Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

МикроРНК основе Регулирование пикорнавирусы тропизм

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/55033
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic College of Medicine

Introduction

Развитие широко применимо, простой и эффективный метод для проектирования вектор с ограниченной тропности обеспечивает большие возможности для повышения безопасности, биологическое понимание и терапевтическое применение вирусов. Некоторые механизмы существуют целевой вирусный тропизм включая transductional транскрипционные и трансляционные методов на основе. Тем не менее, эти способы не подходят и для других векторных систем, могут потребовать дефектные сигнальных путей в клетках-мишенях или необходимо введение больших последовательностей, кодирующих в вирусный геном. Кроме того, эти способы могут привести к ослаблению вируса, значительно затрудняет их терапевтическую активность и ограничивает понимание немодифицированной системы.

MicroRNAs небольшие (22-25 нуклеотидов), некодирующие РНК, переносчики генов глушителей в эукариотических клетках. Функция MicroRNAs путем связывания комплементарных последовательностей-мишеней (элементы ответа) в мессенджере РНК (мРНК) resulti нг в транскриптов дестабилизации, деградации или трансляционной репрессии. MicroRNAs обычно связывают элементы отклика с частичной комплементарности и дают небольшие изменения в экспрессии генов , 1, 2, 3, 4, 5. Более существенные изменения в экспрессии генов может быть достигнуто путем увеличения комплементарность элемента отклика 6. Тысячи зрелых микроРНК были идентифицированы в различных видов и многих моделей демонстрируют дифференциальная экспрессия в различных клеточных и тканевых типов 7, 8, 9. Эти сигнатуры микроРНК могут быть использованы для клеток конкретного ограничения амплификации вируса путем включения дополнительных элементов идеально отклика в вирусный геном 10,= "Xref"> 11, 12, 13. Общая цель этой микроРНК-таргетинга техники является контроль тропизм векторного генома без дополнительного ослабления.

Полезность этого метода для регулирования вирусную тропизм первоначально был продемонстрирован в лентивирусов векторов , чтобы ограничить экспрессию трансгена в конкретных тканях 14, 15, 16. Этот метод впоследствии был применен к широкому спектру репликации и не репликации вирусных векторов для усиления генной терапии, а также улучшить профили безопасности многих онколитических вирусов за счет устранения нежелательных токсичностью в нормальных тканях 10, 11, 12, 13, 17 , Он также используется для обеспечения безопасного и еffective живых ослабленных вакцин, а также для улучшения вируса и производства вакцины процессов 18, 19, 20, 21. МикроРНК-ориентации вектора может позволить затухания в вакцинированных хостов или целевых систем при сохранении уровней роста дикого типа в системах производителей. МикроРНК-нацеливание также могут быть использованы для улучшения биологической безопасности вирусов для исследовательских целей путем ограничения передачи у одного вида (например , человека), сохраняя при этом передачу в других хостов 22. И, наконец, микроРНК-таргетинг может позволить глубокий анализ вирусных жизненных циклов и конкретных ролей типов клеток в патогенезе и иммунитета путем выделения вируса рост 23, 24, 25, 26.

Этот метод предлагает альтernative метод, который легко реализуется и применяется таргетинг для всех вирусных систем. Кроме того, постоянно расширяющийся набор зрелых микроРНК с помощью дифференциальных паттернов экспрессии в конкретных типах клеток делает этот метод очень универсальный. МикроРНК основе нацеливание доказала эффективными для различных вирусных систем без ущерба для системной функции. Основные ограничения этого метода включают в себя метод проб и ошибок, оптимизация потенциал для эвакуации мутаций, а также потенциальные эффекты вне цели на эндогенных транскриптов. Тем не менее, эти ограничения как правило, могут быть преодолены с оптимизированным и рациональной конструкции элемента ответа. РНК-вирусы Положительно чувство, как правило, особенно реагирует на микроРНК-ориентации в связи с ориентацией положительным смысле их генома и наличие транскриптов к микроРНК машин во время полного цитоплазматической цикла репликации. Здесь мы опишем протокол для генерации микроРНК-мишенью Пикорнавирус и experimСИХИЧЕСКОЕ методы для проверки эффективности и специфичности , что адресность в лабораторных условиях .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Элементы Клонирование микроРНК Ответ в вирусный геном

  1. Конструкция микроРНК элемент ответа вставки.
    1. Определить нужный микроРНК и соответствующей последовательности-мишени. Несколько баз данных, доступных со зрелыми последовательностей микроРНК. Рекомендовано: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30.
  2. Клон элемент ответа в плазмиду ДНК , кодирующей вектор генома или транскрипт.
    Примечание: Для двух или более элементов ответа от копирования с помощью уникального сайта рестрикции для вставки проще и более универсальным.
    1. Вставьте элемент ответа или уникальный сайт рестрикции с помощью расширения сплайсинга перекрытия (SOE) ПЦР. Этот метод был описан подробно 31.
    2. При использовании сайта рестрикции для вставки, PURгоняться коммерчески синтезированный, СТР-очищенными смысловые и антисмысловые ultramers кодирующие последовательности вставки фланкированные нависающего последовательностей уникального сайта рестрикции (рисунок 2).
    3. Смешайте 0,5 мкг смысловую ultramer, 0,5 мкг антисмысловую ultramer, ДНК буфера для лигирования до конечной концентрации 1х, и доводят до 50 мкл с помощью H 2 O. прокалить ultramers инкубированием реакционной смеси при 85 ° С в течение 10 мин , а затем понижение температуры путем 0,5 ° C каждые 30 сек до реакции достигает 25 ° C.
    4. Смешайте 0,5 мкг вектора ДНК , кодирующей новый уникальный сайт рестрикции, твердофазный буфером до конечной концентрации 1х 1 мкл соответствующего фермента рестрикции, и довести до конечного объема 20 мкл Н 2 O. Digest вектор при 37 ° C в течение 2 часов. Очищают линеаризованной ДНК путем очистки 32 агарозном геле.
    5. Перевязывать отожженые ultramers в переваренной вектор в течение ночи при 16 °; С с использованием 3: 1 ultramers: вектор мольное отношение и стандартные способы лигирования 33.
      Примечание: При использовании одного сайта фермента рестрикции для вставки она может быть более эффективным, чтобы дефосфорилировать концы расщепленного вектора и фосфорилируют концы отожженных олигонуклеотиды.
    6. Преобразовать сшита ДНК в E.coli с использованием метода шоковой тепла 34.
      Примечание: Плазмиды, кодирующие вирусные геномы, как правило, большой, поэтому с помощью компетентных клеток оптимизированными к поглощению больших конструкций ДНК может повысить эффективность трансформации.
    7. Очищают плазмидной ДНК из отдельных колоний с использованием коммерчески доступного набора для очистки 35. Определить соответствующий клон с элементом ответа микроРНК в правильной ориентации (рисунок 2) путем секвенирования области 36 вставки.

2. Спасая микроРНК-мишенью Пикорнавирус сюдам плазмидной ДНК

  1. Спасение микроРНК-мишенью Пикорнавирус в клеточной линии разрешительного для репликации вируса , который не выражает родственного микроРНК (ы). Этот протокол использует ячейки H1-HeLa , потому что они не выражают MIR-142, MIR-124, или MIR-125, однако это не требуется , чтобы использовать клетки Н1-HeLa для спасения.
    ВНИМАНИЕ: Все указания по безопасному обращению и утилизации инфекционных агентов необходимо следовать соответствующим образом.
    1. Клетки Тарелка Н1-HeLa в 6-луночный планшет таким образом, что они составляют ~ 80% сплошности во время трансфекции (24 ч после засева). Пластина клеток в 2 мл на лунку DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки.
    2. Подогреть трансфекцию реагента до комнатной температуры. Смешайте 250 мкл не содержащей сыворотки, 2,5 мкг плазмидной ДНК, кодирующей микроРНК-мишенью генома и 7,5 мкл реагента для трансфекции в стерильной микроцентрифужных трубки и пипетку осторожно перемешать. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 15-30 мин.
    3. Аспирируйтесредства массовой информации из посеянных клеток и добавляют 2 мл свежей полной среды.
    4. Добавьте всю трансфекцию смесь со стадии 2.1.2 в одну лунку 6-луночного планшета по каплям. Добавьте каждую каплю в другую область скважины.
    5. Инкубируйте клетки при 37 ° С до тех пор, цитопатический эффект (ЦПЭ) или репортерные белки не могут быть обнаружены (~ 24-72 ч).
  2. Урожай и прохождение спасенных вируса на свежие клетки.
    1. Пластина клеток в 6-луночный планшет, таким образом, что они составляют 80-90% сплошности во время инфекции (24 ч после засева).
      Примечание: Шкала вверх или вниз, в зависимости от количества вируса, необходимые для всех последующих экспериментов.
    2. Урожай каждый спасение хорошо путем соскабливания клеток в супернатант с помощью скребка каучука клеток или резинового шпателя. Аккуратно переместите скребок через дно колодца. Перенести клетки и надосадочную жидкость в криогенную пробирку для хранения.
    3. Замораживания / оттаивания образцов в два раза, а затем осадить клеточный мусор путемцентрифугирование при 1200 х г в течение 5 мин при 4 ° C.
    4. Фильтр очищенную супернатант дважды с помощью шприца фильтры 0,2 мкм. Отфильтрованный спасательного супернатант содержит вирус.
      Примечание: Фильтр размер пор может изменяться в зависимости от размера частиц вируса и не могут быть применимы для крупных вирусов.
    5. Аспирируйте медиа из посеянных клеток, мыть один раз с бессывороточной средой и добавляют 1 мл свежей сыворотки среды в каждую лунку.
    6. Добавляют 50 мкл на лунку фильтрованной спасательного супернатанта и осторожно встряхните пластину, чтобы равномерно распределить вирус.
    7. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 2 ч, а затем аспирата средств массовой информации из каждой лунки для удаления неинкорпорированную вируса.
    8. Добавить 1.5-2 мл свежей полной среды на лунку и инкубировали при 37 ° С до СРЕ или репортерные белки не являются очевидными (~ 24-48 ч).
    9. Повторите шаги 2.2.2 2.2.4. Отфильтрованный спасательного супернатант содержит вирусный. запасы вируса Хранить в одноразовых аликвоты в криогенных труб для хранения при -80 °C.

3. Спасая микроРНК-мишенью вируса от In Vitro транскрибируется РНК - транскриптов

  1. Генерирование РНК-транскриптов из ДНК плазмиды, кодирующие микроРНК-мишенью вирусного генома с использованием восходящего потока промотор.
    Примечание: Стандартные методы для создания и поддержания нуклеазы без среды следует использовать для всех последующих шагов.
  2. Линеаризуем ДНК плазмиды с использованием сайта рестрикции фермента ниже по течению стенограммы. Объединить плазмидной ДНК 5 мкг, 1x буфер окончательной концентрации фермента, 3 мкл фермента рестрикции и доводят до 50 мкл с помощью H 2 O. Инкубируйте реакционную смесь при температуре 37 ° С в течение 3 часов.
  3. Добавьте 1/20 объема 0,5 М ЭДТА, 1/10 - й том 5 М NH 4 ацетат и 2 объема 100% этанола, переваренной реакции и перемешать. Инкубируйте при -20 ° С в течение 1 ч до ночи.
  4. Гранул осажденный ДНК в течение 10 мин при 17000 х г при 4 ° С. Слейте supernataнт, ресуспендируют осадок в 500 мкл холодного 70% -ного этанола и осадить ДНК центрифугированием при 17000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
  5. Слейте супернатант и центрифуга снова в течение 30 сек. Удалите остаточный супернатант с пипеткой и воздушно-сухой осадок. Ресуспендируют осадок ДНК в стерильной нуклеазы без H 2 O в концентрации 0,5-1 мкг / мкл.
  6. Оттепель в пробирке транскрипции реагентов при комнатной температуре и поместить Рибонуклеотиды на льду (ферменты в глицерине не замерзают и должны идти непосредственно на льду). Хранить буфер реакционной смеси при комнатной температуре.
  7. Собирают реакции транскрипции в ПЦР-пробирку путем объединения 2 мкл каждого из АТФ, CTP, GTP и UTP решений, 2 мкл 10х буфера для реакции, 1 мкг линеаризуется ДНК, 2 мкл фермента, и довести до конечного объема 20 мкл с помощью нуклеазы -бесплатно H 2 O.
  8. Инкубируют реакционную смесь при температуре 37 ° С в течение 2 часов.
  9. Очищают РНК - транскриптов.
  10. Доведите реакции транскрипции до 100 мкл раствора для элюции (не-предварительно нагретую). Добавьте 350 мкл связывающего раствора концентрата и 250 мкл 100% этанола реакции и перемешивают.
  11. Переноса образца в фильтровальный патрон вставлен в пробирку и центрифугируют в течение 1 мин при 12000 х г. Выбросьте проточные.
  12. Добавьте 500 мкл промывочного раствора в фильтрующем элементе и центрифугировать в течение 1 мин при 12000 х г. Выбросить проскок. Повторите этот шаг мыть еще один раз. Выбросить проскок. Центрифуга в течение 1 мин при 12,0000 XG для удаления остаточного этанола.
  13. Перенести фильтрующий картридж в чистую пробирку для сбора и добавляют 50 мкл предварительно нагретого раствора элюции в фильтрующем элементе. Центрифуга в течение 1 мин при 12000 х г. Повторите этот шаг, элюирования при общем объеме 100 мкл элюента продAining очищенные РНК-транскрипты. Выбросите фильтр-картридж.
  • Определить концентрацию РНК в качестве элюента путем измерения оптической плотности образца при 260 и 280 нм и с использованием закона Ламберта-Бера.
  • Провести оценку целостности РНК с использованием гель - электрофореза РНК 37. Смотрите рисунок 3 для примеров хорошей и плохой целостности РНК. РНК должна быть аликвоты в одноразовых пробирки и хранили при -80 ° C для поддержания целостности.
  • Теплые трансфекцией реагенты до комнатной температуры. Смешайте 250 мкл не содержащей сыворотки среды, 2,5 мкг очищенного РНК-транскриптов, 5 мкл раствора бустерного и 5 мкл реагента для трансфекции в стерильной микроцентрифужных трубки и пипетку осторожно перемешать. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 2-5 мин.
  • Клетки Тарелка Н1-HeLa в 6-луночный планшет таким образом, что они составляют ~ 80% сплошности во время трансфекции (24 ч после засева). Пластина клеток в 2 мл на лунку DMEM с добавлением 10% FETаль бычьей сыворотки.
  • Аспирируйте носители из посеянных клеток и добавляют 2 мл свежей полной среды.
  • Добавьте всю трансфекцию смесь из стадии 3.12 в одну лунку 6-луночного планшета по каплям. Добавьте каждую каплю в другую область скважины.
  • Инкубируйте клетки при 37 ° С до тех пор, цитопатический эффект (ЦПЭ) или репортерные белки не могут быть обнаружены (~ 24-72 ч).
  • Продолжить спасение микроРНК-мишенью вируса, как описано в пунктах 2.2 2.2.9.

    • 4. Титрование запасов вируса путем расчета 50% тканевых культур инфекционная доза (TCID 50)

    1. Пластина Н1-HeLa клеток в 96-луночный планшет при 10 4 клеток на лунку в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение ночи.
      Примечание: Titrate вирус в клетках разрешающих для репликации вируса, которые не выражают родственные микроРНК.
    2. Сделать 10-кратные серийные разведения вируса каждый в общем объеме 1 мл не содержащей сывороткиСМИ.
      Примечание: Используйте более низкие разведения, если требуется большая точность.
      Примечание: Изменение советы после каждого разведения, чтобы предотвратить завышение титр, как вирус может придерживаться советов.
    3. Совет 96-луночного планшета с боковой и аспирата СМИ из посеянных клеток HeLa. Добавьте 100 мкл каждого вируса разведения в каждую лунку до 8 лунок 96-луночного планшета (1 строка на разведение). Добавьте 100 мкл сыворотки среды без вируса в строке 1 и ряд 12 на пластине для элементов управления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда аспирата и добавлять носители в лунки, прикоснувшись кончиком в сторону хорошо, чтобы предотвратить открепления клеток.
    4. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 2 часов. Совет пластины в сторону и аспирата СМИ из лунок.
      Примечание: Изменить советы между каждым из разведения строки.
    5. Добавьте 100 мкл полной среды в каждую лунку. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 72 ч.
    6. Визуализируйте лунки под микроскопом и отметьте каждую лунку положительным или отрицательным для CPE.
    7. Вычислить каждый титра вируса с помощью следующего уравнения: Loг 10 (TCID 50 / мл) = L + D (S-0,5) + log 10 (1 / V). L является отрицательный логарифм 10 наиболее концентрированного вируса разбавления испытанной , в котором все скважины являются положительными. D представляет собой логарифм 10 коэффициента разбавления. S является суммой индивидуальных пропорций (PI). пи является расчетная доля индивидуального разведения (количество положительных лунок / общего количества скважин на разведение. V является объем посевного материала (мл / лунку).

    Таблица 1
    Таблица 1: Количественная инфекционных вирусных частиц путем расчета TCID 50. Типичные результаты клеток, инфицированных серии из десяти-кратных разведений вирусного запаса. "L" приравнивает до 4 , поскольку последнее разведение , где все скважины являются позитивными для CPE составляет 10 -4. "D" представляет собой логарифм 10 из 10 , так как 10-кратном разбавлениибыли использованы и, следовательно, равен 1. "S" является суммой индивидуальных пропорций. В этом примере отдельные пропорции 1,0, 0,875, 0,375, 0,125 и 0. Сумма этих (S) является 2,375. "В" есть объем посевного материала в мл используют для инфицирования клеток на начальном этапе.

    5. Оценка микроРНК нацеливания Эффективность: Кинетика Пошаговый Growth

    1. Элементы управления для этого анализа включают имитировали-инфицированные клетки, неизмененный вирус и вирус, содержащие нецелевой или нефункциональные элемент ответа.
    2. Пластинчатые Н1-HeLa клетки для курса эксперимента по времени в 12-луночных культуральных планшетах таким образом, что они составляют 80-90% сплошности во время инфекции (24 ч после засева). Пластина клеток в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки в количестве 1 мл на лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется к пластине отдельной пластины для каждой временной точки. Этот протокол использует 7 различных моментов времени для вируса с циклом репликации 8-12 ч. клетки Н1-HeLa не требуется, чтобы выполнить этоssay. Этот анализ должен проводиться в разрешающих клетках, которые не выражают целевые микроРНК. Этот анализ также может быть выполнена в клетках, экспрессирующих родственного микроРНК для оценки кинетики роста под селективным давлением.
    3. Аспирируйте средств массовой информации из скважин. Промыть лунки, добавляя 0,5 мл бессывороточной среды в каждую лунку, вихрем тарелку, и аспирировать носитель из скважин. Добавить 0,5 мл свежей сыворотки среды в каждую лунку.
    4. Заражайте каждую лунку при высокой множественности инфекции (MOI; количество инфекционных частиц на клетку) , чтобы гарантировать , что все клетки получают зараженными. Этот протокол использует МВД 3.
      1. Развести запасами вируса в бессывороточной среде до концентрации MOI = 3 на 100 мкл. Добавьте 100 мкл вируса разбавлением каждый до семи различных скважин и инкубировать при 37 ° С в течение 2 ч.
      2. Аспирируйте СМИ из всех лунок и промыть два раза, добавляя 0,5 мл полной среды на лунку, качалки мягко и затем аспирационных.
    5. Добавить 1 мл Complete средств массовой информации в каждую лунку и не инкубировать при 37 ° С до желаемого момента времени.
    6. Сбор образцов для титрования вируса на 2, 4, 6, 8, 10, 24 и 48 ч после инфицирования (1 лунка на временную точку). Передача 700 мкл средств массовой информации в скважине до криогенной трубки хранения. Наскребать клетки в оставшейся надосадочной жидкости, осторожно двигая резиновым скребком по всей скважине. Передача клеток / надосадочную смесь до соответствующей криогенной трубки хранения, содержащую 700 мкл надосадочной жидкости.
      Примечание: Убедитесь, чтобы не выплеснуть супернатанта из одной ямы в другую во время выскабливание в результате загрязненных образцов. Передача 700 мкл до начала выскабливание минимизирует разбрызгивание.
    7. Место образцы при -80 ° С, пока не будут собраны все образцы.
    8. Замораживанию / Образцы три раза и удаления остатков клеток путем центрифугирования образцов при 1200 х г в течение 5 мин при 4 ° C.
    9. Titrate вирус, как описано в разделе 4 и сравнить кинетики роста через тIME.

    6. Оценка микроРНК таргетирования Специфичность: Вирус распространяющихся Пробирной с использованием синтетических микроРНК мимику

    Примечание: Использование синтетического микроРНК мнемосхемы выполняется, чтобы показать специфичность микроРНК: микроРНК-мишень взаимодействия.

    1. Включите макет трансфекцию, отрицательные микроРНК управления имитируют и экспериментальные микроРНК имитировать контролирует только для каждого анализа для оценки токсичности микроРНК-опосредованной. Он также идеально подходит для включения положительного контроля (т.е. микроРНК-гена - мишени или генома) , как низкую эффективность трансфекции микроРНК мимика может привести к ложным негативов.
    2. Пластина Н1-HeLa клеток в 96-луночный планшет для тканевых культур с таким образом, что они составляют 80-90% сплошности во время трансфекции (24 ч после засева). Пластина клеток в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки в количестве 0,1 мл на лунку.
      Примечание: Выполнение этого анализа в клетках разрешающих для репликации вируса, которые не выражают родственного микроРНК.
    3. Теплый йе трансфекции реагенты до комнатной температуры. Объединить 9 мкл сыворотки среды, 200 нм конечной концентрации на лунку микроРНК мимической акций, 0,18 мкл реагента наддува, реагента для трансфекции 0,18 мкл и перемешать. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 2-5 мин.
      Примечание: Объемы указаны за лунку. Рекомендуется, чтобы мастер микс быть собраны для трансфекции всех скважин для поддержания согласованности и минимизации ошибки пипетирования. Оптимальная концентрация микроРНК имитатор будет меняться. Обратитесь к инструкции производителя, сопровождающие микроРНК имитировать в течение разумного исходной концентрации. Это, как правило, в диапазоне от 5-200 нМ конечной концентрации.
    4. Аспирируйте носитель из лунок и добавить 92 мкл свежей полной среды.
      Примечание: Если имеется значительное количество проб, выполнить этот шаг перед сборкой раствора Трансфекция и не хранить пластины при температуре 37 ° С до готовности.
    5. Добавить всю смесь I трансфекцияп шаг 6.3 к клеткам по каплям.
    6. Инкубируют при 37 ° С в течение 6 часов.
    7. Заражайте каждую лунку при низкой MOI , чтобы обеспечить низкий процент клеток заражаются , чтобы позволить анализ распространения вируса. Этот протокол использует MOI 0,2.
      1. Развести запасами вируса в бессывороточной среде до концентрации MOI = 0,2 на 100 мкл. Удалить материал из лунок и добавляют 100 мкл вируса разведения в каждую лунку.
      2. Инкубируют при 37 ° С в течение 2 ч.
    8. Аспирируйте СМИ из каждой лунки и добавляют 100 мкл свежей полной среды.
    9. Инкубируют при 37 ° С в течение 20-22 ч.
    10. Определение вирусов в титрованием супернатанта.
      1. Собирают супернатант из каждой лунки и заменить 100 мкл свежей полной среды.
        Примечание: При использовании суспензии клеток, ресуспендируют осадок клеток из следующего шага в 100 мкл свежей полной среды и вернуться к хорошо образец для жизнеспособности анализа.
      2. Удалить CelluLAR мусор из собранных супернатантов центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
      3. Передача очищенную супернатант в новую пробирку и титруют инфекционного вируса на разрешающих клетках, которые не выражают родственного микроРНК, как описано в разделе 4.
        Примечание: Храните все образцы на льду, чтобы предотвратить потерю инфекционности.
    11. Определение жизнеспособности клеток.
      1. Добавьте 10 мкл МТТ (3- (4,5-диметилтиазолил-2) -2,5-дифенилтетразолийбромид) реагента на каждую лунку.
      2. Инкубируют при 37 ° С в течение 2-4 ч до тех пор, фиолетовый осадок не видно.
      3. Добавьте 100 мкл реагента для моющего средства.
      4. Инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 2 ч.
      5. Измерить оптическую плотность во всех лунках при длине волны 570 нм.
        Примечание: Нормализовать все образцы издеваться трансфицированных клеток для сравнения жизнеспособности клеток процента.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    В таблице 1 представлены результаты , типичные для анализа для титрования в пикорнавирусами и описывает , как вычислить 50% тканевой культуры инфекционную дозу. Схематическое представление общей концепции микроРНК основе регуляции вирусной тропизм , описанной в этой рукописи, показан на рисунке 1. Ориентацию микроРНК к элементу ответа во внутриклеточных взаимодействий, правильной конструкции элемент ответа олигонуклеотиды для отжига и плазмидной вставки, и карта плазмиды ДНК , кодирующей микроРНК-мишенью вирусного генома для транскрипции в пробирке изображен на рисунке 2. на рисунке 3 показана РНК - транскриптов в различной степени целостности визуализированы с помощью электрофореза в агарозном геле. Правильное обращение и использование ДНК шаблонов лишена примесей будет приводить к должным образом расшифрованных РНК-транскриптов, как показано на 3А полосе 2. Остаточные примеси в Lineaавторизованном шаблоны ДНК или следовые количества нуклеазы может привести к низким уровням неправильно транскрибируется РНК и / или продуктов разложения аналогичный наблюдаемому в 3А полосе 3. Неполное линеаризация плазмидной ДНК или ДНК, содержащей большое количество примесей, таких как остаточный этанол приведет несобственные транскрипции и продукты деградации , представленные в 3A полос 4 и 5. 3 также показывает изображение Mengovirus-опосредованных цитопатического эффекта (СРЕ) после трансфекции чистых РНК - транскриптов. На рисунке 4 представлены данные , представляющие курса эксперимента время на оценку кинетики роста неизмененном и микроРНК-мишенью Mengovirus. Результаты показывают, что элементы ответа микроРНК сконструированные в геном Mengovirus не изменяют кинетику репликации вируса в клетках Н1-HeLa, которые не выражают никакого родственного микроРНК. Тем не менее, в RAW 264.7 макрофагов, которые выражают промежуточные уровни микроРНК-125 и высокие уровни микроРНК-142, вирусы, кодирующие соответствующие элементы отклика дисплея запрещенные кинетики репликации, что коррелирует с уровнем микроРНК выраженным. Данные на рисунке 5 показана специфичность микроРНК на основе регулирования Mengovirus тропности. Сверхэкспрессия каждого отдельного микроРНК в клетках H1-HeLa специфически ингибирует размножение (нижний титр вируса) и цитотоксичности (повышение жизнеспособности клеток) Mengovirus кодирующий родственный элемент ответа микроРНК.

    Рисунок 1
    Рисунок 1: Схематическое представление микроРНК на основе регуляции вирусного тропизма. Элементы ответа микроРНК (RE), включенному в вирусный геном будет признан родственными микроРНК, обогащенных в конкретных типах клеток и приводят к целенаправленной деструкции вирусных транскриптов / геномах. Это позволит предотвратить репликацию вируса, распространение и токсичность по отношению к йе окружающие клетки. Тем не менее, вирусная репликация будет поддерживаться в клетках, которые не экспрессируют родственного микроРНК, допускающие размножения вируса, распространения и гибели клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    фигура 2
    Рисунок 2: микроРНК элемент дизайна ответа. (A) Для успешной ориентации последовательность региона семенем RE должно быть идеально дополняют друг друга. RE должен быть ориентирован в геном вируса таким образом, что он может быть распознан родственного зрелой микроРНК в транскриптов мРНК и / или вирусного генома. Большинство УЭ размещаются в пределах UTR 3'-транскриптов. (B) Живописание надлежащим образом спроектированных и отожженных олигонуклеотиды , кодирующие УЭ , содержащие тандемповторы микроРНК-последовательностей-мишеней (Мирт), фланкированных нависающими нуклеотидов сайта фермента рестрикции XhoI. При проектировании тандемных повторов УЭ, не забудьте включить распорные нуклеотиды (обычно 4-6) между микроРНК-целевой копии. (C) плазмидной ДНК , кодирующей полноразмерную вирусный геном с RE включены в 3 'UTR, Т7 промотор и уникальный сайт рестрикции для линеаризации для транскрипции в пробирке. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 3
    Рисунок 3: Спасение вируса из генома , кодирующих РНК - транскриптов. Гель - электрофорез (А) РНК в пробирке транскрибируемых РНК , кодирующих Пикорнавирус геномов для оценки целостности транскриптов. полоса дороги 1: РНК лестницы. Дорожка 2: Правильно транскрибируются РНК с высокой целостности. Дорожка 3: РНК-транскрипты с умеренной целостности. Более высокая полоса правильный размер и нижняя полоса потенциально является продуктом разложения или нежелательная РНК-транскрипт. Дорожка 4: неправомерное транскрипции РНК. Полоса 5: Низкая РНК целостности. 500 нг в пробирке транскрипции РНК была загружена на лунку. Неправильное или транскрипционные продукты разложения, вероятно, из-за использования низкой чистоты или неполностью линеаризованной ДНК. (Б) Изображение фиктивных трансфицированных клеток Н1-HeLa и клетки , трансфицированные РНК - транскриптов , кодирующих Mengovirus. Введение реагентов трансфекции только (Mock) будет поддерживать жизнеспособность клеток после трансфекции, а также проход на свежие клетки. Трансфекция РНК - транскриптов , кодирующих геном Mengovirus (ВМУ 24) приводит к цитопатического эффекта, которые поддерживаются следующие фильтрацию надосадочной жидкости и проход на свежие клетки Н1-HeLa. Шкала бар = 100 мкм.ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 4
    Рисунок 4: Кинетика роста немодифицированных и микроРНК-мишенью Mengoviruses в присутствии или в отсутствие родственными микроРНК. Модифицированный из ссылки 17. (A) H1-HeLa клетки не экспрессируют MIR-124, -125, -142 или. Все три Mengovirus кодирования микроРНК УЭ репликацию с одинаковой кинетикой как немодифицированного вируса (ВМУ 24) , что указывает вставку из микроРНК в этом месте (5 'UTR) не изменяют репликацию вируса. (B) RAW 264.7 макрофагах выражают промежуточные уровни микроРНК-125b и высокие уровни микроРНК-142-3p, но не выражают MIR-124. Включение соответствующих микроРНК-последовательностей-мишеней в результаты генома вируса ATTenuation в соответствии с уровнем экспрессии микроРНК. Данные представлены в виде средних титров вируса +/- SD. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 5
    Рисунок 5: Анализ микроРНК-таргетинга специфичности с использованием синтетических микроРНК мимику. Модифицированный из ссылки 17. H1-HeLa клетки , трансфицированные с индивидуальными мимике микроРНК были заражены вирусом неизмененном (VMC 24) или микроРНК-мишенью вируса (Мирт-VMC 24) при MOI 0,2. (А) жизнеспособность клеток нормированы на макетных обработке клеток подсчитывалось через 24 ч после инфекции с помощью МТТ - анализа клеточной пролиферации. (Б) титр Вирус в надосадочной жидкости всех проб также определ ли через 24 часа после инфицирования.Данные представлены в виде среднего значения жизнеспособности или вирусного титра +/- SD. Два хвостами непарный Стьюдента тесты с коррекцией Уэлша (для неравных дисперсий) были использованы для статистического анализа. Значение р <0,01 считается значительным. (**, Р <0,01, *** р <0,001). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Конструкция, состав и локализация элементов отклика микроРНК внутри вирусного генома будет диктовать нацеливание эффективность и специфичность. Оптимизация этих потребует метода проб и ошибок. Тем не менее, рациональный дизайн на основе РНК - структурного анализа и предыдущих исследований вирусной репликации и микроРНК подписей помогает в реализации этой методики с минимальной оптимизации 10, 11, 12, 13, 38.

    При инициировании разработки УЭ, исследователи должны начать с составления набора микроРНК, которые выражаются в клетках-мишенях, представляющих интерес, уменьшаются в нецелевых клетках, представляющих интерес, и которые были экспериментально подтверждены. После этой компиляции, несколько анализов прогнозирования на основе должны проводиться для решения возможности конкурирующего микроРНК-щитомт взаимодействий. Многие вирусы кодируют микроРНК или некодирующей РНК, которые секвестрацию клеточные микроРНК с целью манипулирования вируса и хозяина экспрессии генов. Кроме того, несколько РНК - вирусы , как было показано, взаимодействуют с клеточными микроРНК с целью повышения их потенциала репликации 39, 40. Поэтому при проектировании УЭ, обязательно исследовать вопрос о том, известны взаимодействия вируса с клеточными микроРНК или если они выражают вирусные микроРНК, которые потенциально могут распознать выбранную цель микроРНК или изменить эндогенную экспрессию выбранного микроРНК. В дополнение к литературных поисков, читатель должен рассмотреть онлайн-инструментов прогнозирования биоинформатики и баз данных, которые включают вирусный целевой микроРНК информацию для оказания помощи в рациональной конструкции УЭ. Такие базы данных и инструменты прогнозирования могут также способствовать выявлению целевых последовательностей, которые могут быть признаны несколькими микроРНК или перекрывающихся последовательностей семян предусилителя посланный в вирусный геном. Для более углубленного обсуждения по методам идентификации целей микроРНК и плюсы и минусы некоторых онлайновых инструментов прогнозирования отсылаем читателя к ссылкам 41, 42. Рекомендуется, чтобы эти инструменты прогнозирования служат только в качестве руководства, как много раз предсказания могут давать ложных срабатываний или негативов. С этой целью могут быть семенных последовательности, которые перекрывают друг друга, однако 3'-конец из микроРНК также будет влиять на эффективность таргетирования. Использование слишком строгих правил набора иногда может быть вредным.

    После того, как набор потенциальных мишеней микроРНК были выявлены, исследователь должен продолжить путем ранжирования целей на основе биологических свойств микроРНК и РНК структурных предсказаний 10, 11, 12, 13,эф "> 38. Абсолютное изобилие зрелой микроРНК в клетках - мишенях и уровень его ассоциации с белком Argonaute будет определять степень молчанием генов. Несколько исследований показали , что только в большом количестве экспрессируется микроРНК значительно регулировать экспрессию генов 16, 43, 44. Кроме того, в то время как некоторые микроРНК обильно выразили свое взаимодействие с Argonaute белками и формированием РНЦ недостаточно для подавления перевода 44. Используя весьма обильную микроРНК с проверенными функцией также минимизирует потенциал для насыщения микроРНК в клетке - мишени и последующего OFF- целевые токсичностью. Другой подход может заключаться в использовании УЭ, которые ориентированы несколькими микроРНК 45, 46, которые могли бы позволить для уменьшенного числа копий при этом сводя к минимуму возможности для офф-мишени toxicitiэс. Отношение мРНК-мишени для микроРНК также будет оказывать значительное влияние на успех такого подхода. Высокая цель соотношение микроРНК позволит снизить уровень репрессий 42, 43, 47, 48. Это особенно важно с вирусами, которые копируют быстро, когда при неправильном регулируется на ранних стадиях инфекции будет накапливаться до уровней, не зависящим от эндогенных микроРНК. Необходимо учитывать эти свойства при выборе микроРНК для таргетинга; В идеале, с помощью микроРНК, функция была экспериментально подтверждена.

    Эффективность целевого молчанием генов также влияет на процент комплементарности мишени до зрелой микроРНК, а также количество копий микроРНК-последовательностей-мишеней, вставленных. 5 'область микроРНК (нуклеотиды 2-8) представляет собой последовательность семян. Принято считать,что этот регион должен быть идеально дополняют друг друга для успешного нацеливания 48, 49. Большинство исследований используют элементы отклика с совершенной комплементарности, поскольку она может увеличить генно-заглушающие активность путем содействия эндонуклеолитического расщепление транскрипта и быстрое повторное использование микроРНК. Это эндонуклеолитического расщепление происходит только тогда, когда микроРНК взаимодействует с белком Argonaute, который имеет эндонуклеолитического активность, которая в клетках млекопитающих ограничивается Argonaute-2. Другие белки Argonaute способствуют деградации мРНК деаденилирование и экзонуклеолитической атаки транскрипта. Мы отсылаем читателя к ссылкам 4, 5, 13, 50, 51, 52 для описания углубленного микроРНК биогенеза и функции. Обычно считается, что INCRослабление числа копий будет способствовать дальнейшему повышению эффективности таргетирования. Тем не менее, это также может потенцировать микроРНК насыщения и не всегда оказывались более эффективными. Иногда лучше включать последовательности-мишени для нескольких различных микроРНК, обогащенных в клетках-мишенях или использовать целевые последовательности, которые распознаются несколькими микроРНК. Количество копий требуется также сильно зависит от количества транскрипта, который будет нуждаться в глушителей и относительного содержания микроРНК в клетках-мишенях. Стенограммы, которые будут накапливаться быстро может потребовать большего количества копий, чтобы предотвратить их outcompeting уровни микроРНК. Экспериментально определение оптимального количества копий для каждой мишени микроРНК, что приводит к достаточно адресности, поддерживает вирусную пригодность, и что сводит к минимуму скорости выхода мутаций рекомендуется.

    Локализация элемента отклика микроРНК в вирусный геном является чрезвычайно важным. Отрицательный результат при анализеэффективность ориентации не всегда означает, что вирус не может быть микроРНК-мишенью. Это может просто означать, цель не доступна в этом месте или, что подавление гена-мишени не является достаточным для ингибирования патогенность. Большинство элементов реагирования вставлены в 3 'нетранслируемые области (UTR) от целевого транскрипта. Тем не менее, успешное нацеливание вирусных геномов было достигнуто , а иногда проявляет повышенную генетическую стабильность , когда элементы ответа вставляются в УТР 5 'или в пределах кодирующих областей существенных генов 38. Оптимальные участки вставки позволит высокую доступность последовательности-мишени микроРНК. Доступность может быть затруднено вторичных структур РНК и стехиометрического интерференции. Поэтому, локализующих элементы ответа в неструктурированных регионах, которые высоко консервативны является хорошей отправной точкой. Последовательности вставляются также могут влиять и быть под влиянием окружающих последовательностей. THUS, оптимальное место для одной микроРНК целевой последовательности не обязательно оптимальным для других элементов реагирования. В то время как экспериментальная проверка и оптимизация локализации RE необходимо, используя программное обеспечение прогнозирования (например, http://unafold.rna.albany.edu/; http://rna.urmc.rochester.edu/software.html) для скрининга потенциальных участков вставки для возмущения окружающих структур РНК настоятельно рекомендуется 53, 54.

    Использование чистых препаратов нуклеиновых кислот высокой целостности также имеет важное значение для получения наилучших результатов. Асептики и содержание РНКазы свободной среды при обращении с РНК-транскриптов или микроРНК мимику имеет важное значение. Для достижения наилучших результатов транскриптов РНК, микроРНК мимика, и конечные титровать запасы вируса должны храниться при температуре -80 ° C в виде небольших аликвот, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания, что приводит к деградации РНК и потери вируса инфекционности. При использовании, эти реагентs должны храниться на льду во все времена.

    Важно отметить, что многие микроРНК являются членами семейства микроРНК, которые разделяют взаимодополняемость. Поэтому при проведении исследований может оказаться полезным включить членов семьи немедленного микроРНК для улучшения оценки ориентации специфичности. Это становится критической , когда клетки в пределах которого желательно репликации вируса, выразить членов семьи (например , семейства микроРНК-let7). Следует также отметить , что специфичность анализа с использованием микроРНК мимику является искусственной системы и избыточная экспрессия микроРНК в некоторых клетках может привести к офф-целевых эффектов 55. Если это происходит, специфичность может быть также оценена в клетках, которые экспрессируют соответствующие микроРНК с использованием ингибиторов микроРНК вместо. Этот анализ позволил бы анализ таргетирования специфичности на основе титрования вируса и жизнеспособность клеток считываниями в присутствии физиологически соответствующих уровней микроРНК.

    10, 11, 12, 13. Многие вирусы обладают высокой частоты мутаций и ускользающих мутантов могут возникнуть быстро. В том числе несколько копий последовательности-мишени, в том числе цели для более чем одного микроРНК, локализовать цели в пределах нескольких высоко консервативных регионов, или наличие дополнительных противовирусных факторов, включая иммунный ответ может облегчить это. Кроме того, введение чужеродного генетического материала в геном вируса часто приводят к снижению способности репликации вируса. Если это происходит, то цель микроРНК, вероятно, будет генетически нестабильна и ускользающих мутантов будут возникать более быстро. Включение множественных копий микроРНК целевых окп также увеличить потенциал для удаления recombinatorial мишеней микроРНК. Таким образом, экспериментальное определение минимального числа копий, необходимого для достаточного нацеливания необходимо. Локализации микроРНК целевых копий в различных местах по всему геному по сравнению с использованием тандемных повторов может помочь в обход этого ограничения. Тем не менее, определение оптимальных конфигураций RE с минимальным количеством целевых копий, необходимых для вставки и сайтов, которые не приводят к измененной кинетики репликации вируса имеет решающее значение для минимизации скорости рекомбинации и целевой мутации. Включение слишком большого количества копий последовательности-мишени может также увеличить потенциал для офф-мишени токсичностью, если это приводит к микроРНК насыщения. Основным изменением в количестве микроРНК доступного для регулирования нормальных клеточных белков может привести к нежелательным эффектам 55. С этой целью многие вирусы изменяют окружающую среду микроРНК в ячейке 56 , и если этотвключает в себя целевой микроРНК, эффективность регулирования может быть уменьшена, если достаточно репликации вируса сохраняется. Все эти проблемы могут быть решены за счет оптимизации реакции элементного состава и / или локализации и с глубоким пониманием системы мишенью и ее ограничений.

    Типичные проблемы, связанные с другими методами таргетинга включают в себя вне цели ослабления вируса, ограничения размера для генетического материала адресности вирусов с ограниченными возможностями, несущими и проблем безопасности, связанных с инженерными вирусов в клетки-мишени, которые обычно не инфицированы. МикроРНК-нацеливание позволяет регуляции вирусного тропизма с минимальной модификацией вируса. Это требует минимального пространства в вирусный геном и может быть адаптирована основанный на экспансивной массив клеточных подписей микроРНК. Этот метод не вводит новые тропизмами для вируса и, следовательно, не вносит каких-либо новых проблем безопасности. Кроме того, этотМетод может быть использован для регулирования нескольких тропизмами одновременно с использованием последовательностей - мишеней для нескольких различных микроРНК , обогащенных в различных типах клеток , 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61. Все это может быть достигнуто без ослабления вируса в клетках, которые не экспрессируют соответствующие микроРНК и, следовательно, может обеспечить механизм для повышения безопасности терапевтических вирусов с повышенной активностью.

    Эксплуатация сотовой техники микроРНК может быть использован для регулирования тропизм многих различных классов вирусов. Подробно изложенные здесь протоколы предназначены для аварийно-спасательных и характеристике микроРНК-мишенью пикорнавирусами, однако они могут быть адаптированы в соответствии с вирусом "цикла репликации и конкретного репортер REAdouts. Хотя различные вирусы имеют специфические стратегии спасательных работ, микроРНК последовательности-мишени могут быть введены в геном вируса, независимо от того, закодирована весь геном в одной плазмиде или является ли вирус имеет ДНК или РНК-геном. До тех пор, как производитель клетки не выражают родственного микроРНК, оптимизированные цели микроРНК не должны нарушать вирус спасения. Эксперименты для анализа кинетики роста вируса и микроРНК таргетирования специфичность может быть изменена путем изменения моментов времени , собранных на основе длины одного цикла репликации вируса и на конкретных считываниями для репликации вируса / токсичности (например , белки репортер, цитотоксичности, геном количественной оценки, и т.д.). Важно отметить, что, хотя этот метод теоретически может быть применен ко всем классам вирусов, многие факторы могут влиять на эффективность этого метода. Например, РНК-вирусы отрицательного смысла, не доказано, как реагировать, как РНК-вирусов с положительной вероятностью смысле из-за ограниченного переменного токаcessibility геномной РНК в микроРНК машин 13. Таким образом, биологические свойства каждого класса вирусов будут распространять дополнительные ограничения по оптимизации RE. Несмотря на эти ограничения, этот метод предлагает альтернативный способ ориентации вирусного тропизма содействия научным исследованиям с участием безопасности, полезности, а также базовое понимание биологических процессов для всех классов вирусов.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
    Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
    Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
    T4 DNA Ligase System NEB M0202S
    MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
    MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
    0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
    5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
    Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
    Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
    TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
    TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
    0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
    2 ml Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
    Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
    MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
    MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
    Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
    pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional Regulation of the Heterochronic Gene Lin-14 By Lin-4 Mediates Temporal Pattern Formation in C. Elegans. Cell. 75 (5), 855-862 (1993).
    2. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans Heterochronic Gene Lin-4 Encodes Small RNAs With Antisense Complementarity to Lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
    3. Ambros, V. The Functions of Animal MicroRNAs. Nature. 431 (7006), 350-355 (2004).
    4. Bartel, D. P. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
    5. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target Recognition and Regulatory Functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
    6. Benitez, A. A., Spanko, L. A., Bouhaddou, M., Sachs, D., Tenoever, B. R. Engineered Mammalian RNAi Can Elicit Antiviral Protection That Negates the Requirement for the Interferon Response. Cell Rep. 13 (7), 1456-1466 (2015).
    7. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Yalcin, A., Meyer, J., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of Tissue-Specific MicroRNAs From Mouse. Curr Biol. 12 (9), 735-739 (2002).
    8. Landgraf, P., et al. A Mammalian MicroRNA Expression Atlas Based on Small RNA Library Sequencing. Cell. 129 (7), 1401-1414 (2007).
    9. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: Tools for MicroRNA Genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
    10. Kelly, E. J., Russell, S. J. MicroRNAs and the Regulation of Vector Tropism. Mol Ther. 17 (3), 409-416 (2009).
    11. Brown, B. D., Naldini, L. Exploiting and Antagonizing MicroRNA Regulation for Therapeutic and Experimental Applications. Nat Rev Genet. 10 (8), 578-585 (2009).
    12. Tenoever, B. R. RNA Viruses and the Host MicroRNA Machinery. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 169-180 (2013).
    13. Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNAs and Oncolytic Viruses. Curr Opin Virol. 13, 40-48 (2015).
    14. Brown, B. D., Venneri, M. A., Zingale, A., Sergi Sergi, L., Naldini, L., L, Endogenous MicroRNA Regulation Suppresses Transgene Expression in Hematopoietic Lineages and Enables Stable Gene Transfer. Nat Med. 12 (5), 585-591 (2006).
    15. Brown, B. D., et al. A MicroRNA-Regulated Lentiviral Vector Mediates Stable Correction of Hemophilia B Mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
    16. Brown, B. D., et al. Endogenous MicroRNA Can be Broadly Exploited to Regulate Transgene Expression According to Tissue, Lineage and Differentiation State. Nat Biotechnol. 25 (12), 1457-1467 (2007).
    17. Ruiz, A. J., Hadac, E. M., Nace, R. A., Russell, S. J. MicroRNA-Detargeted Mengovirus for Oncolytic Virotherapy. J Virol. 90 (8), 4078-4092 (2016).
    18. Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. Engineering Attenuated Virus Vaccines By Controlling Replication Fidelity. Nat Med. 14 (2), 154-161 (2008).
    19. Barnes, D., Kunitomi, M., Vignuzzi, M., Saksela, K., Andino, R. Harnessing Endogenous MiRNAs to Control Virus Tissue Tropism as a Strategy for Developing Attenuated Virus Vaccines. Cell Host Microbe. 4 (3), 239-248 (2008).
    20. Perez, J. T., Pham, A. M., Lorini, M. H., Chua, M. A., Steel, J., Tenoever, B. R. MicroRNA-Mediated Species-Specific Attenuation of Influenza a Virus. Nat Biotechnol. 27 (6), 572-576 (2009).
    21. Saydaminova, K., et al. Efficient Genome Editing in Hematopoietic Stem Cells With Helper-Dependent Ad5/35 Vectors Expressing Site-Specific Endonucleases Under MicroRNA Regulation. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14057 (2015).
    22. Langlois, R. A., et al. MicroRNA-Based Strategy to Mitigate the Risk of Gain-of-function Influenza Studies. Nat Biotechnol. 31 (9), 844-847 (2013).
    23. Kelly, E. J., Hadac, E. M., Cullen, B. R., Russell, S. J. MicroRNA Antagonism of the Picornaviral Life Cycle: Alternative Mechanisms of Interference. PLoS Pathog. 6 (3), e1000820 (2010).
    24. Pham, A. M., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Replication in Cells of Hematopoietic Origin is Necessary for Dengue Virus Dissemination. PLoS Pathog. 8 (1), 1002465 (2012).
    25. Langlois, R. A., Varble, A., Chua, M. A., García-Sastre, A., Tenoever, B. R. Hematopoietic-Specific Targeting of Influenza a Virus Reveals Replication Requirements for Induction of Antiviral Immune Responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (30), 12117-12122 (2012).
    26. Chua, M. A., Schmid, S., Perez, J. T., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Influenza a Virus Utilizes Suboptimal Splicing to Coordinate the Timing of Infection. Cell Rep. 3 (1), 23-29 (2013).
    27. Griffiths-Jones, S. The MicroRNA Registry. Nucleic Acids Res. 32, D109-D111 (2004).
    28. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: MicroRNA Sequences, Targets and Gene Nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).
    29. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Integrating MicroRNA Annotation and Deep-Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 39, D152-D157 (2011).
    30. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Annotating High Confidence MicroRNAs Using Deep Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 42, D68-D73 (2014).
    31. Heckman, K. L., Pease, L. R. Gene Splicing and Mutagenesis By PCR-Driven Overlap Extension. Nat Protoc. 2 (4), 924-932 (2007).
    32. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. . , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5063/gel-purification (2016).
    33. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Ligation Reactions. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5069/dna-ligation-reactions (2016).
    34. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method (2016).
    35. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA From Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
    36. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
    37. Separation of RNA in Agarose Gels. Sourcebook for Electrophoresis. Lonza. , Available from: http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_BenchGuides_SourceBook_Section_VIII_-_Separation_of_RNA_in_Agarose_Gels.pdf 132-145 (2016).
    38. Kueberuwa, G., Cawood, R., Tedcastle, A., Seymour, L. W. Tissue-Specific Attenuation of Oncolytic Sindbis Virus Without Compromised Genetic Stability. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 154-165 (2014).
    39. Grundhoff, A., Sullivan , C. S. Virus-Encoded MicroRNAs. Virology. 411 (2), 325-343 (2011).
    40. Kincaid, R. P., Sullivan, C. S. Virus-Encoded MicroRNAs: An Overview and a Look to the Future. PLoS Pathog. 8 (12), e1003018 (2012).
    41. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental Strategies for MicroRNA Target Identification. Nucleic Acids Res. 39 (16), 6845-6853 (2011).
    42. Thomson, D. W., Dinger, M. E. Endogenous MicroRNA Sponges: Evidence and Controversy. Nat Rev Genet. 17 (5), 272-283 (2016).
    43. Mullokandov, G., et al. High-Throughput Assessment of MicroRNA Activity and Function Using MicroRNA Sensor and Decoy Libraries. Nat Methods. 9 (8), 840-846 (2012).
    44. Thomson, D. W., et al. Assessing the Gene Regulatory Properties of Argonaute-Bound Small RNAs of Diverse Genomic Origin. Nucleic Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
    45. Wu, S., et al. Multiple MicroRNAs Modulate P21cip1/waf1 Expression By Directly Targeting Its 3' Untranslated Region. Oncogene. 29 (15), 2302-2308 (2010).
    46. Vo, N. K., Dalton, R. P., Liu, N., Olson, E. N., Goodman, R. H. Affinity Purification of MicroRNA-133a With the Cardiac Transcription Factor, Hand2. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19231-19236 (2010).
    47. Arvey, A., Larsson, E., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Target mRNA Abundance Dilutes MicroRNA and siRNA Activity. Mol Syst Biol. 6, 363 (2010).
    48. Garcia, D. M., Baek, D., Shin, C., Bell, G. W., Grimson, A., Bartel, D. P. Weak Seed-Pairing Stability and High Target-Site Abundance Decrease the Proficiency of Lsy-6 and Other MicroRNAs. Nat Struct Mol Biol. 18 (10), 1139-1146 (2011).
    49. Jinek, M., Doudna, J. A. A Three-Dimensional View of the Molecular Machinery of RNA Interference. Nature. 457 (7228), 405-412 (2009).
    50. Pasquinelli, A. E. MicroRNAs and Their Targets: Recognition, Regulation and an Emerging Reciprocal Relationship. Nat Rev Genet. 13 (4), 271-282 (2012).
    51. Finnegan, E. F., Pasquinelli, A. E. MicroRNA Biogenesis: Regulating the Regulators. Crit Rev Biochem Mol Biol. 48 (1), 51-68 (2013).
    52. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of MicroRNA Biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
    53. Zuker, M. Mfold Web Server for Nucleic Acid Folding and Hybridization Prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
    54. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA Secondary Structure Prediction and Analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
    55. Khan, A. A., Betel, D., Miller, M. L., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Transfection of Small RNAs Globally Perturbs Gene Regulation By Endogenous MicroRNAs. Nat Biotechnol. 27 (6), 549-555 (2009).
    56. Skalsky, R. L., Cullen, B. R. Viruses, MicroRNAs, and Host Interactions. Annu Rev Microbiol. 64, 123-141 (2010).
    57. Sugio, K., et al. Enhanced Safety Profiles of the Telomerase-Specific Replication-Competent Adenovirus By Incorporation of Normal Cell-Specific MicroRNA-Targeted Sequences. Clin Cancer Res. 17 (9), 2807-2818 (2011).
    58. Fu, X., Rivera, A., Tao, L., De Geest, B., Zhang, X. Construction of an Oncolytic Herpes Simplex Virus That Precisely Targets Hepatocellular Carcinoma Cells. Mol Ther. 20 (2), 339-346 (2012).
    59. Yao, W., Guo, G., Zhang, Q., Fan, L., Wu, N., Bo, Y. The Application of Multiple MiRNA Response Elements Enables Oncolytic Adenoviruses to Possess Specificity to Glioma Cells. Virology. 458-459, 69-82 (2014).
    60. Bofill-De Ros, X., Gironella, M., Fillat, C. Mir-148a- and Mir-216a-regulated Oncolytic Adenoviruses Targeting Pancreatic Tumors Attenuate Tissue Damage Without Perturbation of MiRNA Activity. Mol Ther. 22 (9), 1665-1677 (2014).
    61. Baertsch, M. A., et al. MicroRNA-Mediated Multi-Tissue Detargeting of Oncolytic Measles Virus. Cancer Gene Ther. 21 (9), 373-380 (2014).

    Tags

    Immunology выпуск 120 микроРНК микроРНК-нацеливание пикорнавирус онколитический тропизм вирус цитотоксичность репликация экспрессия генов
    МикроРНК основе Регулирование пикорнавирусы тропизм
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Ruiz, A. J., Russell, S. J.… More

    Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (120), e55033, doi:10.3791/55033 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter