Introduction
L'objectif global de cette méthode est de permettre à l'enquêteur d'observer et de quantifier l'effet qu'un agent pharmacologique a sur le taux d'abeilles cardiaque rapidement et facilement. Les abeilles, comme d'autres insectes, ont un système circulatoire ouvert qui dissémine hémolymphe, l'équivalent d'insectes de sang, à travers la cavité du corps, connu sous le nom hémocèle. La circulation de l' hémolymphe est essentiel pour le transport des nutriments, les facteurs immunitaires, des déchets, ainsi neurohormones et d' autres molécules de signalisation 1. La circulation est facilitée par le vaisseau dorsal, qui se prolonge le long de la ligne médiane dorsale de l'insecte, ainsi que les organes pulsatiles accessoires. Le vaisseau dorsal est divisé en deux sections fonctionnellement distinctes, désigné le cœur dans l'abdomen et l'aorte dans le thorax et la tête. contractions propagés dans l'hémolymphe de la pompe cardiaque vers le thorax et la tête, tandis que les organes pulsatiles accessoires assurent l'écoulement de l'hémolymphe aux extrémités.
Une autre approche qui a été utilisée pour étudier l' activité cardiaque d'abeille est de disséquer partiellement l'insecte afin d'exposer le cœur, puis mesurer les contractions des vaisseaux dorsales en utilisant un déplacement transducteur de force 7. Dans ce protocole, le cœur est constamment baigné avec du sérum physiologique en cours d'exécution et co testmpounds peuvent être dissous dans cette solution pour l' application à l'objet 7. Une différence significative entre cette méthode et ceux décrits précédemment est que le cordon nerveux ventral est éliminé, ce qui élimine le rôle que le système nerveux central a été montré à jouer dans la modulation de fréquence cardiaque 5. Le résultat est que le rythme cardiaque de référence, ce qui est généralement très irrégulier, se stabilise à une fréquence beaucoup plus faible que l' amplitude et est typiquement observée chez un insecte vivant 5,7. Ce que toutes ces méthodes ont en commun est qu'elles nécessitent un équipement hautement spécialisé et souvent coûteux, en plus d'un certain niveau d'expertise, afin d'être menée. Peut-être le plus grand inconvénient est que aucune de ces approches sont particulièrement bien adaptés à des expériences qui impliquent de test d'un grand nombre de sujets, tels que le criblage d'une banque de composés potentiellement cardiomodulatory.
La plus grande force de l'approche décrite iciest sa simplicité. Le protocole est relativement facile à maîtriser, l'installation nécessite peu d'espace, et seule une contribution financière minimale est nécessaire. La méthode nécessite peu plus que quelques abeilles, quelques instruments chirurgicaux, une solution isotonique, et soit un microscope numérique ou un microscope traditionnel avec un appareil photo numérique. Les abeilles sont disséqués pour visualiser le vaisseau dorsal et des vidéos numériques sont utilisés pour enregistrer le rythme cardiaque avant et après traitement avec des agents pharmacologiques. Bien que l' enregistrement vidéo est pas réellement nécessaire d'observer les changements de la fréquence cardiaque, il va grandement augmenter le débit (ie, le nombre de sujets qui peuvent être traités dans un laps de temps donné). L'enquêteur peut maximiser l'efficacité en enregistrant un grand nombre de vidéos à la fois, puis plus tard en marquant ces vidéos à un moment plus opportun. Un autre avantage de cette approche est que les vidéos permettent à l'enquêteur de recommencer, si le processus de notation est interrompu, et la rendre plus facile pour le vViewer aveugler au traitement afin de réduire le biais.
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Protocol
1. Collecte et préparation des sujets d'essai
- Recueillir le nombre approprié d'abeilles de la colonie.
REMARQUE: Le nombre nécessaire dépend non seulement de la taille et la portée de l'expérience, mais aussi la compétence de l'enquêteur. Par exemple, s'il y a 2 groupes de traitement avec une taille d'échantillon souhaitée de 10 abeilles par groupe, un enquêteur raisonnablement qualifiée pourrait recueillir au moins 30 abeilles pour tenir compte des dissections infructueuses et se retrouver avec 20 vidéos utiles pour marquer. - Réduire la quantité de temps qui passe entre la collecte et la dissection.
NOTE: Bien que les abeilles peuvent être logés dans le laboratoire pendant plusieurs jours avant la dissection, le taux de dissections de réussite (ie, la probabilité de maintenir un rythme cardiaque stable dans un vaisseau dorsal disséqué) a été observée pour diminuer par rapport à la quantité de temps que les abeilles sont logés loin de la colonie.- Fournir des abeilles avec une source d'eau et de nourriture tout logé dans le laboratoire. Pour example, au minimum, donner accès à 50% (p / v) de saccharose dans de l'eau (ce qui est suffisant pour une durée de moins de 6 heures). Pour des périodes plus longues, fournissent abeilles accès au miel.
- abeilles Maison dans la nuit de laboratoire à une température d'environ 32 ° C et 60-80% d'humidité relative pour réduire le stress et éviter la déshydratation.
- Avant la dissection, anesthésier les abeilles brièvement pour faciliter la manipulation.
NOTE: Cela peut diminuer le taux de dissections de succès et de réduire le débit.- Refroidir les abeilles soit en les plaçant sur la glace ou dans un réfrigérateur pour juste assez longtemps pour réduire le mouvement afin de faciliter la manipulation.
- Vous pouvez également exposer brièvement les abeilles à CO 2 afin de faciliter la manipulation.
NOTE: Une exposition prolongée au froid peut réduire le taux de dissections de succès. Extended ou une exposition répétée à CO 2 peut également réduire le taux de dissections de succès.
2. DissectionDorsale de la paroi abdominale
NOTE: Les abeilles doivent être vivants au moment de la dissection.
- En utilisant des pinces et / ou des ciseaux de microdissection, enlever les jambes et les ailes pour faciliter la dissection de l'abdomen. Gardez un petit bécher ou un récipient similaire rempli d'eau distillée à proximité dans le but de rinçage des instruments entre les dissections.
- Alors que retenir l'abeille avec une pince, utiliser les ciseaux de microdissection pour couper latéralement le long de la paroi abdominale dorsale entre les première et deuxième tergites (voir Figure 1).
Figure 1: Vue dorsale d' une abeille abdomen. L'incision initiale doit être faite entre les première et deuxième tergites, comme indiqué par la ligne rouge. Barre d'échelle = 1 mm. S'il vous plaît cliquez sur sone pour voir une version plus grande de cette figure.
- Tout en saisissant légèrement le bord postérieur de la seconde Tergite avec la pince, couper longitudinalement le long de chaque côté de l'abeille de l'incision initiale à l'élinde flottante (voir la figure 2). Faites preuve de prudence lors de la coupe pour éviter la perforation du tractus gastro-intestinal.
Figure 2: Vue latérale de l' abeille abdomen. Les deuxième et troisième incisions doivent être faites le long de chaque côté de l'abdomen, comme indiqué par la ligne rouge. Barre d'échelle = 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Echanger les ciseaux pour une deuxième série de pinces fines et les utiliser pour séparer soigneusement la paroi abdominale dorsale du reste of l'abdomen. Retirez délicatement le dard et toute partie du tractus gastro-intestinal qui reste attaché à la paroi abdominale dorsale. Éviter la rupture de l'intestin, car le contenu peut recouvrir la paroi abdominale et d'empêcher la visualisation du vaisseau dorsal.
Figure 3: Vue du vaisseau dorsal. Une fois que l'intestin et le stinger ont été enlevés, le vaisseau dorsal est visible le long de la ligne médiane de la paroi abdominale dorsale disséqué. Barre d'échelle = 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Réorganiser la paroi abdominale dorsale dans l'orientation souhaitée sous la caméra de sorte que le vaisseau dorsal est visible (voir Figure 3). Utiliser les ciseaux de microdissection pour couper tout excès abdominale paroi qui empêche la visualisation du vaisseau dorsal. La forme de la paroi abdominale dorsale devrait ressembler à une coupe peu profonde ou un bol lorsqu'ils sont situés correctement.
- Étant donné que le vaisseau dorsal ne se prolonge pas dans le segment abdominal percoir de l'abeille, retirez le tergite final afin d'améliorer la visualisation du vaisseau dorsal.
- Utilisant une micropipette de volume réglable, couvrir le vaisseau dorsal avec 10 pi d'une solution isotonique pour maintenir des conditions physiologiques et faciliter un rythme cardiaque régulier.
REMARQUE: La solution préconisée est une solution de Ringer de la force du quart (0,120 g / L de chlorure de calcium, 0,105 g / L de chlorure de potassium, 0,050 g / L de bicarbonate de sodium et 2,250 g / l de chlorure de sodium), qui a été trouvée pour faciliter une étable, rythme cardiaque en continu.
3. Observation et modulation de fréquence cardiaque
- Laisser le vaisseau dorsal reposer tranquillement jusqu'à ce qu'un stable, le rythme cardiaque en continu est atteint(Généralement dans les 300 secondes).
REMARQUE: battement de coeur est visualisé sous la forme de contractions rythmiques du vaisseau dorsal. Dans un premier temps, il peut sembler être plus de pouls, surtout si l'abeille a été anesthésiée, mais le cœur sera généralement reprendre battre après le repos dans une solution isotonique pendant plusieurs minutes et peut continuer de battre pendant des heures, à condition qu'il reste baigné dans une solution. - Mesurer la fréquence cardiaque en termes de nombre de battements par minute (BPM).
- Notez le nombre de contractions observées au cours d'une période de 60 sec. Utilisez un compteur à main et une minuterie pour faciliter ce processus.
- Mesurer le changement de la fréquence cardiaque en enregistrant le BPM observé avant et après traitement avec un composé cardiomodulatory.
NOTE: Bien que le temps nécessaire pour observer un effet sur la fréquence cardiaque peut varier en fonction du composé à l'essai, les variations de la fréquence cardiaque peuvent généralement être observées en quelques minutes.- Déterminer la fréquence cardiaque de base précédant immédiatementl'ajout d'un composé d'essai.
REMARQUE: la fréquence cardiaque post-traitement peut généralement être déterminée après 90 et 120 sec. - Préparer cardiomodulators potentiels (par exemple, octopamine) en dissolvant le composé dans la même solution isotonique utilisée pour baigner le vaisseau dorsal.
- Ajouter les composés d'essai à la solution entourant le vaisseau dorsal en utilisant une micropipette.
- Déterminer la fréquence cardiaque de base précédant immédiatementl'ajout d'un composé d'essai.
- Pour une plus grande précision et un débit plus élevé, faire un enregistrement vidéo de chaque objet de test, puis utiliser les vidéos pour marquer le rythme cardiaque à un moment ultérieur.
NOTE: Cela permet à un seul enquêteur de décaler dissections afin de faciliter la production presque continue de vidéos. Lors de l'enregistrement de vidéos, la longueur minimale recommandée est d'environ 240 secondes avec un composé de test étant ajouté à la marque de 60 sec. Cela garantit que l'enquêteur dispose d'une fenêtre de 60 secondes pour marquer le rythme cardiaque de base, puis une autre fenêtre de 60 secondes pour marquer la fréquence cardiaque post-traitement 120 secaprès le traitement.
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Representative Results
Comme bon nombre des composés pharmacologiquement actifs qui pourraient être testés en utilisant ce protocole ne sont pas solubles dans l'eau, il est nécessaire d'avoir un solvant fiable qui permettra des composés d'essai à être livrés via la solution isotonique utilisée pour baigner le vaisseau dorsal. Le diméthylsulfoxyde (DMSO) est un solvant qui est couramment utilisée comme véhicule pour délivrer des médicaments et d' autres composés expérimentaux sur des animaux 8, et il a été utilisé avec succès à cette fin dans des études portant sur l'effet des pesticides sur l' activité cardiaque d' abeille 9. Par conséquent, le DMSO a été choisi comme véhicule pour délivrer le potentiel des composés d'essai sur le vaisseau dorsal, ce qui nécessitait d'être d'abord testée pour l'activité cardiomodulatory. Dans ce protocole, le vaisseau dorsal disséquée est d'abord baigné dans 10 pi de solution de Ringer trimestre force et la fréquence cardiaque est déterminé avant d'ajouter des composés d'essai. Les composés d'essai are livré à une concentration connue dans 10 pi de DMSO dissous dans la solution de Ringer trimestre force, puis le vaisseau dorsal est observé pour les variations ultérieures de la fréquence cardiaque.
Avant l'essai, tous les composés, une concentration de DMSO a été testé pour un quelconque effet sur la fréquence cardiaque, par rapport à la solution de Ringer trimestre force avec 0% de DMSO. DMSO a été dissous à 0,2%, 2%, 10% et 20% v / v dans une solution de quart force de Ringer pour tester une concentration finale de 0,1%, 1%, 5% et 10%, lorsqu'il est ajouté en volume égal à la solution baignant déjà vaisseau dorsal. Cette approche a été utilisée, par opposition à l'ajout de DMSO à la concentration souhaitée dans les premières 10 ul utilisées pour baigner le vaisseau dorsal, parce que pas tous dissection donne un rythme cardiaque stable. Si DMSO a un effet négatif sur la fréquence cardiaque, cet effet pourrait ne pas se distinguer d'une dissection échoué. La fréquence cardiaque a été évaluée immédiatement avantajoutant du DMSO, puis à nouveau 120 secondes plus tard. La figure 4 montre les résultats de cette expérience, ce qui montre que 0,1% et 1% de DMSO dans la solution n'a pas d' effet significatif sur la fréquence cardiaque, par rapport à la force de la solution de Ringer sans DMSO quart, tandis que 5% et 10% de DMSO ont diminué de façon significative la fréquence cardiaque.
Figure 4: Effet du DMSO sur la fréquence cardiaque d'abeille. Le graphique montre la variation en pourcentage de la fréquence cardiaque de base, mesurée en battements par minute. Traitement des abeilles vaisseau dorsal avec dans une solution de Ringer trimestre force ne pas augmenter de manière significative ou diminuer la fréquence cardiaque, par rapport à la solution de Ringer trimestre force sans DMSO 0,1% ou 1% de DMSO v / v. Le traitement avec 5% ou 10% de DMSO dans la solution provoque une diminution significative de la fréquence cardiaque. Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n = 10). * P <0,05 vs 0% contrôle DMSO (Kruskal-Wallis tester avec de multiples tests de comparaisons de Dunn). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Pour que ce test soit pertinent, il doit être possible d'observer les changements de la fréquence cardiaque après un traitement avec des composés cardiomodulatory. L'amine biogène octopamine est connu pour agir comme un neuromodulateur chez les invertébrés 10 et a été montré à agir comme un cardioaccelerant à la fois les mouches des fruits 11 et abeilles 7. Octopamine a été testé contre un véhicule (1% de DMSO dans la solution de Ringer trimestre force), comme décrit ci-dessus à des concentrations de 100 nM, 10 uM et 100 uM. La figure 5 montre les résultats de cette expérience, ce qui démontre que 10 pM et 100 pM concentration de l' octopamine a augmenté de manière significative la fréquence cardiaque.
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Figure 5: Effet de l' octopamine sur la fréquence cardiaque d'abeille. Le graphique montre la variation en pourcentage de la fréquence cardiaque de base, mesurée en battements par minute. Traitement des abeilles vaisseau dorsal avec 100 nM octopamine ne pas augmenter de manière significative ou diminuer la fréquence cardiaque par rapport au véhicule (1% DMSO v / v dans une solution de Ringer trimestre force). Le traitement avec 10 uM et 100 uM octopamine a augmenté de façon significative la fréquence cardiaque par rapport au véhicule. Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n = 10). * P <0,05 vs contrôle du véhicule (test de Kruskal-Wallis avec de multiples tests de comparaisons de Dunn). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dino-Lite Edge digital USB microscope | Dino-Lite | AM4815ZT | Any digital microscope or similar setup will suffice |
| Microscope stand | Dino-Lite | RK-10 | Any stand appropriate for the digital microscope |
| Laptop or PC | Necessary for digital microscope | ||
| Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades) | World Precision Instruments | 14003 | Any similar scissors suitable for microdissection will suffice |
| Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair) | World Precision Instruments | 504482 | Any similar forceps suitable for microdissection will suffice |
| Ringers solution 1/4 strength tablets | Sigma-Aldrich | 96724-100TAB | |
| Dissecting tray | Any surface suitable for microdissection | ||
| Single channel 10 µl pipette | Any device capable of accurately delivering 10 µl volume | ||
| Pipette tips | |||
| Small beaker or container of water | Used to rinse instruments between subjects | ||
| Hand tally counter | Office Depot | 295033 | Any similar product will suffice |
| Timer | Office Depot | 644219 | Any similar product will suffice |
| Deionized water | Preparation of Ringers solution and rinsing instruments |
References
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- League, G. P., Onuh, O. C., Hillyer, J. F. Comparative structural and functional analysis of the larval and adult dorsal vessel and its role in hemolymph circulation in the mosquito Anopheles gambiae. J Exp Biol. 218 (Pt 3), 370-380 (2015).
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- Schwab, E. R., Chilson, R. A., Eddleman, C. D. Heartbeat Rate Modulation Mediated by the Ventral Nerve Cord in the Honey-Bee, Apis-Mellifera. J Comp Physiol B-Biochem Syst Environ Physiol. 161 (6), 602-610 (1991).
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