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Immunology and Infection

피 코르 나 바이러스과의 바이러스 친 화성의 마이크로 RNA-기반 규제

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/55033

Introduction

제한된 친 화성을 가진 벡터 엔지니어링에 대해 광범위하게 적용 할 수있는 간단하고 효과적인 방법의 개발은 안전성, 생물학적 이해와 바이러스의 치료 유틸리티를 향상시키는 중요한 기회를 제공한다. 여러 가지 메커니즘은 transductional, 전사 및 번역 기반 기술을 포함하여 바이러스 친 화성을 대상으로 존재한다. 그러나 이러한 방법은 표적 세포에 결함 신호 전달 경로가 필요하거나 바이러스 게놈에 큰 코딩 서열의 삽입을 요구할 수있다, 모든 벡터 시스템에 일반적으로 적용되지 않습니다. 또한 이러한 방법은 크게 자신의 치료 활동을 방해하고 수정되지 않은 시스템에 대한 통찰력을 제한, 바이러스의 감쇠가 발생할 수 있습니다.

마이크로 RNA는 진핵 세포의 유전자 침묵을 매개 비 코딩 RNA를 작은 (22 ~ 25 뉴클레오티드)이다. (mRNA의) resulti 메신저 RNA를 보완 대상 시퀀스 (응답 요소)를 결합하여 마이크로 RNA 기능 성적 증명서의 불안정, 저하 또는 번역 억압에서 NG. 마이크로 RNA는 일반적으로 부분적으로 상보성 응답 요소를 결합하여 유전자 발현을 1, 2, 3, 4, 5의 작은 변형을 얻었다. 유전자 발현의 더 중요한 변화는 반응 요소 (6)의 보완을 증가시킴으로써 달성 될 수있다. 성숙 마이크로 RNA 수천 세포 및 조직 유형 7, 8, 9의 다양한 종 많은 전시 차등 발현 양상의 다양한 확인되었다. 이러한 마이크로 RNA 서명은 바이러스 게놈 (10)에 완벽하게 상보 응답 요소를 도입하여 바이러스 증폭 셀 고유의 제한을 위해 이용 될 수있다= "외부 참조"> 11, 12, 13. 이 마이크로 RNA-타겟팅 기술의 전체 목표는 추가적인 감쇠없이 벡터 게놈의 친 화성을 제어 할 수있다.

바이러스의 친 화성을 조정하기위한이 방법의 유용성은 원래 특정 조직 14, 15, 16에서 유전자 발현을 제한하는 렌티 바이러스 벡터의 입증되었다. 이 기술은 계속해서,도 17를 복제 정상 조직 10, 11, 12, 13, 원하지 않는 부작용을 제거하여 다수의 온 콜리 틱 바이러스의 안전성 프로파일을 개선 할뿐만 아니라 개선 된 유전자 치료를위한 바이러스 벡터 비 복제의 광대 한 배열에 적용된 . 또한, 안전하고 전자를 생성하기 위해 이용 된ffective 생균 백신과 바이러스 백신 제조는 18, 19, 20, 21를 처리 향상시킬 수있다. 제조자 시스템에서 야생형 성장 수준을 유지하면서, 마이크로 RNA-타겟팅 벡터 접종 호스트 또는 타겟 시스템의 감쇠를 허용 할 수있다. 마이크로 RNA-타겟팅도 다른 호스트 (22) 내의 전송을 유지하면서, 하나의 종 (예 : 인간)에 송신을 제한함으로써 연구 목적을위한 바이러스의 생물 안전성을 향상 시키는데 사용될 수있다. 최종적으로 심층 바이러스 성장 23, 24, 25, 26을 분리하는함으로써 바이러스 생활주기와 병원성 및 면역 세포 유형의 특정 역할을 분석 할 수 있도록 마이크로 RNA는 타겟팅.

이 기술은 고도을 제공합니다모든 바이러스 시스템에서 쉽게 구현 방법 및 적용 타겟팅 ernative. 또한, 특정 세포 유형에 차등 발현 패턴을 가진 성숙한 마이크로 RNA의 끊임없이 확장 컬렉션이 기술은 매우 다양한 있습니다. 마이크로 RNA-기반 타겟팅 시스템의 기능을 손상시키지 않으면 서 바이러스 시스템의 다양한 효능이 입증되었다. 이 기술의 주요 제한은 시행 착오 최적화, 탈출 돌연변이의 가능성, 그리고 내생 성적 증명서에 잠재적 인 오프 대상 효과를 포함한다. 그러나, 이러한 제한은 일반적으로 최적화 합리적인 반응 요소 디자인 극복 될 수있다. 포지티브 - 센스 RNA 바이러스는 그들의 게놈의 포지티브 - 센스 방향과 완전히 세포질 복제 사이클 동안 마이크로 RNA 기계에 사체의 가용성에 마이크로 RNA-타겟팅 특히 반응 경향이있다. 여기서 우리는 마이크로 RNA-대상으로 피 코르 나 바이러스과의 바이러스와 experim를 생성하기위한 프로토콜을 설명ental 방법은 시험관 타겟팅의 효율성과 특이성을 확인합니다.

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Protocol

바이러스 게놈에 1. 복제 마이크로 RNA 응답 요소

  1. 디자인 마이크로 RNA 반응 요소 삽입.
    1. 원하는 마이크로 RNA와 해당 표적 서열을 확인합니다. 여러 데이터베이스는 성숙한 마이크로 RNA 서열 사용할 수 있습니다. 대상 : http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30.
  2. 벡터 게놈 또는 전 사체를 코딩하는 플라스미드 DNA로 반응 요소를 복제.
    주 : 둘 이상의 카피 응답 요소를 삽입하는 독특한 제한 부위를 사용하여 쉽게 더 다재다능하다.
    1. 응답 요소 또는 스플 라이스 오버랩 확장 (SOE) PCR을 사용하여 고유 제한 사이트를 삽입합니다. 이 방법은 상세 (31)에 설명되었다.
    2. 삽입하는 제한 효소 부위를 사용하는 경우 끝까지 마음상업적으로 합성, PAGE 정제 감각과 독특한 제한 사이트 (그림 2)의 오버행 서열에 의해 측면 삽입 서열을 코딩하는 안티센스 ultramers을 쫓아.
    3. 하여 온도 감소를 10 분 동안 85 ° C에서 반응 배양 의해 O.가 ultramers 어닐링 1X의 최종 농도 0.5 μg의 센스 ultramer 0.5 μg의 안티센스 ultramer, DNA 결찰 완충액을 결합하고, H 2 50 μL를 가지고 0.5 ° C 반응 할 때까지 매 30 초 25 ° C에 도달한다.
    4. 새로운 독특한 제한 부위, 배속 최종 농도 효소 완충액 적당한 제한 효소 1 μl를 코딩하는 벡터 DNA 0.5 μg의 결합, 그리고 37 ℃에서 H 2 O. 다이제스트 벡터 20 ㎕의 최종 부피를 가지고 2 시간 동안. 아가 로스 겔 정제 (32)에 의해 선형화 된 DNA를 정제 하였다.
    5. 16 ℃에서 하룻밤 분해 벡터로 어닐링 ultramers을 결찰; C는 3 사용 : 1 ultramers을 : 벡터 몰 비율과 표준 결찰 기술 33.
      주 : 삽입 한 제한 효소 부위를 사용하는 경우는 분해 ​​된 벡터의 끝을 탈 인산 및 어닐링 된 올리고 뉴클레오티드의 말단을 인산화하는 것이 더 효율적일 수있다.
    6. 열충격 방법 (34)을 사용하여 E. 콜라이 DNA 결찰로 변환.
      주 : 바이러스 게놈을 인코딩하는 플라스미드 따라서 변환 효율을 증가시킬 수있다 큰 DNA 구조체를 통풍 관 최적화 적격 세포를 이용하여 일반적으로 크다.
    7. 시판 정제 키트 (35)를 사용하여 개별 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 정제 하였다. 삽입 영역 (36)을 시퀀싱하여 올바른 방향으로 마이크로 RNA 응답 요소 (그림 2)와 적절한 복제를 확인합니다.

2. 이리저리 마이크로 RNA-대상으로 피 코르 나 바이러스과의 바이러스를 구출m 플라스미드 DNA

  1. 구조 동족 마이크로 RNA (들)을 표현하지 않는 바이러스 복제를 허용 세포주에서 피 코르 나 바이러스과의 바이러스를 마이크로 RNA는 타겟. 그들은 miR-142 미르-124, 또는은 miR-125을 표현하지 않기 때문에이 프로토콜은 그러나이 구조에 대한 H1-HeLa 세포를 사용할 필요가 없습니다, H1-HeLa 세포를 사용합니다.
    주의 : 감염성 병원체의 안전한 취급 및 폐기에 대한 모든 지침을 철저히 준수해야한다.
    1. 그들은 ~ 형질의 시간 (24 시간 게시물 시드)에서 80 % 융합이되도록 6 웰 플레이트에 판 H1-HeLa 세포. DMEM의 웰 당 2 ㎖의 플레이트 세포를 10 % 소 태아 혈청.
    2. 실온으로 형질 감염 시약을 따뜻하게. 혼합 부드럽게 250 μL의 혈청이없는 배지, 플라스미드 DNA 부호화 마이크로 RNA 표적 게놈 2.5 μg의 한 무균 마이크로 원심 튜브에서 형질 전환 시약 7.5 μL 피펫과 결합. 15-30 분 동안 실온에서 혼합물을 인큐베이션.
    3. 기음도금 세포에서 미디어와 신선한 전체 미디어의 2 mL를 넣고.
    4. 6 웰 플레이트 드롭 현명 잘 하나에 단계 2.1.2에서 전체 형질 전환 혼합물을 추가합니다. 잘의 다른 영역에 각 드롭을 추가합니다.
    5. 세포 변성 효과 (CPE) 또는 리포터 단백질 (24-72 ~ H) 검출 될 때까지 37 ℃에서 세포를 인큐베이션.
  2. 수확 및 통로 신선한 세포 상에 구출 바이러스.
    1. 6 웰 플레이트에 플레이트 세포는 감염의 시간 (24 시간 게시물 시드)에서 80~90% 합류이되도록.
      참고 : 모든 후속 실험에 필요한 바이러스의 양에 따라 아래로 수직 또는.
    2. 고무 세포 스크레이퍼 또는 고무 경찰관을 이용하여 상층 액에 세포를 긁어하여 각 웰 구조를 수확. 부드럽게 잘 하단에 스크레이퍼를 드래그합니다. 극저온 저장 튜브에 세포와 뜨는을 전송합니다.
    3. 샘플을 두 번 해동 / 정지 다음에 의해 세포 파편 펠렛4 ° C에서 5 분 동안 1,200 XG에 원심 분리.
    4. 회 0.2 μm의 주사기 필터를 사용하여 상등액 클리어 필터. 필터링 된 구조의 상층 액은 바이러스를 포함하고 있습니다.
      주 : 필터의 기공 크기는 바이러스 입자의 크기에 따라 다를 수 있으며 많은 바이러스에 적용 할 수 없다.
    5. 도금 세포에서 대기음 매체는 혈청이없는 미디어로 한번 씻어 각 웰에 신선한 혈청이없는 배지 1 ㎖를 추가합니다.
    6. 필터링 된 구조의 상층 액을 잘 당 50 μL를 추가하고 부드럽게 골고루 바이러스를 배포 할 판 바위.
    7. 비법 인 바이러스를 제거하기 위해 각 웰에서 2 시간 후 흡인 미디어 37 ° C에서 접시를 품어.
    8. 잘마다 신선한 전체 미디어의 1.5 mL를 넣고 및 CPE 또는 리포터 단백질이 명백한 때까지 (~ 24 ~ 48 시간)을 37 ° C에서 품어.
    9. 반복 2.2.4에 2.2.2 단계를 반복합니다. 필터링 된 구조의 상층 액을 바이러스 주식을 포함한다. -80 °에서 극저온 저장 튜브 일회용 씩에 보관 바이러스 주식기음.

3. 시험 관내 전사 RNA 성적 증명서에에서 마이크로 RNA-대상으로 바이러스를 구출

  1. 상류 프로모터를 사용하여 마이크로 RNA-대상으로 바이러스 게놈을 암호화하는 플라스미드 DNA에서 RNA 전 사체를 생성합니다.
    참고 : 클레아없는 환경을 생성하고 유지하기위한 표준 관행이 이후의 모든 단계에 사용한다.
  2. 사체의 하류 효소 제한 부위를 사용하여 플라스미드 DNA 선형화. 5 μg의 플라스미드 DNA, 1X 최종 농도 효소 완충액 3 ㎕를 제한 효소를 결합하고 3 시간 동안 H 2 O. 인큐베이션 50 μL를 37 ℃에서 반응을 가져온다.
  3. 0.5 M EDTA의 1/20 번째 볼륨, 1/10 일 볼륨 5 M NH 4 아세테이트 및 소화 반응에 100 % 에탄올 2 볼륨을 추가하고 혼합한다. 하룻밤에 최대 1 시간 동안 -20 ° C에서 품어.
  4. 4 ℃에서 17,000 XG에서 10 분 동안 침전 된 DNA를 펠렛. supernata을 붓고NT, 차가운 70 % 에탄올 500 μL에 펠렛을 재현 탁하고 4 ℃에서 10 분 동안 17,000 × g으로 원심 분리하여 DNA 펠렛.
  5. 30 초 동안 다시 뜨는 원심 분리기를 따르십시오. 피펫으로 잔류 뜨는을 제거하고 펠렛을 공기 건조. 0.5 μg의 / μL의 농도로 멸균 뉴 클레아없는 H 2 O의 DNA 펠렛을 재현 탁.
  6. 실온에서 시험 관내 전사 된 시약을 해동하고 얼음에 리보 배치 (글리세롤 효소는 고정되지 않고 얼음에 직접 이동한다). 반응물을 실온에서 버퍼를 유지한다.
  7. 2 μL를 조합하여 PCR 튜브에서 전사 반응을 조립 ATP, CTP, GTP, 및 UTP 솔루션 2 μL 배 반응 완충액, 1 μg의 선형화 된 DNA 2 ㎕의 효소 및 뉴 클레아 제 20 μL의 최종 부피를 가지고 각 - 무료 H 2 O
  8. 2 시간 동안 37 ° C에서 반응을 품어.
  9. RNA의 성적 증명서를 정화.
  10. 용출 용액 (-예열되지 않음) 100 μL에 전사 반응을 가져옵니다. 바인딩 솔루션 농축액 350 μL 반응에 100 % 에탄올 250 μL를 추가하고 혼합한다.
  11. 12,000 x g에서 1 분 동안 수집 튜브에서 원심 분리에 삽입되는 필터 카트리지에 샘플을 이동. 흐름 -을 통해 폐기하십시오.
  12. g X 12,000에서 1 분 동안 필터 카트리지와 원심 분리기로 세척 용액 500 μL를 추가합니다. 폐기 흐름을 통해. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. 폐기 흐름을 통해. 잔류 에탄올을 제거하기 위해 12,0000 XG에서 1 분 동안 원심 분리기.
  13. 깨끗한 포집 관에 필터 카트리지를 전송하고 필터 카트리지로 예열 용출 용액 50 μL를 추가한다. 12,000 X g에서 1 분간 원심 분리기. 용리액 계속 100 ㎕의 총 부피에 대한이 용출 단계를 반복정제 된 RNA 전 사체를 aining. 필터 카트리지를 폐기합니다.
  • 260 및 280 nm에서 샘플의 흡광도를 측정하고, 비어 램버트 법칙을 사용하여 용출액에서 RNA 농도를 결정한다.
  • RNA 겔 전기 영동 (37)를 사용하여 RNA의 무결성을 평가한다. 좋고 나쁜 RNA의 무결성의 예 그림 3을 참조하십시오. RNA는 단일 사용 튜브에 분주 및 무결성을 유지하기 위해 -80 ℃에서 보관해야한다.
  • 실온이 형질 전환 시약. 섞어 부드럽게 250 μL 혈청이없는 미디어, 정제 된 RNA 전 사체의 2.5 μg의 부스트 솔루션의 5 μL 및 멸균 microcentrifuge 관에서 형질 전환 시약의 5 ​​μL과 피펫을 결합합니다. 2-5 분 동안 혼합물을 실온에서 인큐베이션.
  • 그들은 ~ 형질의 시간 (24 시간 게시물 시드)에서 80 % 융합이되도록 6 웰 플레이트에 판 H1-HeLa 세포. DMEM의 웰 당 2 ㎖의 플레이트 세포를 10 %의 FET 보충알 혈청.
  • 도금 세포에서 미디어를 대기음 신선한 전체 미디어의 2 mL를 넣어.
  • 6 웰 플레이트 드롭 현명 잘 하나에 단계 3.12에서 전체 형질 전환 혼합물을 추가합니다. 잘의 다른 영역에 각 드롭을 추가합니다.
  • 세포 변성 효과 (CPE) 또는 리포터 단백질 (24-72 ~ H) 검출 될 때까지 37 ℃에서 세포를 인큐베이션.
  • 2.2 2.2.9에 단계에 설명 된대로 마이크로 RNA-대상으로 바이러스의 구조를 계속합니다.
  • 4. 계산에 의해 바이러스 주식을 적정 50 %의 조직 문화 전염성 선량 (TCID 50)

    1. DMEM에서 웰 당 104 세포로 96- 웰 플레이트에 플레이트 H1-HeLa 세포를 10 % 소 태아 혈청. 하룻밤 37 ° C에서 세포를 품어.
      참고 : 동족 마이크로 RNA를 발현하지 않는 바이러스 복제에 대한 허용 세포에서 바이러스를 적정한다.
    2. 혈청 1 ㎖ 총 부피에서 바이러스의 10 배 희석액을 각각 만들미디어.
      참고 : 더 정밀도가 필요한 경우 낮은 희석을 사용합니다.
      참고 : 바이러스가 조언에 충실 할 수 있습니다 각 희석 후 변경 팁 역가의 과대 평가를 방지합니다.
    3. 도금 HeLa 세포에서 측면과 흡인 미디어 팁 96 웰 플레이트. 당 각각의 바이러스 희석 100 μL 아니라 96 웰 플레이트 (희석 당 1 행)의 8 우물을 추가합니다. 1 행과 컨트롤에 대한 접시에 12 행에 바이러스없이 혈청이없는 미디어의 100 μL를 추가합니다.
      참고 : 항상 흡인 및 세포 분리를 방지하기 위해 잘 좌우로 끝을 터치하여 우물에 미디어를 추가 할 수 있습니다.
    4. 2 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어. 옆으로 팁 플레이트와는 우물에서 미디어를 대기음.
      참고 : 각 희석 행 사이의 변경 팁.
    5. 각 웰에 전체 매체의 100 μl를 추가합니다. 72 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
    6. 현미경 우물을 시각화하고 CPE에 대한 각 웰 양 또는 음을 표시합니다.
    7. 다음 식으로 각각의 바이러스 역가를 계산 : 소호10 g (TCID 50 / mL)을 L + D (S-0.5) + 10 (1 / V)를 기록 =. L은 모든 우물 양성하는 테스트 곳 바이러스 희석의 부정적인 로그 (10)이다. D는 희석 계수의 로그 (10)이다. S는 각각의 비율 (PI)의 합이다. PI 양성 웰 / 희석액 웰 당 총량의 각각의 희석 (양의 계산 된 비율이다. V는 접종의 부피 (㎖ / 웰)이다.

    1 번 테이블
    표 1 : TCID (50)를 계산하여 감염성 바이러스 입자를 정량화. 세포의 대표 결과 바이러스 주식의 10 배 희석 일련의 감염. 모든 우물이 CPE에 대한 긍정적 마지막 희석 10-4 때문에 "L"은 4 동일합니다. "D"는 10부터 10 배 희석액의 로그 10사용 1. "S"에 따라서 동일하고 각각의 비율의 합이다. 이 예에서는 각각의 비율은 1.0, 0.875, 0.375, 0.125, 0. 이들의 합 (S) 2.375이다이다. "V"는 처음 세포 감염에 사용 된 용액의 부피 접종이다.

    단일 단계 성장 속도론 5. 마이크로 RNA-대상으로 효능 평가

    1. 이 분석에 대한 컨트롤이 아닌 대상 또는 비 기능적 응답 요소를 포함하는 모의 감염된 세포, 수정되지 않은 바이러스 및 바이러스를 포함한다.
    2. 그들이 감염 시간 (24 시간 후 시드)에서 80-90% 합류이되도록 12 웰 조직 배양 플레이트의 시간 코스 실험용 접시 H1-HeLa 세포. DMEM에서 플레이트 셀 웰 당 1 ㎖의 10 % 소 태아 혈청.
      주 : 각 시점에 대해 별도의 판을 판에 추천합니다. 이 프로토콜은 8 ~ 12 시간 복제 사이클 바이러스에 대한 7 가지 시점을 사용합니다. H1-HeLa 세포는 이것을 수행하기 위해 요구되지 않는다ssay. 이 분석은 대상 마이크로 RNA를 발현하지 않는 허용 세포에서 수행해야합니다. 이 분석은 또한 선택적 압력 하에서 성장 동역학을 평가하기 위해 동족 마이크로 RNA를 발현하는 세포 내에서 수행 될 수있다.
    3. 우물에서 대기음 미디어. 각 웰에 무 혈청 배지 0.5ml를 첨가하여 웰 워시 웰에서 플레이트 및 흡 매체 소용돌이 친다. 각 웰에 신선한 혈청이없는 미디어 0.5 ML을 추가합니다.
    4. 감염의 높은 다수의 각을 잘 감염 (MOI; 셀 당 감염성 입자의 수) 모든 셀이 감염 얻을 수 있도록. 이 프로토콜은 3의 MOI를 사용합니다.
      1. MOI의 농도가 3 백 당 μL를 =에 무 혈청 배지에서 바이러스 주식을 희석. 일곱 가지 우물에 바이러스 희석 100 μL를 각각 추가하고 2 시간 동안 37 ° C에서 품어.
      2. 모든 우물에서 미디어를 대기음하고, 잘 당 0.5 mL의 전체 미디어를 추가 부드럽게 흔들 다음 흡입에 의해 두 번 씻는다.
    5. (c)의 1 mL를 넣고omplete 각 매체 잘 원하는 시점까지 37 ° C에서 품어.
    6. 2, 4, 6, 8, 10, 24 및 48 시간 후 감염 (시점 당 웰)에서 바이러스 적정을 채취. 극저온 저장 튜브에 잘에서 미디어의 700 μL를 전송합니다. 부드럽게 웰 전체에 걸쳐 고무 스크레이퍼를 이동시킴으로써 잔여 상층 액에 세포를 긁어. 상등액 700 μL를 포함하는 대응하는 극저온 저장 튜브에 세포 / 상층 액을 이동.
      참고 : 오염 된 샘플의 결과로 근근이 살아가고 동안 잘 다른에 하나에서 뜨는 스플래시 않도록해야합니다. 튀는을 최소화된다고하기 전에 700 μL를 전송.
    7. -80 ° C에서 장소 샘플 모든 샘플을 수집 할 때까지.
    8. 일시 정지 / 샘플 세 번 해동하고 4 ° C에서 5 분 동안 1,200 XG에서 샘플을 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다.
    9. 제 4 항에 기재된 바이러스를 적정하고 t 위에 성장 동력학 비교IME.

    사용 분석을 바이러스 확산 합성 마이크로 RNA를 모방 6. 마이크로 RNA-대상으로 특이성이 평가

    주 : 마이크로 RNA-대상의 상호 작용 : 합성 마이크로 RNA의 모방의 사용은 마이크로 RNA의 특이성을 보여주기 위해 수행된다.

    1. 모의 형질을 포함, 음성 대조군 마이크로 RNA는 모방과 실험 마이크로 RNA는 모든 분석은 마이크로 RNA-매개 독성을 평가하기 위해 만 컨트롤 모방. 거짓 제외 될 수 있습니다 양성 대조군 (즉, 마이크로 RNA-대상으로 유전자 또는 게놈) 마이크로 RNA를 모방의 낮은 형질 전환 효율을 포함하는 것이 이상적이다.
    2. 그들은 형질 전환 시간 (24 시간 후 시드)에서 80~90% 합류이되도록 96 웰 조직 배양 접시에 접시 H1-헬라 세포. DMEM에서 플레이트 세포는 웰 당 0.1 ml의에서 10 % 소 태아 혈청.
      주 : 동족 마이크로 RNA를 발현하지 않는 바이러스 복제에 대한 허용 세포에서이 분석을 수행합니다.
    3. 따뜻한 번째실온 전자 형질 전환 시약. 9 μL의 혈청이없는 매체, 마이크로 RNA 모방 주식의 웰 당 200 nM의 최종 농도, 0.18 μL 부스트 시약, 0.18 μL 형질 전환 시약을 결합하고 혼합한다. 2-5 분 동안 혼합물을 실온에서 인큐베이션.
      참고 : 나열된 볼륨은 물론 당합니다. 마스터 믹스의 일관성을 유지하고 피펫 오류를 최소화하기 위해 모든 웰의 형질 전환을위한 조립하는 것이 좋습니다. 마이크로 RNA 모방의 최적 농도에 따라 달라질 수 있습니다. 마이크로 RNA와 함께 제공되는 제조업체의 지침에 합리적인 시작 농도 모방 참조하십시오. 이것은 일반적으로 5-200 nM의 최종 농도 범위 일 것이다.
    4. 우물에서 미디어를 대기음 신선한 전체 미디어의 92 μl를 추가합니다.
      주의 : 샘플의 상당수가있는 경우, 종래 형질 용액 조립이 단계를 완료하기 전까지 37 ° C에서 플레이트를 저장한다.
    5. 전체 형질 전환 혼합물 내가 추가N 드롭 현명한 세포에 6.3 단계.
    6. 6 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
    7. 세포의 낮은 비율을 보장하기 위해 낮은 MOI에서 잘 각각 감염은 바이러스 확산의 분석을 허용하는 감염. 이 프로토콜은 0.2의 MOI를 사용합니다.
      1. MOI의 농도가 0.2 (100) 당 μL를 =에 무 혈청 배지에서 바이러스 주식을 희석. 우물에서 미디어를 제거하고 잘 당 바이러스 희석의 100 μL를 추가합니다.
      2. 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
    8. 물론 각에서 대기음 매체와 신선한 전체 미디어의 100 μL를 추가합니다.
    9. 20 ~ 22 시간 동안 37 ° C에서 품어.
    10. 상층 액에서 바이러스의 적정을 결정합니다.
      1. 각 웰의 상층 액을 수집하고 신선한 전체 미디어의 100 μL로 교체합니다.
        주 : 현탁 세포를 사용하는 경우, 신선한 전체 미디어 100 μL의 다음 단계에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 생존력 분석을 위해 잘 샘플 리턴한다.
      2. cellu를 제거4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 원심 분리에 의해 수집 된 상층 액에서 LAR 파편.
      3. 새로운 튜브에 클리어 뜨는을 전송하고 4 절에 설명 된대로 동족 마이크로 RNA를 발현하지 않는 허용 세포에 감염 바이러스를 적정한다.
        주 : 감염의 손실을 방지하기 위해 얼음에 모든 샘플을 보관하십시오.
    11. 세포의 생존을 결정합니다.
      1. MTT의 10 μL 잘 당 (3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5- 디 페닐 브로마이드) 시약을 추가합니다.
      2. 보라색 침전물이 보일 때까지 2-4 시간 동안 37 ° C에서 품어.
      3. 세제 시약 100 μL를 추가합니다.
      4. 2 시간 동안 어둠 속에서 실온에서 인큐베이션.
      5. 570 nm에서 모든 웰의 흡광도를 참조하십시오.
        참고 : %의 세포 생존 능력의 비교를 위해 형질 감염된 세포를 조롱하는 모든 샘플을 정상화.

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    Representative Results

    표 1은 피 코르 나 바이러스과의 바이러스에 대한 적정 분석의 전형적인 결과를 나타내고, 50 % 조직 배양 감염 용량을 계산하는 방법을 설명한다. 이 논문에 기재된 바이러스 향성의 마이크로 RNA 기반 규제의 전반적인 개념의 개략도는 세포 내 작용 어닐링 플라스미드 삽입 반응 요소 올리고 뉴클레오티드의 적절한 설계 동안 반응 요소에도 1의 마이크로 RNA의 방향에 도시 한되고 시험 관내 전사를위한 마이크로 RNA 표적 바이러스 게놈을 코딩하는 플라스미드 DNA의지도 2.도 3은 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 가시화 무결성을 다양한 각도에서 RNA 전 사체를 도시도에 도시된다. 원격 교육 내에서 3A 레인 2에 잔류 불순물과 같이 적절한 처리 및 DNA의 사용은 적절하게 전사 RNA 전 사체 발생합니다 불순물이없는 템플릿음 공인 DNA 템플릿 또는 클레아 미량는 3A 레인에서 관찰 된 것과 유사한 부적절 전사 RNA 및 / 또는 분해물의 낮은 레벨을 초래할 수있다 (3) 등을 초래할 것이다 잔류 에탄올 등의 불순물의 많은 양을 함유하는 플라스미드 DNA 또는 DNA의 불완전한 선형화 3A 레인 4, 5도 3에 나타낸 부적절한 전사 및 저하 제품은 깨끗한 RNA 전 사체의 형질 다음 Mengovirus 매개 세포 변성 효과 (CPE)의 이미지를 보여줍니다. 변성 및 마이크로 RNA 타겟 Mengovirus의 성장 동역학을 평가 시간 코스 실험도 4 표시 나타내는 데이터. 결과는 Mengovirus 게놈으로 설계된 마이크로 RNA 반응 요소 동족 마이크로 RNA 중 하나를 발현하지 않는 H1-HeLa 세포에서 바이러스 복제의 동역학을 변화시키지 않는다는 것을 나타낸다. 그러나, 마이크로 RNA-125의 중간 수준 및 마이크로 RNA-14의 높은 수준을 표현 RAW 264.7 대 식세포에서해당 반응 요소를 코딩이 바이러스는 마이크로 RNA 발현의 수준과 상관 복제 억제 동력학을 표시. 그림 5의 데이터는 Mengovirus의 친 화성의 마이크로 RNA 기반 규제의 특이성을 보여줍니다. H1-HeLa 세포에 각 마이크로 RNA의 과발현은 특히 전파 (낮은 바이러스 역가) 및 동족 마이크로 RNA 반응 요소를 코딩 Mengovirus의 독성 (세포 생존 증가)을 억제한다.

    그림 1
    그림 1 : 바이러스 친 화성의 마이크로 RNA 기반 규제의 도식 표현. 바이러스 게놈에 통합 마이크로 RNA 응답 요소 (RE)는 특정 세포 유형 내에서 농축 동족 마이크로 RNA에 의해 인식과 바이러스 성 성적 증명서 / 게놈의 대상이 저하 될 것입니다. 이 막을 바이러스 복제, 확산 및 독성 토륨하기E는 셀 주변. 그러나, 바이러스 복제 바이러스 전파, 확산 및 세포 사멸에 대한 허용 동족 마이크로 RNA를 발현하지 않는 세포에서 유지됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 2
    그림 2 : 마이크로 RNA 반응 요소 디자인. 성공적으로 완벽하게 보완되어야 RE의 씨앗 시퀀스 지역을 타겟팅 (A). 리는 그것이의 mRNA 전 사체 및 / 또는 바이러스 게놈의 동족 성숙 마이크로 RNA에 의해 인식 될 수있는 바이러스 성 게놈 내에 배향한다. RE들의 대부분은 성적 증명서의 3 'UTR 내에 배치된다. (B)을 포함하는 탠덤 개의 RE를 코딩 적절하게 설계 및 어닐링 된 올리고 뉴클레오티드 묘사를 XhoI 제한 효소 부위의 돌출 뉴클레오타이드 어귀 마이크로 RNA 표적 서열 (miRT)를 반복한다. 탠덤 반복 입술을 설계 할 때, 각각의 마이크로 RNA-대상 복사본 사이에 스페이서 뉴클레오티드를 (일반적으로 4-6)를 포함해야합니다. (C) 플라스미드 DNA의 3 'UTR하는 T7 프로모터에 통합 RE 및 시험 관내 전사를위한 선형화 독특한 제한 부위 전체 길이의 바이러스 게놈을 인코딩하는 단계를 포함한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 3
    그림 3 : 게놈 인코딩 RNA 전 사체에서 바이러스의 구조. 증명서의 무결성을 평가하는 피 코르 나 바이러스과의 바이러스 게놈을 코딩하는 시험 관내 전사 된 RNA는의 (A) RNA 겔 전기 영동. 레인 1 : RNA 사다리. 레인 2 : 제대로 높은 무결성 RNA를 전사. 레인 3 : 중간 무결성 RNA 전 사체. 높은 밴드는 정확한 크기와 낮은 밴드 잠재적으로 분해 제품 또는 원하지 않는 RNA 전 사체입니다. 레인 4 : 잘못 RNA를 전사. 레인 5 : 낮은 무결성 RNA. 시험 관내 전사 RNA의 500 NG 잘 당로드했습니다. 부적절한 전사 또는 분해 제품으로 인해 낮은 순도 또는 불완전하게 선형화 된 DNA의 사용 가능성이있다. Mengovirus을 코딩하는 RNA 전 사체 형질 모의 형질 H1-HeLa 세포 및 셀 (B) 이미지. 형질 전환 시약 만 (모의)의 관리는 신선한 세포에 형질 전환뿐만 아니라 통로를 따라 세포 생존을 유지합니다. 신선한 H1-HeLa 세포에 뜨는 및 통로의 여과를 다음 유지하기 위해 관리되는 Mengovirus 게놈을 암호화 RNA 전 사체 (VMC 24) 세포 변성 효과 결과의 형질. 스케일 바 = 100 μm의.ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 4
    도 4 : 동족 마이크로 RNA의 존재 또는 부재하에 비 변형 및 마이크로 RNA 타겟 Mengoviruses 성장 동력학. 참조 (17)에서 수정. (A) H1-HeLa 세포는은 miR-124, -125, 또는 -142을 표현하지 않습니다. 세 Mengovirus 인코딩 마이크로 RNA 입술은 바이러스 복제를 변경하지 않는이 위치 (5 'UTR)에서 마이크로 RNA의 삽입을 나타내는 수정되지 않은 바이러스와 유사한 반응 속도 (VMC 24)를 복제합니다. (B) RAW 264.7 대 식세포는은 miR-125B 미르-142-3p 높은 수준의 중간 수준을 표현하지만은 miR-124을 표현하지 않습니다. 바이러스 게놈 ATT의 결과에 대응하는 마이크로 RNA 표적 서열의 혼입마이크로 RNA 발현 수준과 일치 enuation. 데이터는 평균 바이러스 역가로 표시됩니다 +/- SD합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 5
    그림 5 : 합성 마이크로 RNA의 모방을 사용하여 마이크로 RNA-대상 특이성의 분석. 참조 (17)에서 수정. 각각의 마이크로 RNA를 모방로 형질 H1-HeLa 세포 0.2의 MOI에서 수정되지 않은 바이러스 (VMC 24) 또는 마이크로 RNA-대상 바이러스 (miRT-VMC 24)에 감염되었다. (A)는 모의 - 처리 된 세포로 정규화 세포 생존율은 MTT 세포 증식 분석을 통해 24 시간 후 감염에서 측정 하였다. 모든 시료의 상층 액 (B)는 바이러스 역가가 24 시간의 감염 후에서 측정 하였다. 그만큼데이터는 평균 생존 또는 바이러스 역가 +/- SD로 표시됩니다. (동일하지 않은 분산을위한) 웰치의 보정 짝이 학생 t 테스트를 두 꼬리 통계 분석에 사용 하였다. 는 P 값 <0.01는 상당한 여겨졌다. (** p <0.01, *** p <0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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    Discussion

    디자인, 조성 및 바이러스 게놈 내에서 마이크로 RNA 응답 요소의 현지화 효능과 특이성을 대상으로 지시합니다. 이러한 최적화 시행 착오가 필요합니다. 그러나, 합리적인 디자인 RNA 구조 분석 및 최적화 최소한 10, 11, 12, 13, 38과 함께이 기술의 구현에서 바이러스 복제 및 마이크로 RNA 서명 보조제의 이전 연구에 기초.

    RE가 디자인을 개시 할 때, 연구자들은 관심있는 표적 세포에서 발현되는 마이크로 RNA의 집합을 컴파일하여 시작해야 관심의 비 표적 세포에서 감소되며, 이는 실험적으로 검증되었다. 이러한 편집 후, 여러 가지의 예측 기반의 경쟁 분석은 마이크로 RNA-타지 가능성을 해결하기 위해 수행되어야t 상호 작용. 많은 마이크로 RNA 바이러스 또는 바이러스와 숙주 유전자 발현을 조작하기 위해 휴대폰을 격리시키는 마이크로 RNA 비 코딩의 RNA를 인코딩한다. 또한, 여러 RNA 바이러스는 복제 능력 (39), (40)을 강화하기 위해 셀룰러 마이크로 RNA와 상호 작용하는 것으로 나타났다. 개의 RE를 설계 할 때 따라서, 세포의 마이크로 RNA와 바이러스의 상호 작용이 알려져 여부가 잠재적으로 선택한 마이크로 RNA의 표적을 인식하거나 선택한 마이크로 RNA의 내생 적 표현을 변경할 수있는 바이러스 마이크로 RNA를 표현하는 경우 조사해야합니다. 문헌 검색 외에, 리더 온라인 생물 정보학 도구와 예측 된 RE의 합리적인 설계에 도움이 마이크로 RNA 바이러스 대상 정보를 포함 데이터베이스를 고려해야한다. 그러한 데이터베이스와 예측 도구는 미리 복수의 마이크로 RNA 또는 중첩 시드 서열에 의해 인식 될 수있는 표적 서열의 확인을 용이하게 할 수있다 바이러스 게놈 내 보냈다. 마이크로 RNA의 표적을 식별하는 방법과 온라인 예측 도구 중 일부의 장단점 대한보다 심도있는 독자는 참고 문헌 41, 42라고합니다. 이러한 예측 도구는 가이드만큼 예측이 오탐 (false positive) 또는 네거티브를 얻을 수 역할을하는 것이 좋습니다. 이를 위해 상기 마이크로 RNA 그러나의 3 '말단도 타겟팅 효율에 영향을 미칠 것이다 오버랩 시드 순서가있을 수있다. 규칙 집합이 너무 엄격한 사용은 때때로 불리 할 수있다.

    잠재적 인 마이크로 RNA 표적의 세트가 식별되고 나면, 연구자는 마이크로 RNA 및 RNA 구조 예측을 10, 11, 12, 13의 생물학적 특성에 기초하여 대상을 순위가 계속해야EF "> 38. 성숙한 표적 세포에 마이크로 RNA 및 유전자 침묵의 과정을 지시 할 것이다 Argonaute 단백질과 연계 그 레벨의 절대 풍부. 몇몇 연구는 단지 다량 발현 마이크로 RNA 크게 유전자 발현 (16), (43)을 조절하는 것으로 입증 일부 마이크로 RNA 풍부 Argonaute 단백질 및 RISC 형성과의 상호 작용을 표현하는 동안 (44). 또한, 변환 (44)를 억제하기에 불충분하다. 또한 표적 세포 및 후속 오프에서 마이크로 RNA 포화의 가능성을 최소화 검증 기능이 매우 풍부 마이크로 RNA를 사용하여 대상은 독성. 다른 접근법은 여전히 오프 - 타겟 toxiciti 가능성을 최소화하면서 감소 카피 수에 대한 허용 할 수있는 복수의 miRNAs (45), (46)에 의해 타겟팅 된 RE를 사용할 수있다에스. 마이크로 RNA에 표적 mRNA의 비는이 접근법의 성공에 큰 영향을 미칠 것이다. 마이크로 RNA의 비율이 높은 타겟 억압 42, 43, 47, 48의 수준을 감소시킬 것이다. 이것은 잘못 내생 마이크로 RNA의 통제 할 수없는 수준으로 축적됩니다 감염시 초기 규제하는 경우 때 신속하게 복제하는 바이러스에 특히 중요하다. 대상에 대한 마이크로 RNA를 선택할 때 이러한 속성을 고려하는 것이 필수적이다; 이상적으로, 그 기능을 실험적으로 검증 된 마이크로 RNA를 사용.

    표적 유전자 침묵의 효율도 성숙 마이크로 RNA에 표적의 퍼센트 상보성뿐만 아니라 삽입 마이크로 RNA 표적 서열의 매수에 의해 영향을 받는다. 마이크로 RNA (뉴클레오타이드 2-8)의 5 '영역은 시드 서열을 구성한다. 그것은 일반적으로 인정되는이 지역은 성공적인 타겟팅 48, 49 완벽하게 보완해야한다는. 그것은 전 사체의 절단 및 endonucleolytic 마이크로 RNA의 신속한 재활용을 촉진함으로써 유전자 사일런 싱 활성을 증가시킬 수 있기 때문에, 대부분의 연구는 완벽한 상보성을 가진 응답 요소를 사용한다. 마이크로 RNA는 포유 동물 세포에서 Argonaute-2로 제한됩니다 endonucleolytic 활동이있는 Argonaute 단백질과 상호 작용 할 때 endonucleolytic 분열에만 발생합니다. 다른 Argonaute 단백질은 deadenylation 및 성적 증명서의 exonucleolytic 공격에 의해 mRNA의 분해를 촉진한다. 독자는 마이크로 RNA의 생합성 및 기능에 대해 자세히 설명 참조 4, 5, 13, 50, 51, 52로 지칭된다. 그것은 그 증분을 생각 일반적입니다카피 수를 완화하는 것은 더 타겟팅 효율성을 향상시킬 것입니다. 그러나, 이것은 또한 마이크로 RNA 포화를 강화할 수 있고, 항상 더 효능이 입증되지 않았습니다. 표적 세포 농축 상이한위한 마이크로 RNA 표적 서열을 포함하거나 복수의 마이크로 RNA에 의해 인식되는 표적 서열을 사용하는 것이 종종 더 좋다. 필요한 카피 수는 또한 침묵 필요 사체의 양 및 표적 세포에 마이크로 RNA의 상대적인 풍부함에 크게 의존한다. 빠르게 축적됩니다 성적 증명서는 마이크로 RNA 수준을 outcompeting 것을 방지하기 위해 더 많은 사본을 요구할 수있다. 실험적으로 충분한 타겟팅 결과 각각의 마이크로 RNA 대상에 대한 최적의 카피 수를 결정, 바이러스 체력을 유지하고, 그 탈출 돌연변이의 비율이 권장 최소화 할 수 있습니다.

    바이러스 게놈 내의 마이크로 RNA 반응 요소의 지역화 매우 중요하다. 부정 결과 분석타겟팅 효율은 항상 바이러스 마이크로 RNA-대상이 될 수 없습니다 의미하지 않는다. 단순히 대상이 해당 위치에 액세스하지 않거나 표적 유전자의 억제가 병원성을 억제하기에 충분하지 않다 의미 할 수있다. 반응 요소의 대부분은 표적 사체의 3 '비 번역 영역 (UTR)에 삽입된다. 그러나, 바이러스 성 게놈의 성공적인 타겟팅을 완성하기에 이르렀다 및 대응 요소는 5 'UTR에 또는 필수 유전자 38 코딩 영역 내에 삽입 될 때 때때로 전시 유전 안정성을 향상. 최적의 삽입 위치는 마이크로 RNA의 표적 서열의 높은 접근성을 허용 할 것이다. 내게는 RNA 이차 구조와 화학 양 론적 간섭에 의해 방해 할 수 있습니다. 따라서, 고도로 보존되는 구조적 영역에서 지역화 응답 요소 좋은 출발점이다. 서열도에 영향을 줄 수있는 주변 서열의 영향에 삽입된다. 티HUS 번 마이크로 RNA 표적 서열을위한 최적의 위치는 다른 반응 요소 반드시 최적이 아니다. RE 현지화의 실험적 검증 및 최적화가 필요하지만, 예측 소프트웨어를 사용하여 (예를 들어 http://unafold.rna.albany.edu/, http://rna.urmc.rochester.edu/software.html) 가능성이 삽입 사이트를 선별하기 주변 RNA 구조의 교란에 대한 매우, 54 (53)을 추천합니다.

    높은 무결성 깨끗한 핵산 제제의 사용은 또한 최상의 결과를 얻기 위해 중요하다. 의 RNase없는 환경의 무균 기술 및 유지 보수 RNA 전 사체 또는 마이크로 RNA의 모방을 처리 필수적이다. 최상의 결과 RNA 전 사체를 들어, 마이크로 RNA의 모방, 최종 적정 바이러스 주식은 RNA 분해 및 바이러스 감염의 손실이 발생 반복 동결 융해를 방지하기 위해 작은 분량 씩 -80 ° C에서 보관해야합니다. 때 사용,이 시약의는 항상 얼음에 보관해야합니다.

    많은 마이크로 RNA가 상보성을 공유하는 마이크로 RNA의 가족의 구성원이라는 것을 주목하는 것이 중요하다. 연구를 수행 할 때 그러므로 표적 특이성 평가를 향상시키기 위해 직접적인 마이크로 RNA 패밀리의 구성원을 포함하는 것이 유리할 수있다. 바이러스 복제가 요구되는 세포 내 가족 (예 미르 Let7 가족)의 구성원을 표현하는 경우에 중요해진다. 또한, 마이크로 RNA를 모방하여 특이성 분석 인공 시스템이며 과발현 일부 셀에서 마이크로 RNA의 오프 - 타겟 효과 (55)이 발생할 수 있음을 유의해야한다. 이 경우, 특이성은 마이크로 RNA 대신 억제제를 사용하여 해당 마이크로 RNA를 발현하는 세포에서 평가 될 수있다. 이 분석은 마이크로 RNA의 생리 학적으로 관련된 수준의 존재 하에서 바이러스 적정 및 세포 생존 판독 값에 기초하여 타겟팅 특이성의 분석을 허용한다.

    10, 11, 12, 13 바이러스 - 매개 된 효과이다. 대부분의 바이러스는 높은 돌연변이 비율을 전시하고 신속하게 발생할 수있는 돌연변이를 탈출. 여러 다중 고도로 보존 된 영역 내에서 타겟 지역화 하나 이상의 마이크로 RNA의 타겟을 포함하는 표적 서열의 카피, 또는 이것을 완화 할 수있는 면역 반응을 비롯한 추가 바이러스 인자의 존재를 포함. 또한, 바이러스 게놈 내로 외래 유전자 물질의 삽입은 종종 바이러스의 복제가 감소 된 용량을 초래할 것이다. 이 경우 마이크로 RNA 표적 유전자 불안정하고 더 빨리 일어난다 돌연변이를 벗어날 가능성이있다. 여러 개의 마이크로 RNA 대상 복사 캘리포니아의 포함N은 마이크로 RNA 표적 재조합의 삭제 가능성을 증가시킨다. 따라서, 충분한 타겟팅을 위해 필요한 최소한의 카피 수의 실험적 결정이 필요하다. 탠덤 반복을 사용하여 대 게놈 전반에 걸쳐 다양한 위치에서 마이크로 RNA 대상 복사본을 지역화하는 것은이 제약을 우회에 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 변형 된 바이러스의 복제 속도론에 포함되지 않는 필요한 대상 복사 및 삽입 부위의 최소 수와 RE 최적의 구성을 식별하는 재조합 표적 돌연변이 비율을 최소화하는 데 중요하다. 마이크로 RNA는 포화가 발생하면 표적 서열이 너무 많은 카피의 포함은 또한 오프 - 타겟 독성 잠재력을 증가시킬 수있다. 바람직하지 않은 효과가 발생할 수 55 정상 세포 단백질을 조절 가능한 마이크로 RNA의 양에서 큰 변화. 이를 위해, 다수의 바이러스는 셀 (56) 내에서,이 경우 마이크로 RNA 환경이 변경충분한 바이러스 복제가 유지되는 경우 대상 마이크로 RNA를 포함하는, 규정의 효율성이 저하 될 수있다. 이러한 문제의 모든 반응 성분 조성 및 / 또는 위치 파악을 최적화함으로써 철저한 타겟팅되는 시스템의 이해와 그 한계로 해결 될 수있다.

    다른 타겟팅 방법과 관련된 일반적인 문제는 바이러스의 오프 대상 감쇠를 포함, 엔지니어링 바이러스와 관련된 제한 수행 능력 및 안전 문제와 바이러스의 유전 타겟팅 자료에 대한 크기 제한은 일반적으로 감염되지 않은 세포를 대상으로한다. 마이크로 RNA-타겟팅은 바이러스의 최소한의 변형 바이러스 친 화성의 조절이 가능합니다. 이는 바이러스 게놈 내에서 최소한의 공간을 필요로하고 휴대 마이크로 RNA 시그니처 광대 한 배열에 기초하여 맞추어 질 수있다. 이 기술은 새로운 안전 문제를 소개하지 않습니다 따라서 바이러스에 대한 새로운 tropisms을 소개하지 않습니다. 또한이방법은 동시에 다른 세포 형태 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61 내에 농축 상이한 마이크로 RNA에 대한 표적 서열을 사용하여 여러 tropisms을 조절하는데 사용될 수있다. 이것은 모든 향상된 치료 효능과 바이러스의 안전성을 개선하는 메커니즘을 제공 할 수 있으므로 해당 마이크로 RNA를 발현하지 않는 세포에서 바이러스를 약독 화없이 달성 될 수있다.

    셀룰러 마이크로 RNA 기계 악용 바이러스의 많은 다른 종류의 친 화성을 조절하기 위해 사용될 수있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 바이러스 '복제주기 및 특정 기자 것이란에 따라하지만 그들이 적용 할 수 있습니다, 마이크로 RNA 타겟 피 코르 나 바이러스과의 바이러스의 구조 및 특성을 위해 설계douts. 다른 바이러스는 특정 구조 전략되었지만, 마이크로 RNA 표적 서열에 관계없이 전체 게놈은 단일 플라스미드 또는 바이러스는 DNA 또는 RNA 게놈을 가지고 있는지 여부를 부호화하는지 여부 바이러스 게놈에 삽입 할 수있다. 한 생산자 세포가 동족 마이크로 RNA를 발현하지 않는 한, 최적화 된 마이크로 RNA의 표적은 바이러스의 구조를 방해해서는 안된다. 실험은 바이러스의 성장 동역학을 분석하여 마이크로 RNA는 타겟팅 특이성 것은 바이러스 복제의 단일 라운드의 길이를 특정 바이러스 복제 / 독성에 대한 판독 (예를 들어, 리포터 단백질, 세포 독성, 게놈 정량화에 기초하여 수집 된 시점을 변화시킴으로써 수정 될 수있다 등). 또한이 기술은 이론적으로 모든 종류의 바이러스에 적용 할 수 있지만, 여러 가지 요인이 방법의 효율성에 영향을 미칠 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 예를 들어, 네거티브 센스 RNA 바이러스에 의한 제한 AC 때문일 포지티브 센스 RNA 바이러스로 검증 응답하지miRNA의 기계 (13)의 게놈 RNA의은 접근하기. 따라서, 바이러스의 각 클래스의 생물학적 특성은 RE 최적화에 대한 자세한 제약을 부여합니다. 이러한 제약에도 불구하고,이 기술은 안전, 유틸리티를 포함하는 바이러스 친 화성 촉진 연구, 바이러스의 모든 클래스에 대한 생물학적 과정의 기본적인 이해를 목표로하는 다른 방법을 제공합니다.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
    Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
    Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
    T4 DNA Ligase System NEB M0202S
    MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
    MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
    0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
    5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
    Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
    Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
    TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
    TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
    0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
    2 ml Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
    Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
    MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
    MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
    Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
    pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.

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    References

    1. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional Regulation of the Heterochronic Gene Lin-14 By Lin-4 Mediates Temporal Pattern Formation in C. Elegans. Cell. 75 (5), 855-862 (1993).
    2. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans Heterochronic Gene Lin-4 Encodes Small RNAs With Antisense Complementarity to Lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
    3. Ambros, V. The Functions of Animal MicroRNAs. Nature. 431 (7006), 350-355 (2004).
    4. Bartel, D. P. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
    5. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target Recognition and Regulatory Functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
    6. Benitez, A. A., Spanko, L. A., Bouhaddou, M., Sachs, D., Tenoever, B. R. Engineered Mammalian RNAi Can Elicit Antiviral Protection That Negates the Requirement for the Interferon Response. Cell Rep. 13 (7), 1456-1466 (2015).
    7. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Yalcin, A., Meyer, J., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of Tissue-Specific MicroRNAs From Mouse. Curr Biol. 12 (9), 735-739 (2002).
    8. Landgraf, P., et al. A Mammalian MicroRNA Expression Atlas Based on Small RNA Library Sequencing. Cell. 129 (7), 1401-1414 (2007).
    9. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: Tools for MicroRNA Genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
    10. Kelly, E. J., Russell, S. J. MicroRNAs and the Regulation of Vector Tropism. Mol Ther. 17 (3), 409-416 (2009).
    11. Brown, B. D., Naldini, L. Exploiting and Antagonizing MicroRNA Regulation for Therapeutic and Experimental Applications. Nat Rev Genet. 10 (8), 578-585 (2009).
    12. Tenoever, B. R. RNA Viruses and the Host MicroRNA Machinery. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 169-180 (2013).
    13. Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNAs and Oncolytic Viruses. Curr Opin Virol. 13, 40-48 (2015).
    14. Brown, B. D., Venneri, M. A., Zingale, A., Sergi Sergi, L., Naldini, L., L, Endogenous MicroRNA Regulation Suppresses Transgene Expression in Hematopoietic Lineages and Enables Stable Gene Transfer. Nat Med. 12 (5), 585-591 (2006).
    15. Brown, B. D., et al. A MicroRNA-Regulated Lentiviral Vector Mediates Stable Correction of Hemophilia B Mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
    16. Brown, B. D., et al. Endogenous MicroRNA Can be Broadly Exploited to Regulate Transgene Expression According to Tissue, Lineage and Differentiation State. Nat Biotechnol. 25 (12), 1457-1467 (2007).
    17. Ruiz, A. J., Hadac, E. M., Nace, R. A., Russell, S. J. MicroRNA-Detargeted Mengovirus for Oncolytic Virotherapy. J Virol. 90 (8), 4078-4092 (2016).
    18. Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. Engineering Attenuated Virus Vaccines By Controlling Replication Fidelity. Nat Med. 14 (2), 154-161 (2008).
    19. Barnes, D., Kunitomi, M., Vignuzzi, M., Saksela, K., Andino, R. Harnessing Endogenous MiRNAs to Control Virus Tissue Tropism as a Strategy for Developing Attenuated Virus Vaccines. Cell Host Microbe. 4 (3), 239-248 (2008).
    20. Perez, J. T., Pham, A. M., Lorini, M. H., Chua, M. A., Steel, J., Tenoever, B. R. MicroRNA-Mediated Species-Specific Attenuation of Influenza a Virus. Nat Biotechnol. 27 (6), 572-576 (2009).
    21. Saydaminova, K., et al. Efficient Genome Editing in Hematopoietic Stem Cells With Helper-Dependent Ad5/35 Vectors Expressing Site-Specific Endonucleases Under MicroRNA Regulation. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14057 (2015).
    22. Langlois, R. A., et al. MicroRNA-Based Strategy to Mitigate the Risk of Gain-of-function Influenza Studies. Nat Biotechnol. 31 (9), 844-847 (2013).
    23. Kelly, E. J., Hadac, E. M., Cullen, B. R., Russell, S. J. MicroRNA Antagonism of the Picornaviral Life Cycle: Alternative Mechanisms of Interference. PLoS Pathog. 6 (3), e1000820 (2010).
    24. Pham, A. M., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Replication in Cells of Hematopoietic Origin is Necessary for Dengue Virus Dissemination. PLoS Pathog. 8 (1), 1002465 (2012).
    25. Langlois, R. A., Varble, A., Chua, M. A., García-Sastre, A., Tenoever, B. R. Hematopoietic-Specific Targeting of Influenza a Virus Reveals Replication Requirements for Induction of Antiviral Immune Responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (30), 12117-12122 (2012).
    26. Chua, M. A., Schmid, S., Perez, J. T., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Influenza a Virus Utilizes Suboptimal Splicing to Coordinate the Timing of Infection. Cell Rep. 3 (1), 23-29 (2013).
    27. Griffiths-Jones, S. The MicroRNA Registry. Nucleic Acids Res. 32, D109-D111 (2004).
    28. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: MicroRNA Sequences, Targets and Gene Nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).
    29. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Integrating MicroRNA Annotation and Deep-Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 39, D152-D157 (2011).
    30. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Annotating High Confidence MicroRNAs Using Deep Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 42, D68-D73 (2014).
    31. Heckman, K. L., Pease, L. R. Gene Splicing and Mutagenesis By PCR-Driven Overlap Extension. Nat Protoc. 2 (4), 924-932 (2007).
    32. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. . , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5063/gel-purification (2016).
    33. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Ligation Reactions. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5069/dna-ligation-reactions (2016).
    34. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method (2016).
    35. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA From Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
    36. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
    37. Separation of RNA in Agarose Gels. Sourcebook for Electrophoresis. Lonza. , Available from: http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_BenchGuides_SourceBook_Section_VIII_-_Separation_of_RNA_in_Agarose_Gels.pdf 132-145 (2016).
    38. Kueberuwa, G., Cawood, R., Tedcastle, A., Seymour, L. W. Tissue-Specific Attenuation of Oncolytic Sindbis Virus Without Compromised Genetic Stability. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 154-165 (2014).
    39. Grundhoff, A., Sullivan , C. S. Virus-Encoded MicroRNAs. Virology. 411 (2), 325-343 (2011).
    40. Kincaid, R. P., Sullivan, C. S. Virus-Encoded MicroRNAs: An Overview and a Look to the Future. PLoS Pathog. 8 (12), e1003018 (2012).
    41. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental Strategies for MicroRNA Target Identification. Nucleic Acids Res. 39 (16), 6845-6853 (2011).
    42. Thomson, D. W., Dinger, M. E. Endogenous MicroRNA Sponges: Evidence and Controversy. Nat Rev Genet. 17 (5), 272-283 (2016).
    43. Mullokandov, G., et al. High-Throughput Assessment of MicroRNA Activity and Function Using MicroRNA Sensor and Decoy Libraries. Nat Methods. 9 (8), 840-846 (2012).
    44. Thomson, D. W., et al. Assessing the Gene Regulatory Properties of Argonaute-Bound Small RNAs of Diverse Genomic Origin. Nucleic Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
    45. Wu, S., et al. Multiple MicroRNAs Modulate P21cip1/waf1 Expression By Directly Targeting Its 3' Untranslated Region. Oncogene. 29 (15), 2302-2308 (2010).
    46. Vo, N. K., Dalton, R. P., Liu, N., Olson, E. N., Goodman, R. H. Affinity Purification of MicroRNA-133a With the Cardiac Transcription Factor, Hand2. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19231-19236 (2010).
    47. Arvey, A., Larsson, E., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Target mRNA Abundance Dilutes MicroRNA and siRNA Activity. Mol Syst Biol. 6, 363 (2010).
    48. Garcia, D. M., Baek, D., Shin, C., Bell, G. W., Grimson, A., Bartel, D. P. Weak Seed-Pairing Stability and High Target-Site Abundance Decrease the Proficiency of Lsy-6 and Other MicroRNAs. Nat Struct Mol Biol. 18 (10), 1139-1146 (2011).
    49. Jinek, M., Doudna, J. A. A Three-Dimensional View of the Molecular Machinery of RNA Interference. Nature. 457 (7228), 405-412 (2009).
    50. Pasquinelli, A. E. MicroRNAs and Their Targets: Recognition, Regulation and an Emerging Reciprocal Relationship. Nat Rev Genet. 13 (4), 271-282 (2012).
    51. Finnegan, E. F., Pasquinelli, A. E. MicroRNA Biogenesis: Regulating the Regulators. Crit Rev Biochem Mol Biol. 48 (1), 51-68 (2013).
    52. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of MicroRNA Biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
    53. Zuker, M. Mfold Web Server for Nucleic Acid Folding and Hybridization Prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
    54. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA Secondary Structure Prediction and Analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
    55. Khan, A. A., Betel, D., Miller, M. L., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Transfection of Small RNAs Globally Perturbs Gene Regulation By Endogenous MicroRNAs. Nat Biotechnol. 27 (6), 549-555 (2009).
    56. Skalsky, R. L., Cullen, B. R. Viruses, MicroRNAs, and Host Interactions. Annu Rev Microbiol. 64, 123-141 (2010).
    57. Sugio, K., et al. Enhanced Safety Profiles of the Telomerase-Specific Replication-Competent Adenovirus By Incorporation of Normal Cell-Specific MicroRNA-Targeted Sequences. Clin Cancer Res. 17 (9), 2807-2818 (2011).
    58. Fu, X., Rivera, A., Tao, L., De Geest, B., Zhang, X. Construction of an Oncolytic Herpes Simplex Virus That Precisely Targets Hepatocellular Carcinoma Cells. Mol Ther. 20 (2), 339-346 (2012).
    59. Yao, W., Guo, G., Zhang, Q., Fan, L., Wu, N., Bo, Y. The Application of Multiple MiRNA Response Elements Enables Oncolytic Adenoviruses to Possess Specificity to Glioma Cells. Virology. 458-459, 69-82 (2014).
    60. Bofill-De Ros, X., Gironella, M., Fillat, C. Mir-148a- and Mir-216a-regulated Oncolytic Adenoviruses Targeting Pancreatic Tumors Attenuate Tissue Damage Without Perturbation of MiRNA Activity. Mol Ther. 22 (9), 1665-1677 (2014).
    61. Baertsch, M. A., et al. MicroRNA-Mediated Multi-Tissue Detargeting of Oncolytic Measles Virus. Cancer Gene Ther. 21 (9), 373-380 (2014).

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