Introduction
El objetivo general de esta metodología es permitir que el investigador para observar y cuantificar el efecto que tiene un agente farmacológico en el ritmo cardíaco de las abejas melíferas forma rápida y sencilla. Las abejas, como otros insectos, tienen un sistema circulatorio abierto que difunde hemolinfa, el equivalente de insectos de la sangre, a través de la cavidad del cuerpo, conocida como la hemocoel. La circulación de hemolinfa es esencial para el transporte de nutrientes, factores inmunológicos, productos de desecho, así neurohormonas y otras moléculas de señalización 1. Circulation es facilitado por el vaso dorsal, que se extiende a lo largo de la línea media dorsal del insecto, así como los órganos pulsátiles accesorios. El vaso dorsal se divide en dos secciones funcionalmente distintas, designado el corazón en el abdomen y la aorta en el tórax y la cabeza. contracciones propagadas en la hemolinfa corazón bombee hacia el tórax y la cabeza, mientras que los órganos pulsátiles accesorios garantizan el flujo de la hemolinfa de las extremidades.
Otro enfoque que se ha utilizado para el estudio de la actividad cardiaca de abeja es para diseccionar parcialmente el insecto con el fin de exponer el corazón, a continuación, medir contracciones vaso dorsal utilizando un transductor de desplazamiento de fuerza 7. En este protocolo, el corazón se baña continuamente con solución salina fisiológica en marcha y prueba de compounds se pueden disolver en esta solución para su aplicación al objeto 7. Una diferencia significativa entre este método y las descritas anteriormente es que el cordón nervioso ventral se elimina, eliminando el papel que el sistema nervioso central se ha demostrado que desempeña en la modulación de la frecuencia cardíaca 5. El resultado es que el latido del corazón de referencia, que suele ser bastante irregular, se estabiliza a una frecuencia mucho más baja y amplitud que se observa típicamente en un insecto que viven 5,7. Lo que todos estos métodos tienen en común es que requieren un equipo altamente especializado y, a menudo caro, además de un cierto nivel de experiencia, con el fin de llevar a cabo. Tal vez la mayor desventaja es que ninguno de estos enfoques son particularmente adecuados para experimentos que involucran el examen de un gran número de temas, tales como selección de una biblioteca de compuestos potencialmente cardiomodulatory.
La mayor fortaleza del método descrito aquíes su simplicidad. El protocolo es relativamente fácil de dominar, la instalación requiere poco espacio, y sólo una entrada financiero mínimo es necesario. El método requiere poco más que algunas abejas, algunos instrumentos quirúrgicos, una solución isotónica, y, o bien un microscopio digital o un microscopio tradicional con una cámara digital. Las abejas son diseccionados para visualizar el vaso dorsal y vídeos digitales se utilizan para registrar la frecuencia cardíaca antes y después del tratamiento con agentes farmacológicos. Aunque la grabación de vídeo no es realmente necesario para observar los cambios en el ritmo cardíaco, además de aumentar considerablemente el rendimiento (es decir, el número de sujetos que se pueden procesar en un período de tiempo determinado). El investigador puede maximizar la eficiencia mediante el registro de un gran número de vídeos a la vez y, posteriormente, marcando estos videos en un momento más conveniente. Otra ventaja de este enfoque es que los vídeos permiten al investigador a empezar de nuevo, se debe interrumpir el proceso de puntuación, y que sea más fácil para el vdel Visor para cegar al tratamiento con el fin de reducir el sesgo.
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Protocol
1. Recogida y preparación de los sujetos de prueba
- Recoger el número apropiado de las abejas de la colonia.
NOTA: El número necesario depende no sólo del tamaño y alcance del experimento, sino también la habilidad del investigador. Por ejemplo, si hay 2 grupos de tratamiento con un tamaño deseado de la muestra de 10 abejas por grupo, un investigador experto razonablemente podría recoger un mínimo de 30 abejas para dar cuenta de las disecciones sin éxito y terminar con 20 videos útiles para marcar. - Minimizar la cantidad de tiempo que transcurre entre la recolección y la disección.
NOTA: A pesar de abejas pueden ser alojados en el laboratorio para día antes de la disección, la tasa de éxito de las disecciones (es decir, la probabilidad de que el mantenimiento de un ritmo cardíaco estable en un vaso dorsal diseccionado) se ha observado para disminuir con relación a la cantidad de tiempo que las abejas se encuentran fuera de la colonia.- Proporcionar abejas con una fuente de agua y alimentos, mientras alojados en el laboratorio. para example, como mínimo, proporcionar acceso a un 50% de solución de sacarosa en agua (w / v) (esto es suficiente para duraciones de menos de 6 h). Para períodos más largos, proporcionan acceso a las abejas de miel.
- abejas de la casa de la noche a la mañana de laboratorio a una temperatura de aproximadamente 32 ° C y 60-80% de humedad relativa para reducir el estrés y evitar la deshidratación.
- Antes de la disección, anestesiar abejas brevemente para ayudar en la manipulación.
NOTA: Esto puede disminuir la tasa de éxito de las disecciones y reducir el rendimiento.- Enfriar las abejas ya sea colocándolos en hielo o en un refrigerador durante el tiempo suficiente para reducir el movimiento con el fin de ayudar en el manejo.
- Alternativamente, exponer brevemente las abejas a CO 2 con el fin de ayudar en el manejo.
NOTA: La exposición prolongada al frío puede reducir la tasa de éxito de las disecciones. Extendido o repetida exposición al CO 2 también puede reducir la tasa de éxito de las disecciones.
2. DisecciónDorsal de la pared abdominal
NOTA: Las abejas deben estar vivos en el momento de la disección.
- El uso de pinzas y / o tijeras de microdisección, eliminar patas y las alas para facilitar la disección del abdomen. Mantenga un pequeño vaso de precipitados o recipiente similar lleno de agua destilada cercano con el fin de enjuagar los instrumentos entre disecciones.
- Mientras que restringir la abeja con fórceps, utilizar las tijeras de microdisección para cortar lateralmente a lo largo de la pared abdominal dorsal entre la primera y segunda tergites (véase la Figura 1).
Figura 1: Vista dorsal del abdomen de la abeja. La incisión inicial debe hacerse entre la primera y segunda tergites, como se indica mediante la línea roja. Barra de escala = 1 mm. Por favor, haga clic en ellae para ver una versión más grande de esta figura.
- Aunque ligeramente agarrando el borde posterior de la segunda Tergito con las pinzas, corta longitudinalmente a lo largo de cada lado de la abeja de la incisión inicial a la aguijón (ver Figura 2). Tenga cuidado al cortar para evitar perforar el tubo digestivo.
Figura 2: Vista lateral del abdomen de la abeja. El segundo y tercer incisiones deben hacerse a lo largo de cada lado del abdomen, como se indica mediante la línea roja. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Intercambiar las tijeras por un segundo juego de pinzas finas y utilizarlos para separar cuidadosamente la pared abdominal dorsal del resto of abdomen. Retire con cuidado el aguijón y cualquier parte del tracto gastrointestinal que permanece unido a la pared abdominal dorsal. Evitar la ruptura de la tripa, ya que los contenidos pueden recubrir la pared abdominal y dificultan visualización del vaso dorsal.
Figura 3: Vista del vaso dorsal. Una vez que el intestino y aguijón se han eliminado, el vaso dorsal es visible a lo largo de la línea media de la pared abdominal dorsal diseccionado. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Organizar la pared abdominal dorsal en la orientación deseada por debajo de la cámara para que el vaso dorsal es visible (véase la Figura 3). Utilizar las tijeras de microdisección para recortar cualquier exceso de abdominal pared que impide la visualización del vaso dorsal. La forma de la pared abdominal dorsal debe ser similar a una taza o recipiente poco profundo cuando situada correctamente.
- Desde el vaso dorsal no se extiende en el segmento abdominal retaguardia de la abeja, quitar el Tergito final con el fin de mejorar la visualización del vaso dorsal.
- Utilizando una micropipeta de volumen ajustable, cubrir el vaso dorsal con 10 l de una solución isotónica para mantener las condiciones fisiológicas y facilitar un constante latido del corazón.
NOTA: La solución recomendada es la fuerza trimestre solución de Ringer (0,120 g / l de cloruro de calcio, 0.105 g / L de cloruro de potasio, 0,050 g / L de bicarbonato de sodio, y 2,250 g / L de cloruro de sodio), que se ha encontrado para facilitar un establo, latido continuo.
3. La observación y la modulación del ritmo cardíaco
- Permitir que el vaso dorsal permanezca inmóvil hasta que se logre un pulso continuo estable(Normalmente dentro de 300 segundos).
NOTA: El latido del corazón es visualizado como contracciones rítmicas del vaso dorsal. Inicialmente, puede parecer que no hay latido del corazón, especialmente si la abeja fue anestesiado, pero el corazón latiendo generalmente reanudar después de descansar en solución isotónica durante varios minutos y puede seguir batiendo durante horas, siempre que sigan siendo bañado en solución. - Medir la frecuencia cardíaca en términos del número de latidos por minuto (BPM).
- Registrar el número de contracciones observadas durante un periodo de 60 seg. Utilizar un contador de cuenta de la mano y un temporizador para facilitar este proceso.
- Medir el cambio en la frecuencia cardíaca mediante el registro de los BPM observado antes y después del tratamiento con un compuesto cardiomodulatory.
NOTA: Aunque el tiempo necesario para observar un efecto sobre la frecuencia cardíaca puede variar dependiendo del compuesto que se está probando, los cambios en la frecuencia cardíaca normalmente se pueden observar dentro de minutos.- Determinar la frecuencia cardíaca basal inmediatamente antes dela adición de cualquier compuesto de prueba.
NOTA: la frecuencia cardiaca post-tratamiento por lo general se puede determinar después de 90 a 120 seg. - Preparar potenciales cardiomodulators (por ejemplo, octopamina) disolviendo el compuesto en la misma solución isotónica usada para bañar al vaso dorsal.
- Añadir los compuestos de ensayo a la solución que rodea el vaso dorsal mediante la utilización de una micropipeta.
- Determinar la frecuencia cardíaca basal inmediatamente antes dela adición de cualquier compuesto de prueba.
- Para una mayor precisión y un mayor rendimiento, una grabación de vídeo de cada sujeto de prueba y luego usar los videos para marcar el ritmo cardíaco en un momento posterior.
NOTA: Esto permite que un solo investigador escalonar disecciones con el fin de facilitar la producción casi continua de videos. Cuando la grabación de vídeos, la longitud mínima recomendada es de aproximadamente 240 segundos con cualquier compuesto de ensayo que se añade en la marca de 60 seg. Esto asegura que el investigador tiene una ventana de 60 seg para asegurar la frecuencia cardíaca basal y luego otra ventana 60 seg para asegurar la frecuencia cardíaca post-tratamiento 120 secdespués del tratamiento.
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Representative Results
Dado que muchos de los compuestos farmacológicamente activos que pueden ser probados usando este protocolo no son solubles en agua, es necesario tener un disolvente fiable que permitirá a los compuestos de ensayo para ser entregados a través de la solución isotónica usada para bañar al vaso dorsal. Dimetil sulfóxido (DMSO) es un disolvente que se utiliza comúnmente como un vehículo para la administración de fármacos experimentales y otros compuestos en los animales 8, y se ha utilizado con éxito para este propósito en los estudios que examinan el efecto de los pesticidas en la actividad cardíaca abeja de la miel 9. En consecuencia, DMSO fue seleccionado como un vehículo potencial para la entrega de los compuestos de ensayo en el recipiente de dorsal, que requiere que primero se ensayó la actividad cardiomodulatory. En este protocolo, el vaso dorsal diseccionado es bañado inicialmente en 10 l de solución al cuarto de Ringer y la frecuencia cardíaca se determina antes de añadir los compuestos de ensayo. Los compuestos de ensayo are entregado a una concentración conocida en 10 l de DMSO disueltos en solución al cuarto de Ringer y luego se observa el vaso dorsal para los cambios posteriores en la frecuencia cardíaca.
Antes de probar cualquier compuesto, un intervalo de concentración de DMSO fue probado para cualquier efecto sobre la frecuencia cardíaca, con relación a la solución de fuerza trimestre de Ringer con 0% de DMSO. DMSO se disolvió a 0,2%, 2%, 10% y 20% v / v en solución al cuarto de Ringer con el fin de probar una concentración final de 0,1%, 1%, 5% y 10% cuando se añade en un volumen igual a la solución ya bañando el vaso dorsal. Este enfoque se utilizó, en lugar de la adición de DMSO a la concentración deseada en los 10 l iniciales utilizados para bañar al vaso dorsal, porque no todos los disección produce un latido del corazón estable. Si DMSO tiene un efecto adverso sobre la frecuencia cardiaca, este efecto podría no ser distinguible de una disección fallado. La frecuencia cardíaca se evaluó inmediatamente antes dela adición de DMSO, y luego de nuevo 120 seg después. La Figura 4 muestra los resultados de este experimento, lo que demuestra que 0,1% y 1% de DMSO en la solución no tuvo ningún efecto significativo sobre la frecuencia cardiaca, con relación a la fuerza trimestre solución de Ringer sin DMSO, mientras que 5% y 10% de DMSO se redujo significativamente la frecuencia cardiaca.
Figura 4: Efecto de DMSO sobre la frecuencia cardíaca de abeja. El gráfico muestra el porcentaje de variación de la frecuencia cardíaca basal, tal como se mide en latidos por minuto. El tratamiento de vaso dorsal abeja de la miel con 0,1% o 1% de DMSO v / v en solución al cuarto de Ringer no aumenta de manera significativa o disminuir la frecuencia cardíaca, con relación a la solución de fuerza trimestre de Ringer sin DMSO. El tratamiento con 5% o 10% DMSO en solución provoca una disminución significativa en la frecuencia cardíaca. Los resultados se expresan como media ± SEM (n = 10). * P <0,05 frente a control de DMSO del 0% (Prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para que este ensayo sea relevante, debe ser posible observar cambios en la frecuencia cardiaca tras el tratamiento con compuestos cardiomodulatory. La octopamina amina biogénica se sabe que actúa como un neuromodulador en invertebrados 10 y se ha demostrado que actúa como un cardioaccelerant tanto en moscas de la fruta 11 y abejas de miel 7. Octopamina se ensayó frente a vehículo (DMSO al 1% en solución al cuarto de Ringer) como se describe anteriormente a concentraciones de 100 nM, 10 mM, y 100 mM. Figura 5 muestra los resultados de este experimento, lo que demuestra que 10 mM y 100 mM concentraciones de octopamina aumentaron significativamente la frecuencia cardiaca.
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Figura 5: Efecto de la octopamina en el ritmo cardíaco de abeja. El gráfico muestra el porcentaje de variación de la frecuencia cardíaca basal, tal como se mide en latidos por minuto. El tratamiento de vaso dorsal abeja de la miel con 100 nM octopamina no aumenta significativamente o disminuir la frecuencia cardiaca con respecto al vehículo (1% de DMSO v / v en solución al cuarto de Ringer). El tratamiento con 10 mM y 100 mM octopamina aumentó significativamente la frecuencia cardiaca respecto al vehículo. Los resultados se expresan como media ± SEM (n = 10). * P <0,05 frente al control del vehículo (prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dino-Lite Edge digital USB microscope | Dino-Lite | AM4815ZT | Any digital microscope or similar setup will suffice |
| Microscope stand | Dino-Lite | RK-10 | Any stand appropriate for the digital microscope |
| Laptop or PC | Necessary for digital microscope | ||
| Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades) | World Precision Instruments | 14003 | Any similar scissors suitable for microdissection will suffice |
| Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair) | World Precision Instruments | 504482 | Any similar forceps suitable for microdissection will suffice |
| Ringers solution 1/4 strength tablets | Sigma-Aldrich | 96724-100TAB | |
| Dissecting tray | Any surface suitable for microdissection | ||
| Single channel 10 µl pipette | Any device capable of accurately delivering 10 µl volume | ||
| Pipette tips | |||
| Small beaker or container of water | Used to rinse instruments between subjects | ||
| Hand tally counter | Office Depot | 295033 | Any similar product will suffice |
| Timer | Office Depot | 644219 | Any similar product will suffice |
| Deionized water | Preparation of Ringers solution and rinsing instruments |
References
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- League, G. P., Onuh, O. C., Hillyer, J. F. Comparative structural and functional analysis of the larval and adult dorsal vessel and its role in hemolymph circulation in the mosquito Anopheles gambiae. J Exp Biol. 218 (Pt 3), 370-380 (2015).
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