Dissektion og Observation af Honey Bee Dorsal Vessel for Studier af hjertefunktion

Introduction

Det overordnede mål med denne metode er at give undersøgeren for hurtigt og nemt observere og kvantificere den virkning, at et farmakologisk middel har på pulsen af ​​honningbier. Bier, ligesom andre insekter, har et åbent kredsløb, der udbreder hemolymph, insekt ækvivalent af blod, hele kroppen hulrum, kendt som hemocoel. Cirkulationen af hæmolymfe er nødvendige for transport af næringsstoffer, immunstoffer, affaldsprodukter, samt neurohormones og andre signalmolekyler ^1. Cirkulation lettes af den dorsale fartøj, der strækker sig langs den dorsale midtlinie insektets, samt accessoriske pulserende organer. Den dorsale fartøj er opdelt i to funktionelt forskellige sektioner, betegnet hjertet i maven og aorta i brystkassen og hovedet. Opformerede sammentrækninger i hjertet pumpe hæmolymfe mod brystkassen og hovedet, mens tilbehør pulserende organer sikrer hemolymph flow til ekstremiteterne.

2. Denne metode er mindre nyttigt i voksne bier, dog, som det kan være vanskeligt klart at se den dorsale beholderen gennem bugvæggen. En etableret fremgangsmåde til optagelse puls i en række forskellige insekter, herunder bier, er brugen af kontakt termografi, som anvender termistorer anvendes på det ydre af insektet til at detektere kardiale pulsationer ^3,4. Puls hos voksne bier er også blevet registreret ved hjælp af en elektrofysiologisk teknik til at måle en elektrisk impedans signal ^4,5. Denne teknik kræver indsættelse af elektroder i dyret ved siden af hjertet og brug af en impedans-konverter til at registrere hjerteslag ^4. Tilsvarende er elektrokardiogram blevet anvendt til at DETECt elektriske signaler produceret af hjerte og kombineret med videooptagelse af bi at observere ændringer i hjerteaktivitet ^6. En klar fordel for disse tilgange er, at pulsen er vurderet i en intakt, levende bi, snarere end i en dissekeret prøve, som er med til at sikre tilgængeligheden af ​​hele spektret af fysiologiske reaktioner i emnet. Udfordringerne i disse tilgange omfatter regnskab for immobilisering eller bedøvelse af emnet, at det er nødvendigt at begrænse eksterne variabler og stimuli, der kan ændre puls, samt bestemmer en passende leveringsmetode ved test farmakologiske agenter.

En anden fremgangsmåde, der har været anvendt til undersøgelse af bi hjerteaktivitet er at delvist dissekere insektet for at blotlægge hjertet, derefter måle dorsale fartøj sammentrækninger med en kraft forskydningstransducer ^7. I denne protokol, er hjertet kontinuerligt badet med rindende fysiologisk saltvand og test compounds kan opløses i denne opløsning for ansøgning til emnet ^7. En væsentlig forskel mellem denne fremgangsmåde og de tidligere beskrevne er, at den ventrale nerve ledningen er fjernet, hvilket eliminerer den rolle, det centrale nervesystem har vist sig at spille i modulering puls ^5. Resultatet er, at den basislinje hjerteslag, som normalt er ganske uberegnelig, stabiliserer ved en meget lavere frekvens og amplitude end der er normalt i en levende insekt ^5,7. Hvad alle disse metoder har til fælles er, at de kræver højt specialiseret og ofte dyre udstyr, ud over et vist niveau af ekspertise, for at blive gennemført. Måske er den største ulempe er, at ingen af ​​disse tilgange er særdeles velegnede til eksperimenter, der indgår forsøg et stort antal patienter, såsom screening af et bibliotek af potentielt cardiomodulatory forbindelser.

Den største styrke af den fremgangsmåde, der er beskrevet herer dets enkelhed. Protokollen er relativt let at mestre, opsætningen kræver lidt plads, og kun en minimal økonomisk input er nødvendig. Fremgangsmåden kræver lidt mere end nogle bier, et par kirurgiske instrumenter, en isotonisk opløsning, og enten en digital mikroskop eller en traditionel mikroskop med et digitalt kamera. Bier dissekeres at visualisere den dorsale fartøj og digitale videoer bruges til at registrere pulsen før og efter behandling med farmakologiske midler. Selvom videooptagelse er faktisk ikke nødvendigt at observere ændringer i hjertefrekvensen, vil det i høj grad øge throughput (dvs. antallet af emner, der kan behandles i en given mængde tid). Investigator kan maksimere effektiviteten ved at optage et stort antal videoer på én gang, og så senere udføre disse videoer på et mere belejligt tidspunkt. En anden fordel ved denne fremgangsmåde er, at videoer tillader investigator at starte forfra, bør scoring processen afbrydes, og gøre det lettere for viewer skal blindet for behandlingen for at reducere skævhed.

Protocol

1. Indsamling og klargøring af testpersoner

1. Saml det nødvendige antal bier fra kolonien.
   BEMÆRK: Antallet behov afhænger ikke kun størrelsen og omfanget af forsøget, men også dygtighed af investigator. For eksempel, hvis der er 2 behandlingsgrupper med en ønsket prøvestørrelse på 10 bier pr gruppe, kan en rimelig dygtig investigator indsamle mindst 30 bier at tage højde for mislykkede dissektioner og ender med 20 nyttige videoer at score.
2. Minimer den tid der går mellem indsamling og dissektion.
   BEMÆRK: Selvom bier kan rummes i laboratoriet for dage før dissektion, succesraten for dissektioner (dvs. sandsynligheden for at opretholde en stabil puls i en dissekeret dorsal fartøj) er blevet observeret at falde i forhold til mængden af tid, bier er opstaldet væk fra kolonien.
   1. Giv bier med en kilde til vand og mad, mens huse i laboratoriet. For EXAmple, som minimum give adgang til en 50% (w / v) opløsning af sucrose i vand (dette er tilstrækkeligt for en varighed på under 6 timer). For længere perioder, giver bierne adgang til honning.
   2. House bier i laboratoriet natten over ved en temperatur på ca. 32 ° C og 60-80% relativ fugtighed for at reducere stress og undgå dehydrering.
3. Forud for dissektion, bedøver bier kortvarigt at støtte i håndtering.
   BEMÆRK: Dette kan nedsætte succesraten for dissektioner og reducere gennemløb.
   1. Chill bierne enten ved at placere dem på is eller i et køleskab i lige længe nok til at reducere bevægelse for at hjælpe med håndtering.
   2. Alternativt kort udsætte bier til CO ₂ for at hjælpe i håndtering.
      BEMÆRK: Udvidet udsættelse for kulde kan reducere succesraten for dissektioner. Udvidet eller gentagen eksponering for CO ₂ kan også reducere succesraten for dissektioner.

2. Dissektionaf Dorsal Abdominal Wall

BEMÆRK: Bier skal være i live på tidspunktet for dissektion.

1. Med pincet og / eller mikrodissektions saks, fjerne ben og vinger for at lette dissektionen af ​​maven. Hold en lille bæger eller lignende beholder fyldt med destilleret vand i nærheden for at skylle instrumenter mellem dissektioner.
2. Mens fastholdende bi med pincet, udnytte de mikrodissektions saks til at klippe lateralt langs den dorsale bugvæggen mellem den første og anden tergites (se figur 1).

Figur 1: Dorsal udsigt over bi maven. Den indledende snit skal foretages mellem den første og anden tergites, som angivet ved den røde linje. Scale bar = 1 mm. Klik hendee for et større version af denne figur.

3. Hold let gribe den bageste kant af det andet tergite med tangen, skåret i længderetningen langs hver side af bi fra den indledende indsnit til stinger (se figur 2). Vær forsigtig, når der skæres for at undgå punktering mavetarmkanalen.

Figur 2: sidebillede af bi abdomen. Den anden og tredje indsnit bør gøres langs begge sider af maven, som angivet ved den røde linje. Scale bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

4. Byt saksen for et andet sæt af fine pincet og udnytte dem til omhyggeligt adskille dorsale bugvæggen fra resten of maven. Fjern forsigtigt stinger og dele af mave-tarmkanalen, der forbliver fastgjort til den dorsale bugvæggen. Undgå brud tarmen, da indholdet kan belægge bugvæggen og hindre visualisering af den dorsale fartøj.

Figur 3: Udsigt over dorsale fartøj. Når tarmen og stinger er blevet fjernet, den dorsale fartøjet er synlig langs midterlinjen af ​​dissekerede dorsale bugvæggen. Scale bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

5. Arrangere den dorsale bugvæggen i den ønskede orientering under kameraet, således at den dorsale fartøj er synlige (se figur 3). Udnyt de mikrodissektions saks til at trimme væk overskydende abdominal mur, der forhindrer visualisering af dorsale fartøj. Formen af ​​den dorsale bugvæggen skal ligne en flad kop eller skål ved korrekt beliggende.
   1. Da den dorsale fartøjet ikke strækker sig ind i den bageste abdominale segment af bi, fjerne den sidste tergite for at forbedre visualisering af den dorsale fartøj.
6. Anvendelse af en justerbar volumen mikropipette, dækker den dorsale fartøj med 10 pi en isotonisk opløsning til at opretholde fysiologiske betingelser og fremme en stabil hjerterytme.
   BEMÆRK: Den anbefalede løsning er kvart styrke Ringers opløsning (0,120 g / l calciumchlorid, 0,105 g / l kaliumchlorid, 0,050 g / l natriumbicarbonat, og 2.250 g / l natriumchlorid), som har vist sig at lette en stabil, kontinuerlig hjerteslag.

3. Observation og Modulation af puls

1. Tillad den dorsale fartøj at stå, indtil en stabil, kontinuerlig hjerteslag opnås(Sædvanligvis inden for 300 sek).
   BEMÆRK: Heartbeat visualiseres som rytmiske sammentrækninger af den dorsale fartøj. I første omgang kan der synes at være nogen hjerteslag, især hvis bien blev bedøvet, men hjertet vil sædvanligvis genoptage bankende efter hvile i isotonisk opløsning i flere minutter og kan fortsætte med at slå i timevis, men holder badet i opløsning.
2. Måle pulsen med hensyn til antallet af slag pr minut (BPM).
   1. Notér antallet af sammentrækninger iagttaget under en 60 sek periode. Brug en hånd tally tæller og en timer til at lette denne proces.
3. Mål ændring i hjertefrekvens ved at optage den observerede BPM før og efter behandling med en cardiomodulatory forbindelse.
   BEMÆRK: Selvom den tid, til at observere en virkning på hjertefrekvensen kan variere afhængigt af forbindelsen, der testes, kan typisk observeres ændringer i hjertefrekvensen inden for få minutter.
   1. Bestem baseline puls umiddelbart førtilsætning af en hvilken som helst test forbindelsen.
      kan normalt bestemmes Efterbehandling puls efter 90 til 120 sek: BEMÆRK.
   2. Forbered potentielle cardiomodulators (f.eks octopamin) ved at opløse forbindelsen i den samme isotonisk opløsning, der anvendes til at bade den dorsale fartøj.
   3. Tilføj testforbindelserne til opløsningen omgiver den dorsale fartøj ved anvendelse af en micropipetter.
4. For større nøjagtighed og højere gennemløb, lave en videooptagelse af hver test emne og derefter bruge videoerne for at score puls på et senere tidspunkt.
   BEMÆRK: Dette giver en enkelt investigator at forskyde dissektioner for at lette næsten kontinuerlig produktion af videoer. Når du optager video, er den anbefalede minimum længde er ca. 240 sek med nogen test forbindelse, som tilføjes i 60 sek mærket. Dette sikrer, at investigator har en 60 sek vindue for at lave basislinie puls og derefter en anden 60 sek vindue for at lave efterbehandling puls 120 sekefter behandling.

Representative Results

Da mange af de farmakologisk aktive forbindelser, der kan testes under anvendelse af denne protokol er ikke opløselige i vand, er det nødvendigt at have en pålidelig opløsningsmiddel, som vil gøre det muligt testforbindelser der skal leveres via isotonisk opløsning, der anvendes til at bade den dorsale fartøj. Dimethylsulfoxid (DMSO) er et opløsningsmiddel, der er almindeligt anvendt som et middel til at levere eksperimentelle lægemidler og andre forbindelser i dyr ^8, og det har været anvendt med succes til dette formål i studier undersøger effekten af pesticider på honningbi hjerteaktivitet ^9. Følgelig blev DMSO udvalgt som et potentielt vehikel til afgivelse testforbindelser til den dorsale fartøj, som krævede, at det først skal testes for cardiomodulatory aktivitet. I denne protokol, er det dissekerede dorsale fartøj oprindeligt badet i 10 pi kvart styrke Ringers opløsning og derefter puls bestemmes før tilsætning testforbindelser. Testforbindelser are leveret på en kendt koncentration i 10 pi DMSO opløst i kvartalet styrke Ringers opløsning og derefter observeres ryggens fartøj for efterfølgende ændringer i hjertefrekvensen.

Forud for at teste eventuelle forbindelser, blev et koncentrationsområde på DMSO testet for nogen virkning på hjertefrekvensen, i forhold til kvartalet styrke Ringers opløsning med 0% DMSO. DMSO blev opløst ved 0,2%, 2%, 10% og 20% ​​v / v i kvart styrke Ringers opløsning med henblik på at teste en slutkoncentration på 0,1%, 1%, 5% og 10%, når det tilsættes i lige så stort volumen til opløsningen allerede badning den dorsale fartøj. Denne fremgangsmåde blev anvendt, i modsætning til tilsætning DMSO ved den ønskede koncentration i de første 10 pi anvendes til at bade den dorsale fartøj, fordi ikke alle dissektion giver en stabil hjerterytme. Hvis DMSO har en negativ virkning på hjertefrekvensen, måske denne effekt ikke kunne skelnes fra en mislykket dissektion. Pulsen blev vurderet umiddelbart førtilsætning DMSO, og derefter igen 120 sek senere. Figur 4 viser resultaterne af dette forsøg, som viser, at 0,1% og 1% DMSO i opløsning havde ingen signifikant virkning på hjertefrekvensen, i forhold til det kvartal styrke Ringers opløsning uden DMSO, mens 5% og 10% DMSO signifikant nedsat hjertefrekvens.

Figur 4: Virkning af DMSO på bi hjertefrekvens. Graf viser den procentvise ændring i basal puls, som målt i slag i minuttet. Behandling af honningbi dorsale fartøj med 0,1% eller 1% DMSO v / v i kvartalet styrke Ringers opløsning ikke væsentligt øge eller sænke hjertefrekvensen, i forhold til kvartalet styrke Ringers opløsning uden DMSO. Behandling med 5% eller 10% DMSO i opløsning medfører et signifikant fald i hjertefrekvens. Resultater er udtrykt som middel ± SEM (n = 10). * P <0,05 vs 0% DMSO kontrol (Kruskal-Wallis test med Dunns multiple sammenligninger test). Klik her for at se en større version af dette tal.

For dette assay skal være relevant, skal det være muligt at observere ændringer i hjertefrekvensen efter behandling med cardiomodulatory forbindelser. Den biogene amin octopamin er kendt for at virke som en neuromodulator i invertebrater ¹⁰ og er blevet vist at virke som en cardioaccelerant i både bananfluer ¹¹ og honningbier ^7. Octopamin blev testet mod køretøjet (1% DMSO i kvart styrke Ringers opløsning) som beskrevet ovenfor ved koncentrationer på 100 nM, 10 pM og 100 pM. Figur 5 viser resultaterne af dette forsøg, som viser, at 10 pM og 100 pM koncentrationer af octopamin signifikant forøget hjertefrekvens.

t "fo: holde-together.within-side =" 1 ">
Figur 5: Effekt af octopamin på bi puls. Graf viser den procentvise ændring i basal puls, som målt i slag i minuttet. Behandling af honningbi dorsale fartøj med 100 nM octopamin ikke væsentligt øge eller sænke pulsen i forhold til køretøjet (1% DMSO v / v i kvartalet styrke Ringers opløsning). Behandling med 10 pM og 100 uM octopamin signifikant øget hjertefrekvens i forhold til køretøjet. Resultater er udtrykt som middel ± SEM (n = 10). * P <0,05 vs kontrol køretøj (Kruskal-Wallis test med Dunns multiple sammenligninger test). Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments