Abstract
בעיות נפוצות בעיבוד של דגימות ביולוגיות לתצפיות עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כוללים קריסת התא, טיפול של דגימות microenvironments רטוב והרס התא. באמצעות רקמות פרחים צעירות, ציסטות oomycete, נבגי פטריות (Agaricales) כדוגמות, פרוטוקולים ספציפיים לעבד דגימות עדינות מתוארות כאן כי להתגבר על כמה מן האתגרים העיקריים טיפול מדגם עבור לכידת תמונה תחת SEM.
meristems הפרחוני קבוע עם ה- FAA (פורמלין-אצטית-אלכוהול) ומעובד עם שיער הנקודה הקריטי (CPD) לא גילה קרס קירות הסלולר או איברים מעוותים. תוצאות אלה הן קריטיות לבנייה מחדש של פיתוח פרחוני. טיפול דומה מבוסס CPD של דגימות microenvironments הרטוב, כגון ציסטות oomycete הקבועה glutaraldehyde, הוא אופטימלי כדי לבחון את גדילת ההפרש של מאפייני אבחון (למשל, קוצי ציסטה) על סוגים שונים של substrates. הרס של תא אחות מצורף נבגי פטריות נמנע לאחר התייבשות, התייבשות, ואת טיפול CPD, צעד חשוב עבור מחקרים תפקודיים נוסף של תאים אלה.
הפרוטוקולים המפורטים כאן מייצגים בעלות נמוכה וחלופות מהירות לרכישת תמונות באיכות טובה לשחזר תהליכי גדילה ללמוד את מאפייני אבחון.
Introduction
בביולוגיה, השימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) הוארך ללימודי האבולוציה מבניים, מורפולוגיה השוואתי, פיתוח איברים, ואפיון של אוכלוסיות או מינים 1. עם הנוף שלה דו ממדים של מבנים מיקרוסקופים, בתחומים כגון micromorphology ו סיסטמטיקה הרוויחו מן התקדמות טכניקת SEM מאז המחצית השנייה של המאה ה -20. לדוגמא, את ההקדמה של המתודולוגיה ציפוי גמגום בשנתי ה -1970 ערך מדידות אפשריות של חומרים עדינים כגון apices לירות ופרחי שיפור ההדמיה של שאינו מוליך רקמות 2, 3. SEM משתמשת האלקטרונים הנפלטים מן השטח של הדגימה כדי לשחזר את הטופוגרפיה בסביבה גבוהה ואקום 4.
מחקרים שכללו SEM מתמקדים בשני היקש תווים מבניים מחדש של growtתהליכי h. תווים מבניים חדשים רלוונטיים הטקסונומיה סיסטמטיקה של מגוון רחב של אורגניזמים התגלו מתצפיות SEM. לדוגמא, תכונות צמח בשימוש לאבחון מינים או סיווגי supraspecific, כגון בורות vestured של עץ 5, הסטיגמה מגוון 6, מורפולוגיה nectary וצמחית 7, 8, פרטים יונקים 9, ו גרגרי אבקה 10, 11, לא יכול להיות דמיינו כמו שצריך בלי SEM. תצפיות מוצלחות עם קונבנציונלי SEM הושגו גם עבור אורגניזמים קבועים בפורמלין זמן ארוך 12 ו העשבייה צמח דגימות 13.
מצד השני, מחקרי שיקום של תהליכי צמיחה באמצעות SEM מדגימים מגוון רחב של נושאים, כגון פיתוח איבר 14, infections המושרה על ידי חיידקים 15, פיזיולוגית שורש צמח 16, מנגנונים מצורפים טפיל-מארח 17, 18, שפעות תרופה על טפילים 19, mycoparasitism ו אנטיביוזה 20, 21, מום צמיחה 22, פיתוח השוואתי של אנשים פרועים מוטציה 23, ומחזורי חיים שלמים 24. למרות מיקרוסקופי אלקטרונים סורקים סביבתי (ESEM) 25 יכולים להיות יתרונות חשובים עבור התצפית של דגימות ביולוגיות רטובות בתהליכי צמיחה, חומר עדין עדיין עלול לסכן אפילו במצב הוואקום הנמוך של ESEM), וצריך להיות מעובד כראוי כדי למנוע אובדן תצפית מורפולוגיים של ערך.
במאמר זה, סקירה של פרוטוקולים ספציפיים להסתכלות SEM של שלושה diffסוגי erent של דגימות מוצגים: meristems פרחוני, oomycetes (Saprolegnia), וחומר פטרייתי. פרוטוקולים אלה לקמפל את החוויה של המחקרים SEM המבוססים הקודמים שלנו 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, שם קשיים ספציפיים פתרונות חלופיים נמצאו. במקרה של התפתחות צמח השוואתית מחקרים מבניים, השימוש SEM נכתב בשנתי ה -1970 34, 35, ומאז, חוקרים גילו כי תכונות פרחוניות מסוימות הן יותר יציבות מאשר סבר עד כה 36. שחזור הפיתוח פרחוני כרוך לכידתו של כל השלבים בין meristems הפרחוני הצעיר anthesis. כדי להגיע למטרה זו, זה essential כי הטופוגרפיה מדגם ואת שלמות דופן התא אינם בסכנה לאחר קיבוע והתייבשות שלאחר מכן. Meristems הפרחוני הקטן פגיע במיוחד כדי התמוטטות דופן תא (1a הדמוי, 1b). בדומה לכך, מבנים עדינים כגון nectaries, עלי כותרת, סטיגמות sporangia דורשים פרוטוקולים יעילים undamaging. סקירה זו מסכמת פרוטוקול אופטימלי לשמור רקמות צעירות ועדינות תילן הדמית SEM.
במקרה של oomycetes (Stramenopiles) -One של קבוצות המגוונות והנפוצות ביותר של טפילים, עם מארחים החל חיידקים וצמחים חסרי חוליות ובעלי חוליות 37 - יש נבגים כי לגדול ולהתפתח בסביבה רטובה. מצב זה מהווה אתגר עבור תצפית SEM כי הנבגים צריכים מצע הולם לא מתאים פרוטוקולי SEM סטנדרטיים. בין oomycetes, מינים של Saprolegnia הם בעלי עניין מיוחד, כי הם can לגרום ירידות קשות aquacultures, דיג, ואוכלוסיות דוחות 38. מאפיינים Micromorphological, כגון קוצים מעוקלים של ציסטות, כבר מצאו להיות שימושי כדי לזהות מינים של Saprolegnia, שהוא היסוד להקים שולטת זיהום טיפולים פוטנציאליים 39. הנה, יש פרוטוקול הניסוי להשוות את דפוסי הצמיחה עמוד השדרה של ציסטות על מצעים שונים כדי לתפעל את המדגם עבור מייבש נקודה קריטית (CPD) הכנה והתבוננות SEM שלאחר מכן.
במקרה שלישי, ישנם ממצאים מעניינים שעלו אחרי בדיקה של נבגים של f herculanea פטריות Phellorinia. f stellata. נובה (Agaricales) 31. יחד עם הנבגים, קבוצת תאי משתלה לא צפויים זוהתה תחת SEM. עם פרוטוקולים מסורתיים קודמים וחומר שלא טופל, התאים נכנסו אחות out קרסה לחלוטין (איור 1 ג '). מסקנות נוספות על רקמות מסוימות בקשר אל הנבגים יכולות להתבצע עם השינויים פשוטים אך חיוניים הגישות הסטנדרטיות המתואר כאן (1D איור).
בסקירה זו, ישנם פרוטוקולים מפורטים SEM, שניתן להשתמש בהם כדי להתמודד עם בעיות שונות הקשורות תצפית SEM, מכוסי הזרע, oomycetes, ו Agaricales, כגון קריסה התא מתכווץ רקמות meristematic, שאינו אופטימלי לצמיחה של הקוצים ציסטה, והרס של רקמות חלוף, בהתאמה.
איור 1: השוואה בין דגימות מטופלים ללא (א, ג) ועם (ב, ד) ה- FAA-אתנול-CPD פרוטוקול. (א - ב) ניצנים פרחוניים של clavatus קַחֲוִינָה, פיתוח האמצע. באד שטופל tetroxide אוסמיום 46 </ sup> (א) ובאד שטופלו בפרוטוקול ה- FAA-CPD (ב). (ג - ד) אחות תאים עם נבגים של herculanea f Phellorinia. stellata. יבשי דגימות ללא (ג) טיפול ועם הפרוטוקול כאן תאר Agaricales (ד). נבגים בכתום. סולמות: (ab) 100 מיקרומטר, (CD) 50 מיקרומטר. התמונות צולמו על ידי י 'רואיז-ליאון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה כולל שישה חלקים עיקריים, שלושה מוקדשי אורגניזמים ספציפיים (סעיפים 1-3), ושלוש המתארים את ההליכים נפוצים לכל (4-6). כוכביות (*) מצביעות צעדים שונים על ידי הנסיינים.
1. מחקרים של פיתוח ומבני צמח מגובש
- איסוף קיבוע
- אם חומר האיסוף: במקום ללא גישה אל ארון קטר, להציג לטבול בחומר באתנול 70% צינורות צנטריפוגות. באופן אידיאלי, לטבול את החומר לאחר 48 שעות FAA (שלבים 1.1.1-1.1.3) כדי למנוע התייבשות מוגזמת של אתנול. אם ארון קטר נגישה חומר צמחי, התעלם משלב זה ולהמשיך עם 1.1.1.
- הכן את מקבע פורמלין-אצטית-אלכוהול (FAA) בתוך ארון קטר מצויד עם מסנן אלדהיד. להוסיף 85 חלקים של 70% אתנול מפוגל, 10 חלקים של פתרון פורמלדהיד 60%, ו -5 חלקים של חומצה אצטית קרחונית. הכן את FAAרק לפני תיקון החומר, כמו האחסון לטווח הארוך שלה אינו מומלץ 40.
- מתחת לארון קטר, יוצקים את המניה של FAA לתוך הפה רחב הפרט ובקבוקי פלסטיק הוכחה דליפה. השתמש בכמה בקבוקים כפי שיש דגימות זמינות, וליצור תוויות זיהוי מדגם.
- בחר את meristems הפרחוני או וגטטיבי לתקן, על מנת להבטיח שהם אינם פגומים על ידי חרקים, פטריות, או תנאי מזג אוויר קיצוניים. חותך את הענפים, הסרת חומר בלתי רצוי, וכן להפקיד המדגם מייד בפתרון ה- FAA.
- לאחר 72-96 שעות, ויוצק את FAA לתוך מיכל פלסטיק לסילוק כימי. מיד, לשטוף את דגימות שלוש פעמים עם אתנול 70% טרי כדי להסיר כל FAA שיורית. חומר קבוע ניתן לאחסן לזמן בלתי מוגבל באתנול 70%.
- Dissection והתייבשות
- לנתח את החומר קבוע באתנול 70% תחת סטראו באמצעות פינצטה בסדר אולטרה, needles, מלקחיים, מברשות, ואת-אזמלים מיקרו (הגודל המרבי של הרקמה צריך להיות סביב 1 ס"מ 3, או 2 ס"מ חומר שטוח). לנתח דגימות לתוך צלחת פטרי מכוסה אתנול למנוע הרקמות מפני התייבשות. השתמש בצלחת פטרי עם הבסיס מכוסה סיליקון שחור יבש לראות רקמות הלבנות מנוגדים טובים יותר.
- שים את החומר גזור מכלי הדגימות עבור מייבש נקודה קריטית (CPD, איור 2 א). בשלב זה, לטבול את המכולות לתוך צלחת פטרי עם 70% אתנול, וכולל את תוויות זיהוי המדגם (עשה עם נייר ועיפרון). לייבוש יעיל יותר עבור מניפולציה נוספת, למנוע ערבוב הדגימות הצעירות ובוגרות באותה האריזה. *
- שים את המכסים על המכולות להפקיד אותם צינורות צנטריפוגה פלסטיק עם שפע של אתנול 70%. אחסן את צינור לילה אם החומר אינו מעובד מייד.
- העביר את החומר הגזור דרך סרייה אתנול הבאהים בצנצנות הרמטיות או צינורות צנטריפוגה: 70%, 90%, 100% ו -100%. השאר את הדגימות בכל פתרון 1 שעות לפחות. שמור את דגימות לילה בתמיסה אתנול 100%.
- ולהעביר את המכולות עם חומר אל CPD (סעיף 4).
- הרכבה והכנת רקמות הצמח להסתכלות SEM
- כתוב את מספר הזיהוי מדגם מתחת מחזיקי מדגם SEM (כלומר, בדלי אלומיניום). מכסה את החלק העליון של הבדלים עם דבק דו-צדדי. מניחים את הספחים לתוך מחזיק הדגימה (איור 2b).
- תחת סטראו, לפתוח בזהירות את המכולות נושא הדגימות הצעירות ועדינות המיובשות כבר CPD. יש לזכור כי לאחר טיפול CPD, הדגימות להיות קלות יותר ורגישים אלקטרוסטטיקה. סגור את מיכלי פעם הדגימות נלקחו מתוך להימנע אבק או זיהומים.
- שים את הדגימות על המשטח הדביק של הספחים, תכנון מראש רצויעמדה (פעם הדגימות לגעת במשטח, זה מאוד קשה להסיר אותם). אל תנסה לבצע דיסקציה גדולה בשלב זה; פשוט להסיר רקמות לא רצויות כי הוא קל להרים. עבור מחקרים palynological, לנתח את המאבקים ולפתוח אותם לחשוף את האבקה על הספחים.
- דגימות ארוכות שימו (למשל, 2 סנטימטר) כגון תפרחות במצב האופקי. במידת האפשר, דגימות אוריינט של אותו מבנה עבור קוטב, בצד, ונוף התחתונה. השאר מספיק מקום בין דגימות על הבדל.
- אם הדגימות לא ניתן לעבד מיד, לשמור אותם מוגנים לילה במיכל הרמטית עם ג'ל סיליקה כדי למנוע התייבשות (איור 2 ג) *. מעיל דגימות באמצעות coater גמגום ולהעבירם אל SEM (סעיפים 5 ו -6).
איור 2: כלי manipulati מדגםעל ועיבוד לפני תצפית SEM. (א) מיכל דגימה מתוצרת פלדה עם קירות מסתתרים לחילופי אתנול / CO 2 בתא CPD. (ב) בדלי פלדה בתוך החזיק דגימת פלסטיק. (ג) זכוכית מכל משמש כדי לשמור על הדגימות מפני לחות ואבק. בבסיס, יש תא עבור ג'ל סיליקה. (ד) Critical פוינט שיער. בחלק הקדמי, יש (משמאל לימין) את מד הלחץ, את מתג ההפעלה, מערכת בקרת טמפרטורה, ואת תצוגת טמפרטורה. לחץ עבודה כרגיל עבור מחלף -ethanol CO 2 הוא 60 ברים (800 psi). בחלק העליון, יש ארבעה שסתומים (כניסה, ניקוז, אוורור, בקרות פליטה) משני צדי תא המדגם המרכזי. התמונות צולמו על ידי י 'רואיז-לאון MA בלו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- גידול ותיקון ציסטות
- הכן peptone וגלוקוז (PG-יב) מדיה 41 באמצעות D - (+) - גלוקוז (6 גרם) peptone mycological (3 גרם) *. להוסיף עד 900 מיליליטר של מים ברז חיטוי 40 דקות ב 121 מעלות צלזיוס. יוצקים 50 מ"ל של פתרון autoclaved בעבר (לאא 2 4 PO, 0.13 מ ') ו -50 מ"ל של B פתרון (Na 2 4 HPO, 0.13 מ').
- מתרבויות המניות של זנים של Saprolegnia parasitica שמרו על peptone, גלוקוז, התקשורת אגר (PGA, אשר מוכנים כמו PG-l אבל הוספת 10 גרם של אגר האירופי בקטריולוגית אל גלוקוז ואת peptone לפני החיטוי), לגדול מושבות mycelia ב 0.5 מ"ל PG-l של טיפות במשך 24-48 שעות ב 20 ° C בצלחות פטרי. להשרות נביגה ידי שטיפת mycelia במי ברז autoclaved שלוש פעמים דוגרים אותם במשך 15 שעות ב 20 ° C= "Xref"> 42, 43.
- אסוף את zoospores משני שפורסם על ידי pipetting את החלק העליון בעדינות של ההשעיה וברכה אותם 1 חלקי מיליליטר. להתסיס במרץ zoospores למשך 30 שניות על ידי vortexing לייצר ציסטות משני 44.
- כדי לבחון את הגדילה ההפרש של עמוד השדרה של ציסטות, על הפרדת כלים פטרי (P60), לשים 0.5 מ"ל של ההשעיה ציסטה משנית על גבי משטחים שונים (כלומר, פחמן, זהב, ורשתות TEM נחושת; סלמון וקשקשת הייק דגים (בעבר מולבן); ופליטות הזכוכית המכסה) *. דגירה ציסטות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 70 דקות, אשר מעדיפה את הקובץ המצורף של ציסטות על פני השטח.
- הסר את הנוזל ולהוסיף 0.5 מ"ל של glutaraldehyde 2% לכל משטח קיבעון של ציסטות. שמור את הדגימות בטמפרטורת חדר מתחת לשידת קטר במשך 1 שעה.
- הסר את glutaraldehyde ו מייבש את המדגם דרך סדרת אתנול (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% , 90%, 100% ו -100%), הוספת 5 מ"ל של כל פתרון אתנול במשך 15 דקות. לאחר בפתרון 100% אתנול האחרון, המדגם ניתן לאחסן עד חודש בצלחת פטרי אטום. בשלב זה, הדגימות מוכנות להיות מיובש CPD.
- להעביר בזהירות את רשתות המאזניים מצלחת פטרי לבעל מתאים CPD (סעיף 4). לצעד זה, השתמש בעל רשת CPD או בעל דגימת ערמה, אשר לשמור דגימות מופרדות אחד מהשני. קח את הרשתות וקשקשת עם פינצטה, תוך התחשבות כי ציסטות צריך לפנות כלפי מעלה על הרשתות כל הזמן. *
- הרכבה והכנת דגימות ציסטה להסתכלות SEM
- הר רשתות המאזניים על ספחי האלומיניום שכוסו בעבר עם קלטת פחמן דו צדדית ומסומן מתחת.
- העברת דגימות אל coater גמגום (סעיף 5).
- שימו לב דגימות תחת SEM (סעיף 6).
= "Jove_title"> 3. לחקר העשבייה פטרייתיים נבגים של Phellorinia herculanea תחת SEM
- התייבשות התייבשות של נבגים
- עוטפים כל דגימה בזהירות עם נייר סינון, ויצרו מעטפות שכותרתו עיפרון ~ 0.5-1 ס"מ 2, נזהרת שלא לרמוס אותם. חותם את נייר הסינון עם מהדקי נייר. העברת הדגימות הארוזות לצלחת פטרי לטבול אותם 10 מיליליטר של מי רעננותם רקמות סביב הנבגים.
- מייד לשים את הדגימות במיקרוגל (600 ואט במשך כ 20 שניות). הסר את החומר כאשר המים מתחילים להתאדות, ולאפשר לו להתקרר בטמפרטורת חדר.
- להעביר את הדגימות דרך סדרת אתנול הבאה: 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% ו -100%. בהתאם לכמות של דגימות, השתמש צינורות מבחנה או צנטריפוגות במשך שלב זה. השאר את הדגימות במשך 15 דקות כל אחד מפתרונות.
- מניחים את דגימות CPD (סעיף 4).
- התקנת preparing נבגים להסתכלות SEM
- פתח את המעטפות. יוצקים את הנבגים על בדל בעבר סיים עם דבק דו-צדדי. לחלופין, לאסוף את הנבגים עם המשטח הדביק של הספחים, נזהר שלא לרמוס אותם *.
- אם הדגימות מכילות כמה נבגים, בנוסף לשלב הקודם, לחתוך חתיכה קטנה של המעטפה (~ 1 מ"מ 2) ומניחים אותו על * בדל חדש.
- מניחים את הרקמות לתוך coater גמגום (סעיף 5).
- שימו לב תחת SEM (סעיף 6).
4. ייבוש החומר בעזרת מייבש נקודה קריטית (CPD, איור 2)
- השתמש CPD באזור מאוורר ולוודא שכל השסתומים של המכונה סגורות. בדקו אם קאמרי המדגם ריק ונקי.
- הפעל את המכונית ולוודא כי בדיקת מערכת בקרת הטמפרטורה מתבצעת באופן אוטומטי. אם CPD יש מערכת אמבט קירור חיצונית, בדוק את מפלס המים לפני מעבר it על.
- פעל על פי הוראות היצרן של CPD הספציפי המשמש אתנול מחלף 2 CO. מטעמי בטיחות, לשאת על הצעד הזה בהשגחת אדם שאומן לשימושם של המכונה. זכור כי היא חשופה לשינויים בלחץ מהירים, זה יכול לכבות באלימות.
- להוציא דגימות המשך לשלב 1.3 אם עבודה עם רקמות הצמח, שלב 2.2 אם עובדים עם ציסטות oomycetes, ודורך 3.2 אם עובדים עם נבגי פטריות.
5. ציפוי דוגמאות עם זהב שימוש Coater גמגום (איור 3 א)
- בדוק את coater הגמגום. ודא כי יעד זהב הקתודה הוא במצב טוב. השתמש במטלית נטולת מוך ספוג 90% אתנול לנקות את הקירות של החדר הריק והמכסה הקאמרית במידת צורך.
- סמן את בעל גמגום עם מספרים ליד כל חור בדל עבור זיהוי נוסף של דגימות תחת המיקרוסקופ. בזהירות, מניח את הספחים עמוסים samples ולאבטח אותם. השתמש בשלב דגימה פלנטרית סיבובי כדי להבטיח ציפוי אחיד על דגימות עם משטחים לא סדירים.
- פעל על פי הוראות היצרן כדי להתאים את ההגדרות כגון מרחק העבודה, לחץ גז פעולה (למשל, 5 x 10 -1 - 7 x 10 -1 mbar) (למשל, 30 מ"מימ.), הזמן המקרטע (למשל, 50 שניות), עובי שכבת זהב (למשל, 12 ננומטר) הזרם (למשל, 15 mA) והיחס בין ההיצע מתח (למשל, 600 V) 45.
- הסר את הספחים ולקחת אותם אל SEM (סעיף 6). לחלופין, למקם את הספחים לתוך מיכל אטום עם ג'ל סיליקה (איור 2 ג).
איור 3: גמגום coater (א) ו- מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (ב). (א) מבט מלפנים של תא ואקום (משמאל), valv גזדואר, טיימר, ואקום, ובקרות נוכחיות. (ב) מבט צד של המרכיבים העיקריים SEM (משמאל לימין): בעמודת הוואקום עם תא המדגם, מסך המחשב עם הבקרות, ועל הצג של התא. התמונות צולמו על ידי י 'רואיז-ליאון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
6. תצפית תחת סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SEM, איור 3B)
- SEM סטרט
- פעל על פי הוראות היצרן כדי להתחיל ולהגדיר את SEM, התאמת גובה מדגם קוטר הצמצם המטרה (למשל, עבור צמחים 2 מיקרומטר ועבור פטריות oomycetes 4 מיקרומטר), מתח ההפעלה (למשל, 15 kV).
- בדוק את היישור הנכון של מערכת אלומת האלקטרונים ולהגדיר את היישור הצירי ואת stigmators פי אינדיקציות יצרנים. התאם tהוא עובד מרחוק על מנת לקבל עומק נאות של שדה.
- לכידת תמונה
- קבל תמונה ממוקדת של המדגם ולהשתמש בו כנקודת התחלה. ההגדלה הקרובה ההגדלה לרמה המקסימלית ולמקד את התמונה שוב. בחר באזורים עם חריגות משטח כגון חורים. אסטיגמציה נכון ולהתאים את הניגודיות ובהירות האופטימליות.
- ללכוד את תמונת SEM עם הרזולוציה הגבוהה. השתמש גלאי BSE אם התמונה מראה כי הדגימות נזקפות. אחרת, מפעיל את גלאי SE. שנה את הגלאי בעקבות הוראות היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פיתוח פרחוני קיבוע של פיתוח ומבני צמח מגובש
באמצעות הפרוטוקול-CPD FAA המתואר כאן, רקמות צמח צעירות ובוגרות שתוקנו באופן המיטבי מיובש הדמית SEM. תהליכים כגון פיתוח פרחוני ניתן לשחזר בגלל הטופוגרפיה והצורה של ניצנים אינה מעוותת על ידי התא מתכווץ (איורים 1b, 1D, 4a-ו). מבנים עם צורות מורכבות יכולים להיות מכוסים בהצלחה עם שכבה אחידה של חומר מוליך (המתכת מן coater הגמגום), המאפשרים ההתאוששות של פרטים בלתי מושגים אחר (איורים 4G-I, 5e). תמונות באיכות טובה של דגימות המגיעים microenvironments רטוב, אשר היה אמור להיות מחיר מופקע עם הזרם אלקטרונים אם מיובש קשה ומצופה, יכולה להיות מושגת (איורים 4 ו, 5 א, 5 ב '). פרטים חשובים כגון משטח קיר אבקה (5b איור, 5c) וסוגים שונים של indumenta (איורי 5D-ז) ניתן ללמוד לעומק בלי חלקיקים מלאכותיים או לא רצויים או צורות מעוותות.
איור 4: קדומה (a, b), באמצע (ה c-), ומאוחר (fi) פיתוח פרחוני שנתפס תחת SEM. (א) אֶשׁכּוֹל של spinosa Caesalpinia (מולינה) Kuntze עם meristems פרחוני מספר. (ב) לאור למעלה של אֶשׁכּוֹל צעיר מַרבֵּה חָלָב violacea Aubl. (ג) ניצן פרחוני של Krameria ixine Loefl. במהלך התמיינות gynoecium. (ד - ה) ניצני Erythrina sp. (ו) תמוך, הבט על פרח של ixine Krameria. המאבקים והסגנון לבלוט. (ז - ט) carnosa Hoya (L.) ר 'בראון. (
איור 5: micrographs SEM של sporangia ואבקה (a, b), משטחים מפורט (ה c-), ו indumenta (f - g). (א) Sporangia של sp Dryopteris. (ב) אבקה של האינטרנט DA Prunus Dulcis ב הנחיתה על הסטיגמה. (ג) אבקה של כדנית Alata בלאנקו. (ד) מבט צד של תפרחת של Erigeron karvinskianus DC. התמונה נלקחה עם אפשרות גלאי BSE. (ה) מבט צד של sp טחבים Peristoma. (ו) בלוטות ולא-בלוטות trichomes על פני שטח abaxial של עלה של L officinalis Rosmarinus. (ז) תצוגה מלמעלה של קשקשי העלים השטוחים של L europaea Olea. סולמות: (א) 400 מיקרומטר, (ב) 60 מיקרומטר, (ג) 5 מיקרומטר, (ד) 4 מ"מ, (ה) 600 מיקרומטר, (ו) 200 מיקרומטר, (ז) 600 מיקרומטר. התמונות צולמו על ידי י 'רואיז-ליאון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
השפעת המצעים שונים על צמיחת השדרה של ציסטות משתי Saprolegnia parasitica
s = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> דפוס הצמיחה עמוד השדרה היה שונה על מצעים שונים. על זכוכית, הקוצים היו מאורכים והראה לולאות בקצותיהן (טבלה 1, איור 6 א). על פחמן וזהב ורשתות הקוצים הם קצרים, מכורבלת ולגדול יותר בשפע ברחבי ציסטות בלי ליצור לולאות (איורים 6 ב, 6 ד). למרות על רשתות נחושת, הקוצים נטו להתכרבל בלי לכרוך, חלקם מאורך (איור 6 ג). על קשקשי דגים, הקוצים היו מתולתל, שופע מסביב למשטח ולפעמים נוצר כרך הקצוות (איור 6 ה-ו).
איור 6: דפוסי צמיחה דיפרנציאלי של עמוד השדרה של Saprolegnia parasitica ציסטות שקועה בתקשורת נוזלית. (א) גלאסים. פחמן (ב). נחושת (ג). (ד) זהב. (ה) הייק מידה. (ו) סולם סלמון. קוצים ישר פותחו על זכוכית ונחושת, ואילו קוצים מסולסלים נוצרו על פחמן, זהב, קשקשי דגים. העצות המכורות (החצים לבנים) של עמוד השדרה ניתנת לצפייה בכל עמוד השדרה גדלה על זכוכית ב כמה קוצים על קשקשי דגים. קירות ציסטה הם בצהוב. קנה מידה: 20 מיקרומטר. התמונות צולמו על ידי י 'רואיז-לאון וס Rezinciuc. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| משטח | מורפולוגיה שדרה | |
| הַאֲרָכָה | Loop בקצה | |
| מכסה זכוכית | התארכות טובה, קוצים קלים לספור מתנה | |
| קשקשי דגים | שדר עם צורה מתולתלת לא קל לספור | מתנה |
| רשתות TEM | קצר ומתולתל הקוצים לא קל לספור | נֶעדָר |
טבלה 1: מורפולוגיה השדרה באמצעות סוגים שונים של המצע.
תצפיות בלתי צפויות ב herculanea f Phellorinia. stellata
מלבד הממצא הבלתי צפוי של העובש laticiferous על exoperidium של פ herculanea, Calonge et al. 31 מצאו globose ותאי אחות חלקה (8-13 מיקרומטר) מעורבב עם נבגים בחומר מיובש בתודה CPD לשלב התייבשות ביצע במיקרוגל. (איור 1D). המבנה ופרטים של קירות tהוא תא אחות הנבגים נשמרים היטב למרות רכב ההפרש שלהם (איורים 1 ג-ד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עם כל כבוד פרוטוקולי SEM רגילים, את שיטות העבודה שהוצגו כאן כוללות יחסית מהירות, קל לעקוב, ומתודולוגיות בעלות נמוכה. בהתאם לכמות של דגימות על מנת להקל על עיבוד, זה לוקח ארבעה עד חמישה ימים כדי לרכוש תמונות באיכות טובה. כוללים אמצעי בטיחות נאות עבור מבצע CPD ו SEM, הנהלים הם קלים לטפל. זהירות מיוחדת צריכה להילקח עם פורמלין ואת glutaraldehyde (ראה 1.1.1 צעדים 1.1.3 ו 2.1.5 לפרוטוקול). ישנם צעדים מסוימים שבהם, במידת הצורך, תהליך זה יכול להיפסק במשך זמן רב מבלי לפגוע דגימות או הורס השלבים הקודמים (למשל, צעדים 1.1.5, 1.2.3, ו 1.3.5). במונחים של עלות, חלק גדול מן הציוד ניתן לעשות שימוש חוזר עבור הכנות כמה (למשל, מכולות אלומיניום CPD ומחזיקי בדל), ואת ריאגנטים הם כימיקלים שאינם יקרים זמינים מכל הספקים המסחריים.
חסרונות של נהלים אלה הםהצורך לסילוק פסולת כימי נכון עבור אלדהידים ואת אתנול המחסור באספקת מפתח ואת המגבלות של הטכניקה. חומרים כגון דיסק הזהב עבור coater הגמגום לבין צילינדר CO 2 עבור CPD צריכים להיבדק היטב מראש. אם הם נמצאים בשימוש רציף, במעבדה תדרוש מניות מרובות מהם, אשר בסופו של דבר מעלה את העלויות. מכיוון חוקרים פרטיים לעתים קרובות לא יכולים להצדיק את ההוצאות נגזרות התחזוקה של סוגים אלה של אספקה, או שהם פשוט לא צריכים להשתמש SEM ברציפות, נהלים אלה נוטים כיום להתבצע במעבדות עם שירותים במיקרוסקופ אלקטרונים חיצוניים.
טכניקת התצפית של SEM מוגבלת מחקר והגברה גדולה של משטחים. אם רקמות פנימיות צריכות לשים לב, הדגימות יש לחתוך את הדרך הנכונה לחקור את המראה החיצוני של הרקמות הפנימיות. כדי לחקור היבטים פנימיים של התאים ב ma הגבוההgnification, מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) נדרש. צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול הם הקיבוע הראוי והתייבשות של הדגימות לפני טיפול CPD, איפה זה חיוני כדי לשמור על הרקמות מפני שינויים מזעזעים ומגע ישיר עם האוויר. כמו כן, ניהול זהיר של השינוי בלחץ בתא CPD המדגם וכמות הציפוי שהופקדה על סוגים שונים של דגימות חשוב.
למרות המגבלות הללו ומניפולציות מיוחדות, ללימוד דגימות ביולוגיות עם SEM בעקבות הפרוטוקולים המתואר כאן מאפשר את הרזולוציה של בעיות נפוצות, כגון קיר תא עיוות איבר (איורים 1, 4, 5), ההגבלות על התצפית וצמיחה של מבנים קרובים מסביבות רטובות נוזליות (איורים 5, 6), ואת ההרס של תאים רגישים (1c הדמוי, 1D).
הפרוטוקולים שהוצגו כאן יש alloweד פירוש מחדש ותשאול של מאפיינים טקסונומיות מסורתיים, כגון מבנה עמוד השדרה ציסטות של Saprolegnia 47. דפוס צמיחת ההפרש של קוצי Saprolegnia על משטחים שונים מדגים את לביליות של תכונה זו ומגבלותיה לאבחון מינים. בנוסף לכידתו של למאפיינים רלוונטיים ללימודי טקסונומיות, שלבי התפתחות איברים, ומחלות זיהומיות, פונקציות של רקמות שלא נראו קודם לכן נחקר בזכות הטכניקות הללו. עכשיו, פרוטוקול זה יכול להתארך עד אלף מקרי מבחן מחכים להיבחן 33. לדברי הצופים מסד ספרות ביקורת עמיתים, בבית האחרון בחמש השנים האחרונות חלו 7425 פרסומי ניירות התמודדות עם הדמיה של צמחי SEM (4914), oomycetes (21) ופטריות (2,490). עובדה זו מרמזת כי מחקר oomycetes באמצעות הדמית SEM הוא עדיין מאוד נדיר בהשוואהצמחים ופטריות. עם ESEM, המספרים הם אפילו נמוכים יותר. ישנם 588 כתבי יד באותו פרק זמן: 337 בצמחים, 1 ב oomycetes ו -250 פטריות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
פרויקט זה קבל מימון מן המחקר של Horizon 2020 ותכנית חדשנות האיחוד האירופי תחת מס 'הסכם מענק 634429. פרסום זה משקף את הדעות רק של המחבר, והנציבות האירופיות לא יכולות להיות אחראיות על כל שימוש אשר עשוי להיות של המידע כלול בו. אנחנו גם מכירים את התרומה הכספית של Real Jardin Botanico, CSIC. SR הוא מודה האיחוד האירופי [ITN-Sapro-238,550] על התמיכה מחקרה ב Saprolegnia. כמו כן, אנו רוצים להודות פרנסיסקו Calonge עבור חביב לספק את התמונות Phellorinia herculanea ו- B. פואיו לעיבוד דגימות (איור 5). כל התמונות צולמו על ידי שירות SEM בבית Real Jardin Botanico-CSIC במדריד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D-(+)-Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
References
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
- Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
- Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
- Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
- Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
- Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
- Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
- Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
- Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
- Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
- Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
- García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
- Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
- Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
- Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
- Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
- Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
- Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
- Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
- Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
- Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
- Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
- Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
- Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
- Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
- Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
- Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
- Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
- Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
- Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
- Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
- Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
- Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
- Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
- van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
- Johansen, D. A. Plant microtechnique. , McGrow-Hill. New York. (1940).
- Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
- Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
- Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
- Echlin, P. Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , Springer Science + Business Media, LLC. NY. (2009).
- Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
- Rezinciuc, S. The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , Universidad Internacional Menéndez Pelayo. Doctoral Thesis (2013).
