Introduction
L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di consentire al ricercatore di rapidamente e facilmente osservare e quantificare l'effetto che un agente farmacologico ha sulla frequenza cardiaca di api mellifere. Api, come altri insetti, hanno un sistema circolatorio aperto che diffonde emolinfa, l'equivalente insetti di sangue, durante la cavità del corpo, conosciuto come hemocoel. La circolazione di emolinfa è essenziale per il trasporto di sostanze nutritive, fattori immunitari, rifiuti, così neurohormones e altre molecole di segnalazione 1. La circolazione è facilitata dal vaso dorsale, che si estende lungo la linea mediana dorsale dell'insetto, nonché organi pulsatile accessori. Il vaso dorsale è divisa in due sezioni funzionalmente distinte, designato cuore nell'addome e l'aorta nel torace e la testa. contrazioni propagate nel emolinfa cuore pompa verso il torace e la testa, mentre gli organi pulsatile accessori assicurano il flusso di emolinfa alle estremità.
Un altro approccio che è stato usato per studiare l'attività cardiaca ape è di sezionare parzialmente l'insetto per esporre cuore, quindi misurare contrazioni vaso dorsale usando un trasduttore di spostamento forza 7. In questo protocollo, il cuore è continuamente bagnata con la corsa soluzione fisiologica e di prova compounds possono essere sciolti in questa soluzione per applicazione al soggetto 7. Una differenza significativa tra questo metodo e quelli precedentemente descritti è che il cordone nervoso ventrale è rimosso, eliminando il ruolo che il sistema nervoso centrale ha dimostrato di giocare in modulazione di frequenza cardiaca 5. Il risultato è che il battito cardiaco basale, che è di solito piuttosto irregolare, stabilizza ad una frequenza molto bassa e l'ampiezza a quello tipicamente osservato in un insetto vivente 5,7. Ciò che tutti questi metodi hanno in comune è che essi richiedono attrezzature altamente specializzate e spesso costosi, oltre ad un certo livello di competenza, per essere realizzato. Forse il più grande svantaggio è che nessuno di questi approcci sono particolarmente adatti per gli esperimenti che coinvolgono test un gran numero di soggetti, come ad esempio lo screening di una libreria di composti potenzialmente cardiomodulatory.
Il maggior punto di forza dell'approccio qui descrittoè la sua semplicità. Il protocollo è relativamente facile da padroneggiare la configurazione richiede poco spazio, ed è necessario solo un ingresso finanziario minimo. Il metodo richiede poco più di alcune api, alcuni strumenti chirurgici, una soluzione isotonica, e di un microscopio digitale o un microscopio tradizionale con una fotocamera digitale. Le api sono sezionati per visualizzare il vaso dorsale e video digitali vengono utilizzati per registrare la frequenza cardiaca prima e dopo il trattamento con agenti farmacologici. Sebbene la registrazione video non è effettivamente necessario per osservare i cambiamenti nella frequenza cardiaca, sarà notevolmente aumentare il throughput (cioè, il numero di soggetti che possono essere elaborati in un determinato periodo di tempo). L'investigatore può massimizzare l'efficienza registrando un gran numero di video in una sola volta e poi segnando questi video in un momento più conveniente. Un altro vantaggio di questo approccio è che i video permettono al ricercatore di ricominciare, se il processo di punteggio essere interrotto, e rendere più facile per la vdel visualizzatore accecare al trattamento, al fine di ridurre i pregiudizi.
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Protocol
1. Raccolta e preparazione dei soggetti di prova
- Raccogliere il numero appropriato di api dalla colonia.
NOTA: Il numero necessario dipende non solo le dimensioni e la portata di questo esperimento, ma anche l'abilità del ricercatore. Ad esempio, se ci sono 2 gruppi di trattamento con un campione desiderato di 10 api per gruppo, un investigatore ragionevolmente abile potrebbe raccogliere almeno 30 api per tenere conto di dissezioni senza successo e finire con 20 video utili per segnare. - Ridurre al minimo la quantità di tempo che intercorre tra la raccolta e la dissezione.
NOTA: Sebbene api possono essere alloggiati in laboratorio per giorni prima dissezione, il tasso di successo di dissezioni (cioè, la probabilità di mantenere una frequenza cardiaca stabile in un vaso dorsale sezionato) è stato osservato a diminuire rispetto alla quantità di tempo che le api sono alloggiati lontano dalla colonia.- Fornire api con una fonte di acqua e cibo, mentre ospitato in laboratorio. per example, come minimo, accessibile un 50% (w / v) di saccarosio in acqua (questo è sufficiente per durate inferiori a 6 ore). Per periodi più lunghi, forniscono le api accesso al miele.
- Casa api nella notte laboratorio ad una temperatura di circa 32 ° C e 60-80% di umidità relativa per ridurre lo stress ed evitare la disidratazione.
- Prima di dissezione, anestetizzare le api brevemente per aiutare nella gestione.
NOTA: Questo può diminuire il tasso di successo di dissezioni e ridurre il throughput.- Raffreddare le api avviene mediante l'immissione sul ghiaccio o in un frigorifero per il tempo sufficiente a ridurre il movimento al fine di aiutare nella gestione.
- In alternativa, esporre brevemente le api a CO 2 al fine di aiutare nella gestione.
NOTA: L'esposizione prolungata al freddo può ridurre il tasso di successo delle dissezioni. Estesa o ripetuta esposizione al CO 2 può anche ridurre il tasso di successo delle dissezioni.
2. La dissezionedi dorsale della parete addominale
NOTA: Le api devono essere vivi al momento della dissezione.
- Utilizzando pinze e / o forbici microdissezione, rimuovere le gambe e le ali per facilitare la dissezione del ventre. Mantenere un piccolo beaker o simile contenitore riempito con acqua distillata vicina allo scopo di risciacquo strumenti tra dissezioni.
- Mentre trattenete l'ape con una pinza, utilizzare le forbici per tagliare microdissezione lateralmente lungo la parete addominale dorsale tra il primo e il secondo tergiti (vedi Figura 1).
Figura 1: vista dorsale di api dell'addome. L'incisione iniziale deve essere fatta tra il primo e secondo tergiti, come indicato dalla linea rossa. Barra di scala = 1 mm. Si prega di cliccare il suoe per vedere una versione più grande di questa figura.
- Mentre leggermente tenendo l'estremità posteriore del secondo tergite con la pinza, tagliare longitudinalmente lungo ogni lato delle api dall'incisione iniziale al stinger (vedere Figura 2). Fare attenzione quando si tagliano per evitare la puntura del tratto gastrointestinale.
Figura 2: Vista laterale di api dell'addome. Il secondo e terzo incisioni devono essere effettuate lungo entrambi i lati del ventre, come indicato dalla linea rossa. Barra di scala = 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Scambiare le forbici per una seconda serie di pinza sottile e utilizzarli per separare accuratamente la parete addominale dorsale dal resto of dell'addome. Rimuovere delicatamente il stinger e qualsiasi parte del tratto gastrointestinale che rimane attaccata alla parete addominale dorsale. Evitare rottura dell'intestino, come il contenuto può rivestire la parete addominale ed impedire la visualizzazione del vaso dorsale.
Figura 3: Vista del vaso dorsale. Una volta che l'intestino e Stinger sono stati rimossi, il vaso dorsale è visibile lungo la linea mediana della parete addominale dorsale sezionato. Barra di scala = 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Disporre la parete addominale dorsali nell'orientamento desiderato sotto la telecamera in modo che il vaso dorsale è visibile (vedere Figura 3). Utilizzare le forbici per tagliare microdissezione via qualsiasi eccesso abmuro dominal che impedisce la visualizzazione del vaso dorsale. La forma della parete addominale dorsale dovrebbe essere simile a una tazza poco profonda o ciotola quando si trova in modo corretto.
- Poiché il vaso dorsale non si estende nel segmento addominale hindmost delle api, rimuovere il tergite finale per migliorare la visualizzazione del vaso dorsale.
- Utilizzando una micropipetta volume regolabile, coprire il vaso dorsale con 10 ml di soluzione isotonica di mantenere condizioni fisiologiche e facilitare un battito cardiaco costante.
NOTA: La soluzione consigliata è forza trimestre soluzione di Ringer (0,120 g di cloruro / L di calcio, cloruro di potassio 0,105 g / L, 0,050 g / L di bicarbonato di sodio, e 2.250 g / L di sodio cloruro), che è stato trovato per facilitare una stalla, battito cardiaco continuo.
3. Osservazione e modulazione di frequenza cardiaca
- Lasciare che il vaso dorsale di sedersi indisturbati fino ad ottenere una stabile, battito cardiaco continua(Di solito entro 300 sec).
NOTA: Heartbeat è visualizzato come contrazioni ritmiche del vaso dorsale. Inizialmente, ci possono sembrano essere alcun battito, specialmente se l'ape è stato anestetizzato, ma il cuore sarà solitamente riprendere battitura dopo riposo in soluzione isotonica per alcuni minuti e può continuare a battere per ore, purché rimane immerso nella soluzione. - Misurare la frequenza cardiaca in termini di numero di battiti al minuto (BPM).
- Registrare il numero di contrazioni osservati durante un periodo di 60 sec. Utilizzare un contatore del riscontro della mano e un timer per facilitare questo processo.
- Misurare la variazione della frequenza cardiaca registrando il BPM osservata prima e dopo il trattamento con un composto cardiomodulatory.
NOTA: Sebbene il tempo necessario per osservare un effetto sulla frequenza cardiaca può variare a seconda del composto in prova, variazioni della frequenza cardiaca in genere può essere osservato in pochi minuti.- Determinare la frequenza cardiaca di base immediatamente primal'aggiunta di composti di prova.
NOTA: la frequenza cardiaca post-trattamento di solito può essere determinato dopo 90 a 120 sec. - Preparare potenziali cardiomodulators (ad esempio, octopamina) sciogliendo il composto nella stessa soluzione isotonica utilizzata per bagnare il vaso dorsale.
- Aggiungere i composti in esame alla soluzione circonda il vaso dorsale utilizzando un micropipetter.
- Determinare la frequenza cardiaca di base immediatamente primal'aggiunta di composti di prova.
- Per una maggiore precisione e un throughput più elevato, effettuare una registrazione video di ciascun soggetto di prova e quindi utilizzare i video a segnare la frequenza cardiaca in un secondo momento.
NOTA: Questo consente a un singolo ricercatore di scaglionare dissezioni al fine di facilitare la produzione quasi continua di video. Durante la registrazione video, la lunghezza minima consigliata è di circa 240 sec con qualsiasi composto di prova che si aggiunge alla boa 60 sec. Questo assicura che il ricercatore ha una finestra di 60 secondi per aver frequenza basale cuore e poi un'altra finestra di 60 secondi per aver post-trattamento della frequenza cardiaca 120 secdopo il trattamento.
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Representative Results
Poiché molti dei composti farmacologicamente attivi che possono essere testati utilizzando questo protocollo non sono solubili in acqua, è necessario avere un solvente affidabile che consenta composti di prova da consegnare tramite la soluzione isotonica utilizzata per bagnare il vaso dorsale. Dimetilsolfossido (DMSO) è un solvente che viene comunemente utilizzato come veicolo per fornire farmaci sperimentali e altri composti negli animali 8, ed è stato usato con successo per questo scopo in studi che esaminano l'effetto dei pesticidi sulla ape attività cardiaca 9. Di conseguenza, DMSO è stato selezionato come potenziale veicolo per fornire composti di prova per il vaso dorsale, che richiedeva che prima testato per l'attività cardiomodulatory. In questo protocollo, il vaso dorsale sezionato è inizialmente immerso in 10 ml di soluzione di forza quarto di Ringer e quindi la frequenza cardiaca è determinata prima di aggiungere composti di prova. composti di prova are consegnato ad una concentrazione nota in 10 ml di DMSO disciolti in soluzione forza trimestre di Ringer e quindi il vaso dorsale si osserva per le successive variazioni della frequenza cardiaca.
Prima di testare composti, un intervallo di concentrazione di DMSO è stato testato per alcun effetto sulla frequenza cardiaca, rispetto alla soluzione di forza trimestre di Ringer con 0% DMSO. DMSO è stata sciolta in 0,2%, 2%, 10%, e 20% v / v in soluzione forza trimestre di Ringer per testare una concentrazione finale di 0,1%, 1%, 5% e 10% quando aggiunto in egual volume la soluzione già bagnando il vaso dorsale. Questo approccio è stato utilizzato, al contrario di aggiunta DMSO alla concentrazione desiderata nei primi 10 microlitri utilizzati per bagnare il vaso dorsale, perché non ogni dissezione produce un battito stabile. Se DMSO ha un effetto negativo sulla frequenza cardiaca, questo effetto potrebbe non essere distinguibile da una dissezione fallito. La frequenza cardiaca è stata valutata immediatamente primaaggiungendo DMSO, e poi ancora 120 sec tardi. La Figura 4 mostra i risultati di questo esperimento, dimostrando che lo 0,1% e 1% DMSO in soluzione non ha avuto effetto significativo sulla frequenza cardiaca, rispetto alla forza trimestre soluzione di Ringer senza DMSO, considerando che il 5% e il 10% DMSO significativamente diminuita frequenza cardiaca.
Figura 4: Effetto del DMSO sulla frequenza cardiaca ape. Il grafico mostra la variazione percentuale della frequenza cardiaca basale, misurata in battiti al minuto. Trattamento di miele d'api vaso dorsale con 0,1% o 1% DMSO v / v in soluzione forza quarto di Ringer non aumentare o diminuire la frequenza cardiaca, rispetto alla soluzione di forza quarto di Ringer senza DMSO in modo significativo. Il trattamento con 5% o 10% DMSO in soluzione provoca una significativa diminuzione della frequenza cardiaca. Risultati espressi come media ± SEM (n = 10). * P <0.05 vs controllo DMSO 0% (Kruskal-Wallis prova con test di confronto multiplo di Dunn). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Affinché questo test per essere rilevante, deve essere possibile osservare cambiamenti nella frequenza cardiaca a seguito di trattamento con composti cardiomodulatory. L'ammina octopamina biogenico è noto per agire come un neuromodulator in invertebrati 10 ed è stato dimostrato di agire come un cardioaccelerant sia frutta mosche 11 e api 7. Octopamine stato testato contro veicolo (1% in soluzione DMSO forza trimestre di Ringer) come descritto in precedenza a concentrazioni di 100 nM, 10 mM e 100 mM. La Figura 5 mostra i risultati di questo esperimento, dimostrando che 10 mM e 100 mM concentrazioni di octopamina significativo aumento della frequenza cardiaca.
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Figura 5: Effetto di octopamina sulla frequenza cardiaca ape. Il grafico mostra la variazione percentuale della frequenza cardiaca basale, misurata in battiti al minuto. Trattamento di miele d'api vaso dorsale con 100 nM octopamina non significativamente aumentare o diminuire la frequenza cardiaca rispetto al veicolo (1% DMSO v / v in soluzione forza quarto di Ringer). Il trattamento con 10 micron e 100 micron octopamina ha aumentato significativamente la frequenza cardiaca rispetto al veicolo. Risultati espressi come media ± SEM (n = 10). * P <0.05 vs controllo del veicolo (test di Kruskal-Wallis con test di confronto multiplo di Dunn). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dino-Lite Edge digital USB microscope | Dino-Lite | AM4815ZT | Any digital microscope or similar setup will suffice |
| Microscope stand | Dino-Lite | RK-10 | Any stand appropriate for the digital microscope |
| Laptop or PC | Necessary for digital microscope | ||
| Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades) | World Precision Instruments | 14003 | Any similar scissors suitable for microdissection will suffice |
| Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair) | World Precision Instruments | 504482 | Any similar forceps suitable for microdissection will suffice |
| Ringers solution 1/4 strength tablets | Sigma-Aldrich | 96724-100TAB | |
| Dissecting tray | Any surface suitable for microdissection | ||
| Single channel 10 µl pipette | Any device capable of accurately delivering 10 µl volume | ||
| Pipette tips | |||
| Small beaker or container of water | Used to rinse instruments between subjects | ||
| Hand tally counter | Office Depot | 295033 | Any similar product will suffice |
| Timer | Office Depot | 644219 | Any similar product will suffice |
| Deionized water | Preparation of Ringers solution and rinsing instruments |
References
- Klowden, M. J. Circulatory Systems. Physiological Systems in Insects, 3rd Edition. , 3rd, 365-413 (2013).
- League, G. P., Onuh, O. C., Hillyer, J. F. Comparative structural and functional analysis of the larval and adult dorsal vessel and its role in hemolymph circulation in the mosquito Anopheles gambiae. J Exp Biol. 218 (Pt 3), 370-380 (2015).
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- Schwab, E. R., Chilson, R. A., Eddleman, C. D. Heartbeat Rate Modulation Mediated by the Ventral Nerve Cord in the Honey-Bee, Apis-Mellifera. J Comp Physiol B-Biochem Syst Environ Physiol. 161 (6), 602-610 (1991).
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