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Biology

समस्याग्रस्त प्लांट, Oomycete, और फफूंद नमूने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) प्रोटोकॉल स्कैन

Published: February 3, 2017 doi: 10.3791/55031
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 3
1Biodiversity and Conservation Department, Real Jardín Botánico, CSIC, 2Research Support Unit, Real Jardín Botánico, CSIC, 3Mycology Department, Real Jardín Botánico, CSIC, 4Division of Glycoscience, AlbaNova University Center, Royal Institute of Technology (KTH)

Abstract

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) के साथ टिप्पणियों के लिए जैविक नमूने के प्रसंस्करण में आम समस्याओं सेल पतन, गीला microenvironments और सेल विनाश से नमूने के उपचार में शामिल हैं। नाजुक नमूने यहां बताए गए SEM के तहत छवि पर कब्जा के लिए नमूना उपचार में मुख्य चुनौतियों में से कुछ पर काबू पाने की प्रक्रिया करने के लिए युवा पुष्प ऊतकों, oomycete अल्सर, और कवक बीजाणुओं (Agaricales) उदाहरण के रूप में विशिष्ट प्रोटोकॉल का उपयोग करना,।

पुष्प मेरिस्टेमों एफएए के साथ तय (Formalin-एसिटिक-शराब) और महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर (सीपीडी) के साथ कार्रवाई की सेलुलर दीवारों या विकृत अंगों ढह प्रदर्शित नहीं किया था। इन परिणामों के पुष्प विकास के पुनर्निर्माण के लिए महत्वपूर्ण हैं। ऐसे glutaraldehyde तय oomycete अल्सर के रूप में गीला microenvironments, से नमूने का एक समान सीपीडी आधारित उपचार, सु के विभिन्न प्रकारों पर नैदानिक विशेषताओं का अंतर विकास (जैसे, पुटी कांटा) का परीक्षण करने के लिए इष्टतम हैbstrates। नर्स कवक बीजाणुओं से जुड़ी कोशिकाओं के विनाश पुनर्जलीकरण, निर्जलीकरण, और सीपीडी उपचार, इन कोशिकाओं के आगे कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम के बाद बचा हुआ था।

प्रोटोकॉल यहाँ विस्तृत कम लागत और अच्छी गुणवत्ता के चित्र के अधिग्रहण के विकास की प्रक्रिया को फिर से संगठित करने के लिए और नैदानिक ​​विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए तेजी के विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Introduction

जीव विज्ञान में, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें (SEM) संरचनात्मक विकास, तुलनात्मक आकृति विज्ञान, अंग विकास, और आबादी या प्रजातियों 1 के लक्षण वर्णन के अध्ययन के लिए बढ़ा दिया गया है। सूक्ष्म संरचनाओं के अपने दो आयामी दृष्टिकोण के साथ, इस तरह के micromorphology और व्यवस्था जैसे क्षेत्रों 20 वीं सदी की दूसरी छमाही के बाद से SEM तकनीक अग्रिमों से फायदा। उदाहरण के लिए, 1970 के दशक में धूम कोटिंग पद्धति की शुरूआत गैर प्रवाहकीय ऊतकों 2, 3 की इमेजिंग बढ़ाने ऐसे शूट apices और फूल के रूप में नाजुक सामग्री के संभावित अवलोकन किया। SEM के एक उच्च निर्वात वातावरण 4 में स्थलाकृति पुन: पेश करने नमूना की सतह से निकली इलेक्ट्रॉनों का उपयोग करता है।

SEM शामिल अध्ययन दोनों संरचनात्मक पात्रों के अनुमान और growt के पुनर्निर्माण में ध्यान केंद्रित कर रहेज प्रक्रियाओं। न्यू संरचनात्मक वर्गीकरण के लिए प्रासंगिक और वर्ण जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला की व्यवस्था SEM टिप्पणियों से खोज की गई है। उदाहरण के लिए, संयंत्र लक्षण इस तरह की लकड़ी 5, कलंक विविधता 6, nectary और पुष्प आकृति विज्ञान 7, 8, trichome विवरण 9, और पराग अनाज की पहनाया हुआ गड्ढ़े 10, 11, ठीक से बिना कल्पना नहीं की जा सकती है के रूप में, प्रजातियों निदान या supraspecific वर्गीकरण के लिए इस्तेमाल किया SEM। पारंपरिक SEM के साथ सफल टिप्पणियों को भी लंबे समय formalin तय जीवों 12 के लिए हासिल किया गया है और संयंत्र वनस्पति संग्रहालय 13 नमूनों।

दूसरी ओर, SEM का उपयोग विकास की प्रक्रिया के पुनर्निर्माण के अध्ययन में इस तरह के अंग विकास 14, infe के रूप में विषयों की एक विस्तृत श्रृंखला शामिलबैक्टीरिया 15, पौधे जड़ शरीर क्रिया विज्ञान 16, परजीवी मेजबान लगाव तंत्र 17, 18, परजीवी 19, mycoparasitism और प्रतिजीविता 20, 21, विकास कुरूपता 22, जंगली और उत्परिवर्ती व्यक्तियों 23 के तुलनात्मक विकास, और पूरे जीवन चक्र पर दवा के प्रभाव से प्रेरित ctions 24। पर्यावरण स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (ESEM) 25 विकास की प्रक्रिया में गीला जैविक नमूने के अवलोकन के लिए महत्वपूर्ण लाभ हो सकता है, नाजुक सामग्री अभी भी ESEM) के कम निर्वात हालत में समझौता किया जा सकता है, और नुकसान से बचने के लिए पर्याप्त रूप से संसाधित करने की आवश्यकता के मूल्यवान रूपात्मक अवलोकन।

इस पत्र, तीन रचनाकार के SEM अवलोकन के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल की समीक्षा मेंनमूनों की erent प्रकार प्रस्तुत है: पुष्प मेरिस्टेमों, oomycetes (Saprolegnia), और फंगल सामग्री। इन प्रोटोकॉल हमारे पिछले SEM आधारित अध्ययन 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, जहां विशिष्ट कठिनाइयों और वैकल्पिक समाधान पाया गया है के अनुभव संकलन। संयंत्र तुलनात्मक विकास और संरचनात्मक अध्ययन के मामले में, SEM के उपयोग के 1970 के दशक के 34, 35 में शुरू किया था, और तब से, शोधकर्ताओं ने पाया है कि कुछ पुष्प सुविधाओं को और अधिक अस्थिर तुलना में पहले सोचा 36 हैं। पुष्प विकास के पुनर्निर्माण युवा पुष्प मेरिस्टेमों और anthesis के बीच सभी चरणों का कब्जा शामिल है। इस उद्देश्य तक पहुंचने के लिए, यह Esse हैntial कि नमूना स्थलाकृति और कोशिका दीवार अखंडता निर्धारण और बाद में निर्जलीकरण के बाद समझौता नहीं कर रहे हैं। (आंकड़े 1 ए, 1 बी) के युवा पुष्प मेरिस्टेमों विशेष रूप से सेल की दीवार ढहने की चपेट में हैं। इसी तरह, इस तरह के nectaries, पंखुड़ी, कलंक और sporangia के रूप में नाजुक संरचनाओं प्रभावी और undamaging प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। इस समीक्षा SEM इमेजिंग के लिए बरकरार युवा और नाजुक ऊतकों को रखने के लिए एक इष्टतम प्रोटोकॉल का सार।

Oomycetes (Stramenopiles) परजीवी के सबसे विविध और व्यापक समूहों में से -एक, रोगाणुओं और पौधों से अकशेरुकी और रीढ़ 37 से लेकर मेजबान टीम के साथ के मामले में - वहाँ बीजाणुओं कि आगे बढ़ने और एक गीला वातावरण में विकसित कर रहे हैं। क्योंकि बीजाणुओं एक पर्याप्त सब्सट्रेट मानक SEM प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त नहीं की जरूरत है इस हालत SEM अवलोकन के लिए एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। Oomycetes के बीच, Saprolegnia की प्रजातियों में विशेष रुचि के हैं क्योंकि वे सीएn aquacultures, मत्स्य पालन, और उभयचर आबादी 38 में गंभीर कटौती के कारण। इस तरह के अल्सर के आदी कांटा के रूप में Micromorphological विशेषताओं, Saprolegnia, जो संक्रमण नियंत्रण और संभावित उपचार 39 की स्थापना के लिए मौलिक है की प्रजातियों की पहचान करने के लिए उपयोगी होना पाया गया है। इधर, विभिन्न substrates पर अल्सर की रीढ़ की हड्डी विकास के पैटर्न की तुलना करने के लिए और महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर (सीपीडी) तैयार करने और बाद में SEM अवलोकन के लिए नमूना हेरफेर करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल है।

एक तिहाई मामले में, वहाँ दिलचस्प निष्कर्ष है कि कवक Phellorinia herculanea च के बीजाणुओं की एक निरीक्षण के बाद आया है। stellata च। नोवा (Agaricales) 31। साथ में बीजाणुओं के साथ, अप्रत्याशित नर्सरी कोशिकाओं का एक समूह SEM के तहत पहचान की थी। पिछले पारंपरिक प्रोटोकॉल और इलाज सामग्री के साथ, नर्स कोशिकाओं कहां आयाटी पूरी तरह से (चित्रा -1 सी) ढह गई। बीजाणुओं के लिए जुड़े विशेष ऊतकों के बारे में अधिक अनुमान मानक दृष्टिकोण यहाँ वर्णित (चित्रा -1) करने के लिए आसान है, लेकिन महत्वपूर्ण संशोधनों के साथ बनाया जा सकता है।

इस समीक्षा में, वहाँ विस्तृत SEM प्रोटोकॉल है कि में SEM अवलोकन के साथ जुड़े विभिन्न समस्याओं से निपटने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वनस्पतियों, oomycetes, और इस तरह के सेल पतन और मेरिस्टेमेटिक ऊतक सिकुड़ते, पुटी कांटा के गैर इष्टतम विकास, और के विनाश के रूप Agaricales, अल्पकालिक ऊतकों, क्रमशः।

आकृति 1
चित्रा 1: बिना (क, ग) और (बी, डी) प्रोटोकॉल एफएए-इथेनॉल सीपीडी इलाज के नमूने की तुलना। (एक - ख) Anacyclus clavatus, मध्य विकास के फूलों की कलियों। बड आज़मियम tetroxide 46 <के साथ इलाज/ sup> (क) और एफएए-सीपीडी प्रोटोकॉल (ख) के साथ इलाज कली। (ग - घ) के Phellorinia herculanea च बीजाणुओं के साथ नर्स कोशिकाओं। stellata। बिना किसी उपचार (ग) और प्रोटोकॉल यहाँ Agaricales (घ) के लिए वर्णित के साथ सूखे नमूने हैं। नारंगी में बीजाणुओं। तराजू: (एबी) 100 माइक्रोन, (सीडी) 50 माइक्रोन। Photos वाई रूज़-Leon द्वारा उठाए गए थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल छह मुख्य वर्गों, विशेष जीवों (वर्गों 1-3), और तीन सब (4-6) के लिए आम प्रक्रियाओं का वर्णन करने के लिए तीन समर्पित भी शामिल है। तारों (*) प्रयोगकर्ताओं द्वारा संशोधित कदम से संकेत मिलता है।

1. विकास के अध्ययन और पूरी तरह से बनाई संयंत्र संरचनाएं

  1. संग्रह और निर्धारण
    1. संयंत्र सामग्री एक धूआं अलमारी करने के लिए कोई उपयोग के साथ एक ही स्थान पर एकत्र किया जाता है, तो परिचय और अपकेंद्रित्र ट्यूब में 70% इथेनॉल में सामग्री विसर्जित कर दिया। आदर्श रूप में, एफएए में 48 घंटे (कदम 1.1.1-1.1.3) के बाद सामग्री विसर्जित इथेनॉल में अत्यधिक निर्जलीकरण से बचने के लिए। एक धूआं अलमारी संयंत्र सामग्री के लिए सुलभ है, तो इस चरण की उपेक्षा और 1.1.1 के साथ जारी है।
    2. एक धूआं अलमारी एक एल्डिहाइड फिल्टर के साथ फिट में formalin-एसिटिक शराब (एफएए) लगानेवाला तैयार करें। 70% विकृत इथेनॉल के 85 भागों, 60% formaldehyde के समाधान के 10 भागों, और हिमनदों एसिटिक एसिड के 5 भागों को जोड़ने। एफएए तैयारबस सामग्री फिक्सिंग, अपनी लंबी अवधि के भंडारण के रूप में पहले 40 अनुशंसित नहीं है।
    3. धूआं अलमारी के तहत अलग-अलग चौड़े मुंह और रिसाव प्रूफ प्लास्टिक की बोतलों में एफएए के शेयर डालना। के रूप में कई बोतलों का प्रयोग के रूप में वहाँ उपलब्ध नमूने हैं, और नमूना पहचान के लिए लेबल बनाने।
    4. ठीक करने के लिए पुष्प या वनस्पति मेरिस्टेमों का चयन करें, यह सुनिश्चित करना है कि वे कीड़े, कवक, या चरम मौसम की स्थिति से क्षतिग्रस्त नहीं कर रहे हैं। शाखाओं में कटौती, अवांछित सामग्री को हटाने, और वे उनके समाधान में तुरंत नमूना जमा।
    5. 72-96 घंटे के बाद, रासायनिक निपटान के लिए एक प्लास्टिक कंटेनर में एफएए डालना। इसके तत्काल बाद, ताजा 70% इथेनॉल के साथ नमूने तीन बार धोने के किसी भी अवशिष्ट एफएए हटा दें। फिक्स्ड सामग्री 70% इथेनॉल में अनिश्चित काल के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  2. विच्छेदन और निर्जलीकरण
    1. stereomicroscope के तहत 70% इथेनॉल में तय सामग्री काटना अल्ट्रा ठीक चिमटी का उपयोग कर, needles, संदंश, ब्रश, और सूक्ष्म नलियां (ऊतक का अधिकतम आकार लगभग 1 में 3 सेमी, या फ्लैट सामग्री के लिए 2 सेमी होना चाहिए)। सूखने से ऊतकों को रोकने के लिए इथेनॉल के साथ कवर एक पेट्री डिश में नमूने काटना। आधार सूखी काले सिलिकॉन के साथ कवर के साथ एक पेट्री डिश का उपयोग बेहतर विषम सफेद ऊतकों देखने के लिए।
    2. महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर (सीपीडी, चित्रा 2A) के लिए नमूना कंटेनरों में विच्छेदित सामग्री रखो। इस बिंदु पर, 70% इथेनॉल के साथ पेट्री डिश में कंटेनर को विसर्जित कर दिया, और नमूना पहचान लेबल (कागज और पेंसिल के साथ बनाया) शामिल हैं। आगे हेरफेर के लिए और अधिक प्रभावी सुखाने के लिए, एक ही कंटेनर में युवा और परिपक्व नमूने मिश्रण से बचने। *
    3. कंटेनरों पर पलकों रखो और 70% इथेनॉल के बहुत से प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में उन्हें जमा। ट्यूबों के स्टोर में रात भर अगर सामग्री तुरंत कार्रवाई नहीं कर रहा है।
    4. निम्नलिखित इथेनॉल Serie के माध्यम से विच्छेदित सामग्री हस्तांतरण70%, 90%, 100%, और 100%: भली भांति बंद जार या अपकेंद्रित्र ट्यूब में है। कम से कम 1 घंटे के लिए प्रत्येक समाधान में नमूने छोड़ दें। नमूने के लिए एक 100% इथेनॉल समाधान में रात भर रखें।
    5. सीपीडी (धारा 4) के लिए सामग्री के साथ कंटेनर स्थानांतरण।
  3. SEM के अवलोकन के लिए बढ़ते और तैयारी संयंत्र के ऊतकों
    1. SEM नमूना धारकों (यानी, एल्यूमीनियम स्टब्स) के नीचे नमूना पहचान संख्या लिखें। डबल पक्षीय टेप के साथ स्टब्स के ऊपर कवर। एक नमूना धारक (चित्रा 2 बी) में स्टब्स रखें।
    2. एक stereomicroscope के तहत, ध्यान से कंटेनर युवा और नाजुक नमूने पहले से ही सीपीडी में सूखे ले जाने खुला। ध्यान में रखिए कि सीपीडी उपचार के बाद, नमूने हल्का और इलेक्ट्रोस्टाटिक्स के प्रति संवेदनशील हो जाते हैं। कंटेनर एक बार नमूने बाहर ले जाया गया है धूल या दोष से बचने के लिए बंद करें।
    3. , स्टब्स की चिपचिपा सतह पर नमूने डाल आगे की योजना बना वांछितस्थिति (एक बार नमूने सतह को छूने, यह बहुत मुश्किल है उन्हें दूर करने के लिए)। इस बिंदु पर एक प्रमुख विच्छेदन ले जाने की कोशिश मत करो; सिर्फ अवांछित ऊतक लेने के लिए आसान है कि हटा दें। palynological पढ़ाई के लिए, anthers काटना और उन्हें खोलने स्टब्स पर पराग बेनकाब करने के लिए।
    4. ऐसे क्षैतिज स्थिति में पुष्पक्रम के रूप में डाल लंबे नमूने (जैसे, 2 सेमी लंबे)। जब संभव हो, ध्रुवीय, पक्ष के लिए एक ही संरचना, और नीचे विचारों के ओरिएंट नमूने हैं। ठूंठ पर नमूने के बीच पर्याप्त जगह छोड़ दें।
    5. नमूने तुरंत संसाधित नहीं किया जा सकता है, तो * रखने के लिए उन्हें सिलिका जेल के साथ एक भली भांति बंद कंटेनर में रात भर संरक्षित पुनर्जलीकरण (चित्रा 2 सी) से बचने के लिए। कोट धूम coater का उपयोग कर सकते हैं और उन्हें SEM के लिए स्थानांतरण के नमूने (5 वर्गों और 6)।

चित्र 2
चित्रा 2: नमूना manipulati के लिए उपकरणपर और SEM अवलोकन के पहले प्रसंस्करण। (क) स्टील का बना सीपीडी कक्ष में इथेनॉल / सीओ 2 के विनिमय के लिए छिपे दीवारों के साथ नमूना कंटेनर। (ख) एक प्लास्टिक नमूना धारक के भीतर स्टील स्टब्स। (ग) ग्लास कंटेनर नमूने नमी और धूल से सुरक्षित रखने के लिए इस्तेमाल किया। आधार पर, वहाँ सिलिका जेल के लिए एक डिब्बे है। (घ) महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर। सामने, वहाँ (बाएं से दाएं) दबाव नापने का यंत्र, बिजली स्विच, तापमान नियंत्रण प्रणाली है, और तापमान प्रदर्शन कर रहे हैं। सीओ 2 -ethanol इंटरचेंज के लिए हमेशा काम के दबाव 60 बार (800 साई) है। शीर्ष में, वहाँ चार वाल्व (इनलेट, नाली, वेंटिलेशन, और निकास नियंत्रण) केंद्रीय नमूना कक्ष flanking हैं। Photos वाई रूज़-लियोन और एमए बेलो द्वारा उठाए गए थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

< पी वर्ग = "jove_title"> 2। विभिन्न सतहों पर Saprolegnia (oomycetes) की पुटी व्यवहार के अध्ययन

  1. बढ़ रही है और अल्सर फिक्सिंग
    1. (+) - - ग्लूकोज (6 ग्राम) और Mycological peptone (3 जी) * peptone और ग्लूकोज (पीजी-एल) मीडिया 41 डी का उपयोग कर तैयार करें। ऊपर नल के पानी के 900 एमएल में जोड़े और 121 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट आटोक्लेव। पहले से autoclaved समाधान ए के 50 एमएल (नाह 2 4 पीओ, 0.13 एम) और समाधान बी के 50 एमएल (ना 2 HPO 4, 0.13 एम) डालो।
    2. Peptone, ग्लूकोज, अगर मीडिया (पीजीए, जो PG-एल के रूप में लेकिन ग्लूकोज और आटोक्लेव पहले peptone करने के लिए यूरोपीय जीवाणु अगर की 10 ग्राम जोड़कर तैयार किया जाता है) पर बनाए रखा Saprolegnia parasitica के तनाव का जायजा संस्कृतियों, से 0.5 एमएल में mycelia कालोनियों बढ़ने पेट्री डिश में 20 डिग्री सेल्सियस पर 24-48 घंटे के लिए PG-एल बूंदों की। तीन बार Autoclaved नल के पानी से धोने के mycelia और 20 डिग्री से कम 15 घंटे के लिए उन्हें incubating सी द्वारा sporulation प्रेरित= "xref"> 42, 43।
    3. धीरे निलंबन के ऊपरी भाग pipetting द्वारा जारी माध्यमिक zoospores लीजिए और 1 एमएल भागों में उन्हें पूल। माध्यमिक अल्सर 44 उत्पादन करने के लिए vortexing द्वारा सख्ती एस के लिए 30 zoospores आंदोलन।
    4. अल्सर का कांटा का अंतर है विकास, अलग पेट्री डिश (P60) पर परीक्षण करने के लिए, विभिन्न सतहों (यानी, कार्बन, सोना, तांबा और मंदिर ग्रिड पर माध्यमिक पुटी निलंबन की 0.5 एमएल डाल; सामन और हेक मछली तराजू (पहले प्रक्षालित), और कांच कवर फिसल जाता है) *। 70 मिनट है, जो सतह के लिए अल्सर की कुर्की के उपकार के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर अल्सर सेते हैं।
    5. तरल निकालें और अल्सर के निर्धारण के लिए प्रत्येक सतह के लिए 2% glutaraldehyde के 0.5 एमएल जोड़ने। 1 घंटे के लिए एक धूआं अलमारी के तहत कमरे के तापमान पर नमूने रखें।
    6. glutaraldehyde निकालें और एक इथेनॉल श्रृंखला (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% के माध्यम से नमूना निर्जलीकरण, 90%, 100%, और 100%), 15 मिनट के लिए प्रत्येक इथेनॉल समाधान के 5 एमएल जोड़ने। पिछले 100% इथेनॉल समाधान में एक बार, नमूना एक मोहरबंद पेट्री डिश में एक महीने तक के लिए भंडारित किया जा सकता है। इस स्तर पर, नमूने सीपीडी में सूखे होने के लिए तैयार कर रहे हैं।
    7. ध्यान से सीपीडी (धारा 4) के लिए उपयुक्त एक धारक को पेट्री डिश से ग्रिड और तराजू हस्तांतरण। इस कदम के लिए, एक सीपीडी ग्रिड धारक या एक स्टैकिंग नमूना धारक है, जो एक दूसरे से अलग नमूने रखने का उपयोग करें। ग्रिड और चिमटी के साथ तराजू ले लो, मन में है कि अल्सर ग्रिड सब समय पर सामना होना चाहिए में रखते हुए। *
  2. SEM के अवलोकन के लिए बढ़ते और तैयारी पुटी नमूने
    1. ग्रिड और एल्यूमीनियम स्टब्स है कि पहले दो तरफा कार्बन टेप के साथ कवर और नीचे लेबल थे पर तराजू माउंट।
    2. धूम coater (धारा 5) के लिए नमूने स्थानांतरण।
    3. SEM (धारा 6) के तहत नमूने का निरीक्षण करें।

Phellorinia herculanea की वनस्पति संग्रहालय कवक spores के अध्ययन

  1. पुनर्जलीकरण और बीजाणुओं का निर्जलीकरण
    1. फिल्टर पेपर के साथ सावधानी से प्रत्येक नमूना लपेटें, पेंसिल लेबल लिफाफे बनाने ~ 0.5-1 2 सेमी, देखभाल करने के लिए उन्हें कुचलने के लिए नहीं। पेपर क्लिप के साथ फिल्टर पेपर सील। एक पेट्री डिश के लिए पैक नमूने स्थानांतरण और उन्हें पानी के 10 एमएल में विसर्जित बीजाणुओं के आसपास के ऊतकों rehydrate करने के लिए।
    2. इसके तत्काल बाद एक माइक्रोवेव (लगभग 20 एस के लिए 600 डब्ल्यू) में नमूने डाल दिया। सामग्री को हटाने में एक बार पानी लुप्त हो जाना शुरू होता है, और यह कमरे के तापमान पर शांत करने के लिए अनुमति देते हैं।
    3. निम्नलिखित इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से नमूने दर्रा: 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, और 100%। नमूने की मात्रा पर निर्भर करता है, इस कदम के लिए एक बीकर या अपकेंद्रित्र ट्यूब का उपयोग करें। प्रत्येक समाधान में 15 मिनट के लिए नमूने छोड़ दें।
    4. सीपीडी (धारा 4) के लिए नमूने रखें।
  2. बढ़ते और पीSEM के अवलोकन के लिए बीजाणुओं reparing
    1. लिफाफे खोलें। डबल पक्षीय टेप के साथ एक पहले से तैयार ठूंठ पर बीजाणुओं डालो। वैकल्पिक रूप से, स्टब्स की चिपचिपा सतह के साथ बीजाणुओं, * इकट्ठा ख्याल रख रही है उन्हें कुचलने के लिए नहीं।
    2. नमूने कुछ बीजाणुओं शामिल हैं, पिछले चरण के अलावा, लिफाफा (~ 1 मिमी 2) का एक छोटा सा टुकड़ा काट और एक नया ठूंठ * पर जगह है।
    3. धूम coater (धारा 5) में ऊतकों रखें।
    4. SEM (धारा 6) के तहत निरीक्षण करें।

4. सामग्री की सुखाने एक महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर का उपयोग कर (सीपीडी, चित्रा 2 डी)

  1. एक हवादार क्षेत्र में सीपीडी का प्रयोग करें और सत्यापित करें कि सभी मशीन के वाल्व बंद हो जाती हैं। यदि नमूना कक्ष खाली और साफ है की जाँच करें।
  2. मशीन पर स्विच और सत्यापित करें कि तापमान नियंत्रण प्रणाली का परीक्षण स्वचालित रूप से जगह लेता है। सीपीडी एक बाहरी प्रशीतन स्नान प्रणाली है, मैं स्विच करने से पहले पानी के स्तर की जांचटी।
  3. विशिष्ट इथेनॉल और सीओ 2 के विनिमय के लिए इस्तेमाल किया सीपीडी के निर्माता के निर्देशों का पालन करें। सुरक्षा के लिए, किसी मशीन के उपयोग के लिए प्रशिक्षित की देखरेख में इस कदम पर ले। याद रखें कि यह तेजी से दबाव में परिवर्तन करने के लिए सामने आ रहा है, यह हिंसक बाहर उड़ा सकता है।
  4. नमूने बाहर ले जाओ और यदि संयंत्र के ऊतकों के साथ काम कर कदम 1.3 के साथ जारी रखने के लिए, 2.2 कदम यदि oomycetes अल्सर के साथ काम कर रहा है, और 3.2 कदम यदि कवक spores के साथ काम कर रहे हैं।

5. गोल्ड धूम Coater (चित्रा 3 ए) का उपयोग के साथ नमूने कोटिंग

  1. धूम coater की जाँच करें। सत्यापित करें कि सोने कैथोड लक्ष्य अच्छी हालत में है। यदि आवश्यक हो तो निर्वात चैम्बर की दीवारों और चैम्बर ढक्कन साफ ​​करने के लिए एक प्रकार का वृक्ष मुक्त कपड़ा 90% इथेनॉल के साथ भीग का प्रयोग करें।
  2. खुर्दबीन के नीचे नमूने की आगे की पहचान के लिए प्रत्येक ठूंठ छेद के बगल में संख्या के साथ धूम धारक निशान। ध्यान से, स्टब्स sampl के साथ भरी हुई जगहतों और उन्हें सुरक्षित। एक रोटरी ग्रहों नमूना मंच का उपयोग अनियमित सतहों के साथ नमूनों पर एक समान कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए।
  3. इस तरह के काम दूरी के रूप में सेटिंग्स समायोजित करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें, आपरेशन गैस के दबाव (जैसे, 5 एक्स 10 -1 - 7 एक्स 10 -1 मिलीबार) (जैसे, 30 मिमी।), Sputtering समय (उदाहरण के लिए, 50 s), सोने की परत (जैसे, 12 एनएम) वर्तमान (जैसे, 15 एमए) और वोल्टेज की आपूर्ति (जैसे, 600 वी) 45 की मोटाई।
  4. स्टब्स निकालें और उन्हें SEM (धारा 6) के लिए ले। वैकल्पिक रूप से, सिलिका जेल (चित्रा 2 सी) के साथ एक मोहरबंद कंटेनर में स्टब्स जगह है।

चित्र तीन
चित्रा 3: धूम coater (क) और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (ख)। (क) निर्वात चैम्बर (बाएं) के सामने का दृश्य, गैस valvई, टाइमर, निर्वात, और वर्तमान नियंत्रित करता है। (ख) SEM मुख्य घटकों के साइड देखें (बाएं से दाएं): नमूना कक्ष, नियंत्रण के साथ कंप्यूटर स्क्रीन, और कक्ष की निगरानी के साथ वैक्यूम स्तंभ। Photos वाई रूज़-Leon द्वारा उठाए गए थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

6. स्कैनिंग के तहत अवलोकन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM, चित्रा 3 बी)

  1. SEM से शुरू
    1. निर्माता के निर्देशों शुरू और SEM सेट, (, जैसे पौधों 2 माइक्रोन के लिए और कवक और 4 माइक्रोन oomycetes के लिए) नमूना ऊंचाई उद्देश्य एपर्चर व्यास का समायोजन, ऑपरेटिंग वोल्टेज (जैसे, 15 केवी) का पालन करें।
    2. इलेक्ट्रॉन बीम सिस्टम के सही संरेखण की जाँच करें और अक्षीय संरेखण और निर्माताओं के संकेत के अनुसार stigmators निर्धारित किया है। टी समायोजित करेंवह क्रम में क्षेत्र की एक पर्याप्त गहराई प्राप्त करने के लिए दूरी काम कर रहे।
  2. चित्र उतारना
    1. नमूने के एक ध्यान केंद्रित छवि हो जाओ और एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में उपयोग करें। अधिकतम स्तर तक बढ़ाई बंद बढ़ाएँ और छवि फिर से ध्यान केंद्रित। ऐसे छेद के रूप में सतह अनियमितताओं के क्षेत्रों का चयन करें। सही दृष्टिवैषम्य और इष्टतम विपरीत और चमक को समायोजित।
    2. कब्जा उच्च संकल्प के साथ SEM छवि। बीएसई डिटेक्टर का उपयोग करता है, तो छवि को दर्शाता है कि नमूने का आरोप लगाया है। अन्यथा, एसई डिटेक्टर निर्धारित किया है। निर्माता के निर्देशों का पालन डिटेक्टरों बदलें।

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Representative Results

पुष्प विकास और विकास के फिक्सेशन और पूरी तरह से बनाई संयंत्र संरचनाएं

एफएए-सीपीडी यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का प्रयोग, युवा और परिपक्व संयंत्र के ऊतकों बेहतर तय की और SEM इमेजिंग के लिए निर्जलित रहे हैं। क्योंकि स्थलाकृति और कलियों का आकार सिकुड़ सेल (आंकड़े 1 बी, 1 डी, 4 ए-एफ) द्वारा विकृत नहीं है इस तरह के फूलों की विकास प्रक्रियाओं के रूप में खंगाला जा सकता है। जटिल आकार के साथ संरचनाओं को सफलतापूर्वक, प्रवाहकीय सामग्री (धूम coater से धातु) के एक समान परत के साथ कवर किया जा सकता है अन्यथा अगम्य विवरण (आंकड़े 4 जी-मैं, 5e) की वसूली की इजाजत दी। गीला microenvironments, जो इस्तेमाल से आने वाले नमूनों की अच्छी गुणवत्ता की छवियों इलेक्ट्रॉन वर्तमान के साथ overcharged हो सकता है अगर बुरी तरह से सूखे चूर्ण और लेपित, प्राप्त किया जा सकता है (आंकड़े 4F, 5 ए, 5 ब)। ऐसे पराग दीवार की सतह के रूप में महत्वपूर्ण विवरण (चित्रा 5 ब, 5C) और indumenta (आंकड़े 5 डी-जी के विभिन्न प्रकार) कृत्रिम या अवांछनीय कणों या विकृत आकार के बिना गहराई से अध्ययन किया जा सकता है।

चित्रा 4
चित्रा 4: प्रारंभिक (क, ख), मध्य (सी ई), और देर से (इंटरनेट) पुष्प विकास SEM के तहत कब्जा कर लिया। (क) कई पुष्प मेरिस्टेमों साथ Caesalpinia spinosa (मोलिना) Kuntze के पुष्प का गुच्छा। (ख) एक युवा पुष्प का गुच्छा Polygala violacea Aubl के शीर्ष दृश्य। (ग) KRAMERIA के पुष्प कली Loefl ixine। जायांग भेदभाव के दौरान। (घ - ई) इरिथ्रिना की कलियों सपा। (च) KRAMERIA ixine का एक फूल के साइड देखें। परागकोष और शैली फैलाना। (छ - मैं) होया carnosa (एल) आर ब्राउन। ( (ज) पुंकेसर और विभाजन अंडप के शीर्ष दृश्य। (I) दो अंडप flanking पुंकेसर की एक जोड़ी के साइड देखें। तारों के पुंकेसर संकेत मिलता है। जी = जायांग। तराजू: (क, i) 1 मिमी, (बी, डी) 400 माइक्रोन, (ग) 200 माइक्रोन, (ई) 500 माइक्रोन, (च, ज) 2 मिमी, (G) 0.25 सेमी। Photos एमए बेलो द्वारा उठाए गए थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: sporangia और पराग के SEM micrographs (क, ख), विस्तृत सतहों (सी ई), और indumenta (एफ - छ)। (क) Dryopteris सपा के Sporangia। (ख) आलू Dulcis डीए वेब के परागख कलंक पर लैंडिंग। (ग) Nepenthes alata ब्लैंको के पराग। (घ) Erigeron की एक पुष्पक्रम के साइड देखें डीसी karvinskianus। छवि बीएसई डिटेक्टर विकल्प के साथ लिया जाता है। (ई) ब्रायोफाइटा Peristoma सपा के साइड देखें। (च) ग्रंथियों और Rosmarinus officinalis एल की एक पत्ती के abaxial सतह पर कोई ग्रंथियों ट्राईकोम्स। (G) Olea europaea एल की पत्ती फ्लैट तराजू के शीर्ष दृश्य। तराजू: (क) 400 माइक्रोन, (ख) 60 माइक्रोन, (ग) 5 माइक्रोन, (घ) 4 मिमी, (ई) 600 माइक्रोन, (च) 200 माइक्रोन, (छ) 600 माइक्रोन। Photos वाई रूज़-Leon द्वारा उठाए गए थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

माध्यमिक अल्सर Saprolegnia parasitica की रीढ़ की हड्डी विकास पर विभिन्न substrates का प्रभाव

(तालिका 1, चित्रा 6A) पर छोरों दिखाया। कार्बन पर और सोने ग्रिड कांटा कम, कर्ल करवाने और बनाने छोरों (आंकड़े 6B, 6D) के बिना अल्सर के आसपास और अधिक बहुतायत से बढ़ रहे हैं। हालांकि तांबे ग्रिड पर, कांटा, पाशन के बिना कर्ल करने के लिए उनमें से कुछ लम्बी (चित्रा 6C) हो जाती थी। मछली तराजू पर, कांटा घुंघराले, सतह के आसपास प्रचुर मात्रा में थे और कभी कभी गठन looped समाप्त होता है (चित्रा 6e-एफ)।

चित्रा 6
चित्रा 6: तरल मीडिया में डूबे अल्सर में Saprolegnia parasitica का कांटा के अंतर विकास पैटर्न। (क) Glasएस। (ख) कार्बन। (ग) कॉपर। (घ) गोल्ड। (ई) हेक पैमाने। (च) सामन पैमाने। सीधे कांटा, कांच और तांबे पर विकसित जबकि कर्ल करवाने कांटा कार्बन, सोना, और मछली तराजू पर गठन किया गया गया था। कांटा के आदी टिप्स (सफेद तीर) कांच पर बढ़ रही सभी कांटा में और मछली तराजू पर कुछ कांटा में प्रत्यक्ष कर रहे हैं। पुटी दीवारों पीले रंग में हैं। स्केल: 20 माइक्रोन। Photos वाई-रूज़ लियोन और एस Rezinciuc द्वारा उठाए गए थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सतह रीढ़ आकृति विज्ञान
बढ़ाव नोक पर लूप
गिलास का आवरण अच्छा बढ़ाव, कांटा आसान गिनती करने के लिए वर्तमान
मछली की शल्क घुंघराले आकार आसान नहीं के साथ कांटा गिनती करने के लिए वर्तमान
मंदिर ग्रिड लघु और घुंघराले कांटा गिनती करने के लिए आसान नहीं अनुपस्थित

तालिका 1: रीढ़ की हड्डी आकृति विज्ञान सब्सट्रेट के विभिन्न प्रकार के प्रयोग से।

में Phellorinia herculanea च अप्रत्याशित टिप्पणियों। stellata

इसके अलावा पी herculanea, Calonge एट अल के exoperidium पर laticiferous hyphae की अप्रत्याशित निष्कर्ष से। 31 गोलाकार और चिकनी नर्स कोशिकाओं (8-13 माइक्रोन) सामग्री माइक्रोवेव में प्रदर्शन पुनर्जलीकरण कदम के लिए सीपीडी धन्यवाद के साथ निर्जलित में बीजाणुओं के साथ मिश्रित पाया। (चित्रा -1)। संरचना और टी की दीवारों का ब्यौरावह नर्स कोशिकाओं और बीजाणुओं अच्छी तरह से अपने अंतर रचना (आंकड़े -1 सी-डी) के बावजूद संरक्षित कर रहे हैं।

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Discussion

मानक SEM प्रोटोकॉल के लिए सम्मान के साथ, यहाँ प्रस्तुत प्रक्रियाओं अपेक्षाकृत तेजी से पालन करने के लिए आसान है, और कम लागत के तरीके शामिल हैं। नमूने की राशि पर और प्रसंस्करण में आसानी पर निर्भर करता है, यह अच्छी गुणवत्ता छवियों को प्राप्त करने के लिए चार से पांच दिन लगते हैं। सीपीडी और SEM ऑपरेशन के लिए पर्याप्त सुरक्षा सावधानियों भी शामिल है, प्रक्रियाओं को संभालने के लिए आसान कर रहे हैं। विशेष रूप से सावधानी (1.1.3 और 2.1.5 प्रोटोकॉल के लिए कदम 1.1.1 देखें) formalin और glutaraldehyde के साथ लिया जाना चाहिए। वहाँ कुछ कदम नमूनों को नुकसान पहुँचाए या पिछले चरणों को बर्बाद कर के बिना जहां, यदि आवश्यक हो, इस प्रक्रिया को एक लंबे समय के लिए रोका जा सकता है (जैसे, कदम 1.1.5, 1.2.3, 1.3.5 और) कर रहे हैं। लागत के मामले में, उपकरण के बहुत कई तैयारी (जैसे, सीपीडी एल्यूमीनियम कंटेनर और ठूंठ धारकों) के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है, और अभिकर्मकों गैर महंगा रसायन सभी वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं से उपलब्ध हैं।

इन प्रक्रियाओं के नुकसान कर रहे हैंएल्डीहाइड और इथेनॉल और चाबी आपूर्ति की कमी और तकनीक की सीमाओं के लिए उचित रासायनिक अपशिष्ट निपटान के लिए की जरूरत है। ऐसी धूम coater और सीपीडी के लिए सीओ 2 सिलेंडर के लिए सोने डिस्क के रूप में सामग्री पहले अच्छी तरह से जाँच की जानी चाहिए। वे निरंतर उपयोग में हैं, जो कि अंत में प्रयोगशाला लागत उठ उनमें से कई कंपनियों के शेयरों की आवश्यकता होगी। क्योंकि व्यक्तिगत शोधकर्ताओं अक्सर खर्चों की आपूर्ति के इन प्रकार के रखरखाव से निकाली गई औचित्य नहीं हो सकता है, या वे बस लगातार SEM का उपयोग करने की जरूरत नहीं है, इन प्रक्रियाओं आजकल बाहरी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेवाओं के साथ प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन हो जाते हैं।

SEM के अवलोकन तकनीक सतहों की एक उच्च वृद्धि के अध्ययन तक सीमित है। आंतरिक ऊतकों मनाया जा जरूरत है, नमूने आंतरिक ऊतकों की बाह्य उपस्थिति का पता लगाने के लिए उचित तरीके से कटौती की जानी चाहिए। उच्च मा पर कोशिकाओं के आंतरिक पहलुओं का पता लगाने के लिएgnification, एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (मंदिर) की आवश्यकता है। प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम उचित निर्धारण और सीपीडी उपचार, जहां यह चौंकाने वाला परिवर्तन और हवा के साथ सीधे संपर्क में आने से सुरक्षित रखने के ऊतकों के लिए महत्वपूर्ण है पहले नमूने के पानी की कमी है। इसके अलावा, सीपीडी नमूना कक्ष में दबाव परिवर्तन और नमूने के विभिन्न प्रकारों पर जमा कोटिंग की राशि से सावधान प्रबंधन महत्वपूर्ण है।

इन सीमाओं और विशेष जोड़तोड़ के बावजूद, SEM प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित निम्नलिखित के साथ जैविक नमूने का अध्ययन इस तरह के सेल की दीवार और अंग विकृति (आंकड़े 1, 4, 5), अवलोकन पर प्रतिबंध के रूप में कुछ आम समस्याओं के समाधान के लिए अनुमति देता है और संरचनाओं के विकास को गीला और तरल वातावरण से आ रही (आंकड़े 5, 6), और संवेदनशील कोशिकाओं (आंकड़े 1C, 1 डी) के विनाश।

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल allowe हैपुनर्व्याख्या और ऐसे Saprolegnia 47 के अल्सर में रीढ़ की हड्डी संरचना के रूप में पारंपरिक वर्गीकरण विशेषताओं, की पूछताछ घ। विभिन्न सतहों पर Saprolegnia कांटा का अंतर है विकास स्वरूप इस सुविधा का lability और प्रजातियों के निदान के लिए अपनी सीमाओं को दर्शाता है। वर्गीकरण अध्ययन, अंग विकास के चरणों, और संक्रामक रोगों, ऊतकों से पहले इन तकनीकों के लिए धन्यवाद पता लगाया गया है कभी नहीं देखा के कार्यों के लिए प्रासंगिक विशेषताओं का कब्जा करने के अलावा। अब, इस प्रोटोकॉल के लिए इंतजार कर मामले के अध्ययन के हजारों 33 की जांच की जा करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। सहकर्मी की समीक्षा की साहित्य डेटाबेस स्कोपस के अनुसार, पिछले पिछले पांच वर्षों में वहाँ पौधों की SEM इमेजिंग (4,914) के साथ काम कर कागजात की 7425 प्रकाशनों, oomycetes (21) और कवक (2,490) किया गया है। इस तथ्य को पता चलता है कि SEM इमेजिंग का उपयोग oomycetes में शोध अभी भी की तुलना में बहुत कम हैपौधों और कवक। ESEM के साथ, संख्या भी कम कर रहे हैं। पौधों में 337, 1 oomycetes में और कवक में 250: वहाँ एक ही समय अवधि में 588 पांडुलिपियां हैं।

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Acknowledgments

इस परियोजना अनुदान समझौते सं 634429. इस प्रकाशन केवल लेखक के विचारों को प्रतिबिंबित करता है के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन प्राप्त हुआ है, और यूरोपीय आयोग जो जानकारी का बनाया जा सकता है किसी भी उपयोग के लिए जिम्मेदार नहीं ठहराया जा सकता उसमें निहित। हम यह भी असली Jardin Botanico, CSIC द्वारा की गई वित्तीय योगदान को स्वीकार करते हैं। एसआर Saprolegnia में उसे अनुसंधान के समर्थन के लिए यूरोपीय संघ [ITN-SAPRO-238550] करने के लिए आभारी है। हम भी फ्रांसिस्को Calonge धन्यवाद कृपया नमूने प्रोसेसिंग (चित्रा 5) के लिए Phellorinia herculanea छवियों और बी Pueyo प्रदान करना चाहते हैं। सभी छवियों मैड्रिड में रियल Jardin Botanico-CSIC पर SEM सेवा द्वारा उठाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid No specific supplier Skin irritation, eye irritation
aluminium stubs Ted Pella, Inc. 16221 www.tedpella.com
Centrifuge tubes No specific supplier
Critical Point Dryer Polaron Quatum Technologies CPD7501
D-(+)-Glucose Merck 1,083,421,000
Double sided sellotape No specific supplier
Ethanol absolute No specific supplier Flammable
European bacteriological agar Conda 1800.00 www.condalab.com
Filter paper No specific supplier
Forceps No specific supplier
Formalin 4% No specific supplier Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable
Glass cover slips No specific supplier
Glass hermetic container  No specific supplier
Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611  (L) Dismadel S.L. 3336 www.dismadel.com
Mycological peptone Conda 1922.00 www.condalab.com
needles No specific supplier
Petri dishes No specific supplier
Plastic containers No specific supplier
Sample holder with lid  for the critical point dryer  Ted Pella, Inc. 4591 www.tedpella.com
scalpels No specific supplier
Scanning Electron Microscope Hitachi S3000N
Software for SEM
Solution A: NaH2PO4
Solution B: Na2HPO4
Specimen holders No specific supplier
Sputter coater Balzers SCD 004
Stereomicroscope No specific supplier
Transmission Electron Microscope (TEM) grids Electron Microscopy Sciences G200 (Square Mesh) www.emsdiassum.com
Tweezers No specific supplier

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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प्लांट बायोलॉजी अंक 120 agaricales महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर अल्सर formaldehyde glutaraldehyde, संयंत्र विकास, धूम coater
समस्याग्रस्त प्लांट, Oomycete, और फफूंद नमूने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) प्रोटोकॉल स्कैन
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Bello, M. A., Ruiz-León, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Diéguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. J. Vis. Exp. (120), e55031, doi:10.3791/55031 (2017).

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