Dissection und Beobachtung von Honey Bee Dorsal Schiff für Untersuchungen der Herzfunktion

Introduction

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist der Prüfer zu ermöglichen, schnell und einfach zu beobachten und die Wirkung zu quantifizieren, dass ein pharmakologisches Mittel auf die Herzfrequenz von Honigbienen hat. Bees, wie andere Insekten, haben ein offenes Kreislaufsystem, die Hämolymphe der Insekten Äquivalent von Blut während der gesamten Körperhöhle, bekannt als Hämocoel verbreitet. Die Zirkulation von Hämolymphe ist essentiell für den Transport von Nährstoffen, Immunfaktoren, Abfallprodukte sowie Neurohormone und andere Signalmoleküle ^1. Kreislauf wird durch die Rückengefäß erleichtert, die entlang der dorsalen Mittellinie des Insekts erstreckt, sowie Zubehör pulsatile Organe. Das Rückengefäß gliedert sich in zwei funktionell unterschiedliche Abschnitte, die das Herz in den Bauch und die Aorta im Thorax und Kopf bezeichnet. Propagated Kontraktionen in der Herzpumpe Hämolymphe in Richtung des Thorax und Kopf, während Zubehör pulsierender Organe gewährleisten Hämolymphe Fluss zu den Extremitäten.

2. Diese Methode ist weniger nützlich bei erwachsenen Bienen jedoch, da es schwierig sein kann, um das Rückengefäß durch die Bauchdecke deutlich anzuzeigen. Ein etablierter Ansatz zur Erfassung der Herzfrequenz in einer Vielzahl von Insekten, einschließlich Bienen, ist die Verwendung von Kontaktthermographie, die an der Außenseite des Insekten angewendet Thermistoren verwendet , um Herz Pulsationen ^3,4 detektieren. Die Herzfrequenz bei erwachsenen Bienen hat auch eine elektrophysiologische Technik aufgezeichnet wurden mit Hilfe eines elektrischen Impedanzsignals ^4,5 zu messen. Diese Technik erfordert das Einsetzen von Elektroden in das Tier neben dem Herzen und die Verwendung eines Impedanzwandlers aufzuzeichnen Herzschläge ^4. In ähnlicher Weise wurden Elektrokardiogramme verwendet, um DETECt elektrische Signale durch das Herz erzeugt und mit Videoaufzeichnung der bee ⁶ kombiniert Veränderungen in der Herzaktivität zu beobachten. Ein klarer Vorteil dieser Ansätze ist, dass die Herzfrequenz in einer intakten, lebenden Bienen bewertet wird, anstatt in einem seziert Probe, die die Verfügbarkeit des gesamten Spektrums von physiologischen Reaktionen im Fach hilft sicherzustellen. Die Herausforderungen dieser Ansätze umfassen Buchhaltung zur Immobilisierung oder anesthetization des Subjekts, die Notwendigkeit, außerhalb Variablen und Reize zu begrenzen, die die Herzfrequenz beeinflussen könnten, sowie eine entsprechende Liefermethode bestimmen, wann pharmakologische Wirkstoffe zu testen.

Ein weiterer Ansatz, der zur Untersuchung von bee Herzaktivität verwendet wurde , ist , um teilweise das Insekt um sezieren das Herz freizulegen, dann messen dorsal Kontraktionen Gefäß eine Kraftverschiebungswandler ⁷ verwendet wird . In diesem Protokoll wird das Herz ständig mit dem Laufen physiologischer Kochsalzlösung und Test co gebadetmpounds ⁷ kann in dieser Lösung für die Anwendung auf dem Gegenstand gelöst werden. Ein signifikanter Unterschied zwischen diesem Verfahren und den zuvor beschriebenen ist , dass der Bauchmark entfernt wird, um die Rolle zu beseitigen , dass das zentrale Nervensystem in Modulieren Herzfrequenz ⁵ spielen gezeigt ist. Das Ergebnis ist , dass die Basisherzschlag, die in der Regel ziemlich erratisch ist, stabilisiert sich bei einer viel niedrigeren Frequenz und Amplitude als üblicherweise in einem lebenden Insekts ^5,7 beobachtet. Was alle diese Methoden gemeinsam haben, ist, dass sie hoch spezialisierte und oft teure Ausrüstung erfordern, zusätzlich zu einem gewissen Maß an Know-how, um durchgeführt werden. Vielleicht ist der größte Nachteil ist, dass keiner dieser Ansätze sind besonders gut geeignet, um Versuche, die eine große Anzahl von Themen beinhalten testen, beispielsweise eine Bibliothek von potentiell cardiomodulatory Screening von Verbindungen.

Die größte Stärke des hier beschriebenen Ansatzist seine Einfachheit. Das Protokoll ist relativ einfach zu meistern, das Setup benötigt wenig Platz, und nur ein minimaler finanzieller Aufwand notwendig ist. Das Verfahren erfordert wenig mehr als einige Bienen, einige chirurgische Instrumente, einer isotonischen Lösung und entweder ein digitales Mikroskop oder ein traditionelles Mikroskop mit einer Digitalkamera. Bienen werden seziert die dorsale Gefäß und digitalen Videos verwendet werden, zu visualisieren die Herzfrequenz vor und nach der Behandlung mit pharmakologischen Mitteln zu erfassen. Obwohl Videoaufzeichnung tatsächlich nicht notwendig ist , Änderungen der Herzfrequenz zu beobachten, wird es den Durchsatz stark erhöhen (dh die Anzahl der Probanden , die in einer bestimmten Zeitspanne verarbeitet werden können). Der Prüfer kann die Effizienz zu maximieren, indem sie eine große Anzahl von Videos auf einmal aufzunehmen und dann später erzielte diese Videos zu einem günstigeren Zeitpunkt. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass Videos erlauben die Ermittler über zu starten, sollte der Scoring-Prozess unterbrochen werden, und machen es einfacher für die viewer bis auf die Behandlung, um Bias zu reduzieren geblendet werden.

Protocol

1. Erhebung und Erstellung von Testpersonen

1. Sammeln Sie die entsprechende Anzahl von Bienen aus der Kolonie.
   Hinweis: Die Anzahl benötigt, hängt nicht nur von der Größe und der Umfang des Experiments, sondern auch die Fähigkeit des Forschers. wenn es zwei Behandlungsgruppen mit einer gewünschten Probengröße von 10 Bienen pro Gruppe sind, zum Beispiel ein einigermaßen erfahrener Ermittler könnte mindestens 30 Bienen zu machen erfolglos Dissektionen sammeln und mit 20 nützlichen Videos am Ende punkten.
2. Minimieren Sie die Zeitspanne, die zwischen Sammlung und Präparation passiert.
   Hinweis: Obwohl Bienen kann im Labor für Tage vor der Dissektion untergebracht werden, wobei die Erfolgsrate von Dissektionen (dh die Wahrscheinlichkeit einer stabilen Herzfrequenz in einem seziert Rückengefäß aufrechtzuerhalten) wurde beobachtet , bezogen auf die Menge der Zeit zu verringern , dass Bienen sind weg von der Kolonie untergebracht.
   1. Geben Sie Bienen mit einer Quelle für Wasser und Nahrung, während im Labor untergebracht. Für EXAmple, auf ein Minimum, den Zugang zu einer 50% (w / v) Saccharoselösung in Wasser (dies ist ausreichend für Zeitdauern von weniger als 6 h). Für längere Zeiträume bieten Bienen den Honig gelangen.
   2. Haus Bienen im Labor über Nacht bei einer Temperatur von etwa 32 ° C und 60-80% relativer Luftfeuchtigkeit Stress zu reduzieren und Austrocknung zu vermeiden.
3. Vor der Präparation, betäuben die Bienen kurz in der Handhabung zu erleichtern.
   HINWEIS: Dies kann die Erfolgsrate von Dissektionen verringern und den Durchsatz zu verringern.
   1. Kühlen Sie die Bienen entweder, indem sie auf Eis gestellt oder in einen Kühlschrank für gerade lange genug, um zu reduzieren Bewegung, um bei der Handhabung zu erleichtern.
   2. Alternativ kurz Bienen zu CO ₂ , um bei der Handhabung zu erleichtern aussetzen.
      HINWEIS: Längere Einwirkung von Kälte kann die Erfolgsrate von Dissektionen reduzieren. Erweiterte oder wiederholter Exposition gegenüber CO ₂ kann auch die Erfolgsrate von Dissektionen reduzieren.

2. Dissectionvon dorsale Bauchwand

HINWEIS: Die Bienen sollten zum Zeitpunkt der Dissektion am Leben.

1. Mit einer Pinzette und / oder Mikrodissektion Schere, entfernen Sie die Beine und Flügel Dissektion des Bauches zu erleichtern. Halten Sie einen kleinen Becher oder einem ähnlichen Behälter mit destilliertem Wasser gefüllt in der Nähe zum Zwecke der Instrumente zwischen Dissektionen Spülen.
2. Während die Biene mit einer Pinzette zurückzuhalten, die Mikrodissektion Schere verwenden seitlich zwischen dem ersten und dem zweiten tergites (siehe Abbildung 1) entlang der dorsalen Bauchwand zu schneiden.

Abbildung 1: Dorsale Ansicht der Bienen Bauch. Der anfängliche Einschnitt sollte zwischen den ersten und zweiten tergites hergestellt werden, wie durch die rote Linie bezeichnet. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken siee eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Während die leichte Schulter der hinteren Kante des zweiten Tergit mit der Greifzange, die entlang jeder Seite der Biene von der anfänglichen Einschnitt in die Stinger längs geschnitten (siehe Abbildung 2). Seien Sie vorsichtig beim Durchstoßen des Magen-Darm-Trakt zu vermeiden Schneiden.

Abbildung 2: Seitenansicht der Bienen Bauch. Die zweite und dritte Einschnitte sollten entlang jeder Seite des Abdomens durchgeführt werden, wie durch die rote Linie bezeichnet. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4. Tauschen Sie die Schere für einen zweiten Satz von feinen Pinzette und verwenden sie sorgfältig auf die dorsale Bauchwand vom Rest trennen of den Bauch. Entfernen Sie vorsichtig die Stinger und einen Teil des Magen-Darm-Trakt, die an der dorsalen Bauchwand befestigt bleibt. Vermeiden Sie den Darm Bersten, als der Inhalt kann Mantel der Bauchdecke und Visualisierung des Rückengefäß behindern.

Abbildung 3: Ansicht des Rückengefäß. Sobald der Darm und Stinger entfernt worden sind, ist der Rückengefäß sichtbar entlang der Mittellinie der dorsalen Bauchwand seziert. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

5. Ordnen Sie die dorsalen Bauchwand in der gewünschten Ausrichtung unterhalb der Kamera , so dass das Rückengefäß sichtbar ist (siehe Abbildung 3). Nutzen Sie die Mikrodissektion Schere überschüssige ab wegzutrimmendominal Wand, die Visualisierung des dorsalen Fahrzeugs behindert wird. Die Form der dorsalen Bauchwand sollte eine flache Schale oder Schüssel ähneln, wenn sie richtig gelegen.
   1. Da das Rückengefäß nicht in die hinterste Abdominalsegment der Biene erweitern, entfernen Sie das letzte Tergit, um die Visualisierung des Rückengefäß zu verbessern.
6. Mit Hilfe eines einstellbaren Volumen-Mikropipette, decken Sie die Rückengefäß mit 10 ul einer isotonischen Lösung physiologischen Bedingungen zu erhalten und einen stetigen Herzschlag erleichtern.
   HINWEIS: Die empfohlene Lösung Viertel Stärke Ringer-Lösung (0,120 g / L Calciumchlorid, 0,105 g / l Kaliumchlorid, 0,050 g / L Natriumbicarbonat und 2,250 g / l Natriumchlorid), das eine stabile zu erleichtern gefunden wurde, kontinuierliche Herzschlag.

3. Beobachtung und Modulation der Herzfrequenz

1. Lassen Sie das Rückengefäß ungestört sitzen, bis eine stabile, kontinuierliche Herzschlag erreicht wird(In der Regel innerhalb von 300 sec).
   HINWEIS: Herzschlag als rhythmische Kontraktionen des dorsalen Gefäß sichtbar gemacht wird. Anfänglich kann es scheinen kein Herzschlag zu sein, besonders wenn die Biene anästhesiert wurde, aber das Herz wird in der Regel schlag fortgesetzt, nachdem mehrere Minuten in isotonischer Lösung ruhen und kann stundenlang weiter zu schlagen, vorausgesetzt, es bleibt in Lösung getaucht.
2. Messen Sie die Herzfrequenz in Bezug auf die Anzahl der Schläge pro Minute (BPM).
   1. Notieren Sie die Anzahl der Kontraktionen während eines 60 Sekunden Zeit beobachtet. Verwenden Sie einen Handtallykostenzähler und einen Timer, diesen Prozess zu erleichtern.
3. Messen Sie die Veränderung der Herzfrequenz durch die beobachtete BPM Aufzeichnung vor und nach der Behandlung mit einer cardiomodulatory Verbindung.
   HINWEIS: Obwohl die Zeit eine Wirkung auf die Herzfrequenz variieren von der Verbindung kann in Abhängigkeit zu beobachten erforderlich getestet werden, können Veränderungen der Herzfrequenz der Regel innerhalb weniger Minuten beobachtet werden.
   1. Bestimmen Sie die Basisherzfrequenz unmittelbar vor derdie Zugabe einer Testverbindung.
      HINWEIS: Die Nachbehandlung Herzfrequenz kann in der Regel nach 90 bis 120 Sekunden bestimmt werden.
   2. Bereiten Potential cardiomodulators (zB Octopamin) , indem die Verbindung in der gleichen isotonischen Lösung Auflösen verwendet , um die Rückengefäß baden.
   3. Fügen Sie die Testverbindungen zur Lösung des Rückengefäß umgeben von einer micropipetter verwendet.
4. Für eine höhere Genauigkeit und einen höheren Durchsatz, eine Videoaufzeichnung eines jeden Probanden machen und dann die Videos verwenden, um die Herzfrequenz zu einem späteren Zeitpunkt punkten.
   HINWEIS: Dies ermöglicht einen einzelnen Ermittler Dissektionen, um zu staffeln fast kontinuierliche Produktion von Videos zu erleichtern. Wenn die Aufnahme von Videos ist die empfohlene Mindestlänge ca. 240 sec bei jeder Testverbindung, bei der Markierung 60 Sekunden hinzugefügt. Dadurch wird sichergestellt, dass der Prüfer für Scoring-Basisherzfrequenz mit 60 sec Fenster hat und dann eine weitere 60 sec Fenster für Scoring Nachbehandlung Herzfrequenz 120 Sekundennach der Behandlung.

Representative Results

Da viele der pharmakologisch wirksamen Verbindungen, die nicht löslich sind, getestet werden kann in Wasser unter Verwendung dieses Protokolls ist es erforderlich, ein zuverlässiges Lösungsmittel zu haben, die Testverbindungen über die isotonische Lösung ermöglicht geliefert werden verwendet, um die Rückengefäß baden. Dimethylsulfoxid (DMSO) ist ein Lösungsmittel , das üblicherweise als Vehikel zur Abgabe von experimentellen Arzneimitteln und anderen Verbindungen in Tieren verwendet wird , ^8, und es wurde erfolgreich für diesen Zweck in Studien verwendet ⁹ die Wirkung von Pestiziden auf honey bee Herzaktivität zu untersuchen. Folglich wurde DMSO als potentielles Fahrzeug Verbindungen zur Abgabe von Test zur dorsalen Gefäß ausgewählt ist, die erforderlich ist, dass es zunächst für cardiomodulatory Aktivität getestet werden. In diesem Protokoll wird die seziert Rückengefäß zunächst in 10 ul Quartal Stärke Ringerlösung gebadet und dann wird die Herzfrequenz vor der Zugabe Testverbindungen bestimmt. Die Testverbindungen are bei einer bekannten Konzentration in 10 ul DMSO in Quartal Stärke Ringerlösung aufgelöst geliefert und dann wird das Rückengefäß für spätere Änderungen der Herzfrequenz beobachtet.

Vor alle Verbindungen zu testen, wurde für jede Wirkung auf die Herzfrequenz, bezogen auf Viertel Stärke Ringer-Lösung mit 0% DMSO ein Konzentrationsbereich von DMSO getestet. DMSO wurde bei 0,2%, gelöst, 2%, 10% und 20% v / v in Viertel Stärke Ringer-Lösung, um eine Endkonzentration von 0,1% zu testen, 1%, 5% und 10%, wenn in gleichen Volumen hinzugefügt die Lösung bereits Baden das Rückengefäß. Dieser Ansatz wurde verwendet, im Gegensatz zur Zugabe von DMSO in der gewünschten Konzentration in den anfänglichen 10 & mgr; l verwendet, um das Rückengefäß, um zu baden, da nicht jede Präparation einen stabilen Herzschlag ergibt. Wenn DMSO eine nachteilige Wirkung auf die Herzfrequenz hat, kann dieser Effekt nicht von einem ausgefallenen dissection unterscheidbar sein. Die Herzfrequenz wurde unmittelbar vor bewertetDMSO Zugabe, und dann wieder 120 Sekunden später. Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse dieses Experiments, die zeigen , dass 0,1% und 1% DMSO in Lösung auf die Herzfrequenz keinen signifikanten Effekt, bezogen auf das Quartal Stärke Ringerlösung ohne DMSO, während 5% und 10% DMSO deutlich Herzfrequenz verringert.

Abbildung 4: Wirkung von DMSO auf die Bienenherzfrequenz. Die Grafik zeigt die prozentuale Veränderung der basalen Herzfrequenz, wie in Schlägen pro Minute gemessen. Die Behandlung von Honigbiene Rückengefäß mit 0,1% oder 1% DMSO V / V in Quartal Stärke Ringer-Lösung nicht wesentlich erhöht oder verringern Herzfrequenz, bezogen auf Viertel Stärke Ringerlösung ohne DMSO. Behandlung mit 5% oder 10% DMSO in Lösung verursacht eine signifikante Abnahme der Herzfrequenz. Die Ergebnisse, ausgedrückt als Mittelwert ± SEM (n = 10). * P <0,05 vs 0% DMSO-Kontrolle (Kruskal-Wallis-Test mit Dunn multiple Vergleiche-Test). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Damit dieser Test relevant zu sein, muss es möglich sein, Veränderungen der Herzfrequenz mit cardiomodulatory Verbindungen nach der Behandlung zu beobachten. Das biogene Amin Octopamin ist bekannt , ¹⁰ als Neuromodulator in wirbellosen Tieren zu handeln und wurde ¹¹ und Honig als cardioaccelerant fliegt Bienen ⁷ in beiden Früchte gezeigt zu handeln. Octopamine wurde gegen Fahrzeug getestet (1% DMSO in Quartal Stärke Ringer-Lösung) als bei Konzentrationen von 100 nM, beschrieben über 10 & mgr; M und 100 & mgr; M. Figur 5 zeigt die Ergebnisse dieses Experiments, die zeigen , dass 10 uM und 100 uM Konzentrationen von Octopamin Herzfrequenz deutlich erhöht.

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Abbildung 5: Wirkung von Octopamin auf die Bienenherzfrequenz. Die Grafik zeigt die prozentuale Veränderung der basalen Herzfrequenz, wie in Schlägen pro Minute gemessen. Die Behandlung von Bienenrückengefäß Honig mit 100 nM Octopamin nicht wesentlich erhöht oder die Herzfrequenz relativ abnehmen zu Fahrzeug (1% DMSO V / V in Quartal Stärke Ringer-Lösung). Behandlung mit 10 uM und 100 uM Octopamin signifikant Herzfrequenz relativ zum Fahrzeug erhöht. Die Ergebnisse, ausgedrückt als Mittelwert ± SEM (n = 10). * P <0,05 vs Fahrzeugsteuerung (Kruskal-Wallis-Test mit Test Dunn multiple Vergleiche). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments