Dissekering och Observation Honey Bee Rygg fartyg för studier av hjärtfunktionen

Introduction

Det övergripande målet med denna metod är att göra det möjligt för forskaren att snabbt och enkelt observera och kvantifiera effekten som en farmakologisk agent har på hjärtfrekvensen av honungsbin. Bin, liksom andra insekter, har ett öppet cirkulationssystem som sprider hemolymfa, insekten motsvarande blod i hela kroppen hålighet, känd som hemocoel. Spridningen av hemolymph är nödvändiga för transport av näringsämnen, immun faktorer, avfall, samt neurohormoner och andra signalmolekyler ^1. Cirkulationen underlättas av den dorsala kärlet, som sträcker sig längs ryggens mittlinje av insekt, liksom accessoriska pulserande organ. Den dorsala kärlet är uppdelat i två funktionellt distinkta sektioner, betecknad hjärtat i buken och aorta i bröstkorgen och huvudet. Förökade sammandragningar i hjärtpump hemolymfa mot bröstkorgen och huvudet, medan tillbehörspulserande organ säkerställa hemolymph flöde till armar och ben.

2. Denna metod är mindre användbara i vuxna bin, men eftersom det kan vara svårt att tydligt visa den dorsala kärlet genom bukväggen. Ett etablerat tillvägagångssätt för registrering av hjärtfrekvensen i en mängd olika insekter, inklusive bin, är användningen av kontakttermografi, som utnyttjar termistorer appliceras på det yttre av insekten för att detektera hjärtpulsationer ^3,4. Hjärtfrekvens hos vuxna bin har också spelats in med en elektrofysiologisk teknik för att mäta en elektrisk impedans signal ^4,5. Denna teknik kräver insättning av elektroder i djuret intill hjärtat och användningen av en impedansomvandlare för att spela in hjärtslag ^4. På liknande sätt har elektrokardiogram använts för att DETECt elektriska signaler som alstras av hjärtat och i kombination med videoinspelning av biet att observera förändringar i hjärtaktivitet ^6. En tydlig fördel med dessa metoder är att hjärtfrekvensen bedöms i en intakt, levande bi, snarare än i en dissekeras prov, vilket bidrar till att säkerställa tillgången till ett komplett utbud av fysiologiska svar i ämnet. De utmaningar som dessa metoder inkluderar redovisning för immobilisering eller bedövning av ämnet, behovet av att begränsa utanför variabler och stimuli som kan ändra puls, samt fastställa en lämplig leveransmetod vid testning farmakologiska medel.

En annan metod som har använts för att studera bee hjärtaktivitet är att delvis dissekera insekten för att exponera hjärtat, sedan mäta dorsala fartygs sammandragningar med en kraft förskjutningsgivare ^7. I detta protokoll, är hjärtat ständigt badade med rinnande fysiologisk saltlösning och prov compounds kan upplösas i denna lösning för applicering på ämnet ^7. En signifikant skillnad mellan denna metod och de som tidigare beskrivits är att den ventrala nervsträngen avlägsnas, vilket eliminerar den roll som det centrala nervsystemet har visat sig spela vid modulering av hjärtfrekvensen ^5. Resultatet är att baslinjen hjärtslag, vilket är oftast ganska ojämn, stabiliseras på en mycket lägre frekvens och amplitud än normalt observeras i en levande insekt ^5,7. Vad alla dessa metoder har gemensamt är att de kräver högt specialiserad och ofta dyr utrustning, förutom en viss nivå av kompetens, för att kunna genomföras. Kanske den största nackdelen är att ingen av dessa metoder särskilt väl lämpade för experiment som omfattar försök ett stort antal ämnen, såsom screening av ett bibliotek av potentiellt cardiomodulatory föreningar.

Den största styrkan i det tillvägagångssätt som beskrivs härär dess enkelhet. Protokollet är relativt lätt att bemästra, installationen kräver lite utrymme, och endast en minimal finansiell ingång är nödvändigt. Metoden kräver lite mer än några bin, några kirurgiska instrument, en isoton lösning, och antingen en digital mikroskop eller ett traditionellt mikroskop med en digital kamera. Bin dissekeras att visualisera ryggkärlet och digital video används för att mäta puls före och efter behandling med farmakologiska medel. Även videoinspelning är faktiskt inte nödvändigt att observera förändringar i hjärtfrekvens, kommer det att kraftigt öka genomströmningen (dvs antal ämnen som kan behandlas i en viss tid). Utredaren kan maximera effektiviteten genom att spela in ett stort antal filmer på en gång och sedan scoring dessa filmer på en mer lämplig tidpunkt. En annan fördel med denna metod är att videor låta utredaren att börja om från början, bör poängprocessen avbryts, och göra det lättare för viewer förblindas till behandlingen i syfte att minska bias.

Protocol

1. Insamling och förberedelse av Försökspersoner

1. Samla lämpligt antal bin från kolonin.
   OBS: Antalet behövs beror på inte bara storleken och omfattningen av experimentet, men också skicklighet utredaren. Till exempel, om det finns 2 behandlingsgrupper med en önskad stickprovsstorlek på 10 bin per grupp, kan en någorlunda kompetent utredare samla minst 30 bin redogöra för misslyckade dissektioner och sluta med 20 användbara videoklipp att göra mål.
2. Minimera den tid som passerar mellan insamling och dissektion.
   OBS! Även om bin kan inrymmas i labbet för dagar före dissektion, andelen framgångsrika dissektioner (dvs. sannolikheten för att upprätthålla en stabil hjärtfrekvens i en dissekeras dorsal kärl) har observerats att minska i relation till den tid som bin är inrymda bort från kolonin.
   1. Ge bin med en källa för vatten och mat medan inrymt i labbet. för example, vid ett minimum, ger tillgång till ett 50% (vikt / volym) lösning av sackaros i vatten (detta är tillräckligt för löptider på mindre än 6 h). För längre perioder, ger bin tillgång till honung.
   2. Hus bin i labbet natten vid en temperatur av ca 32 ° C och 60-80% relativ fuktighet för att minska stress och undvika uttorkning.
3. Före dissektion, bedöva bin kort för att underlätta hanteringen.
   OBS: Detta kan minska andelen framgångsrika dissektioner och minska genomströmningen.
   1. Chill bina antingen genom att placera dem på is eller i kylskåp under precis tillräckligt länge för att reducera rörelser i syfte att hjälpa till vid hantering.
   2. Alternativt kort utsätta bin till _CO2 i syfte att underlätta hanteringen.
      OBS: Utökad exponering för kyla kan minska andelen framgångsrika dissektioner. Förlängd eller upprepad exponering för _CO2 kan också minska andelen framgångsrika dissektioner.

2. Dissektionav Dorsal bukväggen

OBS: Bin bör vara vid liv vid tiden för dissekering.

1. Använd pincett och / eller microdissection sax, ta bort ben och vingar för att underlätta dissektion av buken. Hålla en liten bägare eller liknande behållare fylld med destillerat vatten i närheten i syfte att skölja instrument mellan dissektioner.
2. Medan fasthållande biet med pincett, utnyttja microdissection sax för att klippa i sidled längs ryggens bukväggen mellan de första och andra tergites (se figur 1).

Figur 1: Rygg syn på bee buken. Den initiala snittet bör göras mellan den första och andra tergites, som betecknas med den röda linjen. Skalstreck = 1 mm. Klicka hennee för att se en större version av denna siffra.

3. Medan lätt gripa den bakre kanten av den andra tergite med pincett, skär longitudinellt längs varje sida av bee från den initiala snittet för att inträngningshuvudet (se figur 2). Var försiktig när du skär för att undvika punktering av mag-tarmkanalen.

Figur 2: Lateral vy av binas buken. De andra och tredje snitt skall göras längs endera sidan av buken, såsom betecknas med den röda linjen. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

4. Utbyta saxen för en andra uppsättning av fin pincett och använda dem för att noggrant separera dorsala bukväggen från resten of buken. Försiktigt ta bort Stinger och någon del av mag-tarmkanalen som förblir fäst till den dorsala bukväggen. Undvika bristning tarmen, eftersom innehållet kan belägga bukväggen och hindra visualisering av den dorsala kärlet.

Figur 3: Vy över ryggkärlet. När tarmen och stinger har tagits bort, är ryggens fartyget synlig längs mittlinjen av dissekerade rygg bukväggen. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

5. Ordna rygg bukväggen i önskad riktning under kameran så att ryggens fartyget är synlig (se figur 3). Utnyttja microdissection sax för att klippa bort överflödigt abdominal vägg som hindrar visualisering av den dorsala kärlet. Formen på rygg bukväggen bör likna en grund kopp eller skål när den är korrekt belägen.
   1. Eftersom ryggkärlet inte sträcker sig in i bakersta buken segment av bi, ta bort den sista tergite för att förbättra visualisering av ryggkärlet.
6. Med hjälp av en justerbar volym mikropipett, täcka ryggens fartyget med 10 pl av en isoton lösning för att upprätthålla fysiologiska förhållanden och underlätta en jämn hjärtslag.
   OBS: Den rekommenderade lösningen är kvart styrka Ringers lösning (0,120 g / L kalciumklorid, 0,105 g / L kaliumklorid, 0,050 g / L natriumbikarbonat och 2,250 g / L natriumklorid), som har visat sig underlätta en stabil, kontinuerlig hjärtslag.

3. Observation och Modulering av hjärtfrekvens

1. Tillåta den dorsala kärlet för att stå orörd tills en stabil, kontinuerlig hjärtslag uppnås(Vanligen inom 300 sek).
   OBS: Heartbeat visualiseras såsom rytmiska sammandragningar av den dorsala kärlet. Initialt kan det tyckas vara någon hjärtslag, särskilt om biet sövdes, men hjärtat kommer vanligtvis att återuppta stryk efter vila i isoton lösning under flera minuter och kan fortsätta slå i timmar, förutsatt att den förblir badade i lösning.
2. Mäta hjärtfrekvensen i termer av antalet slag per minut (BPM).
   1. Registrera antalet kontraktioner som observerades under en 60 sekunder period. Använd en handräknare och en timer för att underlätta denna process.
3. Mäta förändringen i hjärtfrekvens genom att spela in den observerade BPM före och efter behandling med en cardiomodulatory förening.
   OBS: Även om den tid som krävs för att observera en effekt på hjärtfrekvensen kan variera beroende på den förening som testas, kan typiskt observeras förändringar i hjärtfrekvens inom några minuter.
   1. Bestämma baslinjen puls omedelbart företillsats av något testförening.
      OBS: Post-behandling hjärtfrekvens kan vanligen bestämmas efter 90-120 sek.
   2. Förbereda potentiella cardiomodulators (t.ex., oktopamin) genom upplösning av föreningen i samma isoton lösning används för att bada den dorsala kärlet.
   3. Lägga testföreningarna till lösningen som omger den dorsala kärlet genom att använda en micropipetter.
4. För större noggrannhet och högre genomströmning, göra en videoinspelning av varje försöksperson och sedan använda videor att göra mål hjärtfrekvens vid ett senare tillfälle.
   OBS: Detta gör att en enda utredare att sprida dissektioner för att underlätta nästan kontinuerlig produktion av filmer. Vid inspelning av video, är det minsta rekommenderade längd ca 240 sek med någon testföreningen tillsätts vid 60 sek märket. Detta säkerställer att utredaren har en 60 sek fönster för att ha dödat baslinje hjärtfrekvens och sedan en annan 60 sek fönster för att ha dödat efterbehandling hjärtfrekvens 120 sekefter behandling.

Representative Results

Eftersom många av de farmakologiskt aktiva föreningarna som kan testas med användning av detta protokoll är inte lösliga i vatten, är det nödvändigt att ha en tillförlitlig lösningsmedel som kommer att tillåta testföreningar som skall levereras via isoton lösning används för att bada den dorsala kärlet. Dimetylsulfoxid (DMSO) är ett lösningsmedel som ofta används som en vehikel för avgivning av experimentella läkemedel och andra föreningar i djur ^8, och det har använts med framgång för detta ändamål i studier som undersökt effekten av pesticider på honungsbi hjärtaktivitet ^9. Följaktligen DMSO utvald som en potentiell bärare för att leverera testföreningar till ryggens fartyget, som krävde att det först testas för cardiomodulatory aktivitet. I detta protokoll är dissekerade ryggkärlet initialt badade i 10 pl kvartal styrka Ringers lösning och sedan hjärtfrekvens bestäms före tillsats testföreningar. Testföreningar are levereras vid en känd koncentration i 10 fil DMSO lösta i kvartalet hållfasthet Ringers lösning och därefter den dorsala kärlet observeras för senare förändringar i hjärtfrekvensen.

Före testning några föreningar, var ett koncentrationsområde av DMSO testas för någon effekt på hjärtfrekvensen, i förhållande till kvartal styrka Ringers lösning med 0% DMSO. DMSO löstes vid 0,2%, 2%, 10% och 20% volym / volym i kvartalet hållfasthet Ringers lösning för att testa en slutlig koncentration av 0,1%, 1%, 5% och 10% vid tillsättning i lika stor volym till lösningen redan badar ryggkärlet. Detta tillvägagångssätt användes, i motsats till tillsats av DMSO vid den önskade koncentrationen i de initiala 10 pl användes för att bada den dorsala kärlet, eftersom inte alla dissektion ger en stabil hjärtrytm. Om DMSO har en negativ effekt på hjärtfrekvensen, kan denna effekt inte kunna skiljas från en misslyckad dissektion. Hjärtfrekvens bedömdes omedelbart förelägga DMSO, och sedan återigen 120 sek senare. Figur 4 visar resultaten av detta experiment, som visar att 0,1% och 1% DMSO i lösning inte hade någon signifikant effekt på hjärtfrekvensen, i förhållande till det kvartal styrkan Ringers lösning utan DMSO, medan 5% och 10% DMSO minskade signifikant hjärtfrekvensen.

Figur 4: Effekt av DMSO på bee hjärtfrekvens. Figuren visar den procentuella förändringen i basala hjärtfrekvensen, som mäts i slag per minut. Behandling av honungsbiet rygg fartyg med 0,1% eller 1% DMSO volym / volym i kvartalet styrka Ringers lösning inte signifikant ökar eller minskar hjärtfrekvensen i förhållande till kvartal styrka Ringers lösning utan DMSO. Behandling med 5% eller 10% DMSO i lösning orsakar en signifikant minskning av hjärtfrekvensen. Resultaten uttrycks som medelvärde ± SEM (n = 10). * P <0,05 jämfört med 0% DMSO kontroll (Kruskal-Wallis test med Dunns multipla jämförelser test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att denna analys för att vara relevant, måste det vara möjligt att observera förändringar i hjärtfrekvens efter behandling med cardiomodulatory föreningar. Den biogena amin oktopamin är känt för att fungera som en neuromodulator i invertebrater ¹⁰ och har visat sig fungera som en cardioaccelerant i både fruktflugor ¹¹ och honungsbin ^7. Oktopamin testades mot fordonet (1% DMSO i kvartalet hållfasthet Ringers lösning) såsom beskrivits ovan vid koncentrationer av 100 nM, 10 ^ M, och 100 ^ M. Figur 5 visar resultaten av detta experiment, som visar att 10 ^ M och 100 ^ M koncentrationer av oktopamin signifikant ökad hjärtfrekvens.

t "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 5: Effekt av octopamine på bee hjärtfrekvens. Figuren visar den procentuella förändringen i basala hjärtfrekvensen, som mäts i slag per minut. Behandling av honungsbiet rygg fartyg med 100 nM octopamine inte signifikant ökar eller minskar hjärtfrekvensen i förhållande till fordonet (1% DMSO volym / volym i kvartalet styrka Ringers lösning). Behandling med 10 | iM och 100 | iM octopamine betydligt ökad hjärtfrekvens i förhållande till fordonet. Resultaten uttrycks som medelvärde ± SEM (n = 10). * P <0,05 vs vehikel-kontroll (Kruskal-Wallis test med Dunns multipla jämförelser test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments