Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

MicroRNA-baserede Regulering af Picornavirus Tropisme

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/55033
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic College of Medicine

Introduction

Udviklingen af ​​et bredt anvendelig, let og effektiv metode til at manipulere en vektor med begrænset tropisme giver en stor mulighed for at øge sikkerheden, biologiske forståelse og terapeutisk nytte af virus. Adskillige mekanismer eksisterer for at målrette viral tropisme herunder transduktionelle, transkriptionelle og translationelle-baserede teknikker. Disse fremgangsmåder er imidlertid ikke generelt anvendelig til alle vektorsystemer, kan kræve defekte signalveje i målrettede celler eller kræver insertion af store kodende sekvenser i det virale genom. Derudover kan disse metoder resulterer i svækkelse af viruset, signifikant hæmmer deres terapeutiske aktivitet og begrænsende indsigt i det umodificerede system.

MikroRNA'er er små (22-25 nukleotider), ikke-kodende RNA'er som medierer gendæmpning i eukaryote celler. MikroRNA'er funktion ved binding komplementære målsekvenser (udsendelse) i messenger-RNA'er (mRNA) resulti ng i udskrift destabilisering, forringelse eller translationel undertrykkelse. MikroRNA'er normalt binder respons elementer med delvis komplementaritet og give små ændringer i genekspression 1, 2, 3, 4, 5. Flere signifikante ændringer i genekspression kan opnås ved at øge komplementariteten af svaret element 6. Tusinder af modne microRNA er blevet identificeret i en række forskellige arter og mange udviser differentielle ekspressionsmønstre i forskellige celle- og vævstyper 7, 8, 9. Disse microRNA signaturer kan udnyttes til cellespecifik begrænsning af virusamplifikation ved inkorporering perfekt komplementære responselementer i det virale genom 10,= "xref"> 11, 12, 13. Det overordnede mål med denne microRNA-targeting teknik er at styre tropisme af en vektor genom uden yderligere dæmpning.

Anvendeligheden af denne fremgangsmåde til regulering viral tropisme blev oprindeligt påvist i lentivirusvektorer at begrænse transgen ekspression i specifikke væv 14, 15, 16. Denne teknik er efterfølgende blevet anvendt på en bred vifte af replikerende og ikke-replikerende virale vektorer for øget genterapi samt at forbedre de sikkerhedsmæssige profiler af mange onkolytiske virus ved at fjerne uønskede toksiciteter i normale væv 10, 11, 12, 13, 17 . Det har også været anvendt til at generere en sikker og eFFEKTIV levende svækkede vacciner samt at forbedre virus og vaccine fremstillingsprocesser 18, 19, 20, 21. MicroRNA målretning af en vektor kan give mulighed for dæmpning i vaccinerede værter eller målrettede systemer samtidig opretholde vildtype vækstrater i producentpriserne systemer. MicroRNA-targeting kan også bruges til at forbedre biosikkerhed af virus med henblik på forskning ved at begrænse transmissionen i én art (f.eks mennesker), samtidig med at transmission i andre værter 22. Endelig microRNA-targeting kan tillade dybdegående analyser af virale livscyklus og specifikke roller celletyper i patogenese og immunitet ved adskillelse viral vækst 23, 24, 25, 26.

Denne teknik giver en alternative målrettet metode, der let implementeres og gælder for alle virus systemer. Derudover stadigt voksende samling af modne microRNA med differentierede udtryk mønstre i specifikke celletyper gør denne teknik meget alsidigt. MicroRNA målretning har vist effektiv til mange forskellige virus systemer uden at kompromittere systemets funktion. De vigtigste begrænsninger ved denne teknik omfatter trial and error optimering, for muligheden for udslip mutationer, og potentielle ikke-tilsigtede virkninger på endogene transskripter. Imidlertid kan disse begrænsninger generelt overvindes med optimeret og rationel responselement design. Positiv-sense RNA-virus tendens til at være særligt lydhøre over for microRNA-targeting følge af den positive-sense orientering af deres genom og tilgængeligheden af ​​udskrifter til microRNA maskiner under helt cytoplasmatisk replikation cyklus. Her beskriver vi en protokol til at generere en microRNA målrettet picornavirus og experimEntal metoder til at kontrollere effektiviteten og specificiteten af denne målretning in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kloning microRNA udendelse i virusgenomet

  1. Design microRNA respons element indsatser.
    1. Identificere det ønskede microRNA og dens tilsvarende målsekvens. Flere databaser er tilgængelige med modne microRNA-sekvenser. Anbefalet: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30.
  2. Klone responselementet i plasmid DNA kodende for vektorgenomet eller transkript.
    BEMÆRK: to eller flere kopi responselementer hjælp af en unik restriktionssted til insertion er lettere og mere alsidig.
    1. Indsæt svar element eller unikke restriktionssted hjælp splejsning-overlap forlængelse (SOE) PCR. Denne metode er blevet beskrevet detaljeret 31.
    2. Hvis der anvendes et restriktionssted til insertion, purchase kommercielt syntetiseret, PAGE-renset sense og antisense ultramers koder for insertsekvenser flankeret af udhænget sekvenser af det unikke restriktionssite (figur 2).
    3. Kombiner 0,5 ug sense ultramer, 0,5 ug antisense ultramer, DNA ligering buffer til endelig koncentration på 1x, og bringe til 50 pi med H2 O. anneale de ultramers ved at inkubere reaktionen ved 85 ° C i 10 minutter og derefter reducere temperaturen af 0,5 ° C hver 30 sek, indtil reaktionen når op på 25 ° C.
    4. Kombiner 0,5 ug vektor DNA, der koder det nye unikke restriktionssite, enzym-buffer til en 1x slutkoncentration, 1 pi det passende restriktionsenzym, og bringe til et endeligt volumen på 20 pi med H2 O. Digest vektoren ved 37 ° C i 2 timer. Oprens det lineariserede DNA ved agarosegeloprensning 32.
    5. Ligere de annealede ultramers i den fordøjede vektor natten over ved 16 °; C under anvendelse af en 3: 1 ultramers: vektor molforhold og standardteknikker til ligering 33.
      BEMÆRK: Når der anvendes en enkelt restriktionsenzymsted for indsættelse kan det være mere effektivt at dephosphorylere enderne af den spaltede vektor og phosphorylere enderne af de annealede oligonukleotider.
    6. Omdan det ligerede DNA i E. coli under anvendelse af varmechok metode 34.
      BEMÆRK: plasmider kodende virusgenomer er generelt store, derfor anvendelse af kompetente celler optimeret for optag store DNA-konstruktioner kan øge transformationseffektivitet.
    7. Oprense plasmid-DNA fra individuelle kolonier under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt oprensningskit 35. Identificere en passende klon med microRNA responselementet i den korrekte orientering (figur 2) ved sekventering af insertet region 36.

2. Redning microRNA-rettet Picornavirus from Plasmid-DNA

  1. Rescue microRNA-målrettet picornavirus i en cellelinie permissiv for virusreplikation, der ikke udtrykker den beslægtede microRNA (s). Denne protokol bruger H1-HeLa-celler, fordi de ikke udtrykker miR-142, miR-124, eller miR-125, men det er ikke nødvendigt at bruge H1-HeLa-celler til redning.
    ADVARSEL: Alle retningslinjer for sikker håndtering og bortskaffelse af smitsomme stoffer bør følges i overensstemmelse hermed.
    1. Plade H1-HeLa-celler i en 6-brønds plade, således at de er ~ 80% konfluente på tidspunktet for transfektion (24 timer efter podning). Plate celler i 2 ml per brønd DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum.
    2. Varm transfektionsreagens til stuetemperatur. Kombiner 250 pi serumfrit medium, 2,5 ug plasmid DNA kodende microRNA-målrettede genom, og 7,5 pi transfektionsreagens i et sterilt mikrocentrifugerør og pipette forsigtigt for at blande. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 15-30 min.
    3. Aspirermedier fra de udpladede celler og tilsættes 2 ml frisk komplet medium.
    4. Tilføje hele transfektionsblandingen fra trin 2.1.2 til en brønd i pladen med 6 brønde dråbevis. Føj hver dråbe til et andet område af brønden.
    5. Inkuber cellerne ved 37 ° C, indtil cytopatiske virkninger (CPE) eller reporter-proteiner er detekterbare (~ 24-72 timer).
  2. Harvest og passage den reddede virus på friske celler.
    1. Plate celler i en 6-brønds plade, således at de er 80-90% konfluente på tidspunktet for infektion (24 timer efter podning).
      BEMÆRK: Opskalering eller ned afhængigt af mængden af ​​virus er nødvendig for alle efterfølgende eksperimenter.
    2. Harvest hver redning brønd ved at skrabe cellerne ud i supernatanten under anvendelse af en gummi celleskraber eller gummiskraber. Træk forsigtigt skraberen på tværs af bunden af ​​brønden. Overfør cellerne og supernatanten til en kryogen opbevaring rør.
    3. Frys / optø prøverne to gange og derefter pelletere cellulært affald vedcentrifugering ved 1200 xg i 5 min ved 4 ° C.
    4. Foretage klarede supernatant to gange under anvendelse af 0,2 um sprøjtefiltre. Den filtrerede redning supernatant indeholder virus.
      BEMÆRK: Filter porestørrelse kan variere afhængigt af størrelsen af ​​viruspartikler og kan ikke anvendes til store vira.
    5. Aspirer medier fra de udpladede celler vaskes en gang med serumfrit medium og der tilsættes 1 ml frisk serumfrit medium til hver brønd.
    6. Der tilsættes 50 pi per brønd af filtreret redning supernatanten og forsigtigt vippe pladen for at fordele virus.
    7. Inkubér pladen ved 37 ° C i 2 timer og derefter aspiratprøver medier fra hver brønd for at fjerne ikke-inkorporeret virus.
    8. Tilføj 1,5-2 ml frisk komplet medium per brønd og inkuberes ved 37 ° C, indtil CPE eller reporter-proteiner er tydelige (~ 24-48 timer).
    9. Gentag trin 2.2.2 til 2.2.4. Filtreret redning supernatant indeholder virus lager. Store virusstammer i engangsprodukter portioner i kryogene opbevaring rør ved -80 °C.

3. Redning microRNA-rettet Virus fra In Vitro transskriberet RNA Afskrifter

  1. Generere RNA-transkripter fra plasmid-DNA, der koder for microRNA-målrettede virale genom under anvendelse af en opstrøms promoter.
    BEMÆRK: Standard praksis for generering og opretholdelse af en nuklease-frit miljø skal anvendes til alle efterfølgende trin.
  2. Linearisere plasmid-DNA under anvendelse af et enzym-restriktionssted nedstrøms for transkriptet. Kombiner 5 ug plasmid-DNA, 1x slutkoncentration enzymbuffer, 3 pi restriktionsenzym og bringe til 50 pi med H2 O. Inkubér reaktionen ved 37 ° C i 3 timer.
  3. Tilføj 1/20 th volumen af 0,5 M EDTA, 1/10 volumen 5 M NH4-acetat, og 2 volumener 100% ethanol til det fordøjede reaktionen og blandes. Inkuber ved -20 ° C i 1 time op til natten over.
  4. Pelletering af udfældede DNA i 10 minutter ved 17.000 xg ved 4 ° C. Hæld supernatant, pellet resuspenderes i 500 pi kold 70% ethanol og pelletering af DNA ved centrifugering ved 17.000 xg i 10 min ved 4 ° C.
  5. Hæld supernatanten og centrifugeres igen i 30 sek. Fjern den resterende supernatant med en pipette og luft-tørre pelleten. Resuspender DNA-pelleten i sterilt nukleasefri H2O i en koncentration på 0,5-1 ug / uL.
  6. Optø in vitro-transkription reagenser ved stuetemperatur og placere ribonucleotider på is (enzymer i glycerol ikke fryse og skal gå direkte på is). Hold reaktionsblandingen puffer ved stuetemperatur.
  7. Saml transkriptionsreaktion i et PCR-rør ved at kombinere 2 pi hver af ATP, CTP, GTP og UTP opløsninger, 2 pi 10x reaktionsbuffer, 1 ug lineariseret DNA, 2 pi enzym og bringe til et endeligt volumen på 20 pi med nuclease -fri H 2 O.
  8. Inkubér reaktionen ved 37 ° C i 2 timer.
  9. Oprense RNA-transkripter.
  10. Bring transkriptionsreaktion til 100 pi med elueringen opløsning (ikke-forvarmet). Tilføj 350 pi bindingsbuffer opløsning koncentrat og 250 pi 100% ethanol til reaktionen og blandes.
  11. Overfør prøven til en filterpatron indsat i et opsamlingsrør og centrifugeres i 1 minut ved 12.000 x g. Kassér gennemløbet.
  12. Der tilsættes 500 pi vaskeopløsning til filterpatronen og centrifugeres i 1 minut ved 12.000 x g. Kassér gennemstrømning. Gentag dette vasketrin en gang til. Kassér gennemstrømning. Centrifugeres i 1 minut ved 12,0000 xg for at fjerne resterende ethanol.
  13. Overfør filterindsatsen til et rent opsamlingsrør og tilsættes 50 pi af den forvarmede elueringsopløsning til filterpatronen. Centrifuge i 1 minut ved 12.000 x g. Gentag dette elueringstrin til et samlet volumen på 100 pi eluent containing oprensede RNA-transkripter. Kassér filter-patron.
  • Bestem koncentrationen RNA i eluatet ved at måle absorbansen af ​​prøven ved 260 og 280 nm og under anvendelse af Beer-Lambert-loven.
  • Vurdere integriteten af RNA ved anvendelse af RNA-gelelektroforese 37. Se figur 3 for eksempler på god og dårlig RNA integritet. RNA bør aliquotted i engangsprodukter rør og opbevaret ved -80 ° C for at opretholde integriteten.
  • Varm transfektionsreagenser til stuetemperatur. Kombiner 250 pi serum-frie medier, 2,5 ug af oprensede RNA-transkripter, 5 pi boost opløsning, og 5 pi transfektionsreagens i et sterilt mikrocentrifugerør og pipette forsigtigt for at blande. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 2-5 min.
  • Plade H1-HeLa-celler i en 6-brønds plade, således at de er ~ 80% konfluente på tidspunktet for transfektion (24 timer efter podning). Plate celler i 2 ml per brønd DMEM suppleret med 10% FETal bovint serum.
  • Aspirer medier fra udpladede celler og tilsæt 2 ml frisk komplet medium.
  • Tilføje hele transfektionsblandingen fra trin 3.12 til en brønd i pladen med 6 brønde dråbevis. Føj hver dråbe til et andet område af brønden.
  • Inkuber cellerne ved 37 ° C, indtil cytopatiske virkninger (CPE) eller reporter-proteiner er detekterbare (~ 24-72 timer).
  • Fortsæt redning af microRNA-rettet virus som beskrevet i trin 2.2 til 2.2.9.

    • 4. titrering Virus Lagre ved beregning af 50% Tissue-kultur infektiøs dosis (TCID 50)

    1. Plade H1-HeLa-celler i en 96-brønds plade ved 10 4 celler per brønd i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum. Cellerne inkuberes ved 37 ° C natten over.
      BEMÆRK: titreres virus i celler tolerante for virusreplikation, der ikke udtrykker beslægtede microRNA.
    2. Make 10-fold seriefortyndinger af virus, hver i et samlet volumen på 1 ml serumfritmedier.
      BEMÆRK: Brug lavere fortyndinger hvis mere præcision er påkrævet.
      BEMÆRK: Skift tips efter hver fortynding for at forhindre overvurdering af titer som virus kan holde sig til tips.
    3. Tip plade med 96 brønde til siden og Aspirer medier fra udpladede HeLa-celler. Tilsæt 100 pi af hver virusfortynding pr brønd til 8 brønde af 96-brønds plade (1 række pr fortynding). Tilsæt 100 pi serumfrit medium uden virus til række 1 og række 12 på plade for kontrollen.
      BEMÆRK: Altid aspirer og tilføje medier til brønde ved at røre spidsen til side af godt at forhindre celle løsrivelse.
    4. Inkuber plade ved 37 ° C i 2 timer. Tip plade til side og aspireres mediet fra brøndene.
      BEMÆRK: Skift tips mellem hver fortynding række.
    5. Tilsæt 100 pi komplette medier til hver brønd. Inkuber plade ved 37 ° C i 72 timer.
    6. Visualiser brøndene under et mikroskop og markere hver brønd positive eller negative for CPE.
    7. Beregn hvert virus titer med følgende ligning: Log 10 (TCID50 / ml) = L + D (S-0,5) + log 10 (1 / V). L er den negative log 10 af de mest koncentrerede virus testet fortynding, ved hvilken alle brønde er positive. D er log10 af fortyndingsfaktoren. S er summen af ​​individuelle proportioner (PI). PI er den beregnede andel af en individuel fortynding (mængde af positive brønde / samlede brønde pr fortynding. V er rumfanget af inokulum (ml / brønd).

    tabel 1
    Tabel 1: Kvantificering infektiøse viruspartikler ved at beregne TCID50. Repræsentative resultater fra celler inficeret med en række af ti-folds fortyndinger af en virus lager. "L" svarer til 4, fordi den sidste fortynding, hvor alle brøndene er positive for CPE er 10 -4. "D" er log10 af 10 siden 10 gange fortyndingerblev anvendt, og er derfor lig med 1. "S" er summen af ​​de individuelle proportioner. I dette eksempel de enkelte andele er 1,0, 0,875, 0,375, 0,125, og 0. Summen af ​​disse (S) er 2,375. "V" er rumfanget af inokulum i ml anvendt til at inficere cellerne oprindeligt.

    5. Evaluering af microRNA-targeting Effekt: Single-trins Vækst Kinetics

    1. Kontroller for denne analyse omfatter mock-inficerede celler, umodificeret virus og virus, der indeholder en ikke-målrettet eller ikke-funktionel respons element.
    2. Plade H1-HeLa-celler for et tidsforløb eksperiment i 12-brønds vævskulturplader, således at de er 80-90% konfluente på tidspunktet for infektion (24 timer efter podning). Plate celler i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 1 ml per brønd.
      BEMÆRK: Anbefales til plade en separat plade for hvert tidspunkt. Denne protokol anvender 7 forskellige tidspunkter for en virus med en 8-12 timers replikationscyklus. H1-HeLa-celler er ikke forpligtet til at udføre denne enssay. Denne analyse skal udføres i tolerante celler, der ikke udtrykker de målrettede microRNA. Dette assay kan også udføres i celler, der udtrykker de beslægtede microRNA at evaluere vækstkinetik under selektivt tryk.
    3. Aspirer medier fra brønde. Vask brøndene ved tilsætning af 0,5 ml serum-frit medium til hver brønd, swirl pladen, og Aspirer medier fra brønde. Tilsæt 0,5 ml frisk serumfrit medium til hver brønd.
    4. Inficere hver brønd ved en høj multiplicitet af infektion (MOI; antal af infektiøse partikler per celle) for at sikre alle celler blive smittet. Denne protokol anvender en MOI på 3.
      1. Fortynd virusstammer i serum-frit medium til en koncentration på MOI = 3 pr 100 pi. Tilsæt 100 pi af virus fortynding hver til syv forskellige brønde og inkuberes ved 37 ° C i 2 timer.
      2. Aspirer medier fra alle brønde og vask to gange ved at tilsætte 0,5 mL komplet medium per brønd, vuggende blidt og derefter opsugning.
    5. Tilsæt 1 ml complete medier til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C, indtil det ønskede tidspunkt.
    6. Indsamle prøver til virustitrering ved 2, 4, 6, 8, 10, 24 og 48 timer efter infektion (1 boringen per tidspunkt). Overfør 700 pi af medierne i brønden til en kryogen opbevaring rør. Skrabe cellerne ind i resterende supernatant ved forsigtigt at bevæge en gummiskraber tværs af hele godt. Overfør celle / supernatant blandingen til det tilsvarende kryogen opbevaring rør indeholdende 700 pi supernatant.
      BEMÆRK: Sørg for ikke at plaske supernatant fra en brønd til en anden under skrabning resulterer i forurenede prøver. Overførsel de 700 uL før skrabe vil minimere sprøjt.
    7. Anbring prøverne ved -80 ° C, indtil alle prøverne er indsamlet.
    8. Frysning / optøning prøverne tre gange og fjerne celleaffald ved centrifugering af prøverne ved 1200 xg i 5 min ved 4 ° C.
    9. Titreres virus som beskrevet i afsnit 4 og sammenligne vækst kinetik løbet tjeg mig.

    6. Evaluering microRNA målretning Specificitet: Virus-spreder under anvendelse Syntetisk microRNA Efterligner

    Bemærk: Brug af en syntetisk microRNA mimic er udført for at vise specificitet microRNA: microRNA-target interaktion.

    1. Indbefatter mock transfektion, negative kontrolprøver microRNA efterligne og eksperimentelle microRNA efterligne kun kontrollerer for hvert assay til at evaluere microRNA-medieret toksicitet. Det er også ideelt at indbefatte en positiv kontrol (dvs. microRNA-målgenet eller genom) så lav transfektionseffektivitet af microRNA efterligner kan resultere i falske negative.
    2. Plade H1-HeLa-celler i en 96-brønds vævskulturplade, således at de er 80-90% konfluente på tidspunktet for transfektion (24 timer efter podning). Plate celler i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 0,1 ml pr brønd.
      BEMÆRK: Udfør denne analyse i celler tolerante for viral replikation, der ikke udtrykker de beslægtede microRNA.
    3. Varm the transfektionsreagenser til stuetemperatur. Kombiner 9 pi serumfrit medium, 200 nM slutkoncentration pr brønd af microRNA mimic bestand, 0,18 pi boost reagens, 0,18 pi transfektionsreagens og blandes. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 2-5 min.
      BEMÆRK: Mængder opført er per brønd. Det anbefales, at en master mix samles til transfektion af alle brønde for at bevare sammenhængen og minimere pipetteringsfejl. Den optimale koncentration af microRNA mimic vil variere. Konsulter producentens anvisninger ledsager microRNA efterligne til en rimelig start koncentration. Dette vil i almindelighed ligge i området fra 5-200 nM slutkoncentrationer.
    4. Aspirer medierne fra brøndene, og der tilsættes 92 ul frisk komplet medium.
      BEMÆRK: Hvis der er et betydeligt antal prøver, udføre dette trin, før samling af transfektion løsning og opbevar pladen ved 37 ° C indtil den er klar.
    5. Tilføje hele transfektionsblandingen in trin 6.3 til cellerne dråbevis.
    6. Der inkuberes ved 37 ° C i 6 timer.
    7. Inficere hver brønd ved en lav MOI for at sikre en lav procentdel af cellerne blive smittet at tillade analyse af virusspredning. Denne protokol anvender en MOI på 0,2.
      1. Fortynd virusstammer i serumfrie medier til en koncentration på MOI = 0,2 pr 100 pi. Fjern mediet fra brøndene og tilsættes 100 pi virus fortynding per brønd.
      2. Der inkuberes ved 37 ° C i 2 timer.
    8. Aspirer medier fra hver brønd, og tilsættes 100 pi frisk komplet medium.
    9. Der inkuberes ved 37 ° C i 20-22 timer.
    10. Bestem virustitrering i supernatanterne.
      1. Opsaml supernatanten fra hver brønd og udskiftes med 100 pi frisk komplet medium.
        BEMÆRK: Hvis der anvendes suspensionsceller, resuspendere cellepelleten fra det følgende trin i 100 pi frisk fuldstændigt medium og vende tilbage til prøve godt for levedygtighed assay.
      2. Fjern Cellular rester fra de indsamlede supernatanter ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
      3. Overfør ryddet supernatant til et nyt rør og titrere smitsomme virus på tolerante celler, der ikke udtrykker de beslægtede microRNA'er som beskrevet i afsnit 4.
        BEMÆRK: Hold alle prøver på is for at forhindre tab af infektivitet.
    11. Bestemme levedygtigheden af cellerne.
      1. Der tilsættes 10 pi MTT (3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) reagens per brønd.
      2. Der inkuberes ved 37 ° C i 2-4 timer, indtil lilla bundfald er synlig.
      3. Tilsæt 100 pi af detergent reagens.
      4. Der inkuberes ved stuetemperatur i mørke i 2 timer.
      5. Læs absorbans af alle brønde ved 570 nm.
        BEMÆRK: Normalisér alle prøver at håne transfekterede celler til sammenligning af procent cellelevedygtighed.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Tabel 1 viser resultater er typiske for en titrering analyse for et picornavirus og beskriver, hvordan man beregner 50% vævskultur infektiøs dosis. En skematisk fremstilling af det samlede koncept af microRNA-baserede regulering af viral tropisme beskrevet i dette manuskript er vist i figur 1. Orienteringen af microRNA til responselement under intracellulære interaktioner, korrekt udformning af responselement oligonukleotider til annealing og plasmid insertion og en over plasmid DNA kodende for et microRNA målrettet virale genom til in vitro-transkription er afbildet i figur 2. Figur 3 viser RNA-transkripter ved varierende grader af integritet visualiseret ved agarosegelelektroforese. Korrekt håndtering og anvendelse af DNA skabeloner uden urenheder vil resultere i korrekt transkriberede RNA-transkripter som vist i 3A lane 2. resterende urenheder inden linearized DNA skabeloner eller spormængder af nuclease kan resultere i lave niveauer af forkert transkriberet RNA og / eller nedbrydningsprodukter af samme størrelsesorden som i 3A lane 3. Ufuldstændig linearisering af plasmid-DNA eller DNA indeholdende høje mængder af urenheder, såsom resterende ethanol vil resultere i ukorrekt transkriptions- og nedbrydningsprodukter repræsenteret i 3A bane 4 og 5. Figur 3 viser også et billede af Mengovirus-medierede cytopatiske virkninger (CPE) efter transfektion af rene RNA-transkripter. Figur 4 viser data, der repræsenterer et tidsforløb eksperiment evaluere vækst kinetik umodificeret og microRNA-rettet Mengovirus. Resultaterne viser, at microRNA responselementer manipuleret ind i Mengovirus genomet ikke ændrer kinetikken af ​​virusreplikation i H1-HeLa-celler, som ikke udtrykker nogen af ​​de beslægtede microRNA. Men i RAW 264,7 makrofager, som udtrykker mellemliggende niveauer af microRNA-125 og høje niveauer af microRNA-142, vira koder for de tilsvarende responselementer vise inhiberede replikering kinetik som korrelerer med niveauet af microRNA udtrykkes. Dataene i figur 5 viser specificiteten af microRNA-baserede regulering af Mengovirus tropisme. Overekspression af enkelte microRNA i H1-HeLa-celler specifikt inhiberer opformering (lavere virustitere) og cytotoksicitet (øget cellelevedygtighed) af Mengovirus koder for det beslægtede microRNA responselementet.

    figur 1
    Figur 1: Skematisk fremstilling af microRNA-baserede regulering af viral tropisme. MicroRNA responselementer (RE) inkorporeret i et viralt genom vil blive genkendt af beslægtede microRNA beriget inden for specifikke celletyper og resultere i målrettet nedbrydning af virustranskripter / genomer. Dette vil forhindre virusreplikation, sprede og toksicitet til the omkringliggende celler. Imidlertid vil virusreplikation blive opretholdt i celler, der ikke udtrykker de beslægtede microRNAer muliggør virusformering, spredning og celledød. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 2
    Figur 2: MicroRNA responselement design. (A) For vellykkede målretning frøet sekvens region af RE bør være perfekt komplementær. RE bør være orienteret inden det virale genom, således at det kan genkendes af den beslægtede modne microRNA i mRNA-transkripter og / eller det virale genom. Størstedelen af ​​VE er placeret i 3'UTR af udskrifter. (B) Afbildning af korrekt udformet og afhærdede oligonukleotider koder RE indeholder tandemgentagelser af microRNA-målsekvenser (MIRT) flankeret af de overhængende nucleotider af Xhol-restriktionsenzymsted. Ved udformningen tandem gentagne RE'er, skal du medtage spacer nukleotider (generelt 4-6) mellem hver microRNA-target kopi. (C) Plasmid DNA kodende for et fuld-længde virale genom med en RE inkorporeret i 3'UTR, en T7-promotor, og et unikt restriktionssted til linearisering til in vitro transkription. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 3
    Figur 3: Redning af virus fra genom-kodende RNA-transkripter. (A) RNA-gelelektroforese af in vitro transskriberede RNA'er kodende picornavirus genomer at evaluere transkript integritet. Lane 1: RNA stigen. Bane 2: Korrekt transkriberet RNA med høj integritet. Bane 3: RNA-transkripter med moderat integritet. Højere bånd er korrekte størrelse og lavere bånd er potentielt et nedbrydningsprodukt eller et uønsket RNA udskrift. Bane 4: Forkert transkriberet RNA. Bane 5: Lav integritet RNA. 500 ng af in vitro-transkriberet RNA blev fyldt per brønd. Ukorrekte transkription eller nedbrydningsprodukter er sandsynligvis på grund af brugen af ​​lav renhed eller ufuldstændigt lineariseret DNA. (B) Billede af mock-transficerede H1-HeLa-celler og celler transficeret med RNA-transkripter koder Mengovirus. Administration af transfektionsreagenser kun (Mock) vil opretholde cellelevedygtighed efter transfektion samt passage på friske celler. Transfektion af RNA-transkripter koder for et Mengovirus genom (VMC 24) resulterer i cytopatiske virkninger, som er opretholdt efter filtrering af supernatanten og passagen på friske H1-HeLa-celler. Scale bar = 100 um.ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 4
    Figur 4: Vækst kinetik umodificerede og microRNA-målrettede Mengoviruses i nærvær eller fravær af sammenhørende microRNA. Modificeret fra henvisning 17. (A) H1-HeLa-celler udtrykker ikke miR-124, -125, eller -142. Alle tre Mengovirus kodning microRNA RE'er replikere med lignende kinetik som den umodificerede virus (VMC 24) indikerer, at indsættelse af microRNA på dette sted (5 'UTR) ikke ændrer virusreplikation. (B) RAW 264.7 makrofager udtrykker mellemliggende niveauer af miR-125b og høje niveauer af miR-142-3p, men udtrykker ikke miR-124. Inkorporering af de tilsvarende microRNA-målsekvenser i genomet resulterer i virus attenuation overensstemmelse med niveauet af microRNA ekspression. Data er repræsenteret som gennemsnitsværdier virustitere +/- SD. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 5
    Figur 5: Analyse af microRNA-targeting specificitet ved hjælp af syntetiske microRNA efterligner. Modificeret fra henvisning 17. H1-HeLa-celler transficeret med individuelle microRNA efterligner blev inficeret med umodificeret virus (VMC 24) eller microRNA-rettet virus (MIRT-VMC 24) ved en MOI på 0,2. (A) Cellelevedygtigheden normaliseret til mock-behandlede celler blev bestemt ved 24 timer efter infektion via MTT celleproliferationsassay. (B) Virustiter i supernatanten af alle prøver blev også bestemt ved 24 timer efter infektion. Detdata er vist som middelværdi levedygtighed eller viral titer +/- SD. To-tailed uparrede Student t test med Welch korrektion (for ulige varianser) blev anvendt til statistisk analyse. En p-værdi <0,01 blev betragtet som signifikant. (**, P <0,01, *** p <0,001). Klik her for at se en større version af dette tal.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Udformningen, sammensætning og lokalisering af microRNA responselementer inden det virale genom vil diktere målretning effekt og specificitet. Optimering disse vil kræve trial and error. Men rationelt design baseret på RNA strukturanalyse og tidligere undersøgelser af viral replikation og microRNA signaturer hjælpemidler i forbindelse med gennemførelsen af denne teknik med minimale optimering 10, 11, 12, 13, 38,.

    Når indlede udformningen af ​​VE bør efterforskere begynde med at udarbejde en række microRNA, som udtrykkes i målcellerne af interesse, er formindsket i de ikke-målceller af interesse, og som er blevet eksperimentelt valideret. Efter denne kompilering, bør gennemføres flere forudsigelse-baserede analyser behandle mulighederne for konkurrerende microRNA-udsigt til rentenedsættelsert interaktioner. Mange vira koder microRNA eller ikke-kodende RNA'er, der sekvestrerer cellulære microRNA for at manipulere viral og host-genekspression. Desuden har flere RNA-vira vist sig at vekselvirke med cellulære microRNA for at øge deres replikation kapacitet 39, 40. Derfor, når designe RE'er, skal du sørge for at undersøge, om der er kendte interaktioner af virus med cellulære microRNA eller hvis de udtrykker virale microRNA, der potentielt kan genkende den valgte microRNA mål eller ændre den endogene udtryk for den valgte microRNA. Ud over litteratursøgning, bør læseren overveje online bioinformatik forudsigelsesværktøjer og databaser, der omfatter viral microRNA target oplysninger til støtte i den rationelt design af VEK. Sådanne databaser og forudsigelsesværktøjer kan også gøre det lettere at identificere målsekvenser, der kan genkendes af flere microRNAer eller overlappende frø sekvenser pre sendes inden den virale genom. For en mere dybdegående diskussion om metoder til at identificere microRNA mål og de fordele og ulemper ved nogle af de online forudsigelsesværktøjer henvises læseren til referencer 41, 42. Det anbefales, at disse forudsigelsesværktøjer kun tjene som guider så mange gange forudsigelser kan give falske positiver eller negativer. Til dette formål kan der være frø sekvenser, der overlapper, vil dog 3'-enden af ​​microRNA også påvirke målretning effektivitet. Brug for strenge af et regelsæt kan undertiden være skadelig.

    Når et sæt af potentielle microRNA mål er blevet identificeret, bør forsøgslederen fortsætte ved at rangordne de mål baseret på de biologiske egenskaber af de microRNA og RNA strukturelle forudsigelser 10, 11, 12, 13,ef "> 38. Den absolutte overflod af den modne microRNA i målrettede celler og dets grad af tilknytning til en Argonaute protein vil diktere graden af gendæmpning. Flere undersøgelser har vist, at kun rigeligt udtrykt microRNA væsentlig grad vil regulere genekspression 16, 43, 44. endvidere har nogle microRNA er rigeligt udtrykt deres samspil med Argonaute proteiner og dannelsen af RISC er utilstrækkelig til at undertrykke oversættelse 44. Ved hjælp af en meget rigelig microRNA med validerede funktion vil også minimere risikoen for microRNA mætning i målcellen og efterfølgende off- target toksiciteter. en anden tilgang kan være at bruge RE'er der er målrettet af flere miRNA 45, 46, der kunne muliggøre en nedsat kopiantal, mens der stadig minimerer potentialet for off-target toxicities. Forholdet mellem target mRNA til microRNA vil også have en betydelig indvirkning på succesen af ​​denne tilgang. Et højt mål til microRNA ratio vil reducere niveauet af undertrykkelse 42, 43, 47, 48. Dette er især kritisk med virus, der replikerer hurtigt, når hvis forkert reguleret tidligt under infektion vil akkumulere til niveauer herre over endogene microRNA. Det er vigtigt at overveje disse egenskaber, når de vælger en microRNA til at målrette; ideelt under anvendelse af en microRNA hvis funktion er blevet eksperimentelt valideret.

    Effektiviteten af ​​målrettet gendæmpning er også påvirket af procent komplementaritet målet til den modne microRNA samt antallet af kopier af microRNA-målsekvenser indsat. 5'-regionen af ​​microRNA (nukleotid 2-8) udgør frøet sekvens. Det er almindeligt accepteretat denne region skal være perfekt komplementære for vellykket målretning 48, 49. De fleste undersøgelser anvender responselementer med perfekt komplementaritet fordi det kan øge gendæmpning aktivitet ved at fremme spaltning i kernen af ​​transkriptet og hurtig genvinding af microRNA. Denne spaltning i kernen opstår kun, når en microRNA interagerer med et Argonaute protein, som har endonucleolytisk aktivitet, hvilket i pattedyrceller er begrænset til Argonaute-2. Andre Argonaute proteiner fremmer mRNA nedbrydning ved deadenylation og exonucleolytisk angreb af udskrift. Læseren henvises til referencer 4, 5, 13, 50, 51, 52 for en grundig beskrivelse af microRNA biogenese og funktion. Det er generelt mente, at incrlempelse kopitallet vil yderligere forbedre targeting effektivitet. Dette kan dog også potensere microRNA mætning og har ikke altid vist sig mere virkningsfuldt. Det er nogle gange bedre at indarbejde målsekvenser for flere forskellige microRNA'er beriget med målcellerne eller bruge target sekvenser, der er anerkendt af flere microRNA. Kopitallet kræves, er også meget afhængig af mængden af ​​transkript, som vil skulle lyddæmpning og den relative forekomst af microRNA i målcellerne. Udskrifter, der vil ophobes hurtigt kan kræve flere eksemplarer for at forhindre dem i at udkonkurrere de microRNA niveauer. Eksperimentelt bestemme det optimale antal kopier for hver microRNA mål, der resulterer i tilstrækkelig målretning fastholder viral fitness, og som minimerer anbefales hastigheden af ​​escape-mutationer.

    Lokalisering af microRNA respons element i det virale genom er yderst vigtigt. Et negativt resultat, når man analysererden målrettet effektivitet betyder ikke altid virus kan ikke være microRNA-rettet. Det kan simpelthen betyde målet ikke er tilgængelig i denne placering eller at undertrykkelsen af ​​det målrettede gen er ikke tilstrækkelig til at inhibere patogeniciteten. Størstedelen af ​​responselementer er indsat i 3'-utranslaterede regioner (UTR) af det målrettede transkript. Imidlertid har vellykket målretning af virusgenomer er opnået og undertiden udviser forøget genetisk stabilitet, når responselementer indsættes i 5 'UTR eller inden for de kodende regioner af essentielle gener 38. Optimale indsættelsessteder vil tillade høj tilgængelighed af målsekvensen til microRNA. Tilgængelighed kan hindres af RNA sekundære strukturer og støkiometrisk indblanding. Derfor lokalisering responselementer i ustrukturerede regioner, som er stærkt konserverede, er et godt udgangspunkt. De sekvenser, der indsættes, kan også påvirke og blive påvirket af de omgivende sekvenser. Thus, en optimal placering for en microRNA target sekvens er ikke nødvendigvis optimal for andre respons elementer. Mens eksperimentel validering og optimering af VE lokalisering er nødvendigt, ved hjælp af forudsigelse software (f.eks http://unafold.rna.albany.edu/; http://rna.urmc.rochester.edu/software.html) at screene potentielle indsætte sites for forstyrrelse af de omkringliggende RNA-strukturer er stærkt anbefales 53, 54.

    Brugen af ​​rene nukleinsyre præparater af høj integritet er også kritisk for at opnå de bedste resultater. Aseptisk teknik og vedligeholdelse af et RNase-frit miljø ved håndtering RNA-transkripter eller microRNA efterligner er afgørende. For de bedste resultater RNA-transkripter, bør microRNA efterligner, og endelige titrerede virusstammer opbevares ved -80 ° C i små portioner for at undgå gentagen nedfrysning og optøning resulterer i RNA-nedbrydning og tab af virus infektivitet. Under brug disse reagenss skal opbevares på is på alle tidspunkter.

    Det er vigtigt at bemærke, at mange microRNA er medlemmer af en familie af microRNA der deler komplementaritet. Derfor, når gennemførelse af undersøgelser kan det være en fordel at omfatte medlemmer af den nærmeste microRNA familien for at forbedre målretning-specificitet evaluering. Dette bliver kritisk, når cellerne inden for hvilke der ønskes virusreplikation, ekspres familiemedlemmer (f.eks MIR-Let7 familie). Det skal også bemærkes, at specificiteten assay under anvendelse af microRNA efterligner er et kunstigt system, og over-ekspression af et microRNA i nogle celler kan resultere i off-target effekter 55. Hvis dette sker, kan specificiteten også blive evalueret i celler, der udtrykker de passende microRNA hjælp microRNA-hæmmere i stedet. Dette assay ville tillade analyse af målretning-specificitet baseret på virustitrering og cellelevedygtighed udlæsninger i nærværelse af fysiologisk relevante niveauer af microRNA.

    10, 11, 12, 13. Mange vira udviser høje mutationsgrader og undslippe mutanter kan opstå hurtigt. Herunder flere kopier af en målsekvens, herunder mål for mere end en microRNA, lokalisering målene inden flere højt konserverede regioner, eller tilstedeværelsen af ​​yderligere antivirale faktorer, herunder et immunrespons kan afhjælpe dette. Derudover vil indsættelse af fremmed genetisk materiale i et virusgenom resulterer ofte i formindsket replikation kapacitet af virusset. Hvis dette sker, microRNA målet sandsynligvis vil være genetisk ustabile og undslippe mutanter vil opstå hurtigere. Inddragelse af flere microRNA mål kopier can også øge potentialet for rekombinatoriske sletning af microRNA targets. Derfor er det nødvendigt eksperimentel bestemmelse af den mindste kopi nummer kræves for tilstrækkelig målretning. Lokalisering microRNA target kopier i forskellige steder i hele genomet versus bruge tandemgentagelser kan støtte i at omgå denne begrænsning. Men identificere optimale VE-konfigurationer med det mindste antal mål nødvendige eksemplarer og indsæt websteder, der ikke resulterer i ændrede replikation kinetik virussen er afgørende for at minimere antallet af rekombination og target mutation. Inddragelse af alt for mange kopier af en målsekvens kan også øge risikoen for off-target toksiciteter hvis det resulterer i microRNA mætning. En væsentlig ændring i mængden af microRNA rådighed for reguleringen normale cellulære proteiner kan resultere i uønskede virkninger 55. Med henblik herpå mange vira ændrer microRNA miljø i en celle 56, og hvis detteomfatter den målrettede microRNA, kan effektiviteten af ​​regulering blive nedsat, hvis opretholdes nok virusreplikation. Alle disse bekymringer kan løses ved at optimere respons element sammensætning og / eller lokalisering og med en grundig forståelse af systemet bliver målrettet og dens begrænsninger.

    Typiske problemer forbundet med andre målretningsmetoder omfatter off-target dæmpning af viruset, at størrelse begrænsninger for genetisk targeting materiale i vira med begrænsede bæreevne og sikkerhedsproblemer forbundet med engineering virus målrette celler, som normalt ikke er inficeret. MicroRNA-målretning tillader regulering af viral tropisme med minimal modifikation af virusset. Det kræver minimal plads inden for et viralt genom og kan skræddersys baseret på en ekspansiv matrix af cellulære microRNA signaturer. Denne teknik er ikke indføre nye tropismer for virus og derfor ikke indføre nye sikkerhedsproblemer. Desuden er dennemetode kan bruges til at regulere flere tropismer samtidigt ved hjælp målsekvenser for flere forskellige microRNA beriget inden for forskellige celletyper 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61. Dette kan alle udføres uden dæmpning virus i celler, der ikke udtrykker de tilsvarende microRNA og derfor kan tilvejebringe en mekanisme til forbedring af sikkerheden af ​​terapeutiske virus med forøget styrke.

    Udnyttelse af cellulær microRNA maskiner kan anvendes til regulering af tropisme af mange forskellige klasser af vira. Protokollerne beskrevet her, er designet til redning og karakterisering af en microRNA-målrettet picornavirus, men de kan tilpasses i henhold til en virus 'replikation cyklus og specifik reporter readouts. Selvom forskellige vira har specifikke redningsstrategier, kan microRNA målsekvenser indsættes i det virale genom, uanset om hele genomet kodes i et enkelt plasmid eller om virusset har en DNA- eller RNA-genom. Så længe de producerende celler ikke udtrykker de beslægtede microRNA'er, bør optimerede microRNA mål ikke forstyrre virus redning. Forsøg at analysere virus vækst kinetik og microRNA-targeting specificitet kan ændres ved at ændre tidspunkter indsamlede baseret på længden af en enkelt runde af virusreplikation og om særlige aflæsninger for virusreplikation / toksicitet (f.eks reporter proteiner, cytotoksicitet, genom kvantificering, etc.). Det er vigtigt at bemærke, at selv om denne teknik i teorien kan anvendes på alle klasser af vira, kan mange faktorer påvirke effektiviteten af ​​denne metode. For eksempel har negativ-sense RNA-vira ikke vist sig så responsiv som positiv-sense-RNA-virus sandsynligvis grundet begrænset actilgænge- ligheden af det genomiske RNA til miRNA maskiner 13. Således vil de biologiske egenskaber hver klasse af vira give yderligere begrænsninger på VE optimering. På trods af disse begrænsninger, denne teknik giver en alternativ metode til at målrette viral tropisme lette forskning, der omfatter sikkerhed, anvendelighed, og grundlæggende forståelse af biologiske processer for alle klasser af virus.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
    Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
    Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
    T4 DNA Ligase System NEB M0202S
    MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
    MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
    0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
    5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
    Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
    Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
    TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
    TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
    0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
    2 ml Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
    Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
    MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
    MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
    Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
    pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional Regulation of the Heterochronic Gene Lin-14 By Lin-4 Mediates Temporal Pattern Formation in C. Elegans. Cell. 75 (5), 855-862 (1993).
    2. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans Heterochronic Gene Lin-4 Encodes Small RNAs With Antisense Complementarity to Lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
    3. Ambros, V. The Functions of Animal MicroRNAs. Nature. 431 (7006), 350-355 (2004).
    4. Bartel, D. P. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
    5. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target Recognition and Regulatory Functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
    6. Benitez, A. A., Spanko, L. A., Bouhaddou, M., Sachs, D., Tenoever, B. R. Engineered Mammalian RNAi Can Elicit Antiviral Protection That Negates the Requirement for the Interferon Response. Cell Rep. 13 (7), 1456-1466 (2015).
    7. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Yalcin, A., Meyer, J., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of Tissue-Specific MicroRNAs From Mouse. Curr Biol. 12 (9), 735-739 (2002).
    8. Landgraf, P., et al. A Mammalian MicroRNA Expression Atlas Based on Small RNA Library Sequencing. Cell. 129 (7), 1401-1414 (2007).
    9. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: Tools for MicroRNA Genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
    10. Kelly, E. J., Russell, S. J. MicroRNAs and the Regulation of Vector Tropism. Mol Ther. 17 (3), 409-416 (2009).
    11. Brown, B. D., Naldini, L. Exploiting and Antagonizing MicroRNA Regulation for Therapeutic and Experimental Applications. Nat Rev Genet. 10 (8), 578-585 (2009).
    12. Tenoever, B. R. RNA Viruses and the Host MicroRNA Machinery. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 169-180 (2013).
    13. Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNAs and Oncolytic Viruses. Curr Opin Virol. 13, 40-48 (2015).
    14. Brown, B. D., Venneri, M. A., Zingale, A., Sergi Sergi, L., Naldini, L., L, Endogenous MicroRNA Regulation Suppresses Transgene Expression in Hematopoietic Lineages and Enables Stable Gene Transfer. Nat Med. 12 (5), 585-591 (2006).
    15. Brown, B. D., et al. A MicroRNA-Regulated Lentiviral Vector Mediates Stable Correction of Hemophilia B Mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
    16. Brown, B. D., et al. Endogenous MicroRNA Can be Broadly Exploited to Regulate Transgene Expression According to Tissue, Lineage and Differentiation State. Nat Biotechnol. 25 (12), 1457-1467 (2007).
    17. Ruiz, A. J., Hadac, E. M., Nace, R. A., Russell, S. J. MicroRNA-Detargeted Mengovirus for Oncolytic Virotherapy. J Virol. 90 (8), 4078-4092 (2016).
    18. Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. Engineering Attenuated Virus Vaccines By Controlling Replication Fidelity. Nat Med. 14 (2), 154-161 (2008).
    19. Barnes, D., Kunitomi, M., Vignuzzi, M., Saksela, K., Andino, R. Harnessing Endogenous MiRNAs to Control Virus Tissue Tropism as a Strategy for Developing Attenuated Virus Vaccines. Cell Host Microbe. 4 (3), 239-248 (2008).
    20. Perez, J. T., Pham, A. M., Lorini, M. H., Chua, M. A., Steel, J., Tenoever, B. R. MicroRNA-Mediated Species-Specific Attenuation of Influenza a Virus. Nat Biotechnol. 27 (6), 572-576 (2009).
    21. Saydaminova, K., et al. Efficient Genome Editing in Hematopoietic Stem Cells With Helper-Dependent Ad5/35 Vectors Expressing Site-Specific Endonucleases Under MicroRNA Regulation. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14057 (2015).
    22. Langlois, R. A., et al. MicroRNA-Based Strategy to Mitigate the Risk of Gain-of-function Influenza Studies. Nat Biotechnol. 31 (9), 844-847 (2013).
    23. Kelly, E. J., Hadac, E. M., Cullen, B. R., Russell, S. J. MicroRNA Antagonism of the Picornaviral Life Cycle: Alternative Mechanisms of Interference. PLoS Pathog. 6 (3), e1000820 (2010).
    24. Pham, A. M., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Replication in Cells of Hematopoietic Origin is Necessary for Dengue Virus Dissemination. PLoS Pathog. 8 (1), 1002465 (2012).
    25. Langlois, R. A., Varble, A., Chua, M. A., García-Sastre, A., Tenoever, B. R. Hematopoietic-Specific Targeting of Influenza a Virus Reveals Replication Requirements for Induction of Antiviral Immune Responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (30), 12117-12122 (2012).
    26. Chua, M. A., Schmid, S., Perez, J. T., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Influenza a Virus Utilizes Suboptimal Splicing to Coordinate the Timing of Infection. Cell Rep. 3 (1), 23-29 (2013).
    27. Griffiths-Jones, S. The MicroRNA Registry. Nucleic Acids Res. 32, D109-D111 (2004).
    28. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: MicroRNA Sequences, Targets and Gene Nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).
    29. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Integrating MicroRNA Annotation and Deep-Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 39, D152-D157 (2011).
    30. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Annotating High Confidence MicroRNAs Using Deep Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 42, D68-D73 (2014).
    31. Heckman, K. L., Pease, L. R. Gene Splicing and Mutagenesis By PCR-Driven Overlap Extension. Nat Protoc. 2 (4), 924-932 (2007).
    32. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. . , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5063/gel-purification (2016).
    33. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Ligation Reactions. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5069/dna-ligation-reactions (2016).
    34. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method (2016).
    35. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA From Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
    36. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
    37. Separation of RNA in Agarose Gels. Sourcebook for Electrophoresis. Lonza. , Available from: http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_BenchGuides_SourceBook_Section_VIII_-_Separation_of_RNA_in_Agarose_Gels.pdf 132-145 (2016).
    38. Kueberuwa, G., Cawood, R., Tedcastle, A., Seymour, L. W. Tissue-Specific Attenuation of Oncolytic Sindbis Virus Without Compromised Genetic Stability. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 154-165 (2014).
    39. Grundhoff, A., Sullivan , C. S. Virus-Encoded MicroRNAs. Virology. 411 (2), 325-343 (2011).
    40. Kincaid, R. P., Sullivan, C. S. Virus-Encoded MicroRNAs: An Overview and a Look to the Future. PLoS Pathog. 8 (12), e1003018 (2012).
    41. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental Strategies for MicroRNA Target Identification. Nucleic Acids Res. 39 (16), 6845-6853 (2011).
    42. Thomson, D. W., Dinger, M. E. Endogenous MicroRNA Sponges: Evidence and Controversy. Nat Rev Genet. 17 (5), 272-283 (2016).
    43. Mullokandov, G., et al. High-Throughput Assessment of MicroRNA Activity and Function Using MicroRNA Sensor and Decoy Libraries. Nat Methods. 9 (8), 840-846 (2012).
    44. Thomson, D. W., et al. Assessing the Gene Regulatory Properties of Argonaute-Bound Small RNAs of Diverse Genomic Origin. Nucleic Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
    45. Wu, S., et al. Multiple MicroRNAs Modulate P21cip1/waf1 Expression By Directly Targeting Its 3' Untranslated Region. Oncogene. 29 (15), 2302-2308 (2010).
    46. Vo, N. K., Dalton, R. P., Liu, N., Olson, E. N., Goodman, R. H. Affinity Purification of MicroRNA-133a With the Cardiac Transcription Factor, Hand2. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19231-19236 (2010).
    47. Arvey, A., Larsson, E., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Target mRNA Abundance Dilutes MicroRNA and siRNA Activity. Mol Syst Biol. 6, 363 (2010).
    48. Garcia, D. M., Baek, D., Shin, C., Bell, G. W., Grimson, A., Bartel, D. P. Weak Seed-Pairing Stability and High Target-Site Abundance Decrease the Proficiency of Lsy-6 and Other MicroRNAs. Nat Struct Mol Biol. 18 (10), 1139-1146 (2011).
    49. Jinek, M., Doudna, J. A. A Three-Dimensional View of the Molecular Machinery of RNA Interference. Nature. 457 (7228), 405-412 (2009).
    50. Pasquinelli, A. E. MicroRNAs and Their Targets: Recognition, Regulation and an Emerging Reciprocal Relationship. Nat Rev Genet. 13 (4), 271-282 (2012).
    51. Finnegan, E. F., Pasquinelli, A. E. MicroRNA Biogenesis: Regulating the Regulators. Crit Rev Biochem Mol Biol. 48 (1), 51-68 (2013).
    52. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of MicroRNA Biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
    53. Zuker, M. Mfold Web Server for Nucleic Acid Folding and Hybridization Prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
    54. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA Secondary Structure Prediction and Analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
    55. Khan, A. A., Betel, D., Miller, M. L., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Transfection of Small RNAs Globally Perturbs Gene Regulation By Endogenous MicroRNAs. Nat Biotechnol. 27 (6), 549-555 (2009).
    56. Skalsky, R. L., Cullen, B. R. Viruses, MicroRNAs, and Host Interactions. Annu Rev Microbiol. 64, 123-141 (2010).
    57. Sugio, K., et al. Enhanced Safety Profiles of the Telomerase-Specific Replication-Competent Adenovirus By Incorporation of Normal Cell-Specific MicroRNA-Targeted Sequences. Clin Cancer Res. 17 (9), 2807-2818 (2011).
    58. Fu, X., Rivera, A., Tao, L., De Geest, B., Zhang, X. Construction of an Oncolytic Herpes Simplex Virus That Precisely Targets Hepatocellular Carcinoma Cells. Mol Ther. 20 (2), 339-346 (2012).
    59. Yao, W., Guo, G., Zhang, Q., Fan, L., Wu, N., Bo, Y. The Application of Multiple MiRNA Response Elements Enables Oncolytic Adenoviruses to Possess Specificity to Glioma Cells. Virology. 458-459, 69-82 (2014).
    60. Bofill-De Ros, X., Gironella, M., Fillat, C. Mir-148a- and Mir-216a-regulated Oncolytic Adenoviruses Targeting Pancreatic Tumors Attenuate Tissue Damage Without Perturbation of MiRNA Activity. Mol Ther. 22 (9), 1665-1677 (2014).
    61. Baertsch, M. A., et al. MicroRNA-Mediated Multi-Tissue Detargeting of Oncolytic Measles Virus. Cancer Gene Ther. 21 (9), 373-380 (2014).

    Tags

    Immunologi microRNA microRNA-targeting picornavirus oncolytisk tropisme virus cytotoksicitet replikation genekspression
    MicroRNA-baserede Regulering af Picornavirus Tropisme
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Ruiz, A. J., Russell, S. J.… More

    Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (120), e55033, doi:10.3791/55033 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter