Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التنظيم القائم على الرنا الميكروي من فيروسة بيكورناوية مع الأجسام

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/55033
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic College of Medicine

Introduction

تطوير طريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع، وسهلة وفعالة لهندسة متجه مع مع الأجسام تقييد توفر فرصة كبيرة لتعزيز سلامة والتفاهم البيولوجي وفائدة علاجية من الفيروسات. وتوجد عدة آليات لاستهداف مع الأجسام الفيروسية بما في ذلك التنبيغي، النسخي، والتقنيات المعتمدة متعدية. ومع ذلك، هذه الأساليب لا تنطبق بشكل عام على جميع أنظمة ناقلات، قد تتطلب مسارات الإشارات المعيبة في الخلايا المستهدفة أو تتطلب إدخال تسلسل الترميز كبيرة في الجينوم الفيروسي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذه الطرق يؤدي إلى توهين الفيروس، مما أعاق بشكل كبير نشاطهم العلاجي والحد من نظرة ثاقبة على النظام معدلة.

الرنا الميكروية صغيرة (22-25 النيوكليوتيدات)، الرنا غير المكودة التي تتوسط إسكات الجينات في الخلايا حقيقية النواة. وظيفة الرنا الميكروية من خلال ربط تسلسل الهدف التكميلية (عناصر الاستجابة) في الرنا المرسال (مرنا) resulti نانوغرام في زعزعة الاستقرار نسخة، وتدهور أو القمع متعدية. الرنا الميكروية عادة ربط عناصر استجابة مع التكامل الجزئي وتسفر عن تعديلات صغيرة في التعبير الجيني 1، 2، 3، 4، 5. عن تغيرات كبيرة في التعبير الجيني يمكن أن يتحقق من خلال زيادة التكامل بين عنصر استجابة 6. وقد تم تحديد الآلاف من microRNAs ناضجة في مجموعة متنوعة من الأنواع والعديد من أنماط التعبير معرض التفاضلية في مجموعة متنوعة من الخلايا والأنسجة أنواع 7، 8، 9. هذه التوقيعات الرنا الميكروي يمكن استغلالها لتقييد خلايا معينة من التضخيم الفيروس عن طريق دمج العناصر استجابة متكاملة تماما في الجينوم الفيروسي 10،= "XREF"> 11، 12، 13. ويتمثل الهدف العام من هذه التقنية التي تستهدف الرنا الميكروي هو السيطرة على مع الأجسام من الجينوم متجه من دون تخفيف إضافي.

وقد تجلى فائدة هذه الطريقة لتنظيم مع الأجسام الفيروسية في الأصل في ناقلات lentiviral لتقييد حرية التعبير التحوير في أنسجة معينة 14 و 15 و 16. وبعد ذلك تم تطبيق هذه التقنية لمجموعة واسعة من تكرار وغير تكرار-النواقل الفيروسية للعلاج بالجينات تعزيز وكذلك لتحسين ملامح سلامة العديد من الفيروسات حال الورم عن طريق القضاء على سمية غير مرغوبة في الأنسجة الطبيعية 10، 11، 12، 13، 17 . كما تم استخدامه لتوليد آمنة وهffective اللقاحات الحية الموهنة، وكذلك لتحسين فيروس وتصنيع اللقاحات عمليات 18، 19، 20، 21. الرنا الميكروي-استهداف ناقلات يمكن أن تسمح لتوهين في المضيفين المحصنة أو الأنظمة المستهدفة مع الحفاظ على مستويات النمو من النوع البري في النظم المنتجة. ويمكن أيضا أن الرنا الميكروي الاستهداف استخدامها لتحسين السلامة الأحيائية من الفيروسات لأغراض بحثية عن طريق تقييد انتقال في نوع واحد (مثل البشر) مع الحفاظ على نقل في المضيفين الآخرين 22. وأخيرا، الرنا الميكروي استهداف يمكن أن تسمح لتحليل متعمق لدورة حياة الفيروس وأدوار محددة من أنواع الخلايا في المرضية والحصانة من خلال فصل النمو الفيروسي 23، 24، 25، 26.

وتقدم هذه التقنية لبديلernative تستهدف طريقة التي يتم تنفيذها بسهولة وقابلة للتطبيق لجميع أنظمة الفيروس. بالإضافة إلى ذلك، جمع الآخذة في التوسع من microRNAs ناضجة مع أنماط التعبير التفاضلية في أنواع معينة من الخلايا يجعل هذه التقنية تنوعا للغاية. وقد ثبت الرنا الميكروي القائم على استهداف فعال لمجموعة متنوعة من أنظمة الفيروس دون المساس وظيفة النظام. وتشمل القيود الرئيسية لهذه التقنية محاكمة والتحسين الخطأ، فإن احتمال حدوث طفرات الهروب، وإمكانية الآثار بعيدا عن الهدف على النصوص الذاتية. ومع ذلك، هذه القيود عموما يمكن التغلب عليها مع تصميم عنصر استجابة الأمثل والعقلاني. فيروسات RNA إيجابي، بمعنى تميل إلى أن تكون استجابة بشكل خاص لالرنا الميكروي استهداف بسبب توجيه بالمعنى الإيجابي من الجينوم، وتوافر النصوص إلى آلية الرنا الميكروي خلال دورة النسخ المتماثل هيولي تماما. نحن هنا وصف بروتوكول لتوليد فيروسة بيكورناوية المستهدفة الرنا الميكروي وexperimطرق ental للتحقق من كفاءة وخصوصية التي تستهدف في المختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. استنساخ عناصر الرنا الميكروي الاستجابة في الجينوم الفيروسي

  1. تصميم الرنا الميكروي إدراج عنصر استجابة.
    1. تحديد الرنا الميكروي المطلوبة وتسلسل الهدف المقابل لها. تتوفر مع تسلسل الرنا الميكروي ناضجة العديد من قواعد البيانات. الموصى بها: http://www.mirbase.org/ 9، 27، 28، 29، 30.
  2. استنساخ عنصر استجابة إلى البلازميد ترميز الجينوم ناقلات أو النص.
    ملاحظة: للحصول على اثنين أو أكثر من العناصر استجابة نسخة باستخدام موقع قيود فريدة من نوعها لإدراج أسهل وأكثر تنوعا.
    1. إدراج عنصر استجابة أو الموقع قيود فريدة باستخدام تمديد لصق-العارضة (الشركات المملوكة للدولة) PCR. وقد وصفت هذه الطريقة بالتفصيل 31.
    2. في حالة استخدام موقع قيود على الإدراج، بورمطاردة تصنيعه تجاريا، والحس-تنقية PAGE وultramers العقاقير ترميز تسلسل إدراج يحيط بها سلاسل المتراكمة للموقع قيود فريدة من نوعها (الشكل 2).
    3. الجمع بين 0.5 ميكروغرام ultramer المعنى، 0.5 ميكروغرام ultramer العقاقير، عازلة الحمض النووي ربط إلى تركيز النهائي من 1X، وتقديمهم إلى 50 ميكرولتر مع H 2 O. يصلب ultramers التي يحتضنها رد الفعل عند 85 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ثم خفض درجة الحرارة عن طريق 0.5 درجة مئوية كل 30 ثانية حتى رد فعل تصل 25 درجة مئوية.
    4. الجمع بين 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي ناقلات ترميز جديد فريد من نوعه الموقع تقييد العازلة انزيم لتركيز النهائي 1X، 1 ميكرولتر من انزيم التقييد المناسب، وتقديمهم إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر مع H 2 O. دايجست متجه عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. تنقية الحمض النووي خطي من قبل تنقية هلام الاغاروز 32.
    5. Ligate وultramers صلب في ناقلات يهضم بين عشية وضحاها في 16 °؛ C باستخدام 3: 1 ultramers: نسبة ناقلات الرحى وتقنيات الربط القياسية 33.
      ملاحظة: عند استخدام واحد موقع انزيم التقييد لإدراجها يمكن أن يكون أكثر فعالية لdephosphorylate ينتهي من ناقلات يهضم والفوسفات نهايات أليغنوكليوتيد] صلب.
    6. تحويل الحمض النووي ligated إلى كولاي باستخدام الحرارة طريقة صدمة 34.
      ملاحظة: البلازميدات ترميز الجينوم الفيروسي كبيرة عموما، وبالتالي استخدام الخلايا المختصة الأمثل لامتصاص يبني DNA كبيرة قد يزيد من كفاءة التحول.
    7. تنقية DNA البلازميد من المستعمرات الفردية باستخدام طقم تنقية المتاحة تجاريا 35. تحديد استنساخ المناسب مع عنصر استجابة الرنا الميكروي في الاتجاه الصحيح (الشكل 2) من خلال تسلسل المنطقة إدراج 36.

2. إنقاذ المستهدفة الرنا الميكروي فيروسة بيكورناوية جيئة وذهابام البلازميد الحمض النووي

  1. فيروسة بيكورناوية الإنقاذ الرنا الميكروي، استهدفت في خط خلية متساهل لتكاثر الفيروس الذي لا يعبر عن الرنا الميكروي وما شابه ذلك (ق). يستخدم هذا البروتوكول خلايا H1-هيلا لأنها لا تعبر عن مير-142، مير-124، أو مير-125، ولكن ليس مطلوبا لاستخدام خلايا H1-هيلا للانقاذ.
    وينبغي أن يتبع جميع المبادئ التوجيهية لأمان المناولة والتخلص من العوامل المعدية وفقا لذلك: تنبيه.
    1. لوحة الخلايا H1-هيلا في لوحة 6 جيدا بحيث أنها ~ 80٪ متكدسة في وقت ترنسفكأيشن (24 ساعة بعد البذر). لوحة الخلايا في 2 مل لكل بئر من DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني.
    2. تدفئة كاشف ترنسفكأيشن إلى درجة حرارة الغرفة. الجمع بين 250 ميكرولتر وسائل الإعلام خالية من المصل، و 2.5 ميكروغرام البلازميد ترميز الحمض النووي الجينوم المستهدفة الرنا الميكروي، و 7.5 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن في أنبوب microcentrifuge معقمة والماصة بلطف لمزج. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة ل15-30 دقيقة.
    3. نضحوسائل الاعلام من الخلايا مطلي وإضافة 2 مل من وسائل الإعلام كاملة جديدة.
    4. يضاف خليط ترنسفكأيشن بأكمله من الخطوة 2.1.2 إلى جانب واحد من 6 جيدا لوحة قطرة من الحكمة. إضافة كل قطرة إلى منطقة مختلفة من البئر.
    5. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى آثار الاعتلال الخلوي (CPE) أو البروتينات مراسل قابلة للكشف (~ 24-72 ساعة).
  2. الحصاد ومرور الفيروس انقاذ على خلايا جديدة.
    1. لوحة الخلايا في لوحة 6 جيدا مثل أنهم 80-90٪ متكدسة في الوقت العدوى (24 ساعة بعد البذر).
      ملاحظة: مقياس صعودا أو هبوطا تبعا لكمية الفيروس اللازمة لجميع التجارب اللاحقة.
    2. حصاد كل الإنقاذ بشكل جيد عن طريق كشط الخلايا في طاف باستخدام مكشطة الخلية المطاط أو شرطي المطاط. سحب بلطف مكشطة عبر قاع البئر. نقل الخلايا وطاف في أنبوب التخزين المبردة.
    3. تجميد / ذوبان الجليد العينات مرتين ثم بيليه الحطام الخلوي من قبلالطرد المركزي في 1200 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. تصفية طاف مسح مرتين باستخدام 0.2 ميكرومتر مرشحات حقنة. يحتوي طاف الإنقاذ التي تمت تصفيتها الفيروس.
      قد تختلف تصفية حجم المسام اعتمادا على حجم جزيئات الفيروس وقد لا تكون قابلة للتطبيق للبحث عن الفيروسات كبيرة: ملاحظة.
    5. وسائل الإعلام نضح من الخلايا مطلي، ويغسل مرة واحدة مع وسائل الإعلام الحرة المصل وإضافة 1 مل من وسائل الاعلام المصل خالية جديدة إلى كل بئر.
    6. إضافة 50 ميكرولتر لكل بئر من طاف الإنقاذ التي تمت تصفيتها وصخرة بلطف لوحة لتوزيع بالتساوي الفيروس.
    7. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة وسائل الإعلام ثم نضح من كل بئر لإزالة الفيروس غير مسجلة.
    8. إضافة 1.5-2 مل من وسائل الإعلام كاملة جديدة لكل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية حتى CPE أو مراسل البروتينات واضحة (~ 24-48 ساعة).
    9. كرر الخطوات من 2.2.2 إلى 2.2.4. ويتضمن تصفية طاف الإنقاذ الأسهم الفيروس. الأسهم مخزن الفيروس في قسامات تستخدم مرة واحدة في أنابيب التخزين المبردة في -80 °C.

3. إنقاذ الفيروسات التي تستهدف الرنا الميكروي من كتب في المختبر RNA النصوص

  1. توليد النصوص من الحمض النووي الريبي DNA البلازميد ترميز الجينوم الفيروسي يستهدف الرنا الميكروي باستخدام مروج المنبع.
    ملاحظة: يجب استخدام الممارسات القياسية لتوليد والحفاظ على البيئة nuclease خالية لجميع الخطوات اللاحقة.
  2. خطي البلازميد استخدام موقع تقييد انزيم المصب من النص. الجمع بين 5 ميكروغرام DNA البلازميد، عازلة النهائي 1X انزيم تركيز، 3 ميكرولتر انزيم التقييد وتقديمهم إلى 50 ميكرولتر مع H 2 O. احتضان رد الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
  3. إضافة إلى حجم 1/20 عشر من 0.5 M EDTA، 1/10 حجم ال 5 M NH 4 خلات، و 2 مجلدات من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى رد فعل هضمها وتخلط. احتضان عند -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة حتى ليلة وضحاها.
  4. بيليه الحمض النووي عجل لمدة 10 دقيقة في 17000 x ج في 4 درجات مئوية. تخلصي من supernataالإقليم الشمالي، resuspend وبيليه في 500 ميكرولتر من البرد الايثانول 70٪ وبيليه الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي في 17000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  5. تخلصي من طاف وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 30 ثانية. إزالة طاف المتبقية مع الماصة والهواء الجاف بيليه. Resuspend بيليه في الحمض النووي في العقيمة nuclease خالية H 2 O بتركيز 0.5-1 ميكروغرام / ميكرولتر.
  6. ذوبان الجليد في المختبر الكواشف النسخ في درجة حرارة الغرفة ووضع ribonucleotides على الجليد (الإنزيمات في الجلسرين لا تجميد ويجب ان تذهب مباشرة على الجليد). الحفاظ على رد فعل العازلة في درجة حرارة الغرفة.
  7. تجميع رد فعل النسخ في أنبوب PCR عن طريق الجمع بين 2 ميكرولتر كل من ATP، CTP، GTP، وحلول UTP، 2 ميكرولتر 10X العازلة رد فعل، 1 ميكروغرام خطي الحمض النووي (2)، انزيم ميكرولتر، وتقديمهم إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر مع نوكلياز H 2 O. خالية
  8. احتضان رد الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  9. تنقية النصوص الحمض النووي الريبي.
  10. جعل رد فعل النسخ إلى 100 ميكرولتر مع الحل شطف (لا-مسخن). إضافة 350 ميكرولتر ملزمة حل التركيز و 250 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى رد فعل وتخلط.
  11. نقل العينة إلى خرطوشة فلتر إدراجها في أنبوب جمع وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 12000 ز س. تجاهل التدفق من خلال.
  12. إضافة 500 ميكرولتر من محلول لغسل خرطوشة الفلتر وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 12000 ز س. تخلصي من خلال تدفق. كرر هذه الخطوة يغسل مرة أخرى. تخلصي من خلال تدفق. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 12،0000 x ج لإزالة الإيثانول المتبقية.
  13. نقل خرطوشة فلتر لأنبوب جمع نظيفة وإضافة 50 ميكرولتر من محلول شطف محمى على خرطوشة الفلتر. الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 12000 ز س. كرر هذه الخطوة شطف للحصول على الحجم الكلي 100 ميكرولتر من تابع شاطفaining النصوص RNA النقاء. تجاهل تصفية خرطوشة.
  • تحديد تركيز الحمض النووي الريبي في شاطف عن طريق قياس الامتصاصية من العينة في 260 و 280 نانومتر، واستخدام قانون بير لامبرت.
  • تقييم سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام الحمض النووي الريبي الكهربائي للهلام 37. انظر الشكل 3 للحصول على أمثلة من الجيدة والسيئة سلامة الحمض النووي الريبي. يجب aliquotted RNA في أنابيب تستخدم مرة واحدة وتخزينها في -80 درجة مئوية إلى الحفاظ على سلامة.
  • الكواشف ترنسفكأيشن الحارة إلى درجة حرارة الغرفة. الجمع بين 250 ميكرولتر وسائل الإعلام خالية من المصل، و 2.5 ميكروغرام من النصوص RNA النقاء، 5 ميكرولتر من دفعة الحل، و 5 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن في أنبوب microcentrifuge معقمة والماصة بلطف لمزج. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-5 دقيقة.
  • لوحة الخلايا H1-هيلا في لوحة 6 جيدا بحيث أنها ~ 80٪ متكدسة في وقت ترنسفكأيشن (24 ساعة بعد البذر). لوحة الخلايا في 2 مل لكل بئر من DMEM تستكمل مع 10٪ المجاليآل المصل البقري.
  • نضح في وسائل الاعلام من الخلايا مطلي وإضافة 2 مل من وسائل الإعلام كاملة جديدة.
  • يضاف خليط ترنسفكأيشن بأكمله من الخطوة 3.12 إلى جانب واحد من 6 جيدا لوحة قطرة من الحكمة. إضافة كل قطرة إلى منطقة مختلفة من البئر.
  • احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى آثار الاعتلال الخلوي (CPE) أو البروتينات مراسل قابلة للكشف (~ 24-72 ساعة).
  • تواصل الانقاذ من الفيروسات التي تستهدف الرنا الميكروي كما هو موضح في الخطوات 2.2 إلى 2.2.9.

    • 4. المعايرة الأسهم الفيروسات عن طريق حساب 50٪ نسيج الثقافة المعدية الجرعة (TCID 50)

    1. لوحة الخلايا H1-هيلا في لوحة 96-جيدا في 10 4 خلايا لكل بئر في DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
      ملاحظة: عاير الفيروس في خلايا متساهلة لتكاثر الفيروس لا تعبر الرنا الميكروية وما شابه ذلك.
    2. جعل 10 أضعاف التخفيفات المسلسل من الفيروسات في كل من إجمالي حجم 1 مل من مصل خاليةوسائل الإعلام.
      ملاحظة: استخدام التخفيفات أقل إذا كنت بحاجة إلى المزيد من الدقة.
      ملاحظة: تغيير نصائح بعد كل تخفيف لمنع المبالغة في تقدير عيار باسم فيروس يمكن التمسك النصائح.
    3. نصيحة 96-جيدا لوحة إلى الجانب ونضح وسائل الإعلام من خلايا هيلا مطلي. إضافة 100 ميكرولتر من كل تخفيف الفيروس لكل بئر إلى 8 آبار 96-جيدا لوحة (صف 1 في التخفيف). إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام الحرة المصل دون الفيروس إلى الصف 1 و صف 12 على لوحة للتحكم.
      ملاحظة: دائما نضح وإضافة وسائل الإعلام إلى الآبار عن طريق لمس تلميح إلى جانب جيدا لمنع انفصال الخلايا.
    4. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. لوحة تلميح إلى الجانب ونضح وسائل الإعلام من الآبار.
      ملاحظة: تغيير نصائح بين كل صف التخفيف.
    5. إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام كاملة إلى كل بئر. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
    6. تصور الآبار تحت المجهر وعلامة كل إيجابية أو سلبية جيدا لCPE.
    7. حساب كل عيار الفيروس مع المعادلة التالية: لوز 10 (TCID 50 / مل) = L + D (S-0.5) + تسجيل 10 (1 / V). L هو سجل سلبي 10 من التخفيف الفيروس الأشد تركيزا اختبار فيه جميع الآبار إيجابية. D هو سجل 10 من عامل التخفيف. S هو مجموع النسب الفردية (باي). بي هي نسبة تحسب لتخفيف الفردي (مبلغ من الآبار إيجابية / المبلغ الإجمالي للآبار في التخفيف الخامس هو حجم اللقاح (مل / جيد).

    الجدول 1
    الجدول 1: تحديد مقدار جزيئات الفيروس المعدية عن طريق حساب TCID 50. نتائج ممثلة من الخلايا المصابة مع سلسلة من التخفيفات عشرة أضعاف من مخزون الفيروس. "L" يعادل 4 لأن تخفيف الماضي حيث جميع الآبار إيجابية لCPE هو 10 -4. "D" هو سجل 10 من التخفيفات 10 منذ 10 أضعافاستخدمت وبالتالي فهو يساوي 1. "S" هو مجموع النسب الفردية. في هذا المثال النسب الفردية هي 1.0، 0.875، 0.375، 0.125، و0. مجموع هذه (S) هو 2.375. "V" هو حجم اللقاح في مل تستخدم لتصيب الخلايا في البداية.

    5. تقييم فعالية استهداف الرنا الميكروي: حركية النمو خطوة واحدة

    1. وتشمل الضوابط لهذا الاختبار خلايا وهمية المصابة، وفيروس معدلة والفيروسات التي تحتوي على عنصر استجابة غير المستهدفة أو غير وظيفية.
    2. لوحة الخلايا H1-هيلا لدورة التجربة المرة في لوحات زراعة الأنسجة 12-جيدا بحيث تكون 80-90٪ متكدسة في الوقت العدوى (24 ساعة بعد البذر). لوحة الخلايا في DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني في 1 مل لكل بئر.
      ملاحظة: أوصت لوحة لوحة منفصلة لكل نقطة زمنية. يستخدم هذا البروتوكول 7 نقاط زمنية مختلفة للفيروس مع دورة النسخ المتماثل 8-12 ساعة. ليس مطلوبا من خلايا H1-هيلا لأداء هذاssay. يجب أن يتم تنفيذ هذا الاختبار في خلايا المتسامحة التي لا تعبر عن الرنا الميكروية المستهدفة. ويمكن أيضا أن هذا الاختبار أن يؤديها في الخلايا معربا عن الرنا الميكروية وما شابه ذلك لتقييم حركية النمو تحت ضغط انتقائي.
    3. وسائل الإعلام نضح من الآبار. غسل الآبار عن طريق إضافة 0.5 مل من المصل خالية المتوسطة إلى كل بئر، دوامة لوحة، ووسائل الإعلام نضح من الآبار. إضافة 0.5 مل من وسائل الاعلام المصل خالية جديدة إلى كل بئر.
    4. تصيب كل بئر في عدد وافر عالية من العدوى (وزارة الداخلية، وعدد من الجسيمات المعدية لكل خلية) للتأكد من جميع الخلايا للحصول على المصابين. يستخدم هذا البروتوكول وزارة الداخلية من 3.
      1. تمييع مخزونات فيروس في وسائل الإعلام خالية من المصل إلى تركيز وزارة الداخلية = 3 لكل 100 ميليلتر. إضافة 100 ميكرولتر من تخفيف الفيروس كل سبعة آبار مختلفة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
      2. نضح في وسائل الاعلام من جميع الآبار، ويغسل مرتين عن طريق إضافة 0.5 مل سائل الإعلام كاملة لكل بئر، هزاز بلطف ثم الشفط.
    5. إضافة 1 مل من جوسائل الإعلام omplete إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية حتى نقطة الوقت المطلوب.
    6. جمع عينات لالمعايرة فيروس في 2، 4، 6، 8، 10، 24 و 48 ساعة بعد الإصابة (1 جيدا في نقطة زمنية). نقل 700 ميكرولتر من وسائل الإعلام في البئر لأنبوب التخزين المبردة. تتخلص من الخلايا في طاف المتبقية عن طريق تحريك بلطف مكشطة المطاط عبر البئر كله. نقل خليط الخلية / طاف في أنبوب التخزين المبردة المقابلة التي تحتوي على 700 ميكرولتر من طاف.
      ملاحظة: تأكد من عدم لطخة طاف من واحدة الى اخرى خلال كشط مما أدى إلى عينات ملوثة. نقل 700 ميكرولتر قبل إلغاء سيقلل الرش.
    7. مكان العينات في -80 درجة مئوية حتى يتم جمع كل العينات.
    8. تجميد / ذوبان الجليد العينات ثلاث مرات وإزالة الحطام الخلوية بواسطة الطرد المركزي العينات في 1200 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    9. عاير الفيروس كما هو موضح في البند 4 ومقارنة حركية النمو خلال رIME.

    6. تقييم خصوصية استهداف الرنا الميكروي: المقلدون الرنا الميكروي الاصطناعية فيروس الانتشار عن طريق الفحص

    يتم تنفيذ استخدام الرنا الميكروي تقليد الاصطناعية لإظهار خصوصية الرنا الميكروي: ملاحظة التفاعل الرنا الميكروي المستهدفة.

    1. تشمل ترنسفكأيشن وهمية، الرنا الميكروي سيطرة سلبية تحاكي والرنا الميكروي تجريبية تحاكي تسيطر فقط عن كل فحص لتقييم سمية بوساطة الرنا الميكروي. وهو مثالي أيضا لتشمل مراقبة إيجابية (أي استهداف الرنا الميكروي الجين أو الجينات) منخفضة الكفاءة ترنسفكأيشن يحاكي الرنا الميكروي يمكن أن يؤدي إلى السلبيات كاذبة.
    2. لوحة الخلايا H1-هيلا في 96-جيدا لوحة زراعة الأنسجة مثل أنهم 80-90٪ متكدسة في وقت ترنسفكأيشن (24 ساعة بعد البذر). لوحة الخلايا في DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني عند 0.1 مل لكل بئر.
      ملاحظة: إجراء هذا الاختبار في خلايا متساهلة لتكاثر الفيروس التي لا تعبر عن الرنا الميكروية وما شابه ذلك.
    3. عشر الدافئالكواشف ترنسفكأيشن ه إلى درجة حرارة الغرفة. الجمع بين وسائل الإعلام الحرة المصل 9 ميكرولتر، 200 نانومتر تركيز النهائي لكل بئر من الأسهم الرنا الميكروي تقليد، 0.18 ميكرولتر دفعة الكاشف، 0.18 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن وتخلط. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-5 دقيقة.
      ملاحظة: أحجام المذكورة هي لكل بئر. فمن المستحسن أن مزيج الرئيسي يتم تجميعها لترنسفكأيشن من جميع الآبار للحفاظ على التناسق وتقليل الخطأ pipetting ل. فإن تركيز الأمثل من الرنا الميكروي تقليد تختلف. استشارة تعليمات الشركة الصانعة المصاحبة للالرنا الميكروي تحاكي لتركيز انطلاق معقولة. هذا وسوف تتراوح عموما 5-200 تركيزات النهائي نانومتر.
    4. نضح في وسائل الإعلام من الآبار وإضافة 92 ميكرولتر من المتوسط كاملة جديدة.
      ملاحظة: إذا كان هناك عدد كبير من العينات، واستكمال هذه الخطوة قبل تجميع الحل ترنسفكأيشن وتخزين لوحة عند 37 درجة مئوية لتصبح جاهزة.
    5. إضافة بأكمله ط خليط ترنسفكأيشنن خطوة 6.3 إلى الخلايا قطرة من الحكمة.
    6. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات.
    7. تصيب كل بئر في وزارة الداخلية منخفضة لضمان انخفاض النسبة المئوية للخلايا للحصول على المصابين يتيح تحليل انتشار الفيروس. يستخدم هذا البروتوكول وزارة الداخلية من 0.2.
      1. تمييع مخزونات فيروس في وسائل الإعلام خالية من المصل إلى تركيز وزارة الداخلية = 0.2 لكل 100 ميليلتر. إزالة وسائل الاعلام من الآبار وإضافة 100 ميكرولتر من تخفيف الفيروس لكل بئر.
      2. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    8. وسائل الإعلام نضح من كل بئر وإضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام كاملة جديدة.
    9. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20-22 ساعة.
    10. تحديد المعايرة الفيروس في supernatants.
      1. جمع طاف من كل بئر واستبدالها مع 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام كاملة جديدة.
        ملاحظة: إذا كنت تستخدم خلايا تعليق، resuspend الكرية خلية من الخطوة التالية في 100 ميليلتر من وسائل الإعلام كاملة جديدة والعودة إلى أخذ عينات بشكل جيد لفحص قدرتها على البقاء.
      2. إزالة celluالحطام لار من supernatants التي تم جمعها بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
      3. نقل طاف مسح لأنبوب جديد ويعاير الفيروسات المعدية على خلايا المتسامحة التي لا تعبر عن الرنا الميكروية وما شابه ذلك كما هو موضح في قسم 4.
        ملاحظة: حافظ على جميع العينات على الجليد لمنع فقدان العدوى.
    11. تحديد صلاحية الخلايا.
      1. إضافة 10 ميكرولتر من الإنتقالي العسكري (3- (4،5-dimethylthiazolyl-2) -2،5-diphenyltetrazolium بروميد) كاشف لكل بئر.
      2. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعة حتى راسب الأرجواني مرئيا.
      3. إضافة 100 ميكرولتر من كاشف المنظفات.
      4. يحضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 2 ساعة.
      5. قراءة الامتصاصية من جميع الآبار في 570 نانومتر.
        ملاحظة: تطبيع جميع العينات للسخرية خلايا transfected للمقارنة بين بقاء الخلية في المئة.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    يمثل الجدول 1 نتائج نموذجية لفحص المعايرة لفيروسة بيكورناوية ويصف كيفية حساب زراعة الأنسجة الجرعة المعدية 50٪. ويرد التمثيل التخطيطي من المفهوم العام للتنظيم على أساس الرنا الميكروي من مع الأجسام الفيروسي وصفها في هذه المخطوطة في الشكل 1. التوجه من الرنا الميكروي لعنصر استجابة خلال التفاعلات بين الخلايا، والتصميم السليم للأليغنوكليوتيد] عنصر استجابة لالصلب والبلازميد الإدراج، و ويصور خريطة البلازميد ترميز الجينوم المستهدفة الرنا الميكروي الفيروسي لفي النسخ المختبر في الشكل يظهر 2. الشكل 3 نسخ الحمض النووي الريبي في درجات النزاهة تصور من قبل الكهربائي للهلام الاغاروز متفاوتة. سليم مناولة واستخدام الحمض النووي قوالب خالية من الشوائب سيؤدي في محاضر RNA كتب بشكل صحيح كما هو موضح في حارة 3A 2. الشوائب المتبقية داخل الخطقوالب الحمض النووي rized بين أو كميات ضئيلة من نوكلياز يمكن أن يؤدي إلى انخفاض مستويات الحمض النووي الريبي كتب بشكل غير صحيح و / أو منتجات التحلل مماثلة لتلك التي لوحظت في حارة 3A 3. الخطية غير المكتملة من البلازميد أو DNA التي تحتوي على كميات عالية من الشوائب مثل الإيثانول المتبقية سوف يؤدي إلى غير سليمة النسخ وتدهور المنتجات ممثلة في الممرات 3A 4 و 5. الشكل 3 يبين أيضا صورة من آثار الاعتلال الخلوي بوساطة الفيروسة المنغوية (CPE) بعد ترنسفكأيشن من نسخ الرنا نظيفة. الرقم 4 يعرض ممثل البيانات من وقت بالطبع تجربة تقييم حركية النمو من الفيروسة المنغوية معدلة واستهدفت الرنا الميكروي. وأظهرت النتائج أن عناصر استجابة الرنا الميكروي هندسيا في الجينوم الفيروسة المنغوية لا تغير حركية تكاثر الفيروس في الخلايا H1-هيلا، التي لا تعبر عن أي من الرنا الميكروية وما شابه ذلك. ومع ذلك، في RAW 264.7 الضامة، التي تعبر عن مستويات متوسطة من الرنا الميكروي-125 ومستويات عالية من الرنا الميكروي-142 والفيروسات ترميز العناصر استجابة المقابلة عرض حركية تكرار تحول دون أن يرتبط مستوى الرنا الميكروي التعبير عنها. البيانات في الشكل (5) يبين خصوصية التنظيم القائم على الرنا الميكروي من الفيروسة المنغوية مع الأجسام. overexpression من كل الرنا الميكروي الفردية في الخلايا H1-هيلا يمنع على وجه التحديد نشر (أقل التتر فيروس) والسمية الخلوية (زيادة قابلية الخلية) من الفيروسة المنغوية ترميز وما شابه ذلك عنصر استجابة الرنا الميكروي.

    شكل 1
    الشكل 1: تمثيل تخطيطي من التنظيم على أساس الرنا الميكروي لمع الأجسام الفيروسية. سيتم التعرف على عناصر استجابة الرنا الميكروي (RE) دمجها في الجينوم الفيروسي عن طريق الرنا الميكروية وما شابه ذلك التخصيب في أنواع معينة من الخلايا وتؤدي إلى تدهور المستهدفة من النصوص الفيروسية / الجينوم. هذا تكاثر الفيروس ومنع انتشار وسمية إلى THالبريد المحيطة الخلايا. ومع ذلك، سيتم الحفاظ على تكاثر الفيروس في الخلايا التي لا تعبر عن الرنا الميكروية وما شابه ذلك السماح لانتشار الفيروس، وانتشار وموت الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 2
    الشكل 2: الرنا الميكروي تصميم عنصر استجابة. (أ) لنجاحها استهداف البذور تسلسل منطقة RE يجب أن تكون مكملة تماما. يجب أن تكون موجهة للRE داخل الجينوم الفيروسي من النوع الذي يمكن التعرف عليه من قبل وما شابه ذلك ناضجة الرنا الميكروي في محاضر مرنا و / أو الجينوم الفيروسي. وضعت غالبية الدقة في UTR 3 'من النصوص. (ب) تصوير من أليغنوكليوتيد] تصميم وصلب صحيح ترميز الدقة التي تحتوي على جنبا إلى جنبيكرر من متواليات الرنا الميكروي المستهدفة (miRT) يحيط بها النيوكليوتيدات المتدلية من موقع انزيم التقييد XhoI. عند تصميم تكرار الدقة جنبا إلى جنب، تأكد من تضمين النيوكليوتيدات هل (عادة 4-6) بين كل نسخة الرنا الميكروي المستهدفة. (C) DNA البلازميد ترميز الجينوم الفيروسي كامل طول مع RE دمجها في "UTR 3، المروج T7، وموقع قيود فريدة من نوعها لالخطية للنسخ في المختبر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (3)
    الرقم 3: الانقاذ من الفيروسات من نسخ الرنا ترميز الجينوم. (أ) RNA هلام الكهربائي في المختبر الرنا كتب ترميز الجينوم فيروسة بيكورناوية لتقييم سلامة نسخة. خط 1: RNA سلم. 2 لين: نسخه بشكل صحيح RNA مع سلامة عالية. حارة 3: نسخ الرنا بنزاهة المعتدلة. أعلى الفرقة هو الحجم الصحيح وانخفاض الفرقة يحتمل ان يكون منتج تدهور أو نسخة الرنا غير مرغوب فيها. حارة 4: كتب غير صحيح الحمض النووي الريبي. حارة 5: منخفض سلامة الحمض النووي الريبي. تم تحميل 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي في المختبر كتب لكل بئر. ومن المرجح غير لائقة النسخ أو تدهور المنتجات بسبب استخدام نقاء منخفضة أو الحمض النووي خطي غير كامل. (ب) صورة من الخلايا H1-هيلا transfected وهمية والخلايا transfected مع النصوص RNA ترميز الفيروسة المنغوية. سوف إدارة الكواشف ترنسفكأيشن فقط (موك) الحفاظ على بقاء الخلية التالية ترنسفكأيشن وكذلك مرور على خلايا جديدة. ترنسفكأيشن من النصوص RNA ترميز الجينوم الفيروسة المنغوية (VMC 24) النتائج في تأثير الاعتلال الخلوي، والتي حافظت التالية الترشيح من طاف والمرور على الخلايا H1-هيلا جديدة. شريط مقياس = 100 ميكرون.ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (4)
    الشكل 4: حركية النمو من Mengoviruses معدلة واستهدفت الرنا الميكروي في وجود أو غياب من microRNAs وما شابه ذلك. تعديل من إشارة 17. خلايا (A) H1-هيلا لا تعبر عن مير-124، -125، أو -142. كل ثلاثة الفيروسة المنغوية الرنا الميكروي ترميز الدقة تكرار مع حركية مماثلة لفيروس معدلة (VMC 24) مشيرا إلى أن الإدراج من الرنا الميكروية في هذا الموقع (5 'UTR) لا تغير تكاثر الفيروس. (ب) RAW 264.7 الضامة تعبر عن مستويات متوسطة من مير 125B ومستويات عالية من مير 142-3p، ولكن لا تعبر عن مير-124. إدراج المقابلة تسلسل الرنا الميكروي المستهدفة في نتائج الجينوم في توري فيروسenuation بما يتفق مع مستوى التعبير الرنا الميكروي. ويمثل البيانات والتتر الفيروسية متوسط ​​+ SD. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 5
    الرقم 5: تحليل خصوصية استهداف الرنا الميكروي باستخدام يقلد الرنا الميكروي الاصطناعية. تعديل من إشارة 17. أصيب خلايا H1-هيلا transfected مع يقلد الرنا الميكروي الفردية مع فيروس معدلة (VMC 24) أو فيروس يستهدف الرنا الميكروي (miRT-VMC 24) في وزارة الداخلية من 0.2. (أ) تم تحديد بقاء الخلية تطبيع للخلايا وهمية المعالجة في 24 ساعة بعد العدوى عن طريق الإنتقالي العسكري تكاثر الخلايا الفحص. تم تحديد (ب) عيار الفيروسات في طاف من جميع العينات أيضا في 24 ساعة بعد العدوى. الويمثل البيانات وقابلية متوسط ​​أو فيروسية عيار +/- SD. اثنين من الذيل أونبايريد الطلاب ر اختبارات مع التصحيح ويلش (على الفروق غير متكافئة) كانت تستخدم لأغراض التحليل الإحصائي. واعتبر أن قيمة ف <0.01 كبيرة. (**، ف <0.01، ***، ف <0.001). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    وتصميم وتركيب وتوطين عناصر استجابة الرنا الميكروي داخل الجينوم الفيروسي تملي تستهدف فعالية وخصوصية. سوف تحسين هذه تتطلب التجربة والخطأ. ومع ذلك، التصميم الرشيد على أساس التحليل البنيوي RNA والدراسات السابقة من تكاثر الفيروس والرنا الميكروي التوقيعات يساعد في تنفيذ هذه التقنية مع الحد الأدنى الأمثل 10، 11، 12، 13، 38.

    عند البدء في تصميم الدقة، وينبغي للمحققين أن تبدأ من خلال تجميع مجموعة من microRNAs التي يتم التعبير عنها في الخلايا المستهدفة من الفائدة، وتقلص في الخلايا غير المستهدفة من الفائدة، والتي تم التحقق من صحتها تجريبيا. وبعد هذا التجميع، وينبغي إجراء عدة تحاليل على أساس التنبؤ لمعالجة إمكانية المنافسة الرنا الميكروي-المستهدفينر التفاعلات. العديد من الفيروسات ترميز الرنا الميكروية أو الرنا غير المكودة أن عزل الرنا الميكروية الخلوية من أجل التلاعب التعبير الجيني الفيروسي والمضيف. وعلاوة على ذلك، وقد ثبت عدة فيروسات الحمض النووي الريبي للتفاعل مع الرنا الميكروية الخلوية من أجل تعزيز قدرة تكرارها 39 و 40. لذلك، عند تصميم الدقة، ومن المؤكد أن تحقيق فيما إذا كان هناك تعرف تفاعلات الفيروس مع الرنا الميكروية الخلوية أو إذا كانت تعبير عن الرنا الميكروية الفيروسية التي يمكن أن يتعرف على الهدف الرنا الميكروي اختيار أو تغيير التعبير الذاتية من الرنا الميكروي الذي تم اختياره. بالإضافة إلى البحث في المؤلفات، يجب على القارئ أن تنظر على الانترنت أدوات التنبؤ المعلوماتية الحيوية وقواعد البيانات التي تتضمن الفيروسية المعلومات الرنا الميكروي الهدف للمساعدة في تصميم عقلاني من الدقة. ويمكن لهذه قواعد البيانات وأدوات التنبؤ أيضا تسهيل التعرف على تسلسل الهدف الذي يمكن التعرف عليه بواسطة الرنا الميكروية متعددة أو تسلسل البذور متداخلة قبل أرسلت داخل الجينوم الفيروسي. لمزيد من النقاش معمقة حول طرق تحديد الأهداف الرنا الميكروي وإيجابيات وسلبيات بعض الأدوات التنبؤ على الانترنت هو القارئ الرجوع إلى المراجع 41، 42. فمن المستحسن أن هذه الأدوات التنبؤ تخدم فقط كمرشدين عدة مرات التنبؤات يمكن أن تسفر عن ايجابيات كاذبة أو السلبيات. تحقيقا لهذه الغاية، قد يكون هناك تسلسل البذور التي تتداخل، لكن نهاية 3 'من الرنا الميكروي سوف تؤثر أيضا على كفاءة الاستهداف. باستخدام صرامة جدا من مجموعة القاعدة يمكن أن يكون أحيانا ضارة.

    مرة واحدة وقد تم تحديد مجموعة من الأهداف المحتملة الرنا الميكروي، وينبغي أن يستمر المحقق بتصنيف الأهداف على أساس الخصائص البيولوجية للالرنا الميكروية وRNA التنبؤات الهيكلية 10، 11، 12، 13،EF "> 38. وفرة مطلقة من الرنا الميكروي ناضجة في الخلايا المستهدفة ومستوى تكوين الجمعيات مع البروتين Argonaute ستحدد درجة إسكات الجينات. وقد أثبتت العديد من الدراسات أن فقط أعرب بوفرة الرنا الميكروية سوف تنظم بشكل ملحوظ التعبير الجيني 16، 43، 44. وعلاوة على ذلك، في حين أعربت بعض الرنا الميكروية يدع مجالا لتفاعلها مع البروتينات Argonaute وتشكيل RISC غير كافية لقمع الترجمة 44. استخدام الرنا الميكروي وفيرة للغاية مع وظيفة التحقق من صحة من شأنها أن تقلل أيضا من احتمالات الرنا الميكروي التشبع في الخلية المستهدفة والمنبعثة اللاحقة سمية الهدف. قد يكون نهجا مختلفا لاستخدام الدقة التي تستهدف من قبل miRNAs متعددة 45، 46، والتي قد تسمح لعدد نسخة مخفضة في حين لا يزال التقليل من احتمالات toxiciti بعيدا عن الهدفوفاق. فإن نسبة مرنا الهدف إلى الرنا الميكروي أيضا أن يكون لها تأثير كبير على نجاح هذا النهج. وهناك هدف ارتفاع نسبة الرنا الميكروي خفض مستوى القمع 42، 43، 47، 48. هذا أمر بالغ الأهمية خصوصا مع الفيروسات التي تحاكي بسرعة عندما إذا ما تم تنظيمها بشكل غير صحيح في وقت مبكر خلال العدوى سوف تتراكم وتصل إلى مستويات خارجة عن سيطرة من microRNAs الذاتية. لا بد من النظر في هذه الخصائص عند اختيار الرنا الميكروي لاستهداف. من الناحية المثالية، وذلك باستخدام الرنا الميكروي التي تم التحقق من صحتها تجريبيا وظيفة.

    تتأثر كفاءة إسكات الجينات المستهدفة أيضا من التكامل في المئة من الهدف إلى الرنا الميكروي ناضجة، فضلا عن عدد من النسخ من تسلسل الرنا الميكروي المستهدفة المدرجة. وتشكل المنطقة 5 'من الرنا الميكروي (النيوكليوتيدات 2-8) في تسلسل البذور. ومن المسلم به عموماأن هذه المنطقة يجب أن تكون مكملة تماما عن الاستهداف الناجح 48 و 49. معظم الدراسات تستخدم عناصر استجابة مع التكامل المثالي لأنها يمكن أن تزيد من نشاط الجينات إسكات من خلال تعزيز الانقسام endonucleolytic من النص وإعادة التدوير السريع للالرنا الميكروي. يحدث هذا الانقسام endonucleolytic فقط عندما يتفاعل الرنا الميكروي مع البروتين Argonaute التي لديها نشاط endonucleolytic، الذي يقتصر في خلايا الثدييات لArgonaute-2. البروتينات Argonaute أخرى تعزز تدهور مرنا من قبل deadenylation والهجوم exonucleolytic من النص. يشار إلى القارئ إلى المراجع 4، 5، 13، 50، 51، 52 لوصف معمقة من الرنا الميكروي نشوء حيوي وظيفة. ويعتقد عموما أن incrوتخفيف عدد النسخ تعزيز كفاءة الاستهداف. ومع ذلك، يمكن أيضا تحفيز الرنا الميكروي التشبع ولم يثبت دائما أكثر فعالية. بل هو أحيانا أفضل لدمج تسلسل الهدف لالرنا الميكروية مختلفة متعددة المخصب في الخلايا المستهدفة أو استخدام تسلسل الهدف التي تعترف بها الرنا الميكروية متعددة. عدد النسخ المطلوب هو أيضا يعتمد بشكل كبير على كمية من نسخة والتي تحتاج إلى إسكات والوفرة النسبية من الرنا الميكروي في الخلايا المستهدفة. النصوص التي سوف تتراكم بسرعة قد تتطلب المزيد من النسخ لمنعهم من outcompeting مستويات الرنا الميكروي. تحديد تجريبيا في عدد النسخ الأمثل لكل هدف الرنا الميكروي الذي ينتج في استهداف كافية، ويحافظ على اللياقة البدنية الفيروسية، والتي تقلل من المستحسن معدل الطفرات الهروب.

    توطين عنصر استجابة الرنا الميكروي داخل الجينوم الفيروسي مهم للغاية. النتيجة السلبية عند تحليلكفاءة استهداف لا يعني دائما ان الفيروس لا يمكن أن يكون استهداف الرنا الميكروي. قد يعني ببساطة الهدف لا يمكن الوصول إليها في هذا الموقع أو ذاك قمع الجينات المستهدفة ليست كافية لمنع المرضية. يتم إدراج معظم عناصر استجابة إلى المناطق غير مترجمة 3 "(UTR) من محضر المستهدفة. ومع ذلك، فقد تم إنجاز الاستهداف الناجح من الجينوم الفيروسي وأحيانا المعارض تعزيز الاستقرار الجيني عندما يتم إدراج عناصر استجابة إلى UTR 5 'أو داخل المناطق ترميز الجينات الأساسية 38. سوف مواقع الإدراج الأمثل تسمح الوصول عالية من تسلسل الهدف إلى الرنا الميكروي. الوصول يمكن عرقلته من قبل الهياكل الثانوية RNA والتدخل متكافئة. لذلك، توطين عناصر استجابة في المناطق غير المنظمة التي يتم حفظها للغاية هي نقطة انطلاق جيدة. تسلسل يجري إدخال قد تؤثر أيضا ويتأثر تسلسل المحيطة بها. تيHUS، وهو المكان الأمثل لتسلسل الهدف الرنا الميكروي واحد ليس الأمثل بالضرورة عن عناصر استجابة أخرى. في حين التحقق التجريبي والاستغلال الأمثل للتوطين RE ضروري، وذلك باستخدام برنامج التنبؤ (على سبيل المثال http://unafold.rna.albany.edu/، http://rna.urmc.rochester.edu/software.html) لحجب المواقع إدراج المحتملة لاضطراب الهياكل RNA المحيطة ينصح بشدة 53، 54.

    استعمال مستحضرات الحمض النووي نظيفة من سلامة عالية أمر بالغ الأهمية من أجل الحصول على أفضل النتائج أيضا. العقيم تقنية وصيانة بيئة خالية من ريبونوكلياز عند التعامل مع النصوص RNA أو يقلد الرنا الميكروي أمر ضروري. للحصول على أفضل النتائج النصوص الحمض النووي الريبي، يجب أن يتم تخزين يقلد الرنا الميكروي، ومخزونات فيروس معاير النهائية في -80 درجة مئوية في قسامات صغيرة لتجنب تكرار التجميد والذوبان مما أدى إلى تدهور الحمض النووي الريبي وفقدان العدوى بالفيروس. عند الاستخدام، هذه كاشف الصورة يجب أن تبقى على الجليد في جميع الأوقات.

    من المهم أن نلاحظ أن العديد من الرنا الميكروية هي أعضاء في عائلة من microRNAs التي تشترك التكامل. لذلك عند إجراء الدراسات أنه قد يكون من المفيد لتشمل أفراد الأسرة الرنا الميكروي فورية لتحسين تقييم استهداف خصوصية. هذا يصبح حاسما عندما الخلايا داخل الذي هو المطلوب تكاثر الفيروس، تعبر عن أفراد الأسرة (على سبيل المثال عائلة مير Let7). كما تجدر الإشارة إلى أن فحص خصوصية باستخدام يقلد الرنا الميكروي هو نظام الاصطناعي والإفراط في التعبير عن الرنا الميكروي في بعض الخلايا قد تؤدي إلى آثار بعيدا عن الهدف 55. إذا حدث هذا، خصوصية ويمكن أيضا أن يتم تقييم في الخلايا التي تعبر عن الرنا الميكروية المناسبة باستخدام مثبطات الرنا الميكروي بدلا من ذلك. أن هذا الاختبار يسمح تحليل استهداف خصوصية على أساس المعايرة فيروس وبقاء الخلية قراءات في وجود مستويات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من microRNAs.

    "jove_content"> الشواغل الرئيسية عند استخدام كوسيلة للسيطرة مع الأجسام الفيروسية التي تستهدف الرنا الميكروي والاستقرار الجيني، وقدرتها على الآثار بعيدا عن الهدف، والآثار بوساطة الفيروسات على البيئة الخلوية الرنا الميكروي 10، 11، 12، 13. العديد من الفيروسات يحمل معدلات طفرة عالية والهروب المسوخ قد تنشأ بسرعة. بما في ذلك نسخ متعددة من تسلسل الهدف، بما في ذلك الأهداف عن الرنا الميكروي أكثر من واحد، إضفاء الطابع المحلي على أهداف داخل عدة مناطق الحفظ جدا، أو وجود عوامل مضادة للفيروسات إضافية بما في ذلك الاستجابة المناعية يمكن أن تخفف من هذا. بالإضافة إلى ذلك، سوف ادراج المادة الوراثية الأجنبية إلى الجينوم الفيروسي غالبا ما تؤدي إلى قدرة تكرار تقلص من الفيروس. إذا حدث هذا، ومن المرجح أن يكون غير مستقر وراثيا والهروب المسوخ سوف تنشأ بسرعة أكبر الهدف الرنا الميكروي. إدراج متعددة الرنا الميكروي نسخ الهدف كاليفورنيان أيضا زيادة إمكانية حذف recombinatorial الأهداف الرنا الميكروي. ولذلك، تقرير التجريبية من الحد الأدنى لعدد النسخ المطلوبة لاستهداف كافية ضروري. يمكن إضفاء الطابع المحلي على الهدف نسخ الرنا الميكروي في مواقع مختلفة في جميع أنحاء الجينوم مقابل استخدام يكرر جنبا إلى جنب مساعدة في تجاوز هذه العقبة. ومع ذلك، وتحديد تكوينات RE الأمثل مع الحد الأدنى لعدد النسخ الهدف المطلوبة ومواقع إدراج التي لا تؤدي إلى حركية النسخ المعدلة من الفيروس أمر بالغ الأهمية للتقليل من معدل إعادة التركيب والطفرات الهدف. إدراج عدد كبير جدا من نسخة من تسلسل الهدف قد يزيد أيضا من احتمال سمية بعيدا عن الهدف إذا نتج عنه الرنا الميكروي التشبع. وتغيير كبير في كمية الرنا الميكروي المتاحة لتنظيم البروتينات الخلوية العادية يمكن أن يؤدي إلى آثار غير مرغوب فيها 55. تحقيقا لهذه الغاية، العديد من الفيروسات تغير البيئة الرنا الميكروي ضمن خلية 56 وإذا كان هذايتضمن الرنا الميكروي المستهدفة، قد تكون انخفضت كفاءة التنظيم إذا تم الحفاظ على تكاثر الفيروس بما فيه الكفاية. يمكن معالجة كل هذه المخاوف من خلال تحسين عناصر التكوين استجابة و / أو التعريب ومع فهم شامل للنظام استهدافهم وحدوده.

    مشاكل النموذجية المترافقة مع أساليب الاستهداف الأخرى تشمل بعيدا عن الهدف تخفيف من الفيروس، والقيود حجم المواد استهداف الوراثية في الفيروسات مع قدرات تحمل محدودة، ومخاوف تتعلق بالسلامة المرتبطة الفيروسات الهندسة لاستهداف الخلايا التي عادة ما تكون غير مصابة. الرنا الميكروي الاستهداف يسمح لتنظيم مع الأجسام الفيروسية مع تعديل الحد الأدنى للفيروس. أنها تتطلب الحد الأدنى من الفضاء داخل الجينوم الفيروسي، ويمكن أن تكون مصممة على أساس مجموعة موسعة من التوقيعات الرنا الميكروي الخلوية. هذا الأسلوب لا يدخل tropisms جديدة للفيروس، وبالتالي لا يدخل أي مخاوف تتعلق بالسلامة جديدة. بالإضافة إلى ذلك، وهذاويمكن استخدام طريقة لتنظيم tropisms متعددة في وقت واحد باستخدام تسلسل الهدف لالرنا الميكروية مختلفة متعددة التخصيب داخل أنواع مختلفة من الخلايا 16، 17، 57، 58، 59، 60، 61. كل هذا يمكن أن يتحقق من دون التخفيف من الفيروس في الخلايا التي لا تعبر عن الرنا الميكروية المقابلة، وبالتالي يمكن توفير آلية لتحسين سلامة الفيروسات العلاجية مع تعزيز فاعلية.

    استغلال الآلات الرنا الميكروي الخلوية يمكن أن تستخدم لتنظيم مع الأجسام للعديد من فئات مختلفة من الفيروسات. تم تصميم بروتوكولات مفصلة هنا من أجل إنقاذ وتوصيف فيروسة بيكورناوية المستهدفة الرنا الميكروي، إلا أنها يمكن تكييفها وفقا لفيروس "دورة النسخ المتماثل والجرمية مراسل محددdouts. على الرغم من أن فيروسات مختلفة واستراتيجيات الإنقاذ محددة، يمكن إدراج تسلسل الهدف الرنا الميكروي في الجينوم الفيروسي بغض النظر عن ما إذا كان ترميز الجينوم بأكمله في البلازميد واحد أو ما اذا كان الفيروس لديه DNA أو الحمض النووي الريبي الجينوم. طالما أن الخلايا المنتجة لا تعبر عن الرنا الميكروية وما شابه ذلك، ينبغي أهداف الرنا الميكروي الأمثل لا يعطل الإنقاذ الفيروس. تجارب لتحليل حركية نمو الفيروس والرنا الميكروي استهداف خصوصية يمكن تعديلها عن طريق تغيير النقاط الزمنية التي تم جمعها على أساس طول دورة واحدة من تكاثر الفيروس وعلى قراءات معينة للفيروس تكرار / سمية (مثل البروتينات مراسل والسمية الخلوية، وتحديد الجينوم، وما إلى ذلك). ومن المهم أن نلاحظ أنه على الرغم من هذه التقنية يمكن نظريا أن تطبق على جميع فئات الفيروسات والعديد من العوامل يمكن أن تؤثر على كفاءة هذا الأسلوب. على سبيل المثال، قد فيروسات الحمض النووي الريبي بالمعنى السلبي لم تثبت تستجيب كما فيروسات الحمض النووي الريبي بالمعنى الإيجابي على الأرجح بسبب ميلان محدودcessibility من الحمض النووي الريبي الجيني للأجهزة ميرنا 13. وبالتالي، فإن الخصائص البيولوجية لكل فئة من الفيروسات نقلها قيود إضافية على تحسين الطاقة المتجددة. على الرغم من هذه القيود، فإن هذا الأسلوب يوفر طريقة بديلة لاستهداف الفيروسية مع الأجسام تسهيل البحث التي تنطوي على السلامة، والمرافق، وفهم أساسي من العمليات البيولوجية لجميع الفئات من الفيروسات.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
    Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
    Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
    T4 DNA Ligase System NEB M0202S
    MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
    MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
    0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
    5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
    Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
    Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
    TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
    TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
    0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
    2 ml Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
    Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
    MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
    MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
    Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
    pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional Regulation of the Heterochronic Gene Lin-14 By Lin-4 Mediates Temporal Pattern Formation in C. Elegans. Cell. 75 (5), 855-862 (1993).
    2. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans Heterochronic Gene Lin-4 Encodes Small RNAs With Antisense Complementarity to Lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
    3. Ambros, V. The Functions of Animal MicroRNAs. Nature. 431 (7006), 350-355 (2004).
    4. Bartel, D. P. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
    5. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target Recognition and Regulatory Functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
    6. Benitez, A. A., Spanko, L. A., Bouhaddou, M., Sachs, D., Tenoever, B. R. Engineered Mammalian RNAi Can Elicit Antiviral Protection That Negates the Requirement for the Interferon Response. Cell Rep. 13 (7), 1456-1466 (2015).
    7. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Yalcin, A., Meyer, J., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of Tissue-Specific MicroRNAs From Mouse. Curr Biol. 12 (9), 735-739 (2002).
    8. Landgraf, P., et al. A Mammalian MicroRNA Expression Atlas Based on Small RNA Library Sequencing. Cell. 129 (7), 1401-1414 (2007).
    9. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: Tools for MicroRNA Genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
    10. Kelly, E. J., Russell, S. J. MicroRNAs and the Regulation of Vector Tropism. Mol Ther. 17 (3), 409-416 (2009).
    11. Brown, B. D., Naldini, L. Exploiting and Antagonizing MicroRNA Regulation for Therapeutic and Experimental Applications. Nat Rev Genet. 10 (8), 578-585 (2009).
    12. Tenoever, B. R. RNA Viruses and the Host MicroRNA Machinery. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 169-180 (2013).
    13. Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNAs and Oncolytic Viruses. Curr Opin Virol. 13, 40-48 (2015).
    14. Brown, B. D., Venneri, M. A., Zingale, A., Sergi Sergi, L., Naldini, L., L, Endogenous MicroRNA Regulation Suppresses Transgene Expression in Hematopoietic Lineages and Enables Stable Gene Transfer. Nat Med. 12 (5), 585-591 (2006).
    15. Brown, B. D., et al. A MicroRNA-Regulated Lentiviral Vector Mediates Stable Correction of Hemophilia B Mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
    16. Brown, B. D., et al. Endogenous MicroRNA Can be Broadly Exploited to Regulate Transgene Expression According to Tissue, Lineage and Differentiation State. Nat Biotechnol. 25 (12), 1457-1467 (2007).
    17. Ruiz, A. J., Hadac, E. M., Nace, R. A., Russell, S. J. MicroRNA-Detargeted Mengovirus for Oncolytic Virotherapy. J Virol. 90 (8), 4078-4092 (2016).
    18. Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. Engineering Attenuated Virus Vaccines By Controlling Replication Fidelity. Nat Med. 14 (2), 154-161 (2008).
    19. Barnes, D., Kunitomi, M., Vignuzzi, M., Saksela, K., Andino, R. Harnessing Endogenous MiRNAs to Control Virus Tissue Tropism as a Strategy for Developing Attenuated Virus Vaccines. Cell Host Microbe. 4 (3), 239-248 (2008).
    20. Perez, J. T., Pham, A. M., Lorini, M. H., Chua, M. A., Steel, J., Tenoever, B. R. MicroRNA-Mediated Species-Specific Attenuation of Influenza a Virus. Nat Biotechnol. 27 (6), 572-576 (2009).
    21. Saydaminova, K., et al. Efficient Genome Editing in Hematopoietic Stem Cells With Helper-Dependent Ad5/35 Vectors Expressing Site-Specific Endonucleases Under MicroRNA Regulation. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14057 (2015).
    22. Langlois, R. A., et al. MicroRNA-Based Strategy to Mitigate the Risk of Gain-of-function Influenza Studies. Nat Biotechnol. 31 (9), 844-847 (2013).
    23. Kelly, E. J., Hadac, E. M., Cullen, B. R., Russell, S. J. MicroRNA Antagonism of the Picornaviral Life Cycle: Alternative Mechanisms of Interference. PLoS Pathog. 6 (3), e1000820 (2010).
    24. Pham, A. M., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Replication in Cells of Hematopoietic Origin is Necessary for Dengue Virus Dissemination. PLoS Pathog. 8 (1), 1002465 (2012).
    25. Langlois, R. A., Varble, A., Chua, M. A., García-Sastre, A., Tenoever, B. R. Hematopoietic-Specific Targeting of Influenza a Virus Reveals Replication Requirements for Induction of Antiviral Immune Responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (30), 12117-12122 (2012).
    26. Chua, M. A., Schmid, S., Perez, J. T., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Influenza a Virus Utilizes Suboptimal Splicing to Coordinate the Timing of Infection. Cell Rep. 3 (1), 23-29 (2013).
    27. Griffiths-Jones, S. The MicroRNA Registry. Nucleic Acids Res. 32, D109-D111 (2004).
    28. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: MicroRNA Sequences, Targets and Gene Nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).
    29. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Integrating MicroRNA Annotation and Deep-Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 39, D152-D157 (2011).
    30. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Annotating High Confidence MicroRNAs Using Deep Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 42, D68-D73 (2014).
    31. Heckman, K. L., Pease, L. R. Gene Splicing and Mutagenesis By PCR-Driven Overlap Extension. Nat Protoc. 2 (4), 924-932 (2007).
    32. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. . , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5063/gel-purification (2016).
    33. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Ligation Reactions. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5069/dna-ligation-reactions (2016).
    34. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method (2016).
    35. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA From Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
    36. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
    37. Separation of RNA in Agarose Gels. Sourcebook for Electrophoresis. Lonza. , Available from: http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_BenchGuides_SourceBook_Section_VIII_-_Separation_of_RNA_in_Agarose_Gels.pdf 132-145 (2016).
    38. Kueberuwa, G., Cawood, R., Tedcastle, A., Seymour, L. W. Tissue-Specific Attenuation of Oncolytic Sindbis Virus Without Compromised Genetic Stability. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 154-165 (2014).
    39. Grundhoff, A., Sullivan , C. S. Virus-Encoded MicroRNAs. Virology. 411 (2), 325-343 (2011).
    40. Kincaid, R. P., Sullivan, C. S. Virus-Encoded MicroRNAs: An Overview and a Look to the Future. PLoS Pathog. 8 (12), e1003018 (2012).
    41. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental Strategies for MicroRNA Target Identification. Nucleic Acids Res. 39 (16), 6845-6853 (2011).
    42. Thomson, D. W., Dinger, M. E. Endogenous MicroRNA Sponges: Evidence and Controversy. Nat Rev Genet. 17 (5), 272-283 (2016).
    43. Mullokandov, G., et al. High-Throughput Assessment of MicroRNA Activity and Function Using MicroRNA Sensor and Decoy Libraries. Nat Methods. 9 (8), 840-846 (2012).
    44. Thomson, D. W., et al. Assessing the Gene Regulatory Properties of Argonaute-Bound Small RNAs of Diverse Genomic Origin. Nucleic Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
    45. Wu, S., et al. Multiple MicroRNAs Modulate P21cip1/waf1 Expression By Directly Targeting Its 3' Untranslated Region. Oncogene. 29 (15), 2302-2308 (2010).
    46. Vo, N. K., Dalton, R. P., Liu, N., Olson, E. N., Goodman, R. H. Affinity Purification of MicroRNA-133a With the Cardiac Transcription Factor, Hand2. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19231-19236 (2010).
    47. Arvey, A., Larsson, E., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Target mRNA Abundance Dilutes MicroRNA and siRNA Activity. Mol Syst Biol. 6, 363 (2010).
    48. Garcia, D. M., Baek, D., Shin, C., Bell, G. W., Grimson, A., Bartel, D. P. Weak Seed-Pairing Stability and High Target-Site Abundance Decrease the Proficiency of Lsy-6 and Other MicroRNAs. Nat Struct Mol Biol. 18 (10), 1139-1146 (2011).
    49. Jinek, M., Doudna, J. A. A Three-Dimensional View of the Molecular Machinery of RNA Interference. Nature. 457 (7228), 405-412 (2009).
    50. Pasquinelli, A. E. MicroRNAs and Their Targets: Recognition, Regulation and an Emerging Reciprocal Relationship. Nat Rev Genet. 13 (4), 271-282 (2012).
    51. Finnegan, E. F., Pasquinelli, A. E. MicroRNA Biogenesis: Regulating the Regulators. Crit Rev Biochem Mol Biol. 48 (1), 51-68 (2013).
    52. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of MicroRNA Biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
    53. Zuker, M. Mfold Web Server for Nucleic Acid Folding and Hybridization Prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
    54. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA Secondary Structure Prediction and Analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
    55. Khan, A. A., Betel, D., Miller, M. L., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Transfection of Small RNAs Globally Perturbs Gene Regulation By Endogenous MicroRNAs. Nat Biotechnol. 27 (6), 549-555 (2009).
    56. Skalsky, R. L., Cullen, B. R. Viruses, MicroRNAs, and Host Interactions. Annu Rev Microbiol. 64, 123-141 (2010).
    57. Sugio, K., et al. Enhanced Safety Profiles of the Telomerase-Specific Replication-Competent Adenovirus By Incorporation of Normal Cell-Specific MicroRNA-Targeted Sequences. Clin Cancer Res. 17 (9), 2807-2818 (2011).
    58. Fu, X., Rivera, A., Tao, L., De Geest, B., Zhang, X. Construction of an Oncolytic Herpes Simplex Virus That Precisely Targets Hepatocellular Carcinoma Cells. Mol Ther. 20 (2), 339-346 (2012).
    59. Yao, W., Guo, G., Zhang, Q., Fan, L., Wu, N., Bo, Y. The Application of Multiple MiRNA Response Elements Enables Oncolytic Adenoviruses to Possess Specificity to Glioma Cells. Virology. 458-459, 69-82 (2014).
    60. Bofill-De Ros, X., Gironella, M., Fillat, C. Mir-148a- and Mir-216a-regulated Oncolytic Adenoviruses Targeting Pancreatic Tumors Attenuate Tissue Damage Without Perturbation of MiRNA Activity. Mol Ther. 22 (9), 1665-1677 (2014).
    61. Baertsch, M. A., et al. MicroRNA-Mediated Multi-Tissue Detargeting of Oncolytic Measles Virus. Cancer Gene Ther. 21 (9), 373-380 (2014).

    Tags

    علم المناعة، العدد 120، الرنا الميكروي، الرنا الميكروي الاستهداف، فيروسة بيكورناوية، حال الورم، مع الأجسام والفيروسات، والسمية الخلوية، والنسخ، والتعبير الجيني
    التنظيم القائم على الرنا الميكروي من فيروسة بيكورناوية مع الأجسام
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Ruiz, A. J., Russell, S. J.… More

    Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (120), e55033, doi:10.3791/55033 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter