Abstract
Vanlige problemer i behandling av biologiske prøver for observasjoner med scanning elektronmikroskop (SEM) innbefatter at celler faller sammen, behandling av prøver fra våte microenvironments og celle-ødeleggelse. Ved hjelp av små blomster vev, eggsporesopper cyster, og sopp sporer (Agaricales) som eksempler, spesifikke protokoller for å behandle ømfintlige prøvene er beskrevet her at overvinne noen av de viktigste utfordringene i prøvebehandling for bildeopptak under SEM.
Blomster meristemer fast med FAA (Formalin-Acetic-alkohol) og behandlet med Critical Point Dryer (CPD) ble ikke vist kollapset mobile vegger eller forvrengt organer. Disse resultatene er avgjørende for gjenoppbyggingen av floral utvikling. En lignende CPD-basert behandling av prøver fra våte mikromiljøer, slik som glutaraldehyd-fiks eggsporesopper cyster, er optimal for å teste den differensielle vekst av diagnostiske egenskaper (f.eks, cysten pigger) på forskjellige typer substrates. Ødeleggelse av sykepleier celler knyttet til sopp sporer ble unngått etter utvanning, dehydrering, og CPD behandling, et viktig skritt for videre funksjonelle studier av disse cellene.
Protokollene beskrevet her representerer lav pris og raske alternativer for erverv av bilder av god kvalitet for å rekonstruere vekstprosesser og for å studere diagnostiske egenskaper.
Introduction
I biologi, har bruken av scanning elektronmikroskopi (SEM) er utvidet til studier av strukturell utvikling, sammenlignende morfologi, organutvikling, og karakterisering av populasjoner eller arter 1. Med sin to-dimensjonal visning av mikroskopiske strukturer, områder som micromorphology og systematikk profit SEM teknikk fremskritt siden andre halvdel av det 20. århundre. For eksempel, innføring av frese belegget metodikken i 1970 gjort mulig observasjoner av ømfintlige materialer som skyter toppunktene og blomster som forsterker avbildning av ikke-ledende vev 2, 3. SEM bruker elektroner kastet ut fra overflaten av prøven for å reprodusere topografien i en høy-vakuum miljø 4.
Studier med SEM er fokusert både i slutning av strukturelle tegn og gjenoppbygging av growth prosesser. Nye strukturelle tegn som er relevante for taksonomi og systematikk til et bredt spekter av organismer har blitt oppdaget fra SEM observasjoner. For eksempel plantetrekk brukes for arter diagnose eller supraspecific klassifikasjoner, for eksempel vestured groper av tre 5, stigma mangfold 6, nectary og floral morfologi 7, 8, trichome detaljer 9 og pollenkorn 10, 11, kan ikke være riktig visualiseres uten SEM. Vellykket observasjoner med konvensjonelle SEM har også oppnådd for lang tid formalinfikserte organismer 12 og plante herbarium eksemplarer 13.
På den annen side, studier av rekonstruksjon av vekstprosesser ved hjelp av SEM involverer et bredt spekter av emner, for eksempel organutvikling 14, infections forårsaket av bakterier 15, plante rot fysiologi 16, parasitt-vert festemekanismer 17, 18, narkotika effekter på parasitter 19, mycoparasitism og antibiosis 20, 21, vekst misdannelses 22, komparativ utvikling av ville og mutante personer 23, og hele livssykluser 24. Selv om miljø scanning elektronmikroskop (ESEM) 25 kan ha viktige fordeler for observasjon av våte biologiske prøver på vekstprosesser, kan sart materiale fremdeles bli svekket, selv i lav-vakuum-tilstand ESEM), og må behandles tilfredsstillende for å unngå tap av verdifulle morfologiske observasjon.
I denne utredningen, en gjennomgang av spesifikke protokoller for SEM observasjon av tre different typer prøver blir presentert: floral meristemer, Oomycetes (Saprolegnia), og soppmateriale. Disse protokollene kompilere opplevelsen av våre tidligere SEM-baserte studier 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, hvor spesifikke vansker og alternative løsninger har blitt funnet. I tilfelle av anlegget komparativ utviklingsmessige og strukturelle studier, bruk av SEM startet i 1970 34, 35, og siden da, oppdaget forskerne at visse floral funksjoner er mer labile enn tidligere antatt 36. Rekonstruksjon av floral utvikling innebærer fangst av alle stadier mellom unge blomster meristemer og anthesis. For å nå dette målet, er det essential at prøven topografi og celleveggen integritet ikke blir kompromittert etter fiksering og påfølgende dehydrering. Unge floral meristemer er spesielt utsatt for celleveggen kollaps (Tall 1a, 1b). Tilsvarende delikate strukturer som nectaries, petals, arr og sporangia krever effektive og undamaging protokoller. Denne anmeldelsen oppsummerer en optimal protokoll for å holde små og delikate vev intakt for SEM bildebehandling.
Når det gjelder de Oomycetes (Stramenopiles) -en av de mest varierte og utbredte grupper av parasitter, med verter som strekker seg fra mikrober og planter til virvelløse dyr og virveldyr 37 - det er sporer som vokser og utvikler seg i et vått miljø. Denne tilstanden er en utfordring for SEM observasjon fordi sporene trenger en tilstrekkelig underlag ikke egnet for standard SEM protokoller. Blant de Oomycetes, arter av Saprolegnia er av spesiell interesse fordi de can forårsake alvorlige reduksjoner i akvakulturer, fiskeri og amfibier populasjoner 38. Micromorphological egenskaper, for eksempel de krok pigger cyster, er blitt funnet å være nyttig for å identifisere arter av Saprolegnia, som er grunnleggende for å etablere infeksjon kontroller og potensielle behandlinger 39. Her er det en forsøksprotokoll for å sammenligne mønstre av ryggraden vekst av cyster på forskjellige substrater, og å manipulere prøve for kritiske punktet tørker (CPD) fremstilling og etterfølgende SEM observasjon.
I et tredje tilfelle, er det interessante funn som kom opp etter en inspeksjon av sporer av sopp Phellorinia herculanea f. lata f. nova (Agaricales) 31. Sammen med sporene, ble en gruppe av uventede barnehage celler identifisert under SEM. Med tidligere tradisjonelle protokoller og ubehandlet materiale, kom sykepleier celler out fullstendig kollapset (Figur 1c). Ytterligere slutninger om spesielle vev knyttet til sporene kan gjøres med enkle, men viktige endringer i standard tilnærminger beskrevet her (figur 1D).
I denne gjennomgangen, er det detaljerte SEM protokoller som kan brukes til å håndtere forskjellige problemer i forbindelse med SEM observasjon i angiosperms, Oomycetes, og Agaricales, slik som at celler faller sammen og krymping meristematic vev, ikke-optimal vekst av cyste pigger, og ødeleggelse av flyktige vev, henholdsvis.
Figur 1: Sammenligning av prøvene som er behandlet uten (a, c) og med (b, d) protokollen FAA-etanol-CPD. (A - b) Blomster knopper av Anacyclus clavatus, mid-utvikling. Bud behandles med osmiumtetroksid 46 </ sup> (a) og Bud behandles med FAA-CPD-protokollen (b). (C - d) Sykepleier celler med sporer av Phellorinia herculanea f. lata. Tørkede prøver uten noen behandling (c) og med den protokoll som er beskrevet her for Agaricales (d). Sporer i oransje. Scales: (ab) 100 mikrometer, (cd) 50 mikrometer. Bilder ble tatt av Y. Ruiz-León. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Denne protokollen omfatter seks hoveddeler, tre viet til bestemte organismer (§§ 1-3), og tre som beskriver prosedyrer som er felles for alle (4-6). Stjerne (*) indikerer trinn modifisert av forskere.
1. Studier av Utvikling og fullt dannet anleggsstruktur
- Innsamling og fiksering
- Dersom plantematerialet samles på et sted uten tilgang til et avtrekksskap, og innføre dyppe materialet i 70% etanol i sentrifugerør. Ideelt dyppe materialet etter 48 timer i FAA (trinn 1.1.1-1.1.3) for å unngå overdreven dehydrering i etanol. Hvis et avtrekksskap er tilgjengelig for plantemateriale, ignorere dette trinnet og fortsette med 1.1.1.
- Forbered formalin-eddik-alkohol (FAA) fiksativ i et avtrekksskap utstyrt med et aldehyd filter. Legg 85 deler av 70% denaturert etanol, 10 deler 60% formaldehydoppløsning, og 5 deler iseddik. Forbered FAAlike før feste materialet, som sin langtidslagring anbefales ikke 40.
- Under avtrekksskap, hell lager av FAA i individuelle bred munn og lekkasjesikre plastflasker. Bruk så mange flasker som det er prøver tilgjengelig, og lage etiketter for prøveidentifikasjon.
- Velg floral eller vegetative meristemer å fikse, slik at de ikke blir skadet av insekter, sopp eller ekstreme værforhold. Klippe grenene, fjerne uønsket materiale, og sette prøven umiddelbart i FAA løsning.
- Etter 72-96 timer, hell FAA i en plastbeholder for kjemisk disposisjon. Umiddelbart vaskes prøvene tre ganger med fersk 70% etanol for å fjerne eventuelle rester av FAA. Fast materiale kan lagres på ubestemt tid i 70% etanol.
- Dissection og dehydrering
- Dissekere fast materiale i 70% etanol under stereo bruker ultrafine pinsett, neEdles, tang, pensler og mikroskalp (den maksimale størrelsen på vevet bør være rundt 1 cm 3, eller 2 cm for flat materiale). Dissekere prøvene inn i en petriskål dekket med etanol for å forhindre vev fra tørking. Bruk en petriskål med base dekket med tørr svart silikon for å bedre se kontrasterende hvite vev.
- Sett dissekert materialet i prøvebeholdere for det kritiske punktet tørketrommel (CPD, figur 2a). På dette punktet, fordype beholderne inn i petriskål med 70% etanol, og omfatter prøveidentifikasjonsmerker (laget med papir og blyant). For mer effektiv tørking for videre manipulering, unngå å blande de unge og modne prøver i samme container. *
- Sett lokk på beholdere og sette dem i plast sentrifugerør med massevis av 70% etanol. Lagre rørene over natten dersom materialet ikke er behandlet straks.
- Overfør den dissekerte materialet gjennom følgende etanol series i hermetiske glass eller sentrifugerør: 70%, 90%, 100% og 100%. La prøvene i hver løsning i 1 time ved minst. Hold prøvene over natten i en 100% etanolløsning.
- Overfør beholderne med materialet til CPD (§ 4).
- Montering og forbereder plantemateriale for SEM observasjon
- Skriv prøven identifikasjonsnummer under SEM prøveholdere (dvs. aluminium stubs). Dekker toppen av stussene med dobbeltsidig tape. Plasser stubber i en prøveholder (figur 2b).
- Under en stereomikroskop, nøye åpne containere med de unge og sarte prøvene allerede tørket i CPD. Husk at etter CPD behandling, prøvene blir lysere og følsomme for elektrostatikk. Lukk beholderne når prøvene er tatt ut for å unngå støv og urenheter.
- Sett prøvene på den klebrige overflaten av stubber, planlegging fremover ønsketstilling (når prøvene i overflaten, er det meget vanskelig å fjerne dem). Ikke prøv å bære en stor disseksjon på dette punktet; bare fjerne uønsket vev som er lett å plukke opp. For palynologiske studier dissekere pollenknapper og åpne dem for å avsløre pollen på stubber.
- Sett lange prøver (f.eks 2 cm lang) som blomsterstander i horisontal stilling. Når det er mulig, orientere prøver av den samme strukturen for polar, side og bunn utsikt. La det være nok plass mellom prøvene på stussen.
- Hvis prøvene ikke kan behandles umiddelbart, holde dem beskyttet over natten i en lufttett beholder med silikagel for å unngå utvanning (figur 2c) *. Coat prøvene ved å frese coater og overføre dem til SEM (§§ 5 og 6).
Figur 2: Verktøy for eksempel manipulatipå og behandling før SEM observasjon. (A) Steel-laget prøven container med hullete vegger for etanol / CO 2 utveksling i CPD kammeret. (B) Stål stubber innenfor en plastprøveholder. (C) Glass container som brukes til å holde prøvene beskyttet mot fuktighet og støv. Ved basen, er det et rom for silikagel. (D) Critical Point tørketrommel. I fronten er det (fra venstre til høyre) manometeret, strømbryter, temperaturkontroll system, og temperaturdisplayet. Vanlig arbeidstrykk for CO 2 etanol utveksling er 60 bar (800 psi). I toppen er det fire ventiler (innløp, avløp, ventilasjon og eksos kontroller) flankerer sentrale prøvekammeret. Bilder ble tatt av Y. Ruiz-León og MA Bello. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Økende og fikse cyster
- Forbered pepton og glukose (PG-l) media 41 ved hjelp av D - (+) - glukose (6 g) og mykologisk pepton (3 g) *. Legg opp til 900 ml vann fra springen og autoklav 40 min ved 121 ° C. Hell 50 ml av den tidligere autoklaverte løsning A (NaH 2PO 4, 0,13 M) og 50 ml av oppløsning B (Na 2 HPO 4, 0,13 M).
- Fra lager kulturer av stammer av Saprolegnia parasitica opprettholdt på pepton, glukose, agar-media (PGA, som er fremstilt som PG-l, men tilsetning av 10 g av europeisk bakteriologisk agar til glukose og pepton før autoklaven), vokse mycelia kolonier i 0,5 mL av PG-l dråper i 24-48 timer ved 20 ° C i petriskåler. Fremkall sporulering ved vasking av mycelia med Autoclaved springvann tre ganger, og inkubere dem i 15 timer ved 20 ° C= "xref"> 42, 43.
- Samle de frigitte sekundære zoosporer ved forsiktig pipettering den øvre del av suspensjonen og pool dem i 1 ml porsjoner. Agitere kraftig de zoosporer i 30 s ved å virvle å produsere sekundære cyster 44.
- For å teste differensial veksten av spines av cyster på egen Petri retter (p60), satt 0,5 ml av den sekundære cyste suspensjon på ulike overflater (dvs., karbon, gull og kobber TEM nett, laks og hake skjell (tidligere bleket), og glass dekkglass) *. Inkuber cyster ved 20 ° C i 70 minutter, noe som favoriserer feste av cyster til overflaten.
- Fjern væsken og tilsett 0,5 ml av 2% glutaraldehyd til hver overflate for fiksering av cyster. Holde prøvene ved romtemperatur under et avtrekksskap i 1 time.
- Fjern det glutaraldehyd og tørke prøven gjennom en etanol-serien (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% og 100%), tilsetning av 5 ml av hver etanolløsning i 15 min. En gang i de siste 100% etanol løsning, kan prøven oppbevares i opptil en måned i en forseglet petriskål. På dette stadiet, prøvene er klar til å tørkes i CPD.
- overføre nøye nett og skalaene fra petriskål til en holder egnet for CPD (§ 4). I dette trinnet bruke en CPD gitter holder eller en stableprøveholder, som holder prøvene adskilt fra hverandre. Ta nett og skalaer med pinsett, husk at cyster skal vende opp på nett hele tiden. *
- Montering og forbereder cyste prøver for SEM observasjon
- Monter ristene og vekten på aluminium stubber som tidligere ble dekket med dobbeltsidig karbon tape og merket under.
- Overfør prøvene til frese belegger (§ 5).
- Observer prøvene under SEM (§ 6).
Phellorinia herculanea henhold SEM
- Rehydrering og dehydrering av sporer
- Pakk hver prøve forsiktig med filter papir, forming blyant-merket konvolutter ~ 0,5-1 cm 2, tar seg ikke å knuse dem. Tett filter papir med binders. Overfør pakket prøvene til en petriskål og dyppe dem i 10 ml vann for å rehydrere vev rundt spores.
- Umiddelbart satt prøvene i en mikrobølgeovn (600 W i ca 20 s). Fjern materialet når vannet begynner å fordampe, og la den avkjøles i romtemperatur.
- Passerer prøvene gjennom følgende etanol serie: 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% og 100%. Avhengig av mengden av sampler ved å bruke et begerglass eller sentrifugerør for dette trinnet. La prøvene i 15 minutter i hver løsning.
- Plasser prøvene til CPD (§ 4).
- Montering og preparing sporer for SEM observasjon
- Åpne konvoluttene. Hell sporene på et tidligere forberedt spire med dobbeltsidig tape. Alternativt samle sporene med den klebrige overflaten av stubber, tar seg ikke å knuse dem *.
- Dersom prøvene inneholder få sporer, i tillegg til det forrige trinnet, kuttet en liten del av konvolutten (~ 1 mm 2) og plassere den på en ny spire *.
- Plasser vevet inn i frese belegger (§ 5).
- Observer under SEM (§ 6).
4. Tørking av Material Bruke et kritisk punkt Dryer (CPD, figur 2d)
- Bruk CPD i et ventilert område og kontrollere at alle ventiler av maskinen er lukket. Sjekk om prøvekammeret er tomt og ren.
- Slå på maskinen, og kontroller at temperaturkontroll system test skjer automatisk. Hvis CPD har en ekstern kjøle bad system, sjekk vannstand før du bytter jegt på.
- Følg produsentens instruksjoner for den spesifikke CPD brukes til etanol og CO 2 utveksling. For sikkerhets skyld bære på dette trinnet under oppsyn av noen trent for bruk av maskinen. Husk at det er utsatt for raske trykkendringer, kan det blåse ut voldsomt.
- Ta ut prøvene og fortsette med trinn 1.3 hvis arbeider med plantemateriale, steg 2,2 hvis arbeider med Oomycetes cyster, og steg 3,2 hvis arbeider med sopp sporer.
5. Coating prøvene med Gold Bruke frese Coater (figur 3a)
- Sjekk frese belegger. Kontroller at gullkatoden målet er i god stand. Bruk en lofri klut dynket med 90% etanol for å rengjøre veggene i vakuumkammeret og kammeret lokket hvis nødvendig.
- Marker frese holder med tall ved siden av hver spire hull for videre identifisering av prøvene under mikroskop. Nøye, plasserer stubber lastet med samples og sikre dem. Bruke en roterende planetprøvetrinn for å sikre et jevnt belegg på prøvestykker med uregelmessige overflater.
- Følg produsentens instruksjoner for å justere innstillinger som arbeidsavstanden, drift gasstrykk (for eksempel 5 x 10 -1 til 7 x 10 -1 mbar) (f.eks, 30 mm.), Sputtering tid (f.eks 50 s), tykkelsen av gull-lag (for eksempel 12 nm) strømmen (f.eks, 15 mA) og spenningstilførselen (for eksempel 600 V) 45.
- Ta av stubber og ta dem til SEM (§ 6). Alternativt, plasserer stubber i en lukket beholder med silikagel (figur 2c).
Figur 3: Sputter-belegger (a) og scanning elektronmikroskop (b). (A) Fronten på vakuumkammeret (til venstre), gass vene, tidtaker, vakuum, og dagens kontroller. (B) Sidevisning av SEM hovedkomponentene (fra venstre til høyre): vakuum kolonne med prøvekammer, dataskjermen med kontrollene, og kammeret skjerm. Bilder ble tatt av Y. Ruiz-León. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6. Observasjon under elektronmikroskop (SEM, figur 3b)
- SEM starte opp
- Følg produsentens instruksjoner for å starte og sette SEM, justere utvalget høyde målet åpningsdiameter (f.eks for planter 2 mikrometer og for sopp og Oomycetes 4 mikrometer), driftsspenning (f.eks, 15 kV).
- Sjekk riktig justering av elektronstråle-systemet og sette parallelliteten og stigmators henhold til produsentens indikasjoner. Juster than arbeider avstand for å oppnå en tilstrekkelig dybdeskarphet.
- image capture
- Få et fokusert bilde av prøven og bruke det som et utgangspunkt. Øk forstørrelsen nær det høyeste nivået og fokusere bildet på nytt. Velge områder med ujevnheter i overflaten som for eksempel hull. Riktig astigmatisme og justere optimal kontrast og lysstyrke.
- Fang SEM bilde med høy oppløsning. Bruk BSE detektoren hvis bildet viser at prøvene ladet. Ellers setter SE detektoren. Endre detektorene følgende produsentens instruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blomster Utvikling og Fiksering av Utvikling og fullt dannet anleggsstruktur
Bruke FAA-CPD-protokollen er beskrevet her, er unge og modne plantevev optimalt fast og dehydrert for SEM bildebehandling. Prosesser som blomsterutvikling kan rekonstrueres fordi topografi og formen av knopper ikke blir forvrengt av celle krymping (fig 1b, 1d, 4a-f). Strukturer med komplekse former kan med hell belagt med et jevnt lag av ledende materiale (metall fra frese beleggeren), slik at gjenvinning av ellers utilgjengelige deler (figurene 4 g-I, 5e). Kvalitetsbilder av prøver fra våte microenvironments, som pleide Godt å være overladet med elektronstrømmen dersom dårlig dehydrert og belagt, kan oppnås (Tall 4f, 5a, 5b). Viktige detaljer som pollen veggflate (Figur 5b, 5c) og forskjellige typer av indumenta (fig 5d-g) kan studeres i dybden uten kunstige eller uønskede partikler eller forvrengt former.
Figur 4: Tidlig (a, b), mid (c-e), og sent (fi) floral utvikling fanget under SEM. (A) klase av Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze med flere blomster meristemer. (B) Top utsikt, ung klase Polygala violacea Aubl. (C) Blomster knopp av Krameria ixine Loefl. under gynoecium differensiering. (D - e) knopper Erythrina sp. (F) fra siden av en blomst av Krameria ixine. De pollenknapper og stil stikke. (G - i) Hoya carnosa (L.) R. Brown. (
Figur 5: SEM mikrografer av sporangia og pollen (a, b), detaljerte flater (c-e), og indumenta (f - g). (A) sporangie av Dryopteris sp. (B) Pollen av Prunus Dulcis DA Webb landing på stigma. (C) Pollen av Nepenthes Alata Blanco. (D) fra siden av en blomsterstand av Erigeron karvinskianus DC. Bilde tatt med BSE detektor alternativet. (E) fra siden av den mose Peristoma sp. (F) Glandular og ingen kjertel trichomes på abaxial overflaten av et blad av Rosmarinus officinalis L. (G) Top visning av blad flate skalaer av Olea europaea L. Vekt: (a) 400 um, (b) 60 pm, (c) 5 um, (d) 4 mm, (e) 600 pm, (f) 200 nm, (g) 600 um. Bilder ble tatt av Y. Ruiz-León. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Effekt av forskjellige underlag på Spine Vekst av Secondary Cyster Saprolegnia parasitica
(Tabell 1, Figur 6a). På karbon og gull rutenett spines er kortere, krøllet og vokse mer rikelig rundt cyster uten at det dannes løkker (figurene 6b, 6d). Selv om kobbernett, spines tendens til å krølle uten looping, noen av dem langstrakt (figur 6c). På fiskeskjell, spines var krøllete, rikelig rundt overflaten og noen ganger dannes løkker endene (figur 6e-f).
Figur 6: Differential vekstmønstre spines av Saprolegnia parasitica i cyster nedsenket i flytende medier. (A) Glass. (B) Carbon. (C) kobber. (D) gull. (E) Hake skala. (F) Salmon skala. Rette pigger ble utviklet på glass og kobber, mens krøllete pigger ble dannet på karbon, gull, og skjell. De hektet tips (hvite piler) av piggene er observerbare i alle pigger som vokser på glass og i noen pigger på skjell. Cyste veggene er i gult. Scale: 20 mikrometer. Bilder ble tatt av Y. Ruiz-León og S. Rezinciuc. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Flate | Spine morfologi | |
| Forlengelse | Loop på spissen | |
| glassdeksel | God forlengelse, pigger lett å telle Nåværende | |
| Fiskeskjell | Pigger med krøllete form ikke lett å telle | Nåværende |
| TEM rutenett | Korte og krøllete pigger ikke lett å telle | Fraværende |
Tabell 1: Spine morfologi ved hjelp av forskjellige typer av substrat.
Uventede Observasjoner i Phellorinia herculanea f. lata
Bortsett fra det uventede funn av laticiferous hyfer på exoperidium av P. herculanea, Calonge et al. 31 funnet kuleformede og glatte sykepleier celler (8-13 mikrometer) blandet med sporer i materialet dehydrert med CPD takket være den rehydratisering trinn som utføres i mikrobølgeovnen. (Figur 1d). Strukturen og detaljer av veggene i than sykepleier celler og sporer er godt konservert til tross for deres differensial sammensetning (fig 1c-d).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hensyn til standard SEM protokoller, prosedyrer som presenteres her inkluderer relativt rask, lett å følge, og rimelige metoder. Avhengig av hvor mye prøver og på enkel behandling, tar det fire til fem dager for å hente bilder av god kvalitet. Inkludert tilstrekkelige sikkerhetsregler for CPD og SEM drift, prosedyrene er lett å håndtere. Spesiell forsiktighet bør tas med formalin og glutaraldehyd (se trinn 1.1.1 til 1.1.3 og 2.1.5 i protokollen). Det er visse skritt der, hvis det er nødvendig, kan prosessen bli stoppet i lang tid uten å skade prøver eller ødelegge tidligere trinn (f.eks trinn 1.1.5, 1.2.3 og 1.3.5). Når det gjelder pris, kan mye av utstyret gjenbrukes i flere preparater (f.eks CPD aluminium containere og stubb holdere), og reagenser er ikke-dyre kjemikalier tilgjengelig fra alle kommersielle leverandører.
Ulemper ved disse fremgangsmåtene erbehovet for riktig kjemisk avfall for aldehyder og etanolen og mangel på viktige forsyninger og begrensningene i teknikken. Materialer som gull disk for frese belegger og CO 2 sylinder for CPD bør sjekkes i god tid. Hvis de er i kontinuerlig bruk, vil laboratoriet kreve flere bestander av dem, som til slutt hever kostnadene. Fordi enkelte forskere ofte ikke kan rettferdiggjøre utgiftene avledet fra vedlikehold av disse typer produkter, eller de rett og slett ikke trenger å bruke SEM kontinuerlig, disse fremgangsmåtene dag har en tendens til å bli utført i laboratorier med eksterne elektronmikros tjenester.
Observasjonen teknikk av SEM er begrenset til en høy forstørrelse studium av overflater. Hvis indre vev må overholdes, skal prøvene deles i den riktige måten å utforske det ytre utseende av indre vev. For å utforske innvendige sider av cellene ved høy magnification, er et transmisjonselektronmikroskop (TEM) som kreves. Kritiske trinnene i protokollen er den riktige fiksering og dehydrering av prøvene før CPD behandling, hvor det er viktig å holde vevet beskyttet mot sjokk endringer og direkte kontakt med luften. Dessuten er nøye styring av trykkendringen i CPD prøvekammeret og mengden av belegg som er avsatt på forskjellige typer av prøver viktig.
Til tross for disse begrensninger og spesielle manipulasjoner, studiet av biologiske prøver med SEM å følge de protokoller som er beskrevet her gjør det mulig for oppløsningen av noen vanlige problemer, for eksempel celleveggen og organ forvrengning (figurene 1, 4, 5), restriksjoner på observasjonen og vekst av strukturer som kommer fra våte og flytende miljøer (figurene 5, 6), og ødeleggelse av følsomme celler (fig 1c, 1d).
Protokollene som presenteres her har allowed nytolkning og avhør av tradisjonelle taksonomiske egenskaper, for eksempel ryggraden strukturen i cyster av Saprolegnia 47. Differensialvekstmønster av Saprolegnia pigger på ulike overflater demonstrerer labilitet av denne funksjonen og dens begrensninger for arter diagnose. I tillegg til fangst av relevante egenskaper for taksonomiske studier, stadier av organutvikling og infeksjonssykdommer, funksjoner av vev aldri observert før har vært utforsket, takket være disse teknikkene. Nå kan denne protokollen utvides til tusenvis av case-studier som venter på å bli undersøkt 33. Ifølge peer-reviewed litteratur database Scopus, i den siste av de siste fem årene har det vært 7,425 publikasjoner av papirer som omhandler SEM avbildning av planter (4914), Oomycetes (21) og sopp (2490). Dette faktum antyder at forskning i Oomycetes ved hjelp av SEM bildebehandling er fortsatt svært knappe i forhold tilplanter og sopp. Med ESEM er tallene enda lavere. Det er 588 manuskripter i samme tidsrom: 337 i planter, 1 i Oomycetes og 250 i sopp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette prosjektet har fått støtte fra EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram i tilskuddsavtalen No. 634429. Denne publikasjonen reflekterer bare synet til forfatteren, og EU-kommisjonen kan ikke holdes ansvarlig for bruk som kan gjøres av informasjonen inneholdt deri. Vi erkjenner også den økonomiske bidraget fra Real Jardín Botánico, CSIC. SR er takknemlig overfor EU [ITN-Sapro-238550] for støtte av sin forskning i Saprolegnia. Vi ønsker også å takke Francisco Calonge for bes gi Phellorinia herculanea bilder og B. Pueyo for behandling av prøvene (figur 5). Alle bildene ble tatt av SEM tjenesten på Real Jardín Botánico-CSIC i Madrid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D-(+)-Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
References
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
- Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
- Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
- Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
- Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
- Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
- Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
- Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
- Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
- Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
- Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
- García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
- Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
- Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
- Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
- Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
- Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
- Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
- Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
- Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
- Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
- Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
- Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
- Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
- Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
- Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
- Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
- Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
- Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
- Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
- Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
- Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
- Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
- Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
- van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
- Johansen, D. A. Plant microtechnique. , McGrow-Hill. New York. (1940).
- Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
- Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
- Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
- Echlin, P. Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , Springer Science + Business Media, LLC. NY. (2009).
- Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
- Rezinciuc, S. The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , Universidad Internacional Menéndez Pelayo. Doctoral Thesis (2013).
