Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

תקנה מבוססת MicroRNA של Picornavirus כמיהות

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/55033
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic College of Medicine

Introduction

פיתוח שיטה ישימה, קלה ויעילה רחבים עבור הנדסת וקטור עם כמיהות מוגבלות מספק הזדמנות גדולה כדי לשפר את הבטיחות, הבנה ביולוגית תועלת טיפולית של וירוסים. מספר מנגנונים קיימים למקד כמיהות ויראלי כולל transductional, תעתיק, וטכניקות מבוססות translational. עם זאת, שיטות אלו אינן ישימות כלל לכל מערכות הווקטור, עשוי לדרוש מסלולי איתות פגומים בתאים ממוקדים או לדרוש החדרת רצפי קידוד גדולים לתוך הגנום הויראלי. בנוסף, שיטות אלה עלולות לגרום הנחתה של הנגיף, ולעכב הפעילות הטיפולית שלהם באופן משמעותי והגבלת תובנה על המערכת ללא שינוי.

מיקרו RNA קטנים (22-25 נוקלאוטידים), ללא קידוד RNAs אשר מתווכים להשתקת גנים בתאים איקריוטיים. מיקרו RNA פונקציה באמצעות קשירה רצפי היעד משלימים (אלמנטים בתגובה) ב RNAs שליח (mRNA) resulti ng ב יציבות תמליל, השפלה או דיכוי translational. מיקרו RNA בדרך כלל לאגד אלמנטים בתגובה עם השלמה חלקית להניב שינויים קטנים ביטוי גנים 1, 2, 3, 4, 5. עוד שינויים משמעותיים ביטוי גנים יכולים להיות מושגת על ידי הגדלת מידת ההשלמה של אלמנט התגובה 6. אלף מייקרו-רנ"א בוגרת זוהו במגוון מיני דפוסי ביטוי הפרש תערוכה רב במגוון של סוגי תאים ורקמות 7, 8, 9. חתימות microRNA אלה ניתן לנצל עבור הגבלת תא ספציפי של הגברת וירוס על ידי שילוב אלמנטים בתגובה משלימים באופן מושלם לתוך הגנום הויראלי 10,= "Xref"> 11, 12, 13. המטרה הכללית של טכניקת מיקוד-microRNA זה היא לשלוט הכמיהות של הגנום וקטור ללא הנחתה נוספת.

השירות של שיטה זו להסדרת כמיהות ויראלי הודגם במקור וקטורים lentiviral להגביל ביטוי transgene ברקמות ספציפיות 14, 15, 16. טכניקה זו לאחר מכן יושמה למגוון רחב של משכפלים ולא משכפל וקטורים ויראליים עבור ריפוי גנטי משופר כמו גם לשפר את פרופיל הבטיחות של וירוסי oncolytic רבים על ידי ביטול רעיל רצוי ברקמות נורמליות 10, 11, 12, 13, 17 . זה גם נוצל כדי ליצור בטוח ודוארחיסונים חיים-מוחלש ffective וכן לשפר וירוס וייצור חיסון מעבד 18, 19, 20, 21. MicroRNA-מיקוד של וקטור יכול לאפשר הנחתה ב מארחים מחוסנים או מערכות ממוקדות תוך שמירה על רמות צמיחת wild-type במערכות יצרן. MicroRNA מיקוד יכול לשמש גם כדי לשפר את הבטיחות הביולוגית של וירוסים למטרות מחקר על ידי הגבלת הילוכים במינים אחד (אדם למשל) תוך שמירה על שידור צבאות אחרים 22. לבסוף, microRNA-מיקוד יכול לאפשר ניתוחים מעמיקים של מחזורי חיים של נגיף ותפקידים ספציפיים של סוגי תאים בפתוגנזה וחסינות ידי הפרדת צמיחת ויראלי 23, 24, 25, 26.

טכניקה זו מציעה alternative שיטת מיקוד מיושמת בקלות ישימה עבור כל מערכות הווירוס. בנוסף, האוסף המתרחבת של מיקרו-רנ"א בוגרת עם דפוסי ביטוי ההפרש בסוגי תאים ספציפיים עושה טכניקה זו תכליתי מאוד. MicroRNA מבוסס מיקוד הוכיח יעיל עבור מגוון רחב של מערכות וירוס מבלי להתפשר תפקוד מערכת. המגבלות העיקריות של גישה זו כוללות בדיקה ואופטימיזציה שגיאה, פוטנציאל מוטציות בריחה, ואת הפוטנציאל מחוץ יעד תופעות על תמלילי אנדוגני. עם זאת, מגבלות אלה ניתן להתגבר באופן כללי עם עיצוב אלמנט בתגובה אופטימלי רציונלים. וירוסי RNA חיובי תחושה נוטים להיות קשוב במיוחד כדי microRNA-מיקוד בשל האורינטציה החיובית תחושת הגנום שלהם ואת הזמינות של התמלילים אל מכונה microRNA במהלך מחזור השכפול ציטופלסמית לחלוטין. כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת picornavirus במיקוד microRNA ואת experimשיטות ental כדי לאמת את יעילות וספציפיות של שמיקוד במבחנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שיבוט microRNA תגובה אלמנטים לתוך הגנום הויראלי

  1. מוסיף אלמנט בתגובה microRNA עיצוב.
    1. זהה את microRNA הרצוי רצף היעד המתאים. מאגרי מידע קיימים מספר עם רצפי מיקרו-רנ"א בוגרת. מומלץ: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30.
  2. Clone האלמנט בתגובה לתוך פלסמיד דנ"א המקודד את הגנום או תעתיק וקטור.
    הערה: זה שתיים או יותר אלמנטים בתגובת עותק באמצעות אתר הגבלה ייחודי להכנסה קלה יותר תכליתית.
    1. הכנס אלמנט תגובה או אתר הגבלה ייחודי באמצעות הרחבה אחוי-חפיפה (SOE) PCR. שיטה זו תוארה בפירוט 31.
    2. אם באמצעות אתר הגבלה להכנסה, PURלרדוף ultramers antisense ותחושת מסונתז מסחרי, מטוהרים-עמוד קידוד רצפי הכנס המוקפים רצפי הסככה של אתר ההגבלה הייחודי (איור 2).
    3. שלב 0.5 מיקרוגרם תחושה ultramer, 0.5 מיקרוגרם antisense ultramer, חיץ קשירת DNA לריכוז סופי של 1x, ומביאים 50 μl עם H 2 O. לחשל ultramers ידי דוגרים התגובה על 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן הפחתת הטמפרטורה על ידי 0.5 ° C כל 30 שניות עד התגובה מגיע 25 ° C.
    4. שלב 0.5 מיקרוגרם של ה- DNA וקטור קידוד אתר ההגבלה הייחודי החדש, חיץ אנזים לריכוז סופי 1x, 1 μl של אנזים ההגבלה המתאים, ומביא נפח סופי של 20 μl עם H 2 O. Digest הווקטור ב 37 ° C עבור 2 שעות. לטהר את ה- DNA לינארית על ידי טיהור ג'ל agarose 32.
    5. ולקשור את ultramers מרותק לתוך וקטור מתעכל לילה בשעה 16 °; C באמצעות 3: 1 ultramers: יחס טוחנת וקטור וטכניקות קשירת תקן 33.
      הערה: בעת השימוש באתר אנזים הגבלה אחת להכנסה זה יכול להיות יעיל יותר dephosphorylate קצות וקטור מתעכל phosphorylate קצות oligonucleotides annealed.
    6. להפוך את ה- DNA ligated לתוך החיידק בשיטת הלם חום 34.
      הערה: פלסמידים קידוד הגנום נגיפי הם גדולה בדרך כלל, ולכן באמצעות תאים מוסמכים אופטימיזציה ספיגים בונת DNA גדולה עלולים להגביר יעילות שינוי.
    7. לטהר DNA פלסמיד ממושבות פרט באמצעות ערכת טיהור זמינה מסחרי 35. זהה שיבוט מתאים עם האלמנט בתגובת microRNA בכיוון הנכון (איור 2) על ידי רצף באזור להכניס 36.

2. הצלה במיקוד microRNA Picornavirus הלוך ושובמ DNA פלסמיד

  1. הצלת microRNA במיקוד picornavirus בקו תא מתירנית לשכפול וירוס כי אינו מבטא את microRNA מאותו המקור (הים). פרוטוקול זה משתמש תאים H1-הלה כי הם אינם מבטאים miR-142, miR-124, או miR-125, אולם זה אינו נדרש להשתמש בתאי H1-הלה להצלה.
    הזהירות: כל נהלי הטיפול והסילוק הבטוחים של חומרים מזהמים יש לפעול בהתאם.
    1. פלייט תאים H1-הלה ​​צלחת 6-גם כך הם ~ 80% ומחוברות בזמן של transfection (24 שעות זריעת פוסט). פלייט תאי 2 מיליליטר לכל טוב של DMEM בתוספת בסרום שור עוברי 10%.
    2. מומלץ לחמם את מגיב transfection לטמפרטורת החדר. מערבבים 250 סרום ללא מדיה μL, 2.5 מיקרוגרם של הגנום במיקוד microRNA קידוד DNA פלסמיד, ו -7.5 μL של מגיב transfection בתוך שפופרת ו pipet microcentrifuge סטרילית בעדינות לתערובת. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות.
    3. לשאובמדיה מן התאים צופה ולהוסיף 2 מיליליטר של תקשורת השלמה הטריה.
    4. מוסיפים את תערובת transfection כולו משלב 2.1.2 כדי גם אחד טיפה חכם צלחת 6 באר. להוסיף כל טיפה לאזור אחר של הבאר.
    5. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס עד תופעות cytopathic (CPE) או חלבוני כתב ניתנים לזיהוי (~ 24-72 שעות).
  2. קציר מעבר הנגיף הציל על תאים טריים.
    1. פלייט תאים בצלחת 6-גם כאלה שהם ומחוברים 80-90% בזמן הזיהום (זריעת פוסט 24 שעות).
      הערה: סולם למעלה או למטה בהתאם לכמות של וירוס צורך עבור כל הניסויים הבאים.
    2. קציר כל הצלה היטב על ידי גירוד את התאים לתוך supernatant באמצעות מגרד גומי תא או שוטר גומי. בעדינות לגרור את המגרד פני החלק התחתון של הבאר. העברת התאים ואת supernatant לתוך צינור אחסון קריוגני.
    3. להקפיא / להפשיר הדגימות פעמים ולאחר מכן גלולת פסולת הסלולר על ידיcentrifuging ב 1,200 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    4. סנן את supernatant פינת פעמים באמצעות מסנני מזרק 0.2 מיקרומטר. את supernatant ההצלה המסוננת מכילה את הנגיף.
      הערה: גודל נקבובי מסנן עשוי להשתנות בהתאם לגודל של חלקיקי נגיף, וייתכן שלא להיות רלוונטי עבור וירוסים גדולים.
    5. לשאוב מדיה מן התאים המצופים, ולשטוף פעם עם סרום ללא מדיה ולהוסיף 1 מיליליטר של סרום ללא מדיה טריה היטב כל אחד.
    6. הוסף 50 μL לכל טוב של supernatant הצלה מסוננת נער בעדינות את הצלחת כדי להפיץ וירוסים באופן שווה.
    7. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ולאחר מכן תקשורת לשאוב מבאר כל להסיר את וירוס מאוגד.
    8. להוסיף 1.5-2 מיליליטר של תקשורת שלמה טריה לכל טוב לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד חלבוני CPE או כתב מורגשים (~ 24-48 שעות).
    9. חזור על שלבים 2.2.2 עד 2.2.4. supernatant הצלה מסונן מכיל מניות וירוס. מניות וירוס אחסן aliquots לשימוש חד-פעמי צינורות אחסון קריוגני ב -80 °ג

3. הצלת וירוס במיקוד microRNA מ במבחנה עיבד RNA תמלול

  1. צור תעתיקי רנ"א מ- DNA פלסמיד המקודד את הגנום הנגיפי במיקוד microRNA באמצעות האמרגן הזרם.
    הערה: שיטות עבודה סטנדרטיות להפקה ושמירה על סביבת nuclease ללא אמורות לשמש את כל הצעדים הבאים.
  2. Linearize פלסמיד דנ"א באמצעות אתר אנזים הגבלה במורד לפרוטוקול. שלב פלסמיד דנ"א 5 מיקרוגרם, חיץ אנזים הריכוז הסופי 1x, אנזים הגבלה 3 μl ומביאים 50 μl עם H 2 O. דגירה התגובה על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
  3. להוסיף 1/20 נפח ה של 0.5 EDTA M, 1/10 נפח ה 5 M NH 4 אצטט, ו 2 כרכים של אתנול 100% על התגובה מתעכל ומערבבים. דגירה ב -20 ° C עבור 1 ח עד הלילה.
  4. גלולת DNA זרז במשך 10 דקות ב 17,000 XG ב 4 ° C.. יוצקים את supernataNT, resuspend גלולה ב 500 μL של אתנול 70% קר גלולה DNA על ידי צנטריפוגה ב 17,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  5. יוצקים את supernatant ו צנטריפוגות שוב למשך 30 שניות. הסר את supernatant שיורית עם pipet ואוויר-לייבש את הגלולה. Resuspend גלולה DNA ב H 2 סטרילי-nuclease חינם O בריכוז של 0.5-1 מיקרוגרם / μL.
  6. הפשרה ריאגנטים שעתוק במבחנה בטמפרטורת חדר ומקום ribonucleotides על קרח (אנזימי גליצרול לא להקפיא וצריכות לעבור ישירות על קרח). שמור למאגר התגובה בטמפרטורת החדר.
  7. הרכיבו את התגובה שעתוק בתוך צינור PCR על ידי שילוב של 2 μL כל אחד ATP, CTP, GTP, ופתרונות UTP, 2 חיץ התגובה μL 10x, 1 מיקרוגרם DNA לינארית, 2 אנזים μl, ומביאים נפח סופי של 20 μL עם nuclease -חינם H 2 O.
  8. דגירת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  9. לטהר את תעתיקי רנ"א.
  10. תביא את תגובת שעתוק 100 μL עם פתרון elution (לא-שחומם מראש). להוסיף 350 μL של תרכיז פתרון מחייב 250 μL של 100% אתנול לתגובה ומערבבים.
  11. מעבירים את המדגם כדי מחסנית מסנן מוכנס לתוך צינור איסוף צנטריפוגות דקות 1 ב 12,000 x ז. מחק את הזרימה דרך.
  12. הוספת 500 μL של פתרון לשטוף למחסנית מסנן צנטריפוגות דקות 1 ב 12,000 x ז. זרימה דרך מחק. חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת. זרימה דרך מחק. צנטריפוגה דקות 1 ב 12,0000 XG כדי להסיר אתנול שיורית.
  13. מעביר את מחסנית מסנן צינור איסוף נקי ולהוסיף 50 μL של פתרון elution שחומם מראש ל מחסנית המסנן. צנטריפוגה 1 דקות ב g 12,000 x. חזור על שלב elution זה בהיקף כולל של 100 μl של המשך eluentaining תעתיקי רנ"א מטוהרים. בטל מחסנית מסנן.
  • קבע את ריכוז רנ"א eluent ידי מדידה הספיגה של המדגם ב 260 ו 280 ננומטר באמצעות החוק הבר-למברט.
  • להעריך את היושרה של RNA באמצעות RNA ג'ל אלקטרופורזה 37. ראה איור 3 עבור דוגמאות של שלמות RNA טובה ורעה. RNA יש aliquotted לתוך צינורות לשימוש חד-פעמי ומאוחסנים ב -80 ° C כדי לשמור על שלמות.
  • ריאגנטים transfection חם לטמפרטורת החדר. מערבבים 250 סרום ללא מדיה μl, 2.5 מיקרוגרם של תעתיקי רנ"א מטוהרים, 5 μL של פתרון דחיפה, ו -5 μL של מגיב transfection בתוך שפופרת ו pipet microcentrifuge סטרילית בעדינות לתערובת. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 2-5 דקות.
  • פלייט תאים H1-הלה ​​צלחת 6-גם כך הם ~ 80% ומחוברות בזמן של transfection (24 שעות זריעת פוסט). פלייט תאים 2 מ"ל לכל טוב של DMEM בתוספת 10% fetבסרום שור al.
  • לשאוב את התקשורת בין התאים צופה ולהוסיף 2 מיליליטר של תקשורת השלמה הטריה.
  • מוסיפים את תערובת transfection כולו משלב 3.12 כדי גם אחד טיפה חכם צלחת 6 באר. להוסיף כל טיפה לאזור אחר של הבאר.
  • דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס עד תופעות cytopathic (CPE) או חלבוני כתב ניתנים לזיהוי (~ 24-72 שעות).
  • המשך ההצלה של וירוס microRNA במיקוד כמתואר בשלבים 2.2 עד 2.2.9.

    • 4. titrating מניות וירוס ידי חישוב 50% רקמות-תרבות מנת זיהומיות (TCID 50)

    1. פלייט H1-הלה תאים בצלחת 96-היטב ב 10 4 תאים לכל היטב DMEM בתוספת 10% בסרום שור העובר. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: לכיל וירוס בתאים מתירנית לשכפול וירוס כי אינם מבטאים רנ"א מאותו מקור.
    2. הפוך פי 10 דילולים סידוריים של וירוס אחד בהיקף כולל של 1 מיליליטר של בסרום ללאכְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת.
      הערה: משתמש דילולים נמוכים יותר אם יותר דיוק נדרש.
      הערה: טיפים שינוי לאחר כל דילול כדי למנוע יתר של כייל כמו וירוס יכול לדבוק עצות.
    3. צלחת 96-היטב טיפ לתקשורת הצד לשאוב מתאי הלה מצופה. הוספת 100 μL של דילול כל וירוס לכל היטב 8-בארות של צלחת 96-היטב (1 בשורה לכל דילול). הוספת 100 μL של סרום ללא מדיה ללא וירוס לחתור 1 ובשורה 12 על צלחת עבור פקדים.
      הערה: לשאוב תמיד ולהוסיף תקשורת לבארות ידי נגיעה בקצה אל הצד של היטב כדי למנוע ניתוק תא.
    4. דגירת צלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. צלחת טיפ הצידה לשאוב התקשורת המבארת.
      הערה: טיפי שינוי בין כל שורת דילול.
    5. הוספת 100 μl של מדיה מלאה כל טוב. דגירת צלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
    6. דמיינו את הבארות תחת מיקרוסקופ ולסמן כל טוב, חיובי או שלילי עבור CPE.
    7. לחשב כל כייל הנגיף עם המשוואה הבאה: Lo10 גרם (TCID 50 / מ"ל) = L + D (S-0.5) + log 10 (1 / V). L הוא היומן השלילי 10 של דילול הנגיף המרוכז ביותר נבדק שבו כל הבארות הן חיוביות. D הוא יומן 10 של גורם לדילול. S הוא הסכום של פרופורציות פרט (pi). pi הוא שיעור המחושב של דילול פרט (כמות בארות חיוביות / סכום כולל של בארות לכל דילול. V הוא הנפח של בידוד (מיליליטר / טוב).

    שולחן 1
    טבלה 1: כימות חלקיקי וירוס מדבק ידי חישוב TCID 50. תוצאות נציגת תאים נגועים עם סדרה של דילולים של פי עשרה של מניות וירוס. "L" משווה ל 4 בגלל הדילול האחרון שבו כל הבארות הן חיוביות עבור CPE הוא 10 -4. "D" הוא יומן 10 מתוך 10 מאז פי 10 דילוליםולכן שמשו ו שווה ל -1 "S" הוא הסכום של פרופורציות פרט. בדוגמא זו את הפרופורציות הבודדות הן 1.0, 0.875, 0.375, 0.125, ו 0. הסכום אלה (S) הוא 2.375. "V" הוא הנפח של בידוד ב מיליליטר להשתמש כדי להדביק את התאים בתחילה.

    5. הערכת מיקוד-microRNA היעילה: קינטיקה צמיחה חד-צעד

    1. פקדים עבור assay זה כוללים תאים מעושים נגוע, וירוס ללא שינוי וירוסים שכוללים אלמנט תגובה הלא ממוקד או שאינו פונקציונלי.
    2. פלייט H1-הלה ​​תאים לניסוי כמובן זמן בצלחות בתרבית רקמה 12 גם כאלה שהם ומחוברות 80-90% בזמן זיהום (24 ​​שעות זריעת פוסט). פלייט תאי DMEM בתוספת בסרום שור עוברי 10% ב 1 מיליליטר לכל טוב.
      הערה: מומלץ לצלחת צלחת נפרדת עבור כל נקודת זמן. פרוטוקול זה משתמש 7 בנקודות זמן שונות עבור וירוס עם מחזור השכפול hr 8-12. תאי H1-הלה ​​אינם נדרשים לבצע זוssay. assay זה צריך להתבצע בתאים מתירנית כי אינם מבטאים את רנ"א ממוקד. assay זה יכול גם להתבצע בתאים המבטאים את רנ"א מאותו המקור להעריך קינטיקה צמיחת נתון ללחץ ברירה טבעית.
    3. מדיה לשאוב מבארות. לשטוף בארות על ידי הוספת 0.5 מ"ל של מדיום סרום ללא היטב כל, מערבולת הצלחת, ומדיה לשאוב מבארות. הוסף 0.5 מ"ל של סרום ללא מדיה טרי היטב כל אחד.
    4. להדביק כל טוב על ריבוי גבוה של זיהום (משרד הפנים; מספר חלקיקים זיהומיות לכל תא) על מנת להבטיח את כל התאים נדבקים. פרוטוקול זה משתמש משרד הפנים של 3.
      1. לדלל מניות וירוס ב סרום ללא מדיה לריכוז של משרד הפנים = 3 ל -100 μL. הוספת 100 μL של דילול וירוס כל לשבע בארות שונות לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
      2. לשאוב התקשורת מכל מבארות ולשטוף פעמיים על ידי הוספת מדיה 0.5 מ"ל מלאה בכל טוב, נדנדה בעדינות ואז aspirating.
    5. הוסף 1 מ"ל של גתקשורת omplete זה היטב לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד נקודת זמן רצויה.
    6. לאסוף דגימות עבור טיטרציה וירוס ב 2, 4, 6, 8, 10, 24 ו -48 שעות לאחר הפגיעה (1 היטב לכל נקודת זמן). העבר 700 μL של התקשורת הבאר לצינור אחסון קריוגני. לגרד את התאים לתוך supernatant הנותר על ידי הזזת מגרד גומי בעדינות על פני הבאר כולו. מעבירים את התערובת תא / supernatant אל הצינור אחסון קריוגני המתאים המכיל 700 μL של supernatant.
      הערה: ודא שלא להתיז supernatant מאחד היטב לתוך אחר במהלך גירוד וכתוצאה מכך דגימות מזוהמות. העברת 700 μL לפני הגרידה יצמצם מתיז.
    7. מקום דגימות ב -80 ° C עד שכל הדגימות נאספות.
    8. הקפאה / הפשרה דגימות שלוש פעמים ולהסיר פסולת הסלולר על ידי צנטריפוגה דגימות ב 1200 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    9. לכייל את הווירוס כמתואר בסעיף 4 ולהשוות קינטיקה צמיחה מעל tIME.

    6. הערכת המיקוד-microRNA הספציפית: וירוס מתפשט Assay באמצעות מחקת microRNA הסינטטי

    הערה: שימוש חקיין microRNA סינטטי מתבצע להראות ספציפי של microRNA: אינטראקצית microRNA-היעד.

    1. כלול transfection המדומה, microRNA בקרה השלילית לחקות ו microRNA הניסיון לחקות שולט רק עבור כל assay להעריך רעילות בתיווך microRNA. הוא גם אידיאלי לכלול בקרה חיובית (כלומר גן במיקוד microRNA או הגנום) יעיל transfection נמוך של מחקת microRNA יכול לגרום שלילי שווא.
    2. פלייט H1-הלה ​​תאים בצלחת בתרבית רקמה 96-גם כאלה שהם ומחוברות 80-90% בזמן transfection (24 שעות זריעת פוסט). פלייט תאים DMEM בתוספת 10% בסרום שור העובר על 0.1 מ"ל לכל טוב.
      הערה: בצע assay זה בתאים מתירנית לשכפול ויראלי אינו מבטא את רנ"א מאותו המקור.
    3. ה החמהריאגנטים transfection דואר לטמפרטורת החדר. שלב התקשורת 9 μL סרום ללא, 200 לריכוז סופי ננומטר לכל טוב של המניה לחקות microRNA, 0.18 מגיב דחיפה μL, 0.18 מגיב transfection μL ומערבבים. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 2-5 דקות.
      הערה: כרכים המפורטים הם לכל טוב. מומלץ תערובת אמן להתגודד transfection של כל בארות כדי לשמור על עקביות ולמזער שגיאה pipetting. הריכוז האופטימלי של microRNA לחקות ישתנה. התייעץ להוראות היצרן המלווה את microRNA לחקות ריכוז התחלה סבירה. זה ינוע בדרך כלל בין 5-200 ריכוזי סופי ננומטר.
    4. לשאוב התקשורת מבארת ולהוסיף 92 μl של מדיום שלם טרי.
      הערה: אם יש מספר לא מבוטל של דוגמאות, להשלים שלב זה לפני ההרכבה של פתרון transfection ולאחסן את הצלחת ב 37 ° C עד מוכן.
    5. מוסיפים את תערובת i transfection כולוn צעד 6.3 לתאי טיפה חכם.
    6. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות.
    7. להדביק כל טוב בכל משרד פנים נמוך כדי להבטיח אחוז נמוך של תאים ידבקו לאפשר ניתוח של התפשטות נגיף. פרוטוקול זה משתמש משרד הפנים של 0.2.
      1. לדלל מניות וירוס ב סרום ללא מדיה לריכוז של משרד הפנים = 0.2 לכל 100 μL. סר מדיה המבארת ולהוסיף 100 μL של דילול וירוס לכל טוב.
      2. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
    8. לשאוב תקשורת מכל טוב ולהוסיף 100 μL של תקשורת השלמה הטריה.
    9. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 20-22 שעות.
    10. לקבוע את טיטרציה וירוס supernatants.
      1. אסוף את supernatant מבאר כל ולהחליף עם 100 μL של תקשורת השלמה הטריה.
        הערה: אם אתה משתמש תאי השעיה, resuspend התא גלול מהשלב הבא 100 μL של תקשורת השלמה הטריה ולחזור לדגום גם עבור assay הכדאית.
      2. הסר Celluפסולת Lar מן supernatants שנאספו על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C..
      3. מעביר את supernatant פינה לצינור טרי לכייל וירוס מדבק על תאים מתירנית כי אינו מבטאים את רנ"א מאותו המקור כמפורט בסעיף 4.
        הערה: שמור את כל הדגימות על קרח כדי למנוע אובדן של infectivity.
    11. לקבוע את הכדאיות של התאים.
      1. הוסף 10 μL של MTT (3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) ברומיד -2,5-diphenyltetrazolium) מגיב לכל טוב.
      2. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 שעות עד המשקע סגול גלוי.
      3. הוספת 100 μL של מגיב דטרגנט.
      4. דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 2 שעות.
      5. קראו ספיג של כל הבארות ב 570 ננומטר.
        הערה: לנרמל את כל דגימות ללעוג תאים transfected להשוואה של כדאיות התא אחוזים.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    טבלת 1 מייצגת תוצאות אופייניות של assay טיטרציה עבור picornavirus ומתארת כיצד לחשב את המינון זיהומיות תרבות 50% רקמות. ייצוג סכמטי של הרעיון הכללי של רגולציה המבוססת על microRNA של כמיהות ויראלי המתואר בכתב היד הזה מוצג באיור 1. האוריינטציה של microRNA לאלמנט התגובה במהלך אינטראקציות תאיים, תכנון נכון של oligonucleotides אלמנט בתגובה להכנסה חישול פלסמיד, וכן מפה של DNA פלסמיד קידוד הגנום הנגיפי במיקוד microRNA של שעתוק במבחנה מתואר באיור 2. איור 3 מראה תעתיקי רנ"א בדרגות משתנות של שלמות דמיינו ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose. טיפול נכון ושימוש DNA תבניות נטולים זיהומים יגרמו תעתיקי רנ"א עבדו כראוי כפי שמוצגים שביל 3A 2. זיהומים שיורית בתוך Lineaתבניות DNA rized או כמויות זעירות של nuclease יכול לגרום לרמות נמוכות של רנ"א עיבד שלא כהלכה ו / או מוצרים פגומים דומה לזה שנצפה בנתיב 3A 3. לינאריזציה Incomplete של DNA פלסמיד או DNA המכיל כמויות גבוהות של זיהומים כגון אתנול שיורית תגרום מוצרי שעתוק והשפלה פסולים מיוצגים נתיבי 3A 4 ו -5 איור 3 מראים גם דימוי של תופעות cytopathic בתיווך Mengovirus (CPE) בעקבות transfection של תעתיקי רנ"א נקיים. מציג איור 4 נציג נתונים של ניסוי כמובן זמן הערכת קינטיקה צמיחה של Mengovirus ללא שינוי ו microRNA במיקוד. התוצאות מראות כי אלמנטים בתגובה microRNA מהונדסים לגנום Mengovirus אינם משנים את קינטיקה של שכפול הנגיף בתאים H1-הלה, אשר אינם מבטאים כל מיקרו-רנ"א מאותו מקור. עם זאת, ב 264.7 מקרופאגים RAW, המבטאים רמות ביניים של microRNA-125 לבין רמות גבוהות של microRNA-142, וירוסים קידוד האלמנטים בתגובה המקביל להציג קינטיקה שכפול עכבות כי בקורלציה עם רמת microRNA הביעו. נתונים איור 5 מראה את הספציפיות של רגולציה המבוססת על microRNA של כמיהות Mengovirus. התבטאות יתר של כל microRNA בודדים בתאים H1-הלה ​​מעכב התפשטות במיוחד (titers וירוס נמוך) ו cytotoxicity (כדאיות התא מוגברת) של Mengovirus קידוד האלמנט בתגובה microRNA מאותו מקור.

    איור 1
    איור 1: ייצוג סכמטי של רגולציה מבוססת microRNA של כמיהות ויראלי. אלמנטים בתגובה MicroRNA (RE) שולבו הגנום הנגיפי יוכרו על ידי מיקרו-רנ"א מאותו מקור מועשר בתוך סוגי תאים ספציפיים לגרום השפלה ממוקד של תמלילי / הגנום הנגיפי. שכפול הנגיף ימנע זה, להתפשט רעילות thדואר תאים סובב. עם זאת, שכפול נגיפי יישמר בתאים אינם מבטאים את רנ"א מאותו המקור המאפשר התפשטות נגיף, התפשטות מוות של תאים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 2
    איור 2: עיצוב אלמנט בתגובה MicroRNA. (א) עבור מוצלחת מיקוד באזור רצף הזרע של RE צריך להיות משלימים באופן מושלם. רי צריכה להיות מכוונת בתוך הגנום הנגיפי כך שהוא יכול להיות מוכר על ידי microRNA בוגר מאותו המקור ב תעתיקי mRNA ו / או הגנום הויראלי. רוב המיל ממוקמים בתוך UTR '3 של התמלילים. (ב) תיאור של oligonucleotides קידוד המכיל מיל תוכנן annealed כראוי טנדםחזרות של רצפי יעד microRNA (miRT) מוקפים נוקלאוטידים התלויים של אתר אנזים הגבלת XhoI. בעת תכנון מיל חוזרים טנדם, הקפד לכלול נוקלאוטידים spacer (בדרך כלל 4-6) בין כל עותק microRNA-היעד. (ג) ה- DNA פלסמיד קידוד גנום ויראלי באורך מלא עם RE שולבו 3 'UTR, האמרגן T7, ואתר הגבלה ייחודי עבור לינאריזציה של שעתוק במבחנה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 3
    איור 3: הצלת מהווירוס תעתיקי רנ"א קידוד-הגנום. (א) RNA ג'ל אלקטרופורזה של RNAs עיבד במבחנה קידוד הגנום picornavirus להעריך שלמות תמליל. נתיב 1: סולם RNA. ליין 2: כראוי עבד RNA עם יושרה גבוהה. ליין 3: תעתיקי רנ"א ביושר מתון. להקה גבוהה היא גודל נכון ואת הלהקה תחתונה היא פוטנציאל מוצר שפל או תעתיקי הרנ"א רצויים. ליין 4: כיאות עבד RNA. ליין 5: RNA יושרה נמוך. 500 ננוגרם של רנ"א במבחנה עיבד הועמס לכל טוב. מוצרי שעתוק או שפלה פסולים צפויים עקב השימוש של טוהר נמוך או DNA לינארית באופן חלקי. תמונה (B) של תאים H1-הלה transfected מדומה ותאי טרנספקציה עם תעתיקי רנ"א קידוד Mengovirus. מנהל של ריאגנטים transfection בלבד (מוק) ישמור כדאיויות תא הבא transfection וכן מעבר על תאים טריים. Transfection של תעתיקי רנ"א המקודדת הגנום Mengovirus (VMC 24) התוצאות תופעות cytopathic, אשר נשמרות לאחר סינון של supernatant והמעבר אל תאי H1-הלה טרי. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 4
    איור 4: קינטיקה צמיחה של Mengoviruses ללא שינוי ו במיקוד microRNA בנוכחות או העדר של מיקרו-רנ"א מאותו מקור. השתנה בהפניה 17. (א) תאים H1-הלה מחווים miR-124, -125, או -142. כל מיל microRNA קידוד שלוש Mengovirus לשכפל עם קינטיקה דומה לזו של וירוס ללא שינוי (VMC 24) המציין הכניסה לזו של מיקרו-רנ"א במיקום זה (5 'UTR) אינם משנים את התרבות הנגיף. (ב) RAW 264.7 מקרופאגים מבטאים רמות ביניים של miR-125b ורמות גבוהות של miR-142-3p, אך אינם מבטאים miR-124. התאגדות של רצפי מיקרו-רנ"א-היעד המתאים לתוך תוצאות הגנום וירוס attenuation בקנה אחד עם רמת הביטוי microRNA. נתונים מיוצגים titers ויראלי ממוצע +/- SD. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 5
    איור 5: ניתוח של סגוליות מיקוד-microRNA באמצעות מחקה microRNA סינתטי. השתנה בהפניה 17. H1-הלה תאים transfected עם מחקה microRNA בודדים נדבקו בווירוס ללא שינוי (VMC 24) או וירוס במיקוד microRNA (miRT-VMC 24) ב משרד הפנים של 0.2. (א) כדאי התא מנורמלות תא מדומה שטופל נקבעו ל 24 שעות לאחר הדבקה באמצעות assay התפשטות תאי MTT. (ב) כייל הנגיף supernatant של כל הדגימות נקבע גם ב 24 שעות לאחר ההדבקה. הנתונים מיוצג הכדאיות מרושעים או כייל הנגיף +/- SD. שני זנב מבחני t סטודנטים מזווגים עם התיקון של וולש (עבור סטיות לא שוויוניות) שמשו לניתוח סטטיסטי. ערך p <0.01 נחשב משמעותי. (**, P <0.01, ***, p <0.001). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    העיצוב, הרכב והלוקליזציה של האלמנטים בתגובת microRNA בתוך הגנום הויראלי יכתיבו מיקוד יעיל וספציפי. אופטימיזציה אלה ידרוש ניסוי וטעייה. עם זאת, תכנון רציונלי מבוסס על ניתוח RNA מבני מחקרים קודמים של שכפול נגיפי איידס חתימות microRNA ביישום הטכניקה הזו עם אופטימיזציה מינימאלי 10, 11, 12, 13, 38.

    בעת ביצוע העיצוב של מיל, החוקרים צריכים להתחיל על ידי הרכבת סט של מיקרו-רנ"א המתבטאים בתאי המטרה של עניין, הם פחתה בתאים שאינם היעד של עניין, וכי אומתו באופן ניסיוני. בעקבות אוסף זה, כמה ניתוחים מבוססי חיזוי צריכים להתנהל להתייחס לאפשרות של microRNA-targe מתחרהאינטראקציות t. וירוסים רבים לקודד מיקרו RNA או RNAs ללא קידוד כי לעקל רנ"א הסלולר כדי לתפעל ביטוי גנים נגיפיים המארח. יתר על כן, כמה וירוסים RNA הוכחו אינטראקציה עם מיקרו-רנ"א הסלולר על מנת לשפר את כושר שכפול שלהם 39, 40. לכן, בעת תכנון מיל, הקפד לבדוק אם יש ידועים אינטראקציות של הנגיף עם מיקרו-רנ"א הסלולר או אם הם מביעים רנ"א נגיפי שעלולים לזהות את היעד microRNA נבחר או לשנות את ביטוי אנדוגני של microRNA הנבחר. בנוסף לחיפושי ספרות, הקורא צריך לשקול כלים ומאגרי מידע חיזוי ביואינפורמטיקה באינטרנט הכוללים מידע יעד microRNA ויראלי כדי לסייע בעיצוב רציונלית של מיל. מסדי נתונים כאלה וכלי חיזוי יכולים גם להקל על זיהוי של רצפי יעד שיכול להיות מוכר על ידי מייקרו-רנ"א המרובה או רצפי זרע חופפים מראש נשלח בתוך הגנום הויראלי. לדיון מעמיק יותר על שיטות לזיהוי מטרות microRNA ואת היתרונות וחסרונות של כמה מהכלים התחזו באינטרנט הקורא נקרא אזכור 41, 42. מומלץ כלי חיזוי אלה משרתים רק כמדריכים כנבואות פעמים רבות יכולות להניב תוצאות חיוביות או שליליים שגויות. לשם כך, ייתכנו רצפי זרע חופפים, אולם בסופו של דבר '3 של microRNA גם ישפיע על יעילות המיקוד. שימוש מדי מחמיר של חקוק באבן יכול לפעמים להיות מזיק.

    לאחר סדרה של מטרות microRNA פוטנציאל זוהו, החוקר צריך להמשיך לפי הדירוג יעדי מבוסס על התכונות הביולוגיות של מיקרו-רנ"א ותחזיות מבניים RNA 10, 11, 12, 13,EF "> 38. השפע המוחלט של microRNA בוגרת תאים ממוקדים ורמת ההתאגדות שלה עם חלבון argonaute יכתיב את המידה להשתקת גנים. מספר מחקרים הראו כי רק מבוטא בשפע רנ"א יסדיר ביטוי גנים 16 באופן משמעותי, 43, 44. יתר על כן, בעוד מייקרו RNA כמה באים לידי ביטוי האינטראקציה שלהם בשפע עם חלבוני argonaute היווצרות של RISC אינו מספיק כדי להדחיק תרגום 44. באמצעות microRNA בהיקף הנרחב ביותר עם פונקציה תוקפת יהיה גם לצמצם את הסיכון רווי microRNA בתא יעד ההנחה מתוך באה רעילות היעד. גישה שונה עשויה להיות שימוש מיל אשר ממוקדות על ידי miRNAs מספר 45, 46, אשר יכולים להרשות לעצמנו מספר עותק מוקטן ועדיין מזעור הסיכון הפוטנציאלי toxiciti מחוץ היעדes. יחס mRNA היעד microRNA תהיה גם השפעה משמעותית על ההצלחה של גישה זו. מטרה גבוהה יחס microRNA תפחית את רמת דיכוי 42, 43, 47, 48. זהו עניין חיוני במיוחד עם וירוסים המחקים במהירות כאשר אם מוסדר כראוי מוקדם במהלך ההדבקה יצטברו לרמות בשליטת רנ"א אנדוגני. זה חיוני כדי לשקול תכונות אלה בעת בחירת microRNA למיקוד; באופן אידיאלי, באמצעות microRNA שתפקידו יאומת באופן ניסיוני.

    היעילות של להשתקת גנים ממוקד הוא מושפע גם ההשלמה אחוז היעד אל microRNA בוגרת וכן את מספר העותקים של רצפי מיקרו-רנ"א-היעד מוכנס. האזור '5 של microRNA (נוקלאוטידים 2-8) מהווה את רצף זרע. מקובלכי אזור זה חייב להיות מושלם משלים מיקוד מוצלח 48, 49. רוב המחקרים להשתמש אלמנטים בתגובה עם השלמה מושלמת כי זה יכול להגביר את פעילות גנים-השתקה באמצעות קידום מחשוף endonucleolytic לפרוטוקול ומחזור המהיר של microRNA. מחשוף endonucleolytic זו מתרחשת רק כאשר microRNA אינטראקציה עם חלבון argonaute שיש לו פעילות endonucleolytic, אשר בתאי יונקים מוגבל argonaute-2. חלבונים argonaute אחרים לקדם השפלה mRNA על ידי deadenylation ולתקוף exonucleolytic לפרוטוקול. הקורא נקרא אזכור 4, 5, 13, 50, 51, 52 עבור תיאור מעמיק של biogenesis microRNA ותפקוד. הוא בדרך כלל חשב כי אינקרהקלת מספר העותק ותחזק את יעילות המיקוד. עם זאת, זה יכול גם להגביר רווית microRNA ולא תמיד מוכח יותר יעיל. לפעמים זה עדיף לשלב רצפי היעד עבור מיקרו-רנ"א שונים מרובים מועשר בתאי המטרה או להשתמש רצפי היעד המוכרים על ידי מיקרו-רנ"א מרובים. מספר העותק הנדרש הוא גם תלוי מאוד את כמות התעתיק שעליו תצטרך והשתקת השפע היחסי של microRNA בתאי המטרה. תמלילים כי יצטברו במהירות עשויים לדרוש יותר עותקים כדי למנוע מהם outcompeting רמות microRNA. ניסיוני קביעת מספר העותק האופטימלי עבור כל יעד microRNA שתוצאתו מיקוד מספיק, שומר כושר ויראלי, וכי מצמצם את שיעור מוטציות בריחה מומלץ.

    לוקליזציה של אלמנט תגובת microRNA בתוך הגנום הויראלי היא מאוד חשובה. תוצאה שלילית כאשר מנתחיםאת יעילות המיקוד לא תמיד אומרת הנגיף לא יכול להיות במיקוד microRNA. זה אולי פשוט מתכוון היעד אינו נגיש שמיקום או ההדחקה של הגן הממוקד אינה מספיקה כדי לעכב פתוגניות. רוב האלמנטים בתגובה מוכנסים לתוך אזורי 3 'המתורגמים (UTR) לפרוטוקול הממוקד. עם זאת, מיקוד מוצלח של הגנום נגיפי הושג ולפעמים מייצגים משופר יציבות גנטית כאשר אלמנטים בתגובה מוכנסים לתוך 'UTR 5 או בתוך אזורי הקידוד של גנים חיוניים 38. אתרי החדרה אופטימליים ייאפשרו נגישות גבוהה של רצף היעד על microRNA. נגישות יכולה להתעכב על ידי מבנים משניים RNA והפרעת stoichiometric. לכן, אלמנטים בתגובה לאיתור באזורים מובנים אשר שמורים ביותר היא נקודת התחלה טובה. הרצפים להיות מוכנסים עשויים להשפיע גם ולהיות מושפעת הרצפים שמסביב. Tהוס, מיקום אופטימלי עבור רצף יעד microRNA אחד אינו אופטימלי בהכרח עבור אלמנטי תגובה אחרים. בעוד אימות ואופטימיזציה ניסיון של לוקליזציה RE יש צורך, באמצעות תוכנת חיזוי (למשל http://unafold.rna.albany.edu/; http://rna.urmc.rochester.edu/software.html) לסנן אתרים להוסיף פוטנציאל עבור הפרעות של מבני RNA שמסביב מומלץ מאוד 53, 54.

    שימוש הכנות חומצה נקיות גרעין של יושרה גבוהה גם קריטי בהשגת התוצאות הטובות ביותר. טכניקת אספטי ותחזוקה של סביבת RNase ללא בעת טיפול תעתיקי רנ"א או מחק microRNA חיוני. עבור תעתיקי רנ"א תוצאות הטובים ביותר, מחק microRNA, ומניות וירוס טיטרציה סופיות צריכים להיות מאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס aliquots הקטן כדי למנוע קפיאה חוזרת הפשרה וכתוצאה מכך שפלת RNA ואובדן infectivity וירוס. כאשר בשימוש, מגיב אלה ים יש לשמור על הקרח בכל עת.

    חשוב לציין כי מיקרו-רנ"א רבים הם בני משפחה של מיקרו-רנ"א החולקות המשלימות. לכן כאשר עורכים מחקרים זה עשוי להיות מועיל לכלול בני משפחת microRNA מיידיות במטרה לשפר הערכה מיקוד-סגוליות. זה הופך להיות קריטי כאשר התאים שבתוכה שכפול נגיף הוא רצוי, להביע בני המשפחה (המשפחתי, למשל miR-Let7). כמו כן יש לציין כי assay הסגולית באמצעות מחקת microRNA היא מערכת מלאכותית יתר הביטוי של microRNA בתאים מסוימים עשויים לגרום לתופעות מחוץ היעד 55. במקרה זה, את הספציפיות ניתן להעריך גם בתאים המבטאים את מיקרו RNA המתאים באמצעות microRNA מעכבי במקום. assay זה יאפשר ניתוח של-סגוליות מיקוד על סמך readouts הכדאיות טיטרציה וירוס ותא בנוכחות רמות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של מיקרו-רנ"א.

    "jove_content"> הדאגות העיקריות בעת שימוש microRNA-מיקוד כשיטה לשלוט כמיהות ויראלי הן יציבות גנטית, פוטנציאל לתופעות מחוץ היעד, ואפקטי וירוס בתיווך על סביבת microRNA הסלולר 10, 11, 12, 13. וירוסים רבים להפגין את קצב המוטציות גבוהה ולברוח מוטציות שעלולות להתעורר במהירות. כולל מספר עותקים של רצף מטרה, לרבות יעדים יותר microRNA אחד, לאיתור המטרות בתוך אזורים המרובים השמורים ביותר, או בנוכחות גורמים אנטי נוספים ובן כמובן גם תגובה חיסונית יכול להקל על זה. בנוסף, החדרת חומר גנטי זר לתוך הגנום נגיפי תגרום שיכולת שכפול פחתה של הנגיף. במקרה זה, יעד microRNA צפוי להיות גנטי בלתי יציבים לברוח מוטציות יקומו מהר יותר. הכללה של ca עותקי יעד microRNA המרובהn גם להגדיל את הפוטנציאל למחיקת recombinatorial של מטרות microRNA. לכן, באופן ניסויי מספר עותק המינימלי הנדרש לצורך מיקוד מספיק הכרחי. לוקליזציה עותקי יעד microRNA במקומות שונים לאורך הגנום לעומת שימוש חוזר טנדם יכול לסייע לעקוף מגבלה זו. עם זאת, זיהוי תצורות RE אופטימליים עם המספר המזערי של עותקי יעד צורך ואתרי כנס שאינו נובע קינטיקה שכפול השונה של הווירוס הוא קריטי למזעור שיעור רקומבינציה ו מוטצית היעד. הכללה של עותקים רבים מדי של רצף יעד עשויה גם להגביר את הפוטנציאל רעיל מחוץ היעד אם התוצאה היא רווית microRNA. בשינוי גדול בסך של microRNA הזמין להסדרת חלבונים תאיים רגילים יכול לגרום לתופעות לא רצויות 55. לשם כך, וירוסים רבים לשנות את סביבת microRNA בתוך תא 56 ואם זהכוללת את microRNA הממוקד, את היעילות של רגולציה עשויה להיות ירידה אם שכפול נגיף מספיק נשמר. כל החששות האלה ניתן לפנות על ידי אופטימיזציה רכב אלמנט תגובה ו / או לוקליזציה עם הבנה מעמיקה של המערכת על כוונת ומגבלותיה.

    בעיות אופייניות הקשורות שיטות מיקוד אחרות כוללות הנחתה מחוץ היעד של הנגיף, אילוצי גודל חומר מיקוד גנטי וירוסים עם יכולות נושאת מוגבלות, חששות בטיחות הקשורים לוירוסי הנדסה למקד תאים כי הם בדרך כלל לא נגועים. MicroRNA מיקוד מאפשר ויסות של כמיהות ויראלי עם שינוי מזערי של הנגיף. זה דורש שטח מינימלי בתוך הגנום הנגיפי ויכול להיות מותאם המבוסס על מערך רחב ידיים של חתימות microRNA הסלולר. טכניקה זו אינה להציג tropisms חדש של וירוס ולכן אינו קובע ספקות בנוגע לבטיחות חדש. בנוסף, זההשיטה יכולה לשמש כדי לווסת tropisms מרובים בו זמנית באמצעות רצפי היעד עבור מיקרו-רנ"א שונים מרובים מועשר בתוך תאים מסוגים שונים 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61. זה יכול כל להיות מושלם בלי הפחתת הנגיף בתאים אשר אינם מבטאים את מיקרו RNA המתאים ולכן יכול לספק מנגנון לשיפור הבטיחות של וירוסים טיפולית עם עוצמה משופרת.

    ניצול של מכונות microRNA סלולריות יכול לשמש להסדרת הכמיהות של מעמדות שונות רבות של וירוסים. הפרוטוקולים המפורטים כאן נועדו להצלה והאפיון של picornavirus במיקוד microRNA, אולם הם יכולים להיות מותאמים לפי וירוס 'מחזור שכפול rea כתב המבוקשdouts. למרות וירוסים שונים יש אסטרטגיות הצלה ספציפי, רצפי היעד microRNA יכול להיות מוכנס לתוך הגנום הויראלי בין אם הגנום כולו מקודד פלסמיד יחיד או אם יש וירוס גנום DNA או RNA. כל עוד התאים המפיקים אינם מבטאים את רנ"א מאותו המקור, מטרות microRNA אופטימיזציה אסור לשבש הצלת וירוס. ניסויים לנתח קינטיקה צמיחת וירוס microRNA-מיקוד סגולי ניתן לשנות על ידי שינוי המועדים לפי השעון שנאספו מבוססים על האורך של סיבוב בודד של שכפול נגיף ועל readouts ספציפית / רעילות שכפולות נגיף (חלבוני כתב למשל, cytotoxicity, כימות הגנום, וכו '). חשוב לציין כי למרות טכניקה זו יכולה תיאורטית להיות מיושמת על כל סוגי וירוסים, גורמים רבים יכולים להשפיע על היעילות של שיטה זו. לדוגמא, וירוסי RNA שלילי במובן לא הוכיחו תגובה כמו וירוסי RNA חיובי במובן הנראה בשל ac המוגבלcessibility של RNA הגנומי אל מכונות מירנה 13. לפיכך, את המאפיינים הביולוגיים של כל סוג של וירוסים יהיה להקנות ואילוצים נוספים על אופטימיזציה RE. למרות מגבלות אלה, טכניקה זו מציעה שיטה חלופית למיקוד מחקר בהנחיית כמיהות ויראלי מעורבים הבטיחות, השירות, והבנה בסיסית של תהליכים ביולוגיים עבור כל סוגי וירוסים.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
    Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
    Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
    T4 DNA Ligase System NEB M0202S
    MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
    MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
    0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
    5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
    Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
    Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
    TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
    TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
    0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
    2 ml Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
    Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
    MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
    MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
    Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
    pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional Regulation of the Heterochronic Gene Lin-14 By Lin-4 Mediates Temporal Pattern Formation in C. Elegans. Cell. 75 (5), 855-862 (1993).
    2. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans Heterochronic Gene Lin-4 Encodes Small RNAs With Antisense Complementarity to Lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
    3. Ambros, V. The Functions of Animal MicroRNAs. Nature. 431 (7006), 350-355 (2004).
    4. Bartel, D. P. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
    5. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target Recognition and Regulatory Functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
    6. Benitez, A. A., Spanko, L. A., Bouhaddou, M., Sachs, D., Tenoever, B. R. Engineered Mammalian RNAi Can Elicit Antiviral Protection That Negates the Requirement for the Interferon Response. Cell Rep. 13 (7), 1456-1466 (2015).
    7. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Yalcin, A., Meyer, J., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of Tissue-Specific MicroRNAs From Mouse. Curr Biol. 12 (9), 735-739 (2002).
    8. Landgraf, P., et al. A Mammalian MicroRNA Expression Atlas Based on Small RNA Library Sequencing. Cell. 129 (7), 1401-1414 (2007).
    9. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: Tools for MicroRNA Genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
    10. Kelly, E. J., Russell, S. J. MicroRNAs and the Regulation of Vector Tropism. Mol Ther. 17 (3), 409-416 (2009).
    11. Brown, B. D., Naldini, L. Exploiting and Antagonizing MicroRNA Regulation for Therapeutic and Experimental Applications. Nat Rev Genet. 10 (8), 578-585 (2009).
    12. Tenoever, B. R. RNA Viruses and the Host MicroRNA Machinery. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 169-180 (2013).
    13. Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNAs and Oncolytic Viruses. Curr Opin Virol. 13, 40-48 (2015).
    14. Brown, B. D., Venneri, M. A., Zingale, A., Sergi Sergi, L., Naldini, L., L, Endogenous MicroRNA Regulation Suppresses Transgene Expression in Hematopoietic Lineages and Enables Stable Gene Transfer. Nat Med. 12 (5), 585-591 (2006).
    15. Brown, B. D., et al. A MicroRNA-Regulated Lentiviral Vector Mediates Stable Correction of Hemophilia B Mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
    16. Brown, B. D., et al. Endogenous MicroRNA Can be Broadly Exploited to Regulate Transgene Expression According to Tissue, Lineage and Differentiation State. Nat Biotechnol. 25 (12), 1457-1467 (2007).
    17. Ruiz, A. J., Hadac, E. M., Nace, R. A., Russell, S. J. MicroRNA-Detargeted Mengovirus for Oncolytic Virotherapy. J Virol. 90 (8), 4078-4092 (2016).
    18. Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. Engineering Attenuated Virus Vaccines By Controlling Replication Fidelity. Nat Med. 14 (2), 154-161 (2008).
    19. Barnes, D., Kunitomi, M., Vignuzzi, M., Saksela, K., Andino, R. Harnessing Endogenous MiRNAs to Control Virus Tissue Tropism as a Strategy for Developing Attenuated Virus Vaccines. Cell Host Microbe. 4 (3), 239-248 (2008).
    20. Perez, J. T., Pham, A. M., Lorini, M. H., Chua, M. A., Steel, J., Tenoever, B. R. MicroRNA-Mediated Species-Specific Attenuation of Influenza a Virus. Nat Biotechnol. 27 (6), 572-576 (2009).
    21. Saydaminova, K., et al. Efficient Genome Editing in Hematopoietic Stem Cells With Helper-Dependent Ad5/35 Vectors Expressing Site-Specific Endonucleases Under MicroRNA Regulation. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14057 (2015).
    22. Langlois, R. A., et al. MicroRNA-Based Strategy to Mitigate the Risk of Gain-of-function Influenza Studies. Nat Biotechnol. 31 (9), 844-847 (2013).
    23. Kelly, E. J., Hadac, E. M., Cullen, B. R., Russell, S. J. MicroRNA Antagonism of the Picornaviral Life Cycle: Alternative Mechanisms of Interference. PLoS Pathog. 6 (3), e1000820 (2010).
    24. Pham, A. M., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Replication in Cells of Hematopoietic Origin is Necessary for Dengue Virus Dissemination. PLoS Pathog. 8 (1), 1002465 (2012).
    25. Langlois, R. A., Varble, A., Chua, M. A., García-Sastre, A., Tenoever, B. R. Hematopoietic-Specific Targeting of Influenza a Virus Reveals Replication Requirements for Induction of Antiviral Immune Responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (30), 12117-12122 (2012).
    26. Chua, M. A., Schmid, S., Perez, J. T., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Influenza a Virus Utilizes Suboptimal Splicing to Coordinate the Timing of Infection. Cell Rep. 3 (1), 23-29 (2013).
    27. Griffiths-Jones, S. The MicroRNA Registry. Nucleic Acids Res. 32, D109-D111 (2004).
    28. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: MicroRNA Sequences, Targets and Gene Nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).
    29. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Integrating MicroRNA Annotation and Deep-Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 39, D152-D157 (2011).
    30. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Annotating High Confidence MicroRNAs Using Deep Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 42, D68-D73 (2014).
    31. Heckman, K. L., Pease, L. R. Gene Splicing and Mutagenesis By PCR-Driven Overlap Extension. Nat Protoc. 2 (4), 924-932 (2007).
    32. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. . , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5063/gel-purification (2016).
    33. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Ligation Reactions. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5069/dna-ligation-reactions (2016).
    34. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method (2016).
    35. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA From Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
    36. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
    37. Separation of RNA in Agarose Gels. Sourcebook for Electrophoresis. Lonza. , Available from: http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_BenchGuides_SourceBook_Section_VIII_-_Separation_of_RNA_in_Agarose_Gels.pdf 132-145 (2016).
    38. Kueberuwa, G., Cawood, R., Tedcastle, A., Seymour, L. W. Tissue-Specific Attenuation of Oncolytic Sindbis Virus Without Compromised Genetic Stability. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 154-165 (2014).
    39. Grundhoff, A., Sullivan , C. S. Virus-Encoded MicroRNAs. Virology. 411 (2), 325-343 (2011).
    40. Kincaid, R. P., Sullivan, C. S. Virus-Encoded MicroRNAs: An Overview and a Look to the Future. PLoS Pathog. 8 (12), e1003018 (2012).
    41. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental Strategies for MicroRNA Target Identification. Nucleic Acids Res. 39 (16), 6845-6853 (2011).
    42. Thomson, D. W., Dinger, M. E. Endogenous MicroRNA Sponges: Evidence and Controversy. Nat Rev Genet. 17 (5), 272-283 (2016).
    43. Mullokandov, G., et al. High-Throughput Assessment of MicroRNA Activity and Function Using MicroRNA Sensor and Decoy Libraries. Nat Methods. 9 (8), 840-846 (2012).
    44. Thomson, D. W., et al. Assessing the Gene Regulatory Properties of Argonaute-Bound Small RNAs of Diverse Genomic Origin. Nucleic Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
    45. Wu, S., et al. Multiple MicroRNAs Modulate P21cip1/waf1 Expression By Directly Targeting Its 3' Untranslated Region. Oncogene. 29 (15), 2302-2308 (2010).
    46. Vo, N. K., Dalton, R. P., Liu, N., Olson, E. N., Goodman, R. H. Affinity Purification of MicroRNA-133a With the Cardiac Transcription Factor, Hand2. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19231-19236 (2010).
    47. Arvey, A., Larsson, E., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Target mRNA Abundance Dilutes MicroRNA and siRNA Activity. Mol Syst Biol. 6, 363 (2010).
    48. Garcia, D. M., Baek, D., Shin, C., Bell, G. W., Grimson, A., Bartel, D. P. Weak Seed-Pairing Stability and High Target-Site Abundance Decrease the Proficiency of Lsy-6 and Other MicroRNAs. Nat Struct Mol Biol. 18 (10), 1139-1146 (2011).
    49. Jinek, M., Doudna, J. A. A Three-Dimensional View of the Molecular Machinery of RNA Interference. Nature. 457 (7228), 405-412 (2009).
    50. Pasquinelli, A. E. MicroRNAs and Their Targets: Recognition, Regulation and an Emerging Reciprocal Relationship. Nat Rev Genet. 13 (4), 271-282 (2012).
    51. Finnegan, E. F., Pasquinelli, A. E. MicroRNA Biogenesis: Regulating the Regulators. Crit Rev Biochem Mol Biol. 48 (1), 51-68 (2013).
    52. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of MicroRNA Biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
    53. Zuker, M. Mfold Web Server for Nucleic Acid Folding and Hybridization Prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
    54. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA Secondary Structure Prediction and Analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
    55. Khan, A. A., Betel, D., Miller, M. L., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Transfection of Small RNAs Globally Perturbs Gene Regulation By Endogenous MicroRNAs. Nat Biotechnol. 27 (6), 549-555 (2009).
    56. Skalsky, R. L., Cullen, B. R. Viruses, MicroRNAs, and Host Interactions. Annu Rev Microbiol. 64, 123-141 (2010).
    57. Sugio, K., et al. Enhanced Safety Profiles of the Telomerase-Specific Replication-Competent Adenovirus By Incorporation of Normal Cell-Specific MicroRNA-Targeted Sequences. Clin Cancer Res. 17 (9), 2807-2818 (2011).
    58. Fu, X., Rivera, A., Tao, L., De Geest, B., Zhang, X. Construction of an Oncolytic Herpes Simplex Virus That Precisely Targets Hepatocellular Carcinoma Cells. Mol Ther. 20 (2), 339-346 (2012).
    59. Yao, W., Guo, G., Zhang, Q., Fan, L., Wu, N., Bo, Y. The Application of Multiple MiRNA Response Elements Enables Oncolytic Adenoviruses to Possess Specificity to Glioma Cells. Virology. 458-459, 69-82 (2014).
    60. Bofill-De Ros, X., Gironella, M., Fillat, C. Mir-148a- and Mir-216a-regulated Oncolytic Adenoviruses Targeting Pancreatic Tumors Attenuate Tissue Damage Without Perturbation of MiRNA Activity. Mol Ther. 22 (9), 1665-1677 (2014).
    61. Baertsch, M. A., et al. MicroRNA-Mediated Multi-Tissue Detargeting of Oncolytic Measles Virus. Cancer Gene Ther. 21 (9), 373-380 (2014).

    Tags

    אימונולוגיה גיליון 120 microRNA microRNA-מיקוד picornavirus oncolytic כמיהות וירוס cytotoxicity שכפול ביטוי גנים
    תקנה מבוססת MicroRNA של Picornavirus כמיהות
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Ruiz, A. J., Russell, S. J.… More

    Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (120), e55033, doi:10.3791/55033 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter