Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

MicroRNA-gebaseerde verordening van Picornavirus Tropism

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/55033

Introduction

De ontwikkeling van een breed toepasbare, eenvoudige en effectieve werkwijze voor het manipuleren van een vector met beperkte tropisme biedt een grote kans om de veiligheid, biologische begrip en therapeutische bruikbaarheid virussen verbeteren. Verschillende mechanismen bestaan ​​om virale tropisme waaronder transductional, transcriptionele en translationele gebaseerde technieken richten. Deze werkwijzen zijn niet algemeen voor alle vectorsystemen, defect signaalwegen in doelcellen vereisen of vereisen grote insertie van coderende sequenties in het virale genoom. Bovendien kunnen deze werkwijzen resulteren in verzwakking van het virus aanzienlijk belemmeren hun therapeutische activiteit en het beperken inzicht in het ongemodificeerde systeem.

MicroRNAs zijn kleine (22-25 nucleotiden), niet-coderende RNA dat gen silencing mediëren in eukaryote cellen. MicroRNA functie door het binden van complementaire doelwit sequenties (response-elementen) in messenger RNA (mRNA) resulti ng in transcript destabilisatie, degradatie of translationele repressie. MicroRNAs gewoonlijk binden responselementen met gedeeltelijke complementariteit en op kleine wijzigingen in genexpressie 1, 2, 3, 4, 5. Belangrijker veranderingen in genexpressie kan worden bereikt door verhoging van de complementariteit responselement 6. Duizenden mature microRNAs zijn geïdentificeerd in verschillende soorten en vele vertonen differentiële expressie patronen in verschillende cel- en weefseltypes 7, 8, 9. Deze microRNA handtekeningen kunnen worden benut celspecifieke beperking van virusreplicatie door opname perfect complementair responselementen in het virale genoom 10,= "xref"> 11, 12, 13. De algemene doelstelling van deze microRNA-targeting techniek is om het tropisme van een vector genoom te bedienen zonder extra demping.

De bruikbaarheid van deze methode voor het reguleren van virale tropisme werd oorspronkelijk aangetoond lentivirale vectoren transgenexpressie beperking op specifieke weefsels 14, 15, 16. Deze techniek is vervolgens toegepast op een breed scala van replicerende en niet-replicerende virale vectoren voor verbeterde gentherapie en de veiligheidsprofielen van vele oncolytische virussen verbeteren door geen ongewenste toxiciteit in normale weefsels 10, 11, 12, 13, 17 . Ook is gebruik gemaakt veilig en e genererenffectieve levende verzwakte vaccins en aan betere vaccins virus en fabricageprocessen 18, 19, 20, 21. MicroRNA-targeting van een vector kunnen zorgen voor een demping bij gevaccineerde hosts of gerichte systemen met behoud van wild-type groeiniveaus van de producentenprijzen systemen. MicroRNA targeting kan ook worden gebruikt om de biologische veiligheid van virussen voor onderzoeksdoeleinden te verbeteren door het beperken transmissie in één soort (bijvoorbeeld mens) terwijl het bericht in het andere hosts 22. Tot slot, microRNA-targeting kunnen zorgen voor een diepgaande analyses van virale levenscycli en de specifieke rol van celtypen in de pathogenese en immuniteit door het scheiden van de virale groei van 23, 24, 25, 26.

Deze techniek biedt een alternative targeting methode die gemakkelijk wordt uitgevoerd en geldt voor alle virus systemen. Daarnaast is de steeds groeiende verzameling van volwassen microRNAs met differentiële expressie patronen in specifieke celtypen maakt deze techniek zeer veelzijdig. MicroRNA-based targeting is doeltreffend voor verschillende virus systemen bewezen zonder dat systeem functioneren. De belangrijkste beperkingen van deze techniek omvatten trial and error optimalisatie, de mogelijkheid van ontsnapping mutaties en potentiële off-target effecten op de endogene transcripten. Toch kunnen deze beperkingen in het algemeen worden overwonnen met geoptimaliseerd en rationeel antwoord element design. Positieve-sense RNA-virussen vaak bijzonder reageert op microRNA targeting om als gevolg van de positieve-sense oriëntatie van het genoom en de beschikbaarheid van de transcripten aan de machine tijdens het microRNA volledig cytoplasmatische replicatiecyclus. Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van een microRNA-gerichte picornavirus en de experimental tot de efficiëntie en specificiteit van deze targeting in vitro verifiëren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Klonen microRNA Response Elements in het virale genoom

  1. Ontwerp microRNA reactie element inserts.
    1. Identificeer de gewenste microRNA en de bijbehorende doelsequentie. Verschillende databases zijn beschikbaar met volwassen microRNA sequenties. Aanbevolen: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30.
  2. Kloon het responselement in plasmide DNA dat codeert voor het vector genoom of transcript.
    LET OP: Voor twee of meer een kopie reactie-elementen met behulp van een unieke restrictieplaats voor invoeging is gemakkelijker en veelzijdiger.
    1. Plaats reactie element of unieke restrictie site met behulp van splice-overlap verlenging (SOE) PCR. Deze werkwijze is in detail beschreven 31.
    2. Bij gebruik van een restrictieplaats voor insertie, purjagen commercieel gesynthetiseerd PAGE-gezuiverde sense en antisense ultramers codeert de insertie sequenties geflankeerd door de overhang sequenties van de unieke restrictieplaats (Figuur 2).
    3. Combineer 0,5 ug zin ultramer, 0,5 gg antisense ultramer, DNA ligatie buffer tot een eindconcentratie van 1 x en breng aan 50 ui met H2O annealen de ultramers door het incuberen van de reactie bij 85 ° C gedurende 10 min en vervolgens verlagen van de temperatuur met 0,5 ° C per 30 seconden totdat de reactie bereikt 25 ° C.
    4. Combineer 0,5 ug vector DNA dat voor het nieuwe unieke restrictieplaats, enzymbuffer een 1x eindconcentratie, 1 ul van de geschikte restrictie-enzym en breng op een eindvolume van 20 pl met H2O Digest de vector bij 37 ° C gedurende 2 uur. Zuiver het gelineariseerde DNA door agarose gel zuivering 32.
    5. Afbinden de gegloeide ultramers in de gedigereerde vector 's nachts bij 16 °; C onder toepassing van een 3: 1 ultramers: vector molverhouding en standaard ligatietechnieken 33.
      OPMERKING: Bij gebruik van een restrictie-enzym plaats voor insertie kan het efficiënter om de uiteinden van het gedigereerde vector defosforyleren fosforyleren en de uiteinden van de oligonucleotiden zijn.
    6. Transformeer de geligeerde DNA in E. coli met behulp van de heat shock methode 34.
      OPMERKING: Plasmiden die coderen voor virale genomen zijn over het algemeen groot; het gebruik van competente cellen geoptimaliseerd voor opname grote DNA constructen transformatie-efficiëntie te verhogen.
    7. Zuiver plasmide DNA uit afzonderlijke kolonies met een algemeen verkrijgbare zuiveringskit 35. Identificeer een geschikte kloon met de microRNA responselement in de juiste oriëntatie (figuur 2) door sequentiebepaling van het insertgebied 36.

2. Het redden van microRNA-gerichte Picornavirus weerm Plasmide DNA

  1. Rescue microRNA-gerichte picornavirus in een cellijn tolerant voor virusreplicatie die niet de verwante microRNA (s) tot expressie brengt. Dit protocol maakt gebruik van H1-HeLa-cellen, omdat ze niet miR-142, miR-124, of miR-125 uit te drukken, maar het is niet verplicht om H1-HeLa-cellen gebruiken voor de redding.
    LET OP: Alle richtlijnen voor het veilig omgaan met en verwijdering van besmettelijke middelen moeten dienovereenkomstig worden gevolgd.
    1. Plaat H1-HeLa-cellen in een 6-wells plaat zodanig dat ze ~ 80% confluent bij de transfectie (24 uur na het enten). Plaat cellen in 2 ml per putje van DMEM gesupplementeerd met 10% foetaal runderserum.
    2. Verwarm het transfectiereagens tot kamertemperatuur. Combineer 250 ul serumvrij medium, 2,5 ug plasmide DNA dat codeert microRNA-gerichte genoom, en 7,5 pl transfectiereagens in een steriele microcentrifugebuis en pipet zachtjes te mengen. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15-30 min.
    3. Zuig hetmedia uit de vergulde cellen en voeg 2 ml vers compleet medium.
    4. Voeg de gehele transfectie mengsel uit stap 2.1.2 één putje van de 6-well plaat druppelsgewijs. Voeg elke druppel naar een ander gebied van de put.
    5. Incubeer de cellen bij 37 ° C tot cytopathische effecten (CPE) of reporter eiwitten detecteerbaar (~ 24-72 h).
  2. Harvest en de passage van de geredde virus op verse cellen.
    1. Plaat cellen in een 6-wells plaat zodanig dat ze 80-90% confluent bij de infectie (24 uur na het enten).
      OPMERKING: vergroot of verkleind afhankelijk van de hoeveelheid virus die noodzakelijk was voor alle volgende experimenten.
    2. Oogst iedere redding goed door het afschrapen van de cellen in het supernatant met behulp van een rubber cel schraper of rubber politieman. Voorzichtig sleep de schraper over de bodem van de put. Breng de cellen en supernatant in een cryogene opslagbuis.
    3. Bevriezen / ontdooien van de monsters twee keer en dan pellet de cellulaire puin doorcentrifugeren bij 1200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    4. Filter de heldere supernatant tweemaal met behulp van 0,2 um spuit filters. De gefilterde redding bovenstaande vloeistof bevat het virus.
      OPMERKING: Filter poriegrootte kan variëren naargelang de grootte van de virusdeeltjes en niet van toepassing voor grote virussen.
    5. Aspireren media van de geïllustreerde cellen, eenmaal wassen met serumvrij medium en voeg 1 ml vers serumvrij medium aan elk putje.
    6. Voeg 50 ul per putje van gefilterd redding supernatant en schud de plaat gelijkmatig virus te verspreiden.
    7. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 2 uur en daarna zuig media uit elk putje van feitelijke virus te verwijderen.
    8. Voeg 1,5-2 ml vers compleet medium per putje en incubeer bij 37 ° C totdat CPE of reporter eiwitten zichtbaar (~ 24-48 h).
    9. Herhaal de stappen 2.2.2 tot 2.2.4. Gefilterd redding supernatant bevat virus voorraad. Store virus voorraden in voor eenmalig gebruik aliquots in cryogene opslag buizen bij -80 °C.

3. Het redden van microRNA-gerichte virus uit in vitro getranscribeerd RNA-transcripten

  1. Genereren RNA transcripten uit plasmide DNA dat codeert voor het microRNA gerichte virale genoom gebruik van een stroomopwaartse promoter.
    OPMERKING: Standaard werkwijzen voor het genereren en handhaven van een nuclease-vrije omgeving worden gebruikt voor alle daaropvolgende stappen.
  2. Gelineariseerd plasmide DNA met een enzym restrictieplaats stroomafwaarts van het transcript. Combineer 5 ug plasmide-DNA, 1 x eindconcentratie enzymbuffer, 3 ui restrictie-enzym en 3 uur brengen 50 pl met H 2 O. Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C.
  3. Voeg 1/20 ste volume van 0,5 M EDTA, 1/10 volume 5 M NH4-acetaat, en 2 volumes 100% ethanol aan het gedigereerde reactie en meng. Incuberen bij -20 ° C gedurende 1 uur tot overnacht.
  4. Pellet de geprecipiteerde DNA gedurende 10 minuten bij 17.000 xg bij 4 ° C. Giet het supernatant, resuspendeer de pellet in 500 ui van koude 70% ethanol en het pellet DNA door centrifugeren bij 17.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  5. Giet het supernatans en centrifugeer nogmaals gedurende 30 sec. Verwijder de resterende bovenstaande vloeistof met een pipet en air-droog de pellet. Resuspendeer de pellet in steriele DNA nuclease-vrij H2O bij een concentratie van 0,5-1 ug / ul.
  6. Ontdooi de in vitro transcriptie reagentia bij kamertemperatuur en plaats het op ijs ribonucleotiden (enzymen in glycerol niet bevriezen en dienen direct op ijs). Houd de reactiebuffer bij kamertemperatuur.
  7. Monteer de transcriptiereactie in een PCR buis door het combineren 2 pi elk van ATP, CTP, GTP en UTP oplossingen, 2 pl 10x reactiebuffer, 1 ug gelineariseerd DNA, 2 pi enzym en breng op een eindvolume van 20 ul met nuclease -vrij H 2 O.
  8. Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 2 uur.
  9. Zuiver het RNA transcripten.
  10. Breng de transcriptie reactie op 100 ul met de elutie-oplossing (niet-voorverwarmde). Voeg 350 ul van bindoplossing concentraat en 250 pl 100% ethanol reactie en meng.
  11. Breng het monster een filter cartridge in een verzamelbuis en centrifugeer ingebracht gedurende 1 min bij 12.000 x g. Gooi het doorstroomkanaal.
  12. Voeg 500 pi wasoplossing om het filterpatroon en centrifugeer gedurende 1 min bij 12.000 x g. Discard doorstroming. Herhaal deze wasstap nog een keer. Discard doorstroming. Centrifugeer 1 min bij 12,0000 xg om resterende ethanol te verwijderen.
  13. Breng de filterpatroon een schone verzamelbuis en voeg 50 ul van de voorverwarmde elutieoplossing de filterpatroon. Centrifugeer gedurende 1 min bij 12.000 x g. Herhaal deze elutiestap een totaal volume van 100 ui eluens containing gezuiverd RNA-transcripten. Gooi filter-cartridge.
  • Bepaal de RNA-concentratie in het elutiemiddel door de absorptie van het monster bij 260 en 280 nm en met de Beer-Lambert wet.
  • Beoordeel de integriteit van het RNA gebruikmakend van RNA gelelektroforese 37. Zie figuur 3 voor voorbeelden van goede en slechte RNA integriteit. RNA worden aliquotted in eenmalig gebruik buizen en bewaard bij -80 ° C tot integriteit.
  • Warm transfectie reagentia op kamertemperatuur. Combineer 250 gl serumvrij medium, 2,5 ug gezuiverd RNA-transcripten, 5 pl boost oplossing en 5 pl transfectiereagens in een steriele microcentrifugebuis en pipet zachtjes te mengen. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 2-5 min.
  • Plaat H1-HeLa-cellen in een 6-wells plaat zodanig dat ze ~ 80% confluent bij de transfectie (24 uur na het enten). Plaat cellen in 2 ml per putje van DMEM gesupplementeerd met 10% fetal runderserum.
  • Zuig de media uit de vergulde cellen en voeg 2 ml vers compleet medium.
  • Voeg de gehele transfectie mengsel uit stap 3,12 tot een putje van de 6-well plaat druppelsgewijs. Voeg elke druppel naar een ander gebied van de put.
  • Incubeer de cellen bij 37 ° C tot cytopathische effecten (CPE) of reporter eiwitten detecteerbaar (~ 24-72 h).
  • Doorgaan redding van microRNA-gerichte virus zoals beschreven in stap 2.2 tot 2.2.9.
  • 4. titreren Virus voorraden op basis van 50% weefselkweek infectieuze dosis (TCID50)

    1. Plaat H1-HeLa-cellen in een 96-puts plaat bij 10 4 cellen per putje in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum. Incubeer cellen bij 37 ° C overnacht.
      OPMERKING: Titreer virus in cellen tolerant voor virusreplicatie die niet verwante microRNAs niet tot expressie brengen.
    2. Voeg 10-voudige seriële verdunningen van virus elk in een totaal volume van 1 ml serumvrijmedia.
      OPMERKING: Gebruik lagere verdunningen als er meer precisie vereist.
      LET OP: Verander tips na elke verdunning tot overschatting van titer voorkomen als virus kan vasthouden aan tips.
    3. Tip 96-wells plaat aan de zijkant en zuig media uit plated HeLa-cellen. Voeg 100 ul van elke verdunning virus per putje tot 8-putjes van 96-putjes plaat (1 toer per verdunning). Voeg 100 ul van het serum-vrije media zonder virus tot rij 1 en rij 12 op de plaat voor de controles.
      LET OP: Altijd aspireren en media aan putten door het aanraken van tip naar de andere kant van goed naar cel onthechting te voorkomen.
    4. Incubeer plaat bij 37 ° C gedurende 2 uur. Tip plaat aan de zijkant en zuig de media uit de putjes.
      OPMERKING: tips Change tussen elke verdunning rij.
    5. Voeg 100 pl compleet medium aan elk putje. Incubeer plaat bij 37 ° C gedurende 72 uur.
    6. Visualiseer de putten onder een microscoop en markeer elk putje positief of negatief voor CPE.
    7. Bereken elke virustiter de volgende vergelijking: Log 10 (TCID50 / ml) = L + D (S-0,5) + log 10 (1 / V). L is de negatieve log 10 van de meest geconcentreerde virus verdunning getest waarbij alle putjes positief. D de log 10 van de verdunningsfactor. S is de som van de individuele verhoudingen (pi). pi is de berekende hoeveelheid van een verdunning (hoeveelheid positieve putjes / totaal aantal putjes per verdunning. V het volume inoculum (ml / putje).

    tafel 1
    Tabel 1: Kwantificering infectueuze virusdeeltjes door berekening van de TCID50. Representatieve resultaten uit cellen geïnfecteerd met een reeks van tienvoudige verdunningen van de virusvoorraad. "L" gelijk aan 4, omdat de laatste verdunning waarbij alle putjes positief zijn voor CPE 10 -4. "D" de log 10 van 10, aangezien 10-voudige verdunningenwerden gebruikt en is dus gelijk aan 1. "S" is de som van de individuele verhoudingen. In dit voorbeeld zijn de individuele verhoudingen 1,0, 0,875, 0,375, 0,125 en 0. De som van deze (S) is 2,375. "V" het volume inoculum in ml gebruikt om de cellen in eerste instantie infecteren.

    5. Evaluatie-microRNA targeting Effectiviteit: Single-step Growth Kinetics

    1. Besturingen voor deze test omvatten schijn geïnfecteerde cellen, ongemodificeerde virus en virussen met een niet-gerichte of niet-functioneel responselement.
    2. Plaat H1-HeLa cellen gedurende een tijdsverloop experiment in 12-putjes weefselkweekplaten zodat ze 80-90% confluent bij de infectie (24 uur na het enten). Plaat cellen in DMEM gesupplementeerd met 10% foetaal runderserum in 1 ml per putje.
      OPMERKING: Aan te raden om een ​​aparte plaat voor elk tijdstip plaat. Dit protocol maakt gebruik van 7 verschillende tijdstippen voor een virus met een 12/8 hr replicatiecyclus. H1-HeLa-cellen zijn niet verplicht om dit een uit te voerenssay. Deze test moet worden uitgevoerd in gevoelige cellen die de beoogde microRNA expressie brengen. Deze test kan ook worden uitgevoerd in cellen die de cognate microRNA groei kinetiek onder selectiedruk evalueren.
    3. Aspireren media uit putten. Was putjes door het toevoegen van 0,5 ml serumvrij medium aan elk putje, de plaat wervelen en zuig media uit putten. Voeg 0,5 ml vers serumvrij medium aan elk putje.
    4. Infect elk putje bij een hoge multipliciteit van infectie (MOI, het aantal infectieuze deeltjes per cel) om ervoor te zorgen alle cellen krijgen geïnfecteerd. Dit protocol maakt gebruik van een MOI van 3.
      1. Verdun virusvoorraden in serumvrij medium tot een concentratie van MOI = 3 per 100 pl. Voeg 100 ul van virusverdunning elk zeven verschillende putjes en incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur.
      2. Zuig de media uit alle putjes en was twee keer door het toevoegen van 0,5 ml volledige media per goed, rockend zachtjes en vervolgens opzuigen.
    5. Voeg 1 ml complete media aan elk putje en incubeer bij 37 ° C tot de gewenste tijdstip.
    6. Verzamelen monsters voor virustitratie op 2, 4, 6, 8, 10, 24 en 48 uur na infectie (1 putje per tijdstip). Transfer 700 ul van de media in de put om een ​​cryogene opslag buis. Schraap de cellen in de resterende supernatant door voorzichtig het verplaatsen van een rubber schraper over het gehele goed. Breng de cel / supernatant mengsel aan de overeenkomstige opslagbuis cryogene met de 700 ui supernatant.
      LET OP: Zorg ervoor dat niet aan bovenstaande spatten van de ene goed in elkaar tijdens het schrapen wat resulteert in besmette monsters. Het overbrengen van de 700 pi voorafgaand aan schrapen zal spatten een minimum te beperken.
    7. Leg monsters bij -80 ° C totdat alle monsters verzameld.
    8. de monsters bevriezen / ontdooien drie keer en neem celresten door centrifugeren van de monsters bij 1200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    9. Titreer het virus zoals beschreven in hoofdstuk 4 en vergelijk de groei kinetiek op tik mij.

    6. Evaluatie-microRNA targeting specificiteit: Virus-uitspreidt Assay met behulp van synthetische microRNA Mimics

    LET OP: Het gebruik van een synthetische microRNA na te bootsen wordt uitgevoerd om de specificiteit van de microRNA tonen: microRNA-target interactie.

    1. Omvatten mock transfectie, negatieve controle microRNA na te bootsen en experimentele microRNA na te bootsen alleen controleert voor elke test om microRNA-gemedieerde toxiciteit te evalueren. Ook ideaal om een positieve controle (ie-microRNA doelwit gen of genoom) zo laag transfectie-efficiëntie van microRNA nabootst kan leiden tot vals negatieven omvatten.
    2. Plaat H1-HeLa-cellen in een 96-well weefselkweekplaat, zodat ze 80-90% confluent bij de transfectie (24 uur na het enten). Plaat cellen in DMEM gesupplementeerd met 10% foetaal runderserum bij 0,1 ml per putje.
      OPMERKING: Voer deze test in cellen tolerant voor virale replicatie, dat niet de verwante microRNAs niet tot expressie brengen.
    3. Warmtee transfectie reagentia op kamertemperatuur. Combineer 9 pi serum-vrije media, 200 nm eindconcentratie per putje van microRNA na te bootsen voorraad, 0,18 pi boost reagens, 0,18 pi transfectiereagens en meng. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 2-5 min.
      LET OP: vermelde volumes zijn per putje. Het wordt aanbevolen om een ​​master mix worden samengesteld voor transfectie van alle putten consistentie te behouden en te minimaliseren pipetteren fout. De optimale concentratie van microRNA nabootsen variëren. Instructies van de fabrikant bij de microRNA nabootsen een redelijke uitgangsconcentratie. Dit zal in het algemeen variëren 5-200 nM eindconcentraties.
    4. Zuig het medium van de putten en voeg 92 ul van vers volledig medium.
      Opmerking: Als er een groot aantal monsters, bevestig deze stap voorafgaand aan het monteren van de transfectie oplossing en bewaar de plaat bij 37 ° C tot klaar.
    5. Voeg de gehele transfectie mengsel in stap 6.3 om de cellen druppelsgewijs.
    6. Incubeer bij 37 ° C gedurende 6 uur.
    7. Infect elk putje bij een lage MOI een laag percentage cellen waarborgen besmet worden analyses van virusverspreiding toegestaan. Dit protocol maakt gebruik van een MOI van 0,2.
      1. Verdun virus voorraden in serum-vrije media tot een concentratie van MOI = 0,2 per 100 ul. Verwijder het afdrukmateriaal uit de putten en van het virus verdunning voeg 100 ul per putje.
      2. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur.
    8. Aspireren media uit elk putje en voeg 100 ul van verse volledige media.
    9. Incubeer bij 37 ° C gedurende 20-22 uur.
    10. Bepaal het virus titratie in de bovenstaande vloeistoffen.
      1. Verzamel de bovenstaande vloeistof uit elk putje en vervangen door 100 gl vers compleet medium.
        LET OP: Bij gebruik van opschorting cellen, resuspendeer de cel pellet uit de volgende stap in 100 ul van verse volledige media en terug te keren naar goed proeven levensvatbaarheid assay.
      2. Verwijder Cellular vuil van de supernatanten verzameld door centrifugeren bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C.
      3. Transfer de ontruimd supernatant naar een nieuwe buis en titreer besmettelijke virus op tolerante cellen die niet de verwante microRNAs niet tot expressie brengen, zoals beschreven in hoofdstuk 4.
        OPMERKING: Houd alle monsters op het ijs om het verlies van besmettelijkheid te voorkomen.
    11. Bepaal de levensvatbaarheid van de cellen.
      1. Voeg 10 ul MTT (3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5-difenyltetrazoliumbromide) reagens per well.
      2. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-4 uur totdat paarse neerslag zichtbaar.
      3. Voeg 100 ul wasmiddel reagens.
      4. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 2 uur.
      5. Lees absorptie van putjes bij 570 nm.
        OPMERKING: Normaliseer alle monsters om getransfecteerde cellen bespotten voor de vergelijking van het percentage levensvatbaarheid van de cellen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Tabel 1 geeft de resultaten een typisch voorbeeld van een titratie test voor een picornavirus en beschrijft hoe de weefselkweek infectieuze dosis van 50% te berekenen. Een schematische weergave van het totale concept van microRNA gebaseerde regulering van virale tropisme in dit handschrift beschreven wordt getoond in figuur 1. De oriëntatie van microRNA tot responselement tijdens intracellulaire interacties juist ontwerp van responselement oligonucleotiden voor hybridisatie en plasmide-insertie en een van plasmide DNA dat codeert voor een microRNA gerichte virale genoom in vitro transcriptie is in Figuur 2. Figuur 3 toont RNA-transcripten in verschillende mate van integriteit gevisualiseerd door agarose gelelektroforese. Juiste verwerking en het gebruik van DNA-matrijzen zonder verontreinigingen resulteert in adequate getranscribeerde RNA-transcripten zoals getoond in 3A baan 2. Residual onzuiverheden in de linearized DNA sjablonen of sporen van nuclease kan leiden tot lage niveaus van ten onrechte getranscribeerd RNA en / of afbraakproducten vergelijkbaar met dat in 3A baan 3. Onvolledige linearisatie plasmide DNA of DNA met een hoog gehalte van verontreinigingen, zoals resterende ethanol zal resulteren in onjuiste transcriptie en afbraakproducten 3A weergegeven in lanen 4 en 5. Figuur 3 toont ook een afbeelding van Mengovirus gemedieerde cytopathische effecten (CPE) na transfectie schone RNA transcripten. Figuur 4 toont gegevens representatief voor een tijdsverloop experiment evalueren van de groei kinetiek van ongemodificeerde en-microRNA gerichte Mengovirus. De resultaten tonen aan dat microRNA responselementen gemanipuleerd in de Mengovirus genoom niet de kinetiek van virusreplicatie in H1-HeLa-cellen, die geen van de verwante microRNA expressie brengen veranderen. Echter, in RAW 264,7 macrofagen, die tussenliggende niveaus van microRNA-125 en een hoog niveau van microRNA-14 uit te drukken2, virussen coderen voor de corresponderende respons elementen weergeven remde replicatie kinetiek die correleert met het niveau van microRNA expressie. Gegevens in Figuur 5 toont de specificiteit van microRNA-gebaseerde regulering van Mengovirus tropisme. Overexpressie van elke individuele microRNA in H1-HeLa-cellen remt specifiek propagatie (lagere virus titer) en cytotoxiciteit (verhoogde levensvatbaarheid van de cellen) van Mengovirus dat codeert voor het verwante microRNA response-element.

    Figuur 1
    Figuur 1: Schematische weergave van microRNA-gebaseerde regulering van virale tropisme. MicroRNA responselementen (RE) opgenomen in een viraal genoom wordt herkend door cognate microRNA verrijkt in specifieke celtypen en resulteren in gerichte afbraak van de virale transcripten / genomen. Hiermee wordt voorkomen dat virus replicatie, verspreiden en toxiciteit aan The omringende cellen. Echter, virale replicatie in cellen die de cognate microRNA waardoor viruspropagatie, uitgespreid en celdood expressie brengen worden gehandhaafd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 2
    Figuur 2: MicroRNA reactie element design. (A) Voor een succesvolle targeting zaad sequentiegebied van de RE moeten perfect complementair zijn. De RE moet gericht binnen het virale genoom zodanig dat het door de verwante rijpe microRNA kunnen worden opgenomen in mRNA transcripten en / of het virale genoom. De meerderheid van de RE's worden geplaatst in de 3 'UTR van de transcripten. (B) Afbeelding van goed ontworpen en oligonucleotiden die coderen voor RE's met tandemherhalingen van het microRNA-target sequenties (MIRT) geflankeerd door de overhangende nucleotiden van de Xhol restrictie-enzym plaats. Bij het ontwerpen van tandem repeat RE's, zorg ervoor dat spacer nucleotiden (meestal 4-6) tussen elke microRNA-target kopie bevatten. (C) Het plasmide DNA dat voor een full-length virale genoom met een RE opgenomen in de 3 'UTR, een T7 promoter, en een unieke restrictieplaats voor linearisatie in vitro transcriptie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 3
    Figuur 3: Redding van het virus uit genoom coderend RNA-transcripten. (A) RNA gelelektroforese van in vitro getranscribeerde RNA's codeert picornavirussen genoom tot transcript integriteit te evalueren. rijbaan 1: RNA ladder. Laan 2: Goed getranscribeerd RNA met een hoge integriteit. Laan 3: RNA-transcripten met matige integriteit. Hogere band is de juiste maat en een lagere band is potentieel een afbraakproduct of een ongewenste RNA-transcript. Laan 4: Onjuist getranscribeerd RNA. Laan 5: Lage integriteit RNA. 500 ng in vitro getranscribeerde RNA geladen per putje. Onjuiste transcriptie of afbraakproducten waarschijnlijk te wijten aan het gebruik van lage zuiverheid of onvolledig gelineariseerd DNA. (B) Afbeelding van schijn-getransfecteerde H1-HeLa-cellen en cellen die met RNA-transcripten die coderen voor Mengovirus. Toediening van transfectiereagentia alleen (Mock) zal levensvatbaarheid van de cellen te handhaven na transfectie evenals passage op verse cellen. Transfectie van RNA transcripten coderend voor een Mengovirus genoom (ih 24) resulteert in cytopathische effecten, die worden onderhouden na filtratie van het supernatant en passage naar verse H1-HeLa-cellen. Schaal bar = 100 micrometer.ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 4
    Figuur 4: Groeikinetiek ongemodificeerde en microRNA gerichte Mengoviruses in aanwezigheid of afwezigheid van verwante microRNA. Gemodificeerde uit referentie 17. (A) H1-HeLa-cellen niet tot expressie miR-124, -125 of -142. Alle drie Mengovirus encoding microRNA RE's repliceren met gelijkaardige kinetiek als de niet-gemodificeerde virus (VMC 24) dat aangeeft dat het inbrengen van de microRNAs op deze locatie (5 'UTR) niet veranderen virus replicatie. (B) RAW 264,7 macrofagen uiten tussenliggende niveaus van miR-125b en een hoog niveau van miR-142-3p, maar spreken zich niet uit miR-124. Opneming van de overeenkomstige microRNA-doelsequenties in het genoom leidt virus attenuation overeenstemming met het niveau van microRNA expressie. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde +/- SD virale titers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 5
    Figuur 5: Analyse van microRNA gericht specificiteit met behulp van synthetische nabootsers microRNA. Gemodificeerde uit referentie 17. H1-HeLa-cellen getransfecteerd met individuele microRNA nabootsers werden geïnfecteerd met ongemodificeerde virus (ih 24) of microRNA-gerichte virus (MIRT-ih 24) bij een MOI van 0,2. (A) De cellevensvatbaarheid genormaliseerd naar mock-behandelde cellen werd bepaald op 24 uur na infectie via MTT-celproliferatie assay. (B) virus titer in het supernatant van de monsters werd bepaald op 24 uur na infectie. Degegevens worden weergegeven als gemiddelde levensvatbaarheid of virale titer +/- SD. Tweezijdige ongepaarde Student t-toets van correctiemiddelen Welch (ongelijke varianties) werden gebruikt voor statistische analyse. Een p waarde <0,01 werd als significant beschouwd. (**, P <0,01, *** p <0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Het ontwerp, de samenstelling en lokaliseren van microRNA responselementen in het virale genoom zal dicteren gericht op effectiviteit en specificiteit. Het optimaliseren van deze zullen trial and error nodig. Echter, rationele ontwerp op RNA structuuranalyse en eerdere studies van virale replicatie en microRNA handtekeningen helpt bij de uitvoering van deze techniek met minimale optimalisatie 10, 11, 12, 13, 38.

    Bij de inleiding van het ontwerp van RE, moeten onderzoekers beginnen met het samenstellen van een set van microRNA's die worden uitgedrukt in het doel cellen van belang, worden verminderd in de non-target cellen van belang, en dat zijn experimenteel gevalideerd. Na deze verzameling moet verscheidene predictie gebaseerde analyses worden uitgevoerd om de mogelijkheid tot concurrerende microRNA-Targe pakkent interacties. Veel virussen coderen microRNAs of niet-coderende RNA's die cellulaire microRNAs sequester om virale en gastheer genexpressie te manipuleren. Bovendien hebben diverse RNA-virussen is aangetoond dat interactie met cellulaire microRNA teneinde de replicatie capaciteit 39, 40 versterken. Daarom is bij het ontwerpen van onderzoek, zorg ervoor om te onderzoeken of er interacties tussen het virus met cellulaire microRNAs of als ze uiten virale microRNAs die mogelijk de gekozen microRNA doelwit konden herkennen of de endogene expressie van de gekozen microRNA veranderen. Naast literatuuronderzoek, moet de lezer overwegen online bioinformatica voorspelling instrumenten en databases die virale microRNA doel informatie om te helpen bij het rationele ontwerp van RE's omvatten. Dergelijke databases en voorspelling tools kunnen ook identificatie van target sequenties die door meerdere microRNAs of overlappende zaad sequenties pre herkend kan worden vergemakkelijkt verzonden binnen het virale genoom. Voor een meer diepgaande discussie over methoden voor het identificeren microRNA doelstellingen en de voor- en nadelen van een aantal van de online voorspelling instrumenten van de lezer wordt verwezen naar referenties 41, 42. Het wordt aanbevolen dat deze voorspelling instrumenten dienen als gidsen zo vaak voorspellingen valse positieven of negatieven kan opleveren. Daartoe kunnen er zaad sequenties die overlappen, maar het 3 'uiteinde van de microRNA ook de richtende efficiëntie beïnvloeden. Het gebruik van te streng van een regelset kan soms schadelijk.

    Wanneer een reeks mogelijke microRNA doelen geformuleerd, moet de onderzoeker voortzetten als doelen op basis van de biologische eigenschappen van de microRNA en RNA structurele voorspellingen 10, 11, 12, 13,ef "> 38. De absolute rijkdom van de mature microRNA in gerichte cellen en het niveau van de associatie met een Argonaute eiwit zal de mate van gene silencing dicteren. Verschillende studies hebben aangetoond dat alleen overvloedig uitgedrukt microRNAs aanzienlijk zal reguleren genexpressie 16, 43, 44. Bovendien, terwijl sommige microRNA overvloedig hun interactie worden uitgedrukt Argonaute eiwitten en de vorming van RISC onvoldoende translatie 44 onderdrukken. gebruikmaking van een zeer overvloedige microRNA gevalideerde functie ook het potentieel voor microRNA verzadiging in de doelcel en daaropvolgende off- minimaliseren doelwit toxiciteit. een andere benadering kan zijn om RE's die zijn gericht door meerdere miRNAs 45, 46, die kan leiden tot een verminderd aantal kopieën, terwijl nog steeds de mogelijkheden voor off-target toxiciti minimaliseren gebruikenes. De verhouding van doelwit-mRNA microRNA zal ook een aanzienlijke invloed op het succes van deze benadering. Een gewenste hoge verhouding om microRNA zal het niveau van onderdrukking 42, 43, 47, 48 te verminderen. Dit is vooral van belang met virussen die zich snel vermenigvuldigen wanneer bij onjuist vroeg geregeld tijdens infectie zal ophopen tot niveaus die buiten de controle van endogene microRNAs. Het is essentieel om deze eigenschappen te overwegen bij het kiezen van een microRNA voor het richten; idealiter met een microRNA waarvan de functie is experimenteel bevestigd.

    De efficiëntie van gerichte genuitschakeling wordt ook beïnvloed door het percentage complementariteit van de doelstelling om de mature microRNA en het aantal kopieën van microRNA-doelsequenties ingevoegd. De 5'-gebied van het microRNA (nucleotiden 2-8) vormt het zaad volgorde. Algemeen wordt aangenomendat dit gebied perfect complementair is voor een succesvolle targeting 48, 49 moet zijn. De meerderheid van de studies gebruiken respons elementen met een perfecte complementariteit omdat het gen-silencing-activiteit kan verhogen door het bevorderen van endonucleolytische splitsing van het transcript en snelle recycling van het microRNA. Dit endonucleolytische splitsing treedt alleen op wanneer een microRNA interageert met een eiwit dat Argonaute endonucleolytische activiteit, die in zoogdiercellen is beperkt tot Argonaute-2. Andere Argonaute eiwitten bevorderen mRNA degradatie door deadenylation en exonucleolytische aanval van het transcript. De lezer wordt verwezen naar referenties 4, 5, 13, 50, 51, 52 voor een uitgebreide beschrijving van microRNA biogenese en functie. Algemeen wordt gedacht dat incrversoepeling van het aantal kopieën zal verder verbeteren van de targeting-efficiency. Dit kan echter ook versterken microRNA verzadiging en heeft niet altijd bewezen effectief. Soms is het beter om doelwitsequenties bevatten voor meerdere verschillende microRNA verrijkt in de doelcellen of doelsequenties die door meerdere microRNAs herkend gebruiken. Het aantal kopieën nodig is sterk afhankelijk van de hoeveelheid transcript dat silencing nodig en de relatieve abundantie van de microRNA in de doelcellen. Afschriften die snel zal ophopen kan meer exemplaren nodig hebben om te voorkomen dat ze weggeconcurreerd de microRNA niveaus. Experimenteel bepalen van het optimale aantal kopieën voor elke microRNA doel dat resulteert in voldoende targeting, onderhoudt virale fitness, en dat minimaliseert de snelheid van de escape mutaties wordt aanbevolen.

    Lokalisatie van de microRNA responselement in het virale genoom is uiterst belangrijk. Een negatief resultaat bij het analyserende targeting-efficiëntie betekent niet altijd dat het virus kan niet-microRNA gericht zijn. Kan eenvoudigweg betekenen het doelwit zijn niet op die locatie en dat onderdrukking van het doelgen is niet voldoende om pathogeniteit te remmen. De meeste respons elementen worden in de 3 'onvertaalde gebieden (UTR) van het beoogde transcript. Echter succesvol richten van virale genomen afgerond en soms vertoont verhoogde genetische stabiliteit bij responselementen in het 5 'UTR of binnen de coderende regio van essentiële genen 38 worden ingebracht. Optimale insertieplaatsen zal een goede bereikbaarheid van de doelsequentie aan de microRNA mogelijk. Toegankelijkheid kan worden belemmerd door RNA secundaire structuren en stoichiometrische interferentie. Daarom lokaliseren reactie elementen in ongestructureerde regio's die sterk geconserveerd is een goed uitgangspunt. De sequenties ingebracht kan ook beïnvloeden en worden beïnvloed door de omringende sequenties. Thus, een optimale locatie voor een microRNA doelsequentie is niet per definitie optimaal is voor andere respons elementen. Terwijl de experimentele validatie en optimalisatie van RE localisatie noodzakelijk is, met behulp van voorspelling software (bijv http://unafold.rna.albany.edu/; http://rna.urmc.rochester.edu/software.html) om potentiële insert websites screenen voor verstoring van de omringende RNA structuren is een aanrader 53, 54.

    Het gebruik van schone nucleïnezuurpreparaten van hoge integriteit is ook kritisch voor het verkrijgen van de beste resultaten. Aseptische techniek en het onderhoud van een RNase-vrije omgeving bij het hanteren van RNA-transcripten of microRNA bootst is van essentieel belang. Voor de beste resultaten RNA transcripten moet microRNA nabootst en definitieve getitreerd virus voorraden worden opgeslagen bij -80 ° C in kleine porties om herhaaldelijk bevriezen en ontdooien leidt tot RNA afbraak en verlies van virusinfectiviteit voorkomen. Tijdens het gebruik van deze reagenss moeten worden bewaard op ijs te allen tijde.

    Het is belangrijk op te merken dat veel microRNAs zijn leden van een familie van microRNAs die complementariteit te delen. Dus bij het uitvoeren van studies gunstig voor leden van de familie omvatten directe microRNA targeting-specificiteit betere evaluatie mogelijk. Dit wordt kritisch wanneer de cellen waarin virusreplicatie gewenst is, drukken de leden van het gezin (bijv miR-Let7 familie). Ook moet worden opgemerkt dat het specifieke assay gebruikt microRNA bootst een kunstmatige systeem en overexpressie van een microRNA in sommige cellen kan resulteren in off-target effecten 55. Als dit gebeurt, kan de specificiteit ook geëvalueerd worden in cellen die de juiste microRNA's met behulp van microRNA-remmers in plaats daarvan uit te drukken. Deze test zou analyse targeting-specificiteit op basis virustitratie en cellevensvatbaarheid uitlezingen bij aanwezigheid van fysiologisch relevante niveaus van miRNA mogelijk.

    10, 11, 12, 13. Veel virussen vertonen een hoge mutatie tarieven en ontsnappen mutanten kunnen snel ontstaan. Waaronder meerdere kopieën van een doelsequentie, waaronder doelwitten voor meerdere microRNA, lokaliseren de doelen binnen verschillende sterk geconserveerde gebieden, of de aanwezigheid van bijkomende antivirale factoren een immuunrespons kan dit verlichten. Bovendien insertie van vreemd genetisch materiaal in een viraal genoom zal vaak leiden tot verminderde replicatie capaciteit van het virus. Als dit gebeurt, de microRNA doel is waarschijnlijk genetisch instabiel te zijn en te ontsnappen mutanten zal sneller ontstaan. Opname van meerdere microRNA doel kopieën can ook het potentieel voor recombinatie schrapping van het microRNA doelen te verhogen. Daarom experimentele bepaling van het minimum aantal kopieën nodig voor voldoende targeting noodzakelijk. Lokaliseren van microRNA doelwit kopieën op diverse locaties in het genoom versus het gebruik van tandem repeats kan helpen bij het omzeilen van deze beperking. Het identificeren van optimale RE configuraties met een minimum aantal beoogde exemplaren nodig en insert sites die niet resulteren in gewijzigde kinetiek replicatie van het virus essentieel is voor het minimaliseren van recombinatie en beoogde mutatie. Opname van te veel exemplaren van een doelsequentie kan ook de mogelijkheden voor off-target toxiciteit verhogen als het resulteert in microRNA verzadiging. Een belangrijke wijziging in de hoeveelheid microRNA vindt reguleren normale cellulaire eiwitten kan leiden tot ongewenste effecten 55. Hiertoe veel virussen af aan het microRNA omgeving binnen een cel 56 en als ditinclusief de beoogde microRNA, kan de efficiëntie van de verordening te worden verlaagd als er genoeg virusreplicatie wordt gehandhaafd. Al deze problemen kunnen worden aangepakt door het optimaliseren responselement samenstelling en / of lokalisatie en een grondig begrip van het systeem en het doelwit zijn beperkingen.

    Typische problemen in verband met andere targetingmethoden hierbij gaan doelwit verzwakking van het virus, groottebeperkingen genetische targeting materiaal virussen met beperkte draagkracht en veiligheidsmaatregelen in verband met technische virussen om cellen die normaal niet besmet targeten. MicroRNA targeting maakt regulatie van virale tropisme met minimale modificatie van het virus. Het vereist een minimale ruimte in een viraal genoom en kan worden aangepast op basis van een uitgebreide reeks van cellulaire microRNA handtekeningen. Deze techniek is niet nieuw tropismen in te voeren voor het virus en dus geen nieuwe bezorgdheid over de veiligheid te introduceren. Bovendien, ditmethode kan worden gebruikt om meerdere tropismen regelen gelijktijdig met doelsequenties voor meerdere verschillende microRNA verrijkt in verschillende celtypes 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61. Dit kan allemaal worden bereikt zonder afbreuk het virus in cellen die de overeenkomstige microRNA expressie brengen en daarom een ​​mechanisme voor verbetering van de veiligheid van therapeutische virussen met verbeterde sterkte.

    Exploitatie van microRNA cellulaire machinerie kan worden gebruikt voor het regelen tropisme van veel verschillende soorten virussen. De protocollen die hier worden beschreven zijn ontworpen voor de redding en karakterisering van een microRNA gerichte picornavirus, maar ze kunnen worden aangepast aan een virus 'replicatiecyclus en specifieke reporter readouts. Hoewel verschillende virussen specifieke redding strategieën kunnen microRNA doelsequenties in het virale genoom worden ingebracht, ongeacht of het gehele genoom wordt gecodeerd in een enkel plasmide, of dat het virus een DNA of RNA-genoom. Zolang de producerende cellen niet de verwante microRNAs te drukken, moet geoptimaliseerd microRNA doelstellingen niet verstoren virus te redden. Experimenten analyseren virusgroei kinetiek en microRNA targeting specificiteit kan worden aangepast door verandering van de tijdstippen verzameld op basis van de lengte van een enkele ronde van virusreplicatie en specifieke uitlezingen voor virusreplicatie / toxiciteit (bijv reportereiwitten, cytotoxiciteit, genoom kwantificering etc.). Het is belangrijk op te merken dat hoewel deze techniek theoretisch kan worden toegepast op alle soorten virussen, kunnen vele factoren de efficiëntie van deze werkwijze beïnvloeden. Zo hebben negatieve-sense RNA-virussen niet zo reageren als positieve-sense RNA-virussen waarschijnlijk bewezen door beperkte actoegankelijkheidsfuncties van het genomische RNA van de machine 13 miRNA. Zo zal de biologische eigenschappen van elke klasse van virussen extra beperkingen op RE-optimalisatie geven. Ondanks deze beperkingen, deze techniek biedt een alternatieve methode voor het richten van virale tropisme faciliteren van onderzoek waarbij de veiligheid, nut, en basiskennis van biologische processen voor alle klassen van virussen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
    Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
    Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
    T4 DNA Ligase System NEB M0202S
    MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
    MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
    0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
    5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
    Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
    Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
    TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
    TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
    0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
    2 ml Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
    Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
    MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
    MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
    Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
    pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional Regulation of the Heterochronic Gene Lin-14 By Lin-4 Mediates Temporal Pattern Formation in C. Elegans. Cell. 75 (5), 855-862 (1993).
    2. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans Heterochronic Gene Lin-4 Encodes Small RNAs With Antisense Complementarity to Lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
    3. Ambros, V. The Functions of Animal MicroRNAs. Nature. 431 (7006), 350-355 (2004).
    4. Bartel, D. P. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
    5. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target Recognition and Regulatory Functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
    6. Benitez, A. A., Spanko, L. A., Bouhaddou, M., Sachs, D., Tenoever, B. R. Engineered Mammalian RNAi Can Elicit Antiviral Protection That Negates the Requirement for the Interferon Response. Cell Rep. 13 (7), 1456-1466 (2015).
    7. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Yalcin, A., Meyer, J., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of Tissue-Specific MicroRNAs From Mouse. Curr Biol. 12 (9), 735-739 (2002).
    8. Landgraf, P., et al. A Mammalian MicroRNA Expression Atlas Based on Small RNA Library Sequencing. Cell. 129 (7), 1401-1414 (2007).
    9. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: Tools for MicroRNA Genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
    10. Kelly, E. J., Russell, S. J. MicroRNAs and the Regulation of Vector Tropism. Mol Ther. 17 (3), 409-416 (2009).
    11. Brown, B. D., Naldini, L. Exploiting and Antagonizing MicroRNA Regulation for Therapeutic and Experimental Applications. Nat Rev Genet. 10 (8), 578-585 (2009).
    12. Tenoever, B. R. RNA Viruses and the Host MicroRNA Machinery. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 169-180 (2013).
    13. Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNAs and Oncolytic Viruses. Curr Opin Virol. 13, 40-48 (2015).
    14. Brown, B. D., Venneri, M. A., Zingale, A., Sergi Sergi, L., Naldini, L., L, Endogenous MicroRNA Regulation Suppresses Transgene Expression in Hematopoietic Lineages and Enables Stable Gene Transfer. Nat Med. 12 (5), 585-591 (2006).
    15. Brown, B. D., et al. A MicroRNA-Regulated Lentiviral Vector Mediates Stable Correction of Hemophilia B Mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
    16. Brown, B. D., et al. Endogenous MicroRNA Can be Broadly Exploited to Regulate Transgene Expression According to Tissue, Lineage and Differentiation State. Nat Biotechnol. 25 (12), 1457-1467 (2007).
    17. Ruiz, A. J., Hadac, E. M., Nace, R. A., Russell, S. J. MicroRNA-Detargeted Mengovirus for Oncolytic Virotherapy. J Virol. 90 (8), 4078-4092 (2016).
    18. Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. Engineering Attenuated Virus Vaccines By Controlling Replication Fidelity. Nat Med. 14 (2), 154-161 (2008).
    19. Barnes, D., Kunitomi, M., Vignuzzi, M., Saksela, K., Andino, R. Harnessing Endogenous MiRNAs to Control Virus Tissue Tropism as a Strategy for Developing Attenuated Virus Vaccines. Cell Host Microbe. 4 (3), 239-248 (2008).
    20. Perez, J. T., Pham, A. M., Lorini, M. H., Chua, M. A., Steel, J., Tenoever, B. R. MicroRNA-Mediated Species-Specific Attenuation of Influenza a Virus. Nat Biotechnol. 27 (6), 572-576 (2009).
    21. Saydaminova, K., et al. Efficient Genome Editing in Hematopoietic Stem Cells With Helper-Dependent Ad5/35 Vectors Expressing Site-Specific Endonucleases Under MicroRNA Regulation. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14057 (2015).
    22. Langlois, R. A., et al. MicroRNA-Based Strategy to Mitigate the Risk of Gain-of-function Influenza Studies. Nat Biotechnol. 31 (9), 844-847 (2013).
    23. Kelly, E. J., Hadac, E. M., Cullen, B. R., Russell, S. J. MicroRNA Antagonism of the Picornaviral Life Cycle: Alternative Mechanisms of Interference. PLoS Pathog. 6 (3), e1000820 (2010).
    24. Pham, A. M., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Replication in Cells of Hematopoietic Origin is Necessary for Dengue Virus Dissemination. PLoS Pathog. 8 (1), 1002465 (2012).
    25. Langlois, R. A., Varble, A., Chua, M. A., García-Sastre, A., Tenoever, B. R. Hematopoietic-Specific Targeting of Influenza a Virus Reveals Replication Requirements for Induction of Antiviral Immune Responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (30), 12117-12122 (2012).
    26. Chua, M. A., Schmid, S., Perez, J. T., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Influenza a Virus Utilizes Suboptimal Splicing to Coordinate the Timing of Infection. Cell Rep. 3 (1), 23-29 (2013).
    27. Griffiths-Jones, S. The MicroRNA Registry. Nucleic Acids Res. 32, D109-D111 (2004).
    28. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: MicroRNA Sequences, Targets and Gene Nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).
    29. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Integrating MicroRNA Annotation and Deep-Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 39, D152-D157 (2011).
    30. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Annotating High Confidence MicroRNAs Using Deep Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 42, D68-D73 (2014).
    31. Heckman, K. L., Pease, L. R. Gene Splicing and Mutagenesis By PCR-Driven Overlap Extension. Nat Protoc. 2 (4), 924-932 (2007).
    32. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. . , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5063/gel-purification (2016).
    33. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Ligation Reactions. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5069/dna-ligation-reactions (2016).
    34. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method (2016).
    35. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA From Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
    36. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
    37. Separation of RNA in Agarose Gels. Sourcebook for Electrophoresis. Lonza. , Available from: http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_BenchGuides_SourceBook_Section_VIII_-_Separation_of_RNA_in_Agarose_Gels.pdf 132-145 (2016).
    38. Kueberuwa, G., Cawood, R., Tedcastle, A., Seymour, L. W. Tissue-Specific Attenuation of Oncolytic Sindbis Virus Without Compromised Genetic Stability. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 154-165 (2014).
    39. Grundhoff, A., Sullivan , C. S. Virus-Encoded MicroRNAs. Virology. 411 (2), 325-343 (2011).
    40. Kincaid, R. P., Sullivan, C. S. Virus-Encoded MicroRNAs: An Overview and a Look to the Future. PLoS Pathog. 8 (12), e1003018 (2012).
    41. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental Strategies for MicroRNA Target Identification. Nucleic Acids Res. 39 (16), 6845-6853 (2011).
    42. Thomson, D. W., Dinger, M. E. Endogenous MicroRNA Sponges: Evidence and Controversy. Nat Rev Genet. 17 (5), 272-283 (2016).
    43. Mullokandov, G., et al. High-Throughput Assessment of MicroRNA Activity and Function Using MicroRNA Sensor and Decoy Libraries. Nat Methods. 9 (8), 840-846 (2012).
    44. Thomson, D. W., et al. Assessing the Gene Regulatory Properties of Argonaute-Bound Small RNAs of Diverse Genomic Origin. Nucleic Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
    45. Wu, S., et al. Multiple MicroRNAs Modulate P21cip1/waf1 Expression By Directly Targeting Its 3' Untranslated Region. Oncogene. 29 (15), 2302-2308 (2010).
    46. Vo, N. K., Dalton, R. P., Liu, N., Olson, E. N., Goodman, R. H. Affinity Purification of MicroRNA-133a With the Cardiac Transcription Factor, Hand2. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19231-19236 (2010).
    47. Arvey, A., Larsson, E., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Target mRNA Abundance Dilutes MicroRNA and siRNA Activity. Mol Syst Biol. 6, 363 (2010).
    48. Garcia, D. M., Baek, D., Shin, C., Bell, G. W., Grimson, A., Bartel, D. P. Weak Seed-Pairing Stability and High Target-Site Abundance Decrease the Proficiency of Lsy-6 and Other MicroRNAs. Nat Struct Mol Biol. 18 (10), 1139-1146 (2011).
    49. Jinek, M., Doudna, J. A. A Three-Dimensional View of the Molecular Machinery of RNA Interference. Nature. 457 (7228), 405-412 (2009).
    50. Pasquinelli, A. E. MicroRNAs and Their Targets: Recognition, Regulation and an Emerging Reciprocal Relationship. Nat Rev Genet. 13 (4), 271-282 (2012).
    51. Finnegan, E. F., Pasquinelli, A. E. MicroRNA Biogenesis: Regulating the Regulators. Crit Rev Biochem Mol Biol. 48 (1), 51-68 (2013).
    52. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of MicroRNA Biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
    53. Zuker, M. Mfold Web Server for Nucleic Acid Folding and Hybridization Prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
    54. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA Secondary Structure Prediction and Analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
    55. Khan, A. A., Betel, D., Miller, M. L., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Transfection of Small RNAs Globally Perturbs Gene Regulation By Endogenous MicroRNAs. Nat Biotechnol. 27 (6), 549-555 (2009).
    56. Skalsky, R. L., Cullen, B. R. Viruses, MicroRNAs, and Host Interactions. Annu Rev Microbiol. 64, 123-141 (2010).
    57. Sugio, K., et al. Enhanced Safety Profiles of the Telomerase-Specific Replication-Competent Adenovirus By Incorporation of Normal Cell-Specific MicroRNA-Targeted Sequences. Clin Cancer Res. 17 (9), 2807-2818 (2011).
    58. Fu, X., Rivera, A., Tao, L., De Geest, B., Zhang, X. Construction of an Oncolytic Herpes Simplex Virus That Precisely Targets Hepatocellular Carcinoma Cells. Mol Ther. 20 (2), 339-346 (2012).
    59. Yao, W., Guo, G., Zhang, Q., Fan, L., Wu, N., Bo, Y. The Application of Multiple MiRNA Response Elements Enables Oncolytic Adenoviruses to Possess Specificity to Glioma Cells. Virology. 458-459, 69-82 (2014).
    60. Bofill-De Ros, X., Gironella, M., Fillat, C. Mir-148a- and Mir-216a-regulated Oncolytic Adenoviruses Targeting Pancreatic Tumors Attenuate Tissue Damage Without Perturbation of MiRNA Activity. Mol Ther. 22 (9), 1665-1677 (2014).
    61. Baertsch, M. A., et al. MicroRNA-Mediated Multi-Tissue Detargeting of Oncolytic Measles Virus. Cancer Gene Ther. 21 (9), 373-380 (2014).

    Tags

    Immunologie microRNA microRNA-targeting picornavirus oncolytische tropisme virus cytotoxiciteit replicatie genexpressie
    MicroRNA-gebaseerde verordening van Picornavirus Tropism
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Ruiz, A. J., Russell, S. J.More

    Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (120), e55033, doi:10.3791/55033 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter