het aantal beats per minuut (BPM).
   1. Noteer het aantal contracties waargenomen tijdens een 60 sec periode. Gebruik een hand telapparaat en een timer om dit proces te vergemakkelijken.
3. Meet de verandering van de hartfrequentie door registratie van de BPM waargenomen voor en na behandeling met een verbinding cardiomodulatory.
   LET OP: Hoewel de tijd die nodig is om een ​​effect op de hartslag te observeren kan variëren afhankelijk van de verbinding die wordt getest, kunnen veranderingen in de hartslag doorgaans worden waargenomen binnen enkele minuten.
   1. Bepaal de basislijn hartslag onmiddellijk voorafgaand aantoevoeging van een testverbinding.
      OPMERKING: Post-behandeling hartslag kan doorgaans worden bepaald na 90 tot 120 sec.
   2. Bereid potentiële cardiomodulators (bijvoorbeeld octopamine) door de verbinding in dezelfde isotone oplossing gebruikt om de dorsale vat baden.
   3. Voeg de testverbindingen om de oplossing rond de dorsale vat met behulp van een micropipet.
4. Voor een grotere nauwkeurigheid en hogere doorvoersnelheid, maak een video-opname van elke proefpersoon en vervolgens gebruik maken van de video's om de hartslag te scoren op een later tijdstip.
   LET OP: Dit maakt het mogelijk een enkele onderzoeker dissecties wankelen om bijna continue productie van video's te vergemakkelijken. Bij het opnemen van video's, de minimaal aanbevolen lengte is ongeveer 240 sec bij elke testverbinding bij de 60 seconden merk wordt toegevoegd. Dit zorgt ervoor dat de onderzoeker een 60 sec venster voor het maken van de uitgangswaarde hartfrequentie en dan nog 60 sec venster voor het maken nabehandeling hartslag 120 secna de behandeling.

Representative Results

Aangezien veel van de farmacologisch actieve verbindingen die kunnen worden getest met dit protocol niet oplosbaar in water, is het noodzakelijk om een ​​betrouwbare oplosmiddel waarmee testverbindingen via de isotone oplossing gebruikt om de dorsale vat baden te bezorgen. Dimethylsulfoxide (DMSO) is een oplosmiddel dat gewoonlijk wordt toegepast als een vehikel voor het afleveren experimentele geneesmiddelen en andere verbindingen bij dieren ^8, en is met succes gebruikt voor dit doel in studies naar het effect van pesticiden op honingbij hartactiviteit ^9. Bijgevolg DMSO werd geselecteerd als mogelijke instrument om het streven testverbindingen aan de dorsale vat bevond, die eerst worden getest cardiomodulatory activiteit. In dit protocol wordt het ontleed dorsale vat aanvankelijk badend in 10 ui oplossing kwartaal kracht Ringer's en dan de hartslag wordt voorafgaand aan het toevoegen testverbindingen bepaald. Test verbindingen are geleverd op een bekende concentratie in 10 ui DMSO opgelost in oplossing kwartaal kracht Ringer's en vervolgens de dorsale schip wordt waargenomen voor de volgende veranderingen in de hartslag.

Alvorens te testen welke stoffen een concentratiebereik van DMSO werd onderzocht op enig effect op de hartslag, ten opzichte oplossing H sterkte Ringers met 0% DMSO. DMSO werd opgelost in 0,2%, 2%, 10% en 20% v / v in oplossing H sterkte Ringers om een ​​eindconcentratie van 0,1%, 1%, 5% en 10% te testen wanneer toegevoegd in gelijke volume de oplossing al baden de dorsale vat. Deze benadering werd gebruikt, in tegenstelling tot het toevoegen van DMSO in de gewenste concentratie in de oorspronkelijke 10 pl gebruikt om de dorsale vat baden, omdat niet elke dissectie levert een stabiele hartslag. Als DMSO heeft een negatief effect op de hartslag, kan dit effect niet te onderscheiden van een mislukte dissectie zijn. Hartslag werd onmiddellijk voorafgaand aan het beoordelenhet toevoegen van DMSO, en dan weer 120 seconden later. Figuur 4 toont de resultaten van dit experiment tonen dat 0,1% en 1% DMSO in oplossing geen significant effect op de hartfrequentie, ten opzichte van het H sterkte Ringers oplossing zonder DMSO had, terwijl 5% en 10% DMSO significant verlaagde hartslag.

Figuur 4: Effect van DMSO op bijen hartslag. De grafiek toont de procentuele verandering van de basale hartfrequentie, gemeten in slagen per minuut. Behandeling van honingbij dorsale vat met 0,1% of 1% DMSO v / v oplossing in H sterkte Ringers niet significant verhogen of verlagen hartslag, ten opzichte oplossing H sterkte Ringers zonder DMSO. Behandeling met 5% of 10% DMSO in oplossing leidt tot een significante verlaging van de hartfrequentie. Resultaten uitgedrukt als gemiddelde ± SEM (n = 10). * P <0,05 versus 0% DMSO control (Kruskal-Wallis testen met meerdere vergelijkingen-test Dunn's). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om deze test relevant zijn, moet het mogelijk zijn om veranderingen in de hartslag na behandeling met cardiomodulatory verbindingen observeren. De biogene amine octopamine is bekend om als neuromodulator invertebraten en ¹⁰ is getoond om als cardioaccelerant zowel fruitvliegen ¹¹ en honingbijen ^7. Octopamine werd getest tegen vehikel (1% DMSO in oplossing H sterkte Ringers) zoals hierboven beschreven in concentraties van 100 nM, 10 uM en 100 uM. Figuur 5 toont de resultaten van dit experiment tonen dat 10 uM en 100 uM concentraties octopamine significant verhoogde hartslag.

t "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 5: Effect van octopamine op bijen hartslag. De grafiek toont de procentuele verandering van de basale hartfrequentie, gemeten in slagen per minuut. Behandeling van honingbij dorsale schip met 100 nM octopamine niet significant toeneemt of hartslag opzichte van het voertuig te verlagen (1% DMSO v / v in oplossing kwartaal kracht Ringer's). Behandeling met 10 pM en 100 pM octopamine significant verhoogde hartslag ten opzichte van het voertuig. Resultaten uitgedrukt als gemiddelde ± SEM (n = 10). * P <vs controle over het voertuig (test Kruskal-Wallis met meerdere vergelijkingen-test Dunn's) 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments