Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Picornavirüs tropizm MicroRNA tabanlı Yönetmelik

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/55033

Introduction

Kısıtlı tropizm ile bir vektör mühendislik için geniş, uygulanabilir, kolay ve etkili bir yöntem geliştirilmesi güvenliğini, biyolojik anlayış ve virüslerin tedavi programını geliştirmek için önemli bir fırsat sunuyor. Çeşitli mekanizmalar Transdüksiyonel, transkripsiyonel ve translasyonel tabanlı teknikler de dahil olmak üzere viral tropizm hedef var. Bununla birlikte, bu yöntemler, hedef hücrelerde hatalı sinyal yollarını gerektiren ya da viral genoma büyük kodlama dizilerinin eklenmesine gerektirebilir bütün vektör sistemleri, genel olarak uygun değildir. Buna ek olarak, bu yöntemler, önemli ölçüde bir terapötik aktivite engelleyen ve modifiye edilmemiş sistemine bilgi sınırlayıcı virüs zayıflamasına neden olabilir.

MikroRNAlar ökaryotik hücrelerde gen susmasının aracılık kodlayıcı olmayan RNA'lar, küçük (22-25 nükleotid) vardır. (MRNA) resulti mesajcı RNA'lar tamamlayıcı hedef sekanslarını (tepki elemanı) bağlanarak MikroRNA'lar işlevi transkript destabilization, bozulma veya translasyonel baskıya içinde ng. MikroRNA'lar normal kısmen tamamlayıcı olan yanıt elementlerine bağlanarak gen ekspresyonu, 1, 2, 3, 4, 5, küçük değişiklikler verir. Gen ekspresyonu daha belirgin değişiklikler yanıt elementi 6 tamamlayıcılık arttırarak elde edilebilir. Olgun mikroRNA binlerce hücre ve doku tipleri 7, 8, 9, çeşitli tür ve birçok sergi diferansiyel ekspresyonu çeşitli tespit edilmiştir. Bu mıkroRNA imzalar, viral genomun 10 ile mükemmel bir şekilde tamamlayan müdahale elemanları içeren virüs amplifikasyon hücreye özel sınırlama yararlanılabilir= "xref"> 11, 12, 13. Bu mıkroRNA hedefleme tekniği genel amacı, ek zayıflatma bir vektör genom tropizmi kontrol etmektir.

Viral tropizm düzenleyen bu yöntemin yardımcı başlangıçta belirli dokular 14, 15, 16, transgen ekspresyonunu sınırlamak için lentiviral vektörlerde gösterilmiştir. Bu teknik, daha sonra, 17 çoğaltma ve normal dokularda 10, 11, 12, 13, istenmeyen toksisite ortadan kaldırarak bir çok onkolitik virüs güvenlik profilleri artırmak için hem de geliştirilmiş gen terapisi için viral vektörler replike olmayan geniş bir dizi tatbik edilmiştir . Aynı zamanda, güvenli ve e oluşturmak için kullanılmıştırtk in kısım canlı zayıflatılmış aşılar gibi virüs ve aşı üretim 18, 19, 20, 21 süreçleri iyileştirmek için. Üretici sistemleri yabani-tip büyüme seviyelerini muhafaza ederken, mikroRNA hedefleme vektörünün aşılanmış ana veya hedeflenen sistemlerde zayıflama olanak sağlayabilmektedir. MikroRNA hedefleme, diğer ana 22'deki iletim koruyarak bir tür (örneğin insanlarda) iletim kısıtlayarak araştırma amacıyla virüsler biyo-güvenlik geliştirmek için kullanılabilir. Son olarak, derinlemesine viral büyüme 23, 24, 25, 26 ayrıştırarak viral yaşam döngüleri ve patogenez ve bağışıklık hücre tiplerinin belirli roller analizleri için izin verebilir microRNA hedefleme.

Bu teknik bir alt sunuyortüm virüs sistemleri için kolay uygulanan yöntem ve uygulanabilir hedefleme ernative. Buna ek olarak, belirli bir hücre tiplerinde farklı ifade desenleri ile olgun microRNA sürekli genişleyen koleksiyon bu tekniğin çok yönlü hale getirir. MicroRNA tabanlı hedefleme sistemi işlevini ödün vermeden virus sistemleri çeşitli etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bu tekniğin en önemli sınırlamaları deneme ve hata optimizasyonu, kaçış mutasyonları için potansiyel ve endojen transkript üzerinde potansiyel hedef dışı etkileri sayılabilir. Ancak, bu sınırlamalar genellikle optimize edilmiş ve rasyonel yanıt elemanı tasarımı ile aşılabilir. Pozitif-sens RNA virüsleri nedeniyle genomunun pozitif-duyu yönünde ve tam olarak sitoplazmik replikasyon döngüsü sırasında mikroRNA makine transkript mevcudiyetine microRNA hedefleme özellikle duyarlı olma eğilimindedir. Burada bir microRNA hedefli picarnovirüsün ve experim üretmek için bir protokol açıklarental yöntemler in vitro olarak hedef etkinliğini ve özgüllüğünü doğrulamak için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Viral genoma 1. Klonlama mikroRNA tepki elemanı

  1. Tasarım microRNA yanıt elemanı ekler.
    1. İstenen microRNA ve karşılık gelen hedef dizisini belirlemek. Çeşitli veri tabanları olgun microRNA dizileri ile kullanılabilir. Önerilen: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30.
  2. Vektör genomunu veya transkript kodlayan plazmid DNA içine tepki elemanı Clone.
    Not: iki veya daha fazla kopyalama tepki elemanı sokulması için tek bir kısıtlama sitesi kullanmak için daha kolay ve daha çok yönlüdür.
    1. tepki elemanı veya bağlayıcı örtüşme uzatma (SOE) PCR ile benzersiz kısıtlama alanı yerleştirin. Bu yöntem ayrıntılı olarak 31 de tarif edilmiştir.
    2. yerleştirmek için bir kısıtlama sahası kullanılarak, PUR Eğerticari olarak sentezlenir, PAGE-saflaştınldı sens ve benzersiz restriksiyon sitesi (Şekil 2) çıkıntı dizileri tarafından taarruz uç dizileri kodlayan antisens ultramers takip.
    3. Sıcaklığını azaltarak, daha sonra 10 dakika boyunca 85 ° C'de reaksiyonu inkübe tarafından O ultramers tavlanması 1x nihai konsantrasyon 0.5 mg sens ultramer, 0.5 ug antisens ultramer DNA ligasyon tamponu birleştirin ve H2 ile 50 ul'ye getirin 0.5 ° C reaksiyon tamamlanana kadar her 30 saniye, 25 ° C'ye ulaştı.
    4. Yeni benzersiz kısıtlama sahası, bir 1 x nihai konsantrasyonda enzim tamponu, uygun kısıtlama enzimi 1 ul kodlayan vektör DNA 0.5 ug birleştirin ve 37 ° C'de H2O Digest vektörü 20 ul bir son hacme getirmek 2 saat. Agaroz jel saflaştırma 32 ile doğrusallaştırılmış DNA saflaştınlır.
    5. 16 ° 'de bir gece boyunca sindirilmiş vektör içine tavlanmış ultramers ligateC 3 kullanarak: 1 ultramers: vektör molar oranı ve standart ligasyon teknikleri 33.
      Not: sokulması için tek bir kısıtlayıcı enzim merkezi kullanırken sindirilmiş vektörün uçları defosforile ve tavlanmış oligonükleotidlerin uçlarını fosforile daha etkili olabilir.
    6. Isı şok yöntemi 34 kullanılarak E. coli lige DNA Dönüşümü.
      Not: viral genomlara kodlayan plasmidler dolayısı ile de transformasyon verimi arttırabilir büyük DNA yapıları alım prosesini optimize yetkin hücreleri kullanılarak, genel olarak büyüktür.
    7. Bir ticari olarak temin edilebilen saflaştırma kiti 35 ile tek tek kolonilerden plazmid DNA saflaştınlır. Uç bölge 36, dizilişiyle doğru yönlenmede mikroRNA karşılık elemanının (Şekil 2) uygun bir klon tanımlamak.

2. sağa sola microRNA hedefli picarnovirüsün Kurtarmakm plasmid DNA

  1. Kurtarma aynı kökenli mikroRNA (ler) i eksprese etmez virüs replikasyonuna izin hücre hattı picarnovirüsün mıkroRNA hedefli. Onlar mir-142 Mir-124 ya da MIR-125 ifade yoktur, çünkü bu protokol ancak kurtarma H1-HeLa hücrelerini kullanmak için gerekli değildir, H1-HeLa hücreleri kullanır.
    DİKKAT: enfeksiyöz ajanların güvenli taşıma ve bertaraf için tüm kurallar buna göre takip edilmelidir.
    1. bu ~ transfeksiyon zamanı (24 saat sonra tohumlama)% 80 konfluent şekilde bir 6-yuvalı plaka plaka H1-HeLa hücreleri. DMEM oyuk başına 2 mL Plaka hücreleri,% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiştir.
    2. Oda sıcaklığına kadar transfeksiyon reaktifi ısıtın. karıştırmak için yavaşça 250 mcL serumsuz ortam, plazmid DNA kodlayan mıkroRNA hedefli genomunun 2.5 ug, ve steril mikrosantrifüj tüpü içinde, transfeksiyon tepkin maddesi, 7.5 uL ve pipet birleştirin. 15-30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı.
    3. soluklukaplama hücrelerden ortam ve taze tam ortam 2 ml.
    4. 6-plaka açılan bilge bir kuyuya adım 2.1.2 tamamını transfeksiyon karışımı ekleyin. kuyunun farklı bir alana her damla ekleyin.
    5. sitopatik etkiler (CPE) ya da raportör proteinler (~ 24-72 saat) tespit kadar 37 ° C'de inkübe hücreleri.
  2. Hasat ve geçiş taze hücrelerine kurtarılan virüs.
    1. 6-çukurlu plaka içindeki levhalar hücrelerin enfeksiyonunun (24 saat sonra tohumlama) de% 80-90 ortak akışlı olacak şekilde.
      NOT: sonraki tüm deneyler için gerekli olan virüs miktarına bağlı olarak aşağı yukarı ölçekleme veya.
    2. Bir lastik hücre kazıyıcı ya da kauçuk polis kullanarak süpernatant içine hücreleri kazıyarak her iyi kurtarma hasat. Yavaşça kuyunun alt kısmında kazıyıcı sürükleyin. Bir kriyojenik depolama tüpü içine hücreleri ve supernatant aktarın.
    3. numuneleri iki kez çözülme / Freeze ve sonra hücresel enkaz pelet4 ° C'de 5 dakika boyunca 1200 x g'de santrifüj.
    4. iki kez 0.2 mikron şırınga filtreleri kullanarak temizlenir süpernatant Filtre. süzülmüş kurtarma süpernatant virüs içeriyor.
      Not: Filtre gözenek boyutu virüs partiküllerinin boyutuna bağlı olarak değişebilir ve büyük virüs için geçerli olabilir.
    5. kaplama hücrelerden aspire ortam, serumsuz ortam ile bir kez yıkanır ve her bir taze serumsuz ortam 1 ml.
    6. süzülmüş kurtarma süpernatant oyuk başına 50 uL ekleyin ve hafifçe eşit virüs dağıtmak için plakayı sallayın.
    7. adi virüs her bir 2 saat ve daha sonra aspire ortam için 37 ° C'de inkübe plakası.
    8. oyuk başına taze tam ortam 1.5-2 ml ilave edilir ve CPE veya raportör protein belirgin olana kadar (~ 24-48 saat) 37 ° C'de inkübe edin.
    9. Tekrarlayın 2.2.4 2.2.2 adımları. Filtreli kurtarma süpernatant virüs stok içerir. -80 ° kriyojenik depolama tüpleri tek kullanımlık alikotları mağaza virüs stoklarıC.

3. Vitro Transcribed RNA transkriptleri In den microRNA hedefli Virus Rescuing

  1. bir akış yukarı promoteri kullanılarak mıkroRNA hedefli viral genomu kodlayan plazmid DNA, RNA transkriptleri oluşturmak.
    Not: bir nükleaz içermeyen bir ortam oluşturmak ve muhafaza etmek için standart yöntemler takip eden tüm adımlar için kullanılmalıdır.
  2. transkriptin aşağı bir enzim kısıtlama sahası kullanılarak plazmid DNA linearize. 5 ug plazmid DNA, 1 x nihai konsantrasyon enzim tamponu, 3 pL restriksiyon enzimi birleştirin ve 3 saat H2O inkübe 50 ul 37 ° C 'de reaksiyon getir.
  3. 0.5 M EDTA 1/20 inci hacmi, 1/10 hacmi 5 M NH4 asetat ve sindirilmiş reaksiyona% 100 etanol 2 hacim ilave et ve karıştır. gece boyunca kadar 1 saat boyunca -20 ° C'de inkübe edin.
  4. 4 ° C'de 17,000 x g'de 10 dakika boyunca çökeltilir DNA pelleti. supernata dökünnt, soğuk% 70 etanol 500 mL pelet 4 ° C'de 10 dakika boyunca 17.000 x g'de santrifüjleme ile DNA pelleti.
  5. 30 saniye süreyle tekrar süpernatant ve santrifüj dökün. Bir pipet ile artık Süpernatantı ve pelet hava kurulayın. 0.5-1 mg / ml bir konsantrasyonda, steril nükleaz içermeyen H2O DNA pelletini.
  6. Oda sıcaklığında in vitro transkripsiyon reaktifleri çözülme ve buz üzerinde ribonükleotitlerin yerleştirin (gliserol enzimler donma yok ve buz üzerinde doğrudan gitmeli). Oda sıcaklığında, reaksiyon tamponu tutun.
  7. 2 uL birleştirerek bir PCR tüpü içinde transkripsiyon reaksiyonu monte ATP, CTP, GTP ve UTP çözeltiler, 2 ul 10x reaksiyon tamponu, 1 ug doğrusallaştırılmış DNA, 2 ul enzim ve nükleaz ile 20 ul'lik nihai bir hacme getirmek her içermeyen H 2 O
  8. 2 saat boyunca 37 ° C'de reaksiyon inkübe edin.
  9. RNA transkript arındırın.
  10. Elüsyon çözeltisi (-ısıtılmış olan) 100 mcL transkripsiyon reaksiyonu getirin. bağlama çözeltisi konsantresi 350 uL ve reaksiyona% 100 etanol 250 uL ilave et ve karıştır.
  11. 12.000 x g'de 1 dakika için bir toplama tüpü ve santrifüj içine yerleştirilen bir filtre kartuşu örnek aktarın. flow-through atın.
  12. 12,000 x g'de 1 dakika için filtre kartuşu ve santrifüj yıkama çözeltisi 500 uL ekleyin. Iskarta akış yoluyla. Bu yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın. Iskarta akış yoluyla. geriye kalan etanolü atmak üzere 12,0000 xg'de 1 dakika boyunca santrifüj.
  13. Temiz bir toplama tüpüne filtre kartuşunu aktarın ve filtre kartuşu, önceden ısıtılmış yıkama çözeltisi 50 ul ekleyin. 12.000 x g'de 1 dakika boyunca santrifüj. yıkama sıvısı cont 100 ul toplam hacim için yıkama adımı tekrarArındırılmış RNA transkriptleri Tahliye. Filtre kartuşu atın.
  • 260 ve 280 nm 'de numunenin absorbansı ölçmek ve Beer-Lambert kuralına ile elüsyon RNA konsantrasyonunun belirlenmesi.
  • RNA jel elektroforez 37 kullanılarak RNA bütünlüğünü değerlendirmek. Iyi ve kötü RNA bütünlüğü örnekleri için Şekil 3'e bakınız. RNA, tek kullanımlık tüplere bölündü ve bütünlüğünü korumak için 80 ° C 'de muhafaza edilmesi gerekir.
  • oda sıcaklığına ısınmaya transfeksiyon reaktifleri. karıştırmak için yavaşça 250 ul serumsuz ortam, saflaştırılmış RNA transkriptlerinin 2.5 ug, püskürtme çözeltisi, 5 uL ve steril mikrosantrifüj tüpü içinde transfeksiyon reaktifi 5 uL ve pipet birleştirin. 2-5 dakika için oda sıcaklığında inkübe karışımı.
  • bu ~ transfeksiyon zamanı (24 saat sonra tohumlama)% 80 konfluent şekilde bir 6-yuvalı plaka plaka H1-HeLa hücreleri. DMEM oyuk başına 2 mL Plaka hücreleri% 10 FET ile desteklenmişark sığır serumu.
  • kaplama hücrelerinin ortamı aspire ve taze tam ortam 2 ml.
  • 6-plaka açılan bilge bir kuyuya adım 3.12 kadar tüm transfeksiyon karışımı ekleyin. kuyunun farklı bir alana her damla ekleyin.
  • sitopatik etkiler (CPE) ya da raportör proteinler (~ 24-72 saat) tespit kadar 37 ° C'de inkübe hücreleri.
  • 2.2 2.2.9 adımları tarif edildiği gibi mıkroRNA hedefli virüs kurtarma devam edin.
  • 4. hesaplanması ile Virüs Hisse titre% 50 Doku kültürü Bulaşıcı Dozu (TCID50)

    1. DMEM içerisinde oyuk başına 10 4 hücre 96 oyuklu bir plaka içerisinde levhalar tercihen H1-HeLa hücreleri% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiştir. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri.
      NOT: soydaş microRNA ifade etmeyen virüs replikasyonu için izin veren hücrelerde virüs titre edilir.
    2. Serumsuz 1 mL toplam hacim içinde virüsün 10 kat seri seyreltileri, her sağlayınOrtam.
      NOT: Daha fazla hassasiyet gerekiyorsa alt dilüsyonları kullanın.
      NOT: Virüs ipuçları sopa gibi her seyreltme sonrası Değişim ipuçları titre abartılmış önlemek için.
    3. Kaplama HeLa hücrelerinde yan ve aspirat ortamına ucu 96 oyuklu plaka. ortalama her bir virüs, seyreltme 100 uL oyuğa 96 oyuklu bir plaka (seyreltme için 1 sıra) 8-kuyu ekleyin. 1 satır ve kontroller için plaka üzerinde 12 satır virüs olmadan serum içermeyen medya 100 uL ekleyin.
      NOT: Her zaman aspirat ve hücre ayrılmasını önlemek için kuyu yan ucu dokunarak kuyulara medya ekleyebilirsiniz.
    4. 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe plakası. yan uç plaka ve kuyulardan medya aspire.
      NOT: Her seyreltme satır arasında değiştirme ipuçları.
    5. Her bir oyuğa tam ortam içinde 100 ul ekle. 72 saat boyunca 37 ° C'de inkübe plakası.
    6. Bir mikroskop altında kuyu görselleştirmek ve CPE için her bir kuyunun olumlu ya da olumsuz işaretleyin.
    7. Aşağıdaki denklem kullanılarak her bir virüs titresi hesaplanır: Lo10 g (TCID50 / ml) L + D (S-0.5) + 10 (1 / V) log =. L Tüm kuyu olumlu olduğu test edilmiş en yoğun virüs seyreltme negatif log 10'dur. D seyreltme faktörü günlük 10'dur. S bireysel oranlarda (pi) toplamıdır. PI pozitif oyuk / seyrelti başına kuyu toplam miktarının bağımsız bir seyreltme (miktarın hesaplanan oranıdır. V inokulum hacmi (ml / oyuk) 'dir.

    tablo 1
    Tablo 1: TCID50 hesaplayarak bulaşıcı virüs parçacıkları nicel. hücrelerden Örnek sonuçlar virüs stokunun on katlı çözücüler bir dizi ile enfekte. Tüm kuyuları CPE için pozitif son seyreltme 10 -4 olduğu için "L" 4 eşittir. "D" 10 yana 10-kat seyreltilmiş günlük 10kullanılan ve 1. "S" bu nedenle eşit edildi bireysel oranlarda toplamıdır. Bu örnekte bireysel oranlar 1.0, 0.875, 0.375, 0.125, ve 0'a bunlar toplamı (S) 2.375 olarak düzenlenmiştir. "V" başlangıçta hücreleri enfekte kullanılan ml inokulum hacmi.

    Tek adım Büyüme Kinetiği: 5. microRNA hedefleme Etkinlik Değerlendirilmesi

    1. Bu deney için kontrol eder, bir hedefli olmayan ya da fonksiyonel olmayan tepki elementi içeren sözde-enfekte edilmiş hücreler, modifiye edilmemiş virüs ve virüs bulunmaktadır.
    2. enfeksiyon süresi (24 saat sonra tohumlama) de% 80-90 ortak akışlı olacak şekilde 12 oyuklu doku kültür plakaları içinde zamana bağlı bir deney için plastik H1-HeLa hücreleri. DMEM plakası hücreleri, oyuk başına 1 mL% 10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiştir.
      NOT: Her zaman noktası için ayrı bir plaka plaka önerilir. Bu protokol, bir 8-12 saat çoğaltma çevrimi ile bir virüs 7 farklı zaman noktaları kullanır. H1-HeLa hücreleri Bu gerçekleştirmek için gerekli değildirssay. Bu deney, hedef microRNA eksprese etmeyen permisif hücreler de yapılmalıdır. Bu deney aynı zamanda bir selektif basınç altında büyüme kinetikleri değerlendirmek için aynı kökenli microRNA ifade eden hücrelerde gerçekleştirilebilir.
    3. kuyulardan aspire medya. Her bir oyuğa serumsuz ortam 0.5 mL ilave edilerek kuyu yıkayın kuyu plaka ve aspire ortamı girdap. her bir oyuğa taze serumsuz ortam 0.5 mL ekleyin.
    4. Enfeksiyon, yüksek çokluğunda her kuyu enfekte (İçişleri Bakanlığı; hücre başına bulaşıcı parçacıkların sayısı) tüm hücreleri enfekte olsun sağlamak. Bu protokol, 3 MOI kullanır.
      1. İçişleri Bakanlığı bir konsantrasyon 3 başına 100 uL = serum serbest ortamda virüs stokları sulandırmak. Yedi farklı oyuklara virüsü seyreltme 100 uL, her ilave edin ve 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      2. tüm kuyulardan medya aspire ve iyi başına 0.5 ml tam medya ekleyerek hafifçe sallanan ve daha sonra aspire iki kez yıkayın.
    5. c 1 ml ekleyinomplete her ortam de ve istenen zaman noktasına kadar 37 ° C'de inkübe edin.
    6. 2, 4, 6, 8, 10, 24 ve 48 saat sonra enfeksiyonu (zaman noktası başına 1 Well) virüs titrasyonu için numune toplayın. Bir kriyojenik depolama tüpü iyi medya 700 uL aktarın. yavaşça tüm kuyunun genelinde bir lastik kazıyıcı hareket ettirerek kalan süpernatant içine hücreleri kazıyın. süpernatant 700 mcL içeren mukabil kriyojenik depolama tüp hücre / süpernatant karışımı aktarın.
      NOT: kontamine numunelerde ortaya çıkan kazıma sırasında iyi bir içine birinden süpernatant sıçrama değil emin olun. sıçramasına en aza indirecek kazıma önce 700 uL aktarılması.
    7. -80 ° C'de Örnekleri ve bütün örnekleri toplanıncaya kadar devam eder.
    8. Donma / numuneleri üç kez çözülmesi ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1200 x g'de örnekleri santrifüj edilerek hücre tortularını çıkarmak.
    9. 4. bölümde açıklandığı gibi virüs titre ve t üzerinde büyüme kinetikleri karşılaştırmakime.

    Kullanımı Testi Virüs yayılan Sentetik microRNA taklit eder: 6. microRNA hedefleme Özgünlük değerlendirilmesi

    NOT: microRNA hedef etkileşimi: sentetik microRNA Mimic Kullanım microRNA özgünlüğünü göstermek için yapılır.

    1. sahte transfeksiyon Dahil, negatif kontrol microRNA taklit ve deneysel mikroRNA her tahlil microRNA aracılı toksisite değerlendirmek için tek kontrol taklit. Yanlış negatif neden olabilir pozitif kontrol (yani, mıkroRNA-hedefli gen ya da genom) mıkroRNA taklit düşük transfeksiyon verimi dahil edilmesi de ideal bir yerdir.
    2. bu transfeksiyon zamanı (24 saat sonra tohumlama) de% 80-90 ortak akışlı olacak şekilde 96 oyuklu bir doku kültür plakasının Plaka H1-HeLa hücreleri. DMEM Levha hücreleri, göz başına 0.1 ml,% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiştir.
      NOT: soydaş microRNA ifade etmeyen viral replikasyon için izin veren hücrelerde bu tahlil gerçekleştirin.
    3. SıcaklıkOda sıcaklığına e transfeksiyon reaktifleri. 9 ul serumsuz ortam, mıkroRNA mimik stokunun oyuk başına 200 nM nihai konsantrasyon, 0.18 uL kuvvetlendirme reaktifi, 0.18 uL transfeksiyon reaktifi birleştirilir ve karıştırılır. 2-5 dakika için oda sıcaklığında inkübe karışımı.
      NOT: Listelenen Ciltler kuyu başı. Bir ana karışımı tutarlılığı korumak ve pipetleme hatası en aza indirmek için tüm oyuklara transfeksiyonu için monte edilmesi tavsiye edilir. mikroRNA Mimic optimal konsantrasyonu değişecektir. microRNA eşlik üreticinin talimatlarına uygun bir başlangıç ​​konsantrasyonu için taklit başvurun. Bu genellikle 5-200 nM son konsantrasyonları aralığında olacaktır.
    4. Kuyulardan medya aspire ve taze tam orta 92 ul ekleyin.
      Not: numunelerin önemli bir kısmı varsa önce transfeksiyon solüsyonu montaj için bu adımı tam ve hazır olana kadar 37 ° C 'de plaka saklayın.
    5. Tüm transfeksiyon karışımı i ekleyinn damla damla hücrelere 6.3 adım.
    6. 6 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    7. Hücrelerin düşük bir yüzde sağlamak için düşük İçişleri Bakanlığı her iyi enfekte virüs yayılması analizi izin enfekte olsun. Bu protokol, 0.2 MOI kullanır.
      1. İçişleri Bakanlığı konsantrasyonu 0.2 100 başına uL = serum serbest ortamda virüs stokları sulandırmak. Kuyulardan ortamı çıkarın ve oyuk başına virüs seyreltme 100 mcL ekleyin.
      2. 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    8. her bir aspire medya ve taze eksiksiz bir medya 100 mcL ekleyin.
    9. 20-22 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    10. Yüzen virüs titrasyonu belirler.
      1. her gözden üst fazın toplayın ve taze tam ortam içinde 100 uL ile değiştirin.
        NOT: süspansiyon hücreleri kullanılarak ise, taze eksiksiz bir medya 100 uL aşağıdaki adımı hücre pelletini ve canlılık testi için iyi örnek dönmek.
      2. CELLU kaldır4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile toplandı süpernatanlarından lar artıkları.
      3. bir tüpe süpernatant aktarın ve bölüm 4'te tarif edildiği gibi aynı kökenli microRNA eksprese etmeyen permisif hücreler üzerinde bulaşıcı bir virüs titre edilir.
        NOT: enfeksiyon yetilerini kaybetmesini önlemek için buz üzerinde her edilmiş olur.
    11. Hücrelerin canlılığını belirlemek.
      1. MTT 10 uL, göz başına (3- (4,5-Dimetiltiazolil-2) -2,5-difeniltetrazolyum bromür) reaktif ekleyin.
      2. Mor renkli çökelti görünene kadar 2-4 saat süreyle, 37 ° C'de inkübe edin.
      3. Deterjan reaktif 100 mcL ekleyin.
      4. 2 saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin.
      5. 570 nm 'de tüm oyuklara absorbansı okuyun.
        NOT: Yüzde hücre canlılığı karşılaştırılması için transfekte hücreler alay etmek, tüm örnekleri Normale.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Tablo 1, bir pikornavirüs için bir titrasyon deneyinin tipik bir sonucu temsil eder ve% 50 doku kültürü enfeksiyon dozu hesaplamak açıklamaktadır. Bu yazıda tarif edilen viral tropizm mıkroRNA dayalı bir düzenleme genel kavramının şematik bir temsili, hücre içi etkileşimler, tavlama ve plazmid sokulması için tepki elemanı oligonükleotidlerin uygun tasarımı sırasında tepki elemanı, Şekil 1 microRNA yönlenmede gösterilmiştir ve bir in vitro transkripsiyon için, bir mıkroRNA hedefli viral genomu kodlayan plasmid DNA haritası 2. Şekil 3, agaroz jel elektroforezi ile görselleştirilmiştir bütünlüğü değişen derecelerde RNA transkriptleri gösteren şekilde gösterilmiştir. linea içinde 3A şeritte 2. Kalıntı kirleri gösterildiği gibi uygun kullanım ve DNA'nın kullanımının düzgün transkribe edilen RNA transkript neden olur kirliliklerin yoksun şablonlarırized DNA şablonları ve nükleaz eser miktarlarda 3A şeritte gözlenene benzer düzgün transkribe RNA ve / veya parçalanma ürünlerinin düşük seviyelerde neden olabilir 3. Bu neden olur kalıntı etanol gibi yabancı maddelerin yüksek miktarlarını ihtiva eden plasmid DNA ya da DNA'nın eksik doğrusallaştırma Şekil 3A şerit 4 ve 5, Şekil 3'te gösterilen uygun olmayan transkripsiyon ve ayrışma ürünleri de temiz RNA transkriptlerinin transfeksiyonu takiben Mengo dolayımlı sitopatik etkiler (CPE) bir görüntüsünü göstermektedir. Değiştirilmemiş ve microRNA hedefli Mengo büyüme kinetikleri değerlendiren bir zaman ders deney Şekil 4 görüntüler veri temsilcisi. Sonuçlar Mengo genomuna tasarlanmış mikroRNA yanıt elemanları aynı kökenli mikroRNA bir ifade yoktur H1-HeLa hücrelerinde virüs replikasyonu kinetikleri değiştirmeyen göstermektedir. Bununla birlikte, mıkroRNA-125 ara seviyeleri ve microRNA-14, yüksek düzeyde eksprese RAW 264.7 makrofajlar içindekarşılık gelen tepki elemanları kodlayan 2, virüs microRNA düzeyi ifade ile ilişkilidir inhibe çoğaltma kinetikleri gösterir. Şekil 5'te Veri Mengo tropizm microRNA dayalı bir düzenleme özgünlüğünü göstermektedir. H1-HeLa hücrelerinde her microRNA aşırı ekspresyonu özellikle yayılmasını (alt virüs titreleri) ve soydaş microRNA tepki elemanı kodlayan Mengo sitotoksisitesini (artmış hücre canlılığı) inhibe eder.

    Şekil 1
    Şekil 1: Viral tropizm microRNA tabanlı düzenlemenin şematik gösterimi. Bir viral genom içine dahil MicroRNA tepki elemanları (RE) belirli bir hücre türleri içinde zenginleştirilmiş soydaş microRNA tarafından tanınan ve viral transkript / genom hedeflenen düşmesine neden olacaktır. Bu engeller virüs replikasyonu, yaymak ve toksisite inciE hücreleri çevreleyen. Ancak, viral replikasyonu, virüs yayılması, yayılması ve hücre ölümü için izin aynı kökenli microRNA eksprese etmeyen hücrelerde saklanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    şekil 2
    Şekil 2: mikroRNA yanıt elemanı tasarımı. Başarılı mükemmel tamamlayıcı olmalıdır RE tohum sırası bölgesini hedefleyen için (A). RE mRNA transkript ve / veya viral genom içinde kognat Olgun microRNA tarafından kabul edilebilir şekilde, viral genom içinde yönlendirilmelidir. Res çoğunluğu transkriptlerin 3 'UTR içinde yerleştirilir. (B) tandem içeren Res şifreleyen uygun şekilde tasarlanmış ve tavlanmış oligonükleotidlerin TasvirXhol sınırlama enzimi sarkan nükleotidler ile çevrili mıkroRNA hedef sekanslar (Mirt) arasında tekrarlar. tandem repeat Res tasarlarken, her microRNA hedef kopya arasındaki boşluk nükleotidlerin (genellikle 4-6) eklemeyi unutmayın. (C) plazmid DNA 3 'UTR, bir T7 promotörü eklenmiş bir Re, in vitro transkripsiyon için doğrusallaştırma için benzersiz restriksiyon bölgesi ile tam uzunlukta viral genomu kodlayan. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 3,
    Şekil 3: genom kodlayan RNA transkriptlerinden virüs kurtarma. Transkript değerlendirilmesi amaçlı pikornavirüs genomları kodlayan, in vitro transkribe RNA (A) RNA jel elektroforezi. Lane 1: RNA merdiveni. Şerit 2: Düzgün yüksek bütünlük RNA transkripsiyonu. Şerit 3: orta bütünlüğü ile RNA transkript. Yüksek bant Doğru boyut ve alt bant potansiyel bir bozunma ürünü veya istenmeyen bir RNA transkripti olmasıdır. Şerit 4: Yanlış RNA transkripsiyonu. Yol 5: Düşük bütünlük RNA. İn vitro transkribe RNA, 500 ng oyuk başına yüklenmiştir. Yanlış transkripsiyon veya parçalanma ürünleri, düşük saflık ya da eksik doğrusallaştırılmış DNA'nın kullanımının muhtemeldir. Mengo kodlayan RNA transkriptleri ile transfekte sahte transfekte H1-HeLa hücreleri ve hücre (B) Görüntü. transfeksiyon reaktif sadece (Mock) Yönetim taze hücreleri üzerine transfeksiyon yanı sıra geçit aşağıdaki hücre canlılığını korumak olacaktır. Taze H1-HeLa hücreleri üzerine süpernatant ve geçit filtrasyon aşağıdaki bakım işlemleri bir Mengo genomu kodlayan RNA transkriptleri (VMC 24) sitopatik etkileri sonuçlarının Transfeksiyon. Ölçek çubuğu = 100 mikron.ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 4,
    Şekil 4: aynı kökenli mikroRNA varlığında ya da yokluğunda, değişikliğe uğratılmamış ve mıkroRNA hedefli Mengoviruses büyüme kinetikleri. Referans 17 modifiye. (A) H1-HeLa hücreleri MIR-124, -125, -142 veya ifade yoktur. Her üç Mengo kodlama mikroRNA RE'ler virüs çoğalmasını değiştirmez bu konumda (5 'UTR) de microRNA bu ekleme belirten değiştirilmemiş virüs olarak benzer kinetik (VMC 24) ile çoğaltma. (B) RAW 264.7 makrofajlar miR-125b ve miR-142-3p yüksek düzeyde orta seviyelerde ifade, ancak miR-124 ifade etmezler. Virüs att genom sonuçlarına karşılık gelen microRNA hedef dizilerin dahil edilmesimikroRNA ekspresyon düzeyi ile uyumlu enuation. Veriler ortalama viral titreleri olarak temsil edilir +/- SD. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 5,
    Şekil 5: Sentetik microRNA taklitlerinin kullanarak microRNA hedefleme özgüllük analizi. Referans 17 modifiye. Bireysel mikroRNA taklit transfekte H1-HeLa hücreleri 0.2 MOl'de uğratılmamış virüs (VMC 24) ya da mıkroRNA hedefli virüsü (Mirt-VMC 24) ile enfekte edilmiştir. (A), sahte muameleye tabi tutulmuş hücrelere göre normalize hücre canlılığı MTT hücre çoğalma tahlilinde ile 24 saat sonrası enfeksiyon belirlenmiştir. Tüm örneklerde süpernatanında (B) Virüs titresi, 24 saat sonrası enfeksiyon belirlenmiştir.Veriler ortalama canlılığı veya viral titre +/- SD olarak temsil edilir. (Eşitsiz varyanslar için) Welch düzeltme eşleştirilmemiş Student t testi, iki kuyruklu istatistiksel analiz için kullanıldı. P <0.01 anlamlı kabul edildi. (** P <0.01, *** P <0.001). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    tasarım, kompozisyon ve viral genom içindeki microRNA yanıt elemanlarının yerleşimi etkinliğini ve özgüllüğünü hedef belirleyecektir. Bu duruma getirme deneme yanılma gerektirir. Bununla birlikte, rasyonel RNA yapısal analiz ve en az optimizasyonu 10, 11, 12, 13, 38, bu tekniğin uygulanması viral replikasyon ve mikroRNA imzaları AIDS eden önceki çalışmalara dayanarak.

    RES tasarımını başlatırken, araştırmacılar ilgi hedef hücrelerde ifade edilir microRNA bir dizi derleyerek başlamalıdır, ilgi hedef olmayan hücrelerde azalmış ve bu deneysel doğrulanmıştır. Bu derleme ardından, birkaç tahmin tabanlı analizler rakip microRNA-targe olasılığını ele yapılmalıdırt etkileşimleri. Birçok virüs microRNA veya viral ve konak gen ekspresyonu yönlendirmek için hücresel microRNA tecrit kodlayıcı olmayan RNA'lar kodlar. Ayrıca, çok sayıda RNA virüslerin, replikasyonu kapasitesi 39, 40 arttırılması amacıyla hücresel mikroRNA etkileşim olduğu gösterilmiştir. Res tasarlarken, bu nedenle, hücresel microRNA ile virüs etkileşimleri var bilinen olsun veya potansiyel seçilen microRNA hedef tanımak veya seçilen microRNA endojen ifade değiştirebilecek viral microRNA ifade araştırmak için emin olun. literatür taraması ek olarak, okuyucu çevrimiçi biyoinformatik tahmin araçları ve RES rasyonel tasarım yardımcı viral microRNA hedef bilgilerini içeren veritabanlarını düşünmelisiniz. Bu tür veri tabanları ve tahmin araçları da ön birden microRNA veya örtüşen tohum dizilerinden tarafından kabul edilebilir hedef dizilerin belirlenmesini kolaylaştırabilir viral genom içinde gönderilir. MicroRNA hedeflerinin belirlenmesi yöntemleri ve çevrimiçi tahmin araçları bazı artılarını ve eksilerini bir daha derinlemesine bir tartışma için okuyucu başvuruları 41, 42 anılır. Tahmin araçları sadece kılavuzları gibi birçok kez tahminler yanlış pozitif veya negatif sonuçlara yol açabileceğini hizmet tavsiye edilir. Bu amaçla, microRNA Ancak 3 'ucu, aynı zamanda hedefleme verimini etkileyecek örtüşen tohum dizileri olabilir. Bir kural kümesinin çok sıkı kullanmak bazen zararlı olabilir.

    Potansiyel microRNA hedefleri bir dizi tespit edildikten sonra, araştırmacı microRNA ve RNA yapısal tahminler 10, 11, 12, 13 biyolojik özelliklerine göre hedefleri sıralama ile devam etmelidir,EF "> 38. Olgun hedef hücrelerde microRNA ve gen susturma derecesini belirleyecektir bir Argonaute protein ile esas seviyesinin mutlak bolluğu. Birkaç çalışma, sadece bol eksprese mikroRNAlar belirgin gen ekspresyonu 16, 43 düzenleyecek olduğunu göstermiştir, bazı mikroRNAlar bol Argonaute protein ve RISC oluşumu ile etkileşim ifade edilmektedir 44.. Ayrıca, çeviri 44 bastırmak için yetersizdir., hedef hücre ve daha sonra KAPAMADA olarak mikroRNA doyma potansiyelini en aza indirmek doğrulanmış fonksiyonu ile yüksek miktardaki mikroRNA kullanılması hedef toksisitesi. farklı bir yaklaşım hala kapalı hedef toxiciti potansiyelini en aza indirerek azaltılmış kopya numarası için izin verebilir birden miRNA'lar 45, 46 tarafından hedeflenen Res, kullanmak için olabilires. microRNA hedef mRNA oranı da bu yaklaşımın başarısı üzerinde önemli bir etkiye sahip olacaktır. MikroRNA oranına göre yüksek bir hedef baskı 42, 43, 47, 48 seviyesini azaltacaktır. Bu yanlış endojen microRNA kontrolü dışındaki seviyelere birikir enfeksiyon sırasında erken düzenlenmiş ise ne zaman hızla çoğaltmak virüsler özellikle önemlidir. Hedef için bir microRNA seçerken bu özellikleri dikkate esastır; ideal olan fonksiyon deneysel valide edilmiş bir microRNA kullanarak.

    hedefli gen susturma verimliliği de olgun microRNA hedefin yüzde tamamlayıcılığı olarak yerleştirilmiş mıkroRNA-hedef dizilerin kopya sayısı etkilenir. mikroRNA (nükleotidler 2-8) ait 5 'bölgesi tohumu dizisi teşkil eder. Bu genel olarak kabul edilmektedirBu bölge başarılı hedefleme 48, 49 için son derece tamamlayıcı olması gerektiğini. bu transkript endonükleolıtık bölünme ve microRNA hızlı geri dönüşümünü teşvik ederek gen-susması aktivitesini artırabilir çünkü çalışmaların çoğu mükemmel tamamlayıcılık ile yanıt öğeleri kullanır. Bir mıkroRNA, memeli hücrelerinde Argonaute-2 ile sınırlı endonükleolitik aktivite sahip bir Argonaute protein ile etkileşimde, bu endonükleolitik klivaj yalnızca oluşur. Diğer Argonaute proteinleri deadenylation ve transkript eksonükleolitik saldırısıyla mRNA yıkımını teşvik. Okuyucu mikroRNA biyogenez ve fonksiyon derinlemesine bir açıklama için referans 4, 5, 13, 50, 51, 52 olarak adlandırılır. O incr düşünce genellikle birkopya sayısını hafifletilmesi daha hedefleme verimini artıracaktır. Ancak, bu da microRNA doygunluğu güçlendirebilir ve her zaman daha etkili kanıtlanmış değildir. Hedef hücreler açısından zenginleştirilmiş çok farklı mikroRNA hedef dizilerinin ilave edilmesi veya birden fazla mikroRNA tarafından tanınan hedef sekanslarını kullanımı, bazen daha iyidir. Gerekli kopya numarası, susturulması gerekir transkript miktarının ve hedef hücrelerde microRNA nispi bolluk oldukça bağımlıdır. hızla birikir Transkript mikroRNA düzeylerinin outcompeting engellemek için fazla kopya isteyebilir. Deneysel yeterli hedefleme sonuçları, her mikroRNA hedef için uygun kopya sayısını belirlemek viral uygunluk tutar, ve bu çıkış mutasyon oranı önerilir en aza indirir.

    viral genom içinde mikroRNA yanıt elementi lokalizasyonu son derece önemlidir. Negatif bir sonuç analizive verimliliği hedefleyen her zaman virüs microRNA hedefli olamaz anlamına gelmez. Bu sadece hedef bu konumda erişilebilir değil veya hedeflenen genin bu baskı patojenitesini inhibe etmek için yeterli olmadığı anlamına gelebilir. yanıt elemanları çoğunluğu hedeflenen transkriptin 3 'çevrilmemiş bölgeleri (UTR) içine sokulur. Ancak, viral genomların, başarılı hedefleme başarılmıştır ve müdahale elemanları 5 'UTR halinde veya gerekli genlerin 38 kodlama bölgeleri içinde yerleştirilir bazen sergiler genetik dengesi arttırılmış. Optimum yerleştirme siteleri microRNA hedef dizinin yüksek erişilebilirlik sağlayacaktır. Erişilebilirlik RNA ikincil yapılar ve stokiyometrik müdahale ile engellenmiş olabilir. Bu nedenle, yüksek ölçüde korunmuş olan yapısal olmayan bölgelerinde lokalize tepki elemanı iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. dizileri de etkileyebilir ve çevresindeki diziler tarafından etkilendiği sokulması. Thus bir mikroRNA, hedef sekansı için en uygun konumu diğer müdahale elemanları için gerekli optimal değildir. RE lokalizasyonu deneysel doğrulama ve optimizasyon gerekli olmakla birlikte, tahmin yazılımı kullanarak (örn http://unafold.rna.albany.edu/; http://rna.urmc.rochester.edu/software.html) potansiyel insert sitelerini taramak için çevredeki RNA yapılarının pertürbasyon için son derece 54 53 tavsiye edilir.

    Yüksek bütünlüğü temiz nükleik asit preparatlarının kullanımı, en iyi sonuçları elde etmek için kritiktir. Bir RNaz ücretsiz ortamın aseptik teknik ve bakım RNA transkriptleri veya microRNA taklit taşıma esastır. En iyi sonuçlar için, RNA transkriptleri için, mıkroRNA taklit eden, ve son titre Virüs stokları RNA ayrışma ve virüs enfektivite kaybı ile sonuçlanan tekrar dondurma ve eritme kaçınmak için küçük parçalar halinde -80 ° C'de saklanmalıdır. Kullanılmadığı zaman, bu reaktifs, her zaman buz üzerinde tutulmalıdır.

    Birçok mikroRNAlar tamamlayıcılık paylaşan microRNA bir ailenin üyeleri olduğunu not etmek önemlidir. çalışmalar yaparken nedenle hedef-özgüllük değerlendirmesini iyileştirmek için derhal microRNA aile üyeleri dahil etmek yararlı olabilir. Virüs çoğaltma istenen, içinde hücreler, aile (örn miR-Let7 aile) üyeleri ifade bu kritik hale gelir. Ayrıca, mıkroRNA taklit kullanılarak özgüllük deney, yapay bir sistem olup, fazla sentezlenme, bazı hücrelerde microRNA hedef dışı etkiler 55 neden olabileceği hususu not edilmelidir. Bu durum ortaya çıkarsa, özgüllük de yerine microRNA inhibitörleri kullanarak uygun microRNA ifade eden hücrelerde değerlendirilebilir. Bu deney, mikroRNA fizyolojik olarak uygun seviyelerinin varlığında virüs titrasyon ve hücre canlılığı okumalarla göre hedefleme-özgüllük analiz edilmesine izin verecektir.

    10, 11, 12, 13, virüs aracılı etkilerdir. Birçok virüs, yüksek mutasyon oranları sergilemek ve hızlı bir şekilde ortaya çıkabilecek mutantlar kaçış. Birden çok yüksek oranda korunmuş bölgeler içinde hedefleri lokalize birden fazla microRNA için hedefler içeren bir hedef dizinin kopya, ya da bu hafifletmek bir bağışıklık tepkisi de dahil olmak üzere ilave antiviral faktörlerin varlığını da dahil olmak üzere. Buna ek olarak, bir viral genomunda, yabancı genetik malzemenin eklenmesi, genellikle, virüsün azaltılmış bir replikasyon kapasitesi ile sonuçlanır. Bu durum ortaya çıkarsa, microRNA hedef genetik kararsız olması ve daha hızlı ortaya çıkacak mutantlar kaçmak muhtemeldir. Birden fazla microRNA hedef kopya ca İçermen da microRNA hedeflerinin recombinatorial silinmesi için potansiyelini artırmak. Bu nedenle, yeterli hedefleme için gerekli olan minimum kopya sayısının deneysel belirlenmesi gereklidir. tandem tekrarlar kullanarak karşı genom boyunca çeşitli yerlerde mikroRNA hedef kopya lokalize bu kısıtlamayı atlayarak yardımcı olabilir. Ancak, virüsün değişmiş çoğaltma kinetiği yol açmaz gereken hedef kopya ve insert siteleri az sayıda optimum RE yapılandırmaları belirlenmesi rekombinasyon ve hedef mutasyon oranını en aza indirmek için kritik öneme sahiptir. o mikroRNA doygunluk sonuçları ise bir hedef dizinin çok kopya İçerme de off-hedef toksisite potansiyelini artırabilir. Istenmeyen etkilerin 55 neden olabilir normal hücresel proteinler düzenleyen uygun microRNA miktarında önemli bir değişiklik. Bu amaçla, birçok virüs, bir hücre 56 içinde ve eğer bu mikroRNA ortamını değiştirirYeterince virüs çoğaltma muhafaza edilmesi halinde hedeflenen mikroRNA içerir düzenlemenin etkinliği azalabilir. Bu endişeleri her tepki elemanı kompozisyonunu ve / veya lokalizasyonu optimize ederek ve kapsamlı bir hedef alındığı sistemin anlaşılması ve sınırlamalar ile ele alınabilir.

    diğer hedefleme yöntemleri ile ilgili tipik problemler virüsün hedef dışı zayıflama dahil, mühendislik virüsleri ile ilgili sınırlı taşıma kapasiteleri ve güvenlik kaygıları ile virüslerde genetik hedefleme malzeme için boyut kısıtlamaları normalde enfekte olmayan hedef hücrelere. MikroRNA hedefleme virüs minimum modifikasyonla, viral tropizm düzenleme sağlar. Bir viral genom içinde çok az yer kaplar ve hücresel microRNA imzalar geniş bir dizide dayalı uygun olabilir. Bu teknik, herhangi bir yeni güvenlik endişeleri tanıtmak değil, bu nedenle virüs için yeni tropisms tanıtmak ve etmez. Ayrıca, buyöntem, aynı zamanda, farklı hücre tipleri 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61 olan çok sayıda farklı zenginleştirilmiş mikroRNA hedef sekansları ile birden çok tropisms regüle etmek için kullanılabilir. Bu, tüm geliştirilmiş etki ile tedavi virüslerin güvenliğini geliştirmek için bir mekanizma sağlayan bu nedenle karşılık gelen microRNA ifade olmayan hücrelerde virüs zayıflatmaksızın gerçekleştirilebilir.

    Hücresel mikroRNA makine yararlanılabilmesi virüslerin pek çok farklı sınıflara tropizminin düzenlemek için kullanılabilir. Burada ayrıntılı protokoller bir virüs 'çoğaltma döngüsü ve özel raportör rea göre ancak onlar adapte edilebilir, bir microRNA hedefli picarnovirüsün kurtarılması ve karakterizasyonu için tasarlanmıştırdouts. farklı virüs ilgili kurtarma stratejileri de, mikroRNA hedef diziler bağımsız olarak tüm genomu, bir tek plasmidde ya da virüs, bir DNA ya da RNA genomunu olup olmadığı kodlanan bağımsız olarak viral genom içine sokulabilir. Sürece üretici hücreler soydaş microRNA ifade yok gibi, optimize edilmiş microRNA hedefleri virüs kurtarma bozmamak lazım. Deneyler virüs büyüme kinetiklerini analiz etme ve mikroRNA hedefleme özgüllük virüs replikasyonu Tek yuvarlak bir uzunluğu ve belirli virüs kopyalama / toksisite için okumalar (örneğin bir raportör protein, sitotoksisite, genom nicelenmesine dayanan toplanan zaman noktalarını değiştirerek değiştirilebilir vb.) Teknik, teorik olarak virüs tüm sınıfları uygulanabilir olsa da, bir çok faktör, bu yöntemin verimliliğini etkileyebilir dikkat etmek önemlidir. Örneğin, negatif anlamda RNA virüsleri nedeniyle sınırlı ac muhtemel pozitif sens RNA virüsleri gibi duyarlı kanıtlanmış değilMiRNA makine 13 genomik RNA'nın cessibility. Böylece, virüslerin her sınıfın biyolojik özellikleri RE optimizasyonu ek kısıtlamalar vermek olacaktır. Bu kısıtlamalara rağmen, bu teknik emniyet, programı içeren viral tropizm kolaylaştıran araştırma ve virüslerin tüm sınıflar için biyolojik süreçlerin temel bir anlayış hedef için alternatif bir yöntem sunmaktadır.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
    Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
    Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
    T4 DNA Ligase System NEB M0202S
    MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
    MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
    0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
    5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
    Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
    Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
    TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
    TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
    0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
    2 ml Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
    Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
    MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
    MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
    Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
    pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional Regulation of the Heterochronic Gene Lin-14 By Lin-4 Mediates Temporal Pattern Formation in C. Elegans. Cell. 75 (5), 855-862 (1993).
    2. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans Heterochronic Gene Lin-4 Encodes Small RNAs With Antisense Complementarity to Lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
    3. Ambros, V. The Functions of Animal MicroRNAs. Nature. 431 (7006), 350-355 (2004).
    4. Bartel, D. P. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
    5. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target Recognition and Regulatory Functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
    6. Benitez, A. A., Spanko, L. A., Bouhaddou, M., Sachs, D., Tenoever, B. R. Engineered Mammalian RNAi Can Elicit Antiviral Protection That Negates the Requirement for the Interferon Response. Cell Rep. 13 (7), 1456-1466 (2015).
    7. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Yalcin, A., Meyer, J., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of Tissue-Specific MicroRNAs From Mouse. Curr Biol. 12 (9), 735-739 (2002).
    8. Landgraf, P., et al. A Mammalian MicroRNA Expression Atlas Based on Small RNA Library Sequencing. Cell. 129 (7), 1401-1414 (2007).
    9. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: Tools for MicroRNA Genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
    10. Kelly, E. J., Russell, S. J. MicroRNAs and the Regulation of Vector Tropism. Mol Ther. 17 (3), 409-416 (2009).
    11. Brown, B. D., Naldini, L. Exploiting and Antagonizing MicroRNA Regulation for Therapeutic and Experimental Applications. Nat Rev Genet. 10 (8), 578-585 (2009).
    12. Tenoever, B. R. RNA Viruses and the Host MicroRNA Machinery. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 169-180 (2013).
    13. Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNAs and Oncolytic Viruses. Curr Opin Virol. 13, 40-48 (2015).
    14. Brown, B. D., Venneri, M. A., Zingale, A., Sergi Sergi, L., Naldini, L., L, Endogenous MicroRNA Regulation Suppresses Transgene Expression in Hematopoietic Lineages and Enables Stable Gene Transfer. Nat Med. 12 (5), 585-591 (2006).
    15. Brown, B. D., et al. A MicroRNA-Regulated Lentiviral Vector Mediates Stable Correction of Hemophilia B Mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
    16. Brown, B. D., et al. Endogenous MicroRNA Can be Broadly Exploited to Regulate Transgene Expression According to Tissue, Lineage and Differentiation State. Nat Biotechnol. 25 (12), 1457-1467 (2007).
    17. Ruiz, A. J., Hadac, E. M., Nace, R. A., Russell, S. J. MicroRNA-Detargeted Mengovirus for Oncolytic Virotherapy. J Virol. 90 (8), 4078-4092 (2016).
    18. Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. Engineering Attenuated Virus Vaccines By Controlling Replication Fidelity. Nat Med. 14 (2), 154-161 (2008).
    19. Barnes, D., Kunitomi, M., Vignuzzi, M., Saksela, K., Andino, R. Harnessing Endogenous MiRNAs to Control Virus Tissue Tropism as a Strategy for Developing Attenuated Virus Vaccines. Cell Host Microbe. 4 (3), 239-248 (2008).
    20. Perez, J. T., Pham, A. M., Lorini, M. H., Chua, M. A., Steel, J., Tenoever, B. R. MicroRNA-Mediated Species-Specific Attenuation of Influenza a Virus. Nat Biotechnol. 27 (6), 572-576 (2009).
    21. Saydaminova, K., et al. Efficient Genome Editing in Hematopoietic Stem Cells With Helper-Dependent Ad5/35 Vectors Expressing Site-Specific Endonucleases Under MicroRNA Regulation. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14057 (2015).
    22. Langlois, R. A., et al. MicroRNA-Based Strategy to Mitigate the Risk of Gain-of-function Influenza Studies. Nat Biotechnol. 31 (9), 844-847 (2013).
    23. Kelly, E. J., Hadac, E. M., Cullen, B. R., Russell, S. J. MicroRNA Antagonism of the Picornaviral Life Cycle: Alternative Mechanisms of Interference. PLoS Pathog. 6 (3), e1000820 (2010).
    24. Pham, A. M., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Replication in Cells of Hematopoietic Origin is Necessary for Dengue Virus Dissemination. PLoS Pathog. 8 (1), 1002465 (2012).
    25. Langlois, R. A., Varble, A., Chua, M. A., García-Sastre, A., Tenoever, B. R. Hematopoietic-Specific Targeting of Influenza a Virus Reveals Replication Requirements for Induction of Antiviral Immune Responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (30), 12117-12122 (2012).
    26. Chua, M. A., Schmid, S., Perez, J. T., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Influenza a Virus Utilizes Suboptimal Splicing to Coordinate the Timing of Infection. Cell Rep. 3 (1), 23-29 (2013).
    27. Griffiths-Jones, S. The MicroRNA Registry. Nucleic Acids Res. 32, D109-D111 (2004).
    28. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: MicroRNA Sequences, Targets and Gene Nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).
    29. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Integrating MicroRNA Annotation and Deep-Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 39, D152-D157 (2011).
    30. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Annotating High Confidence MicroRNAs Using Deep Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 42, D68-D73 (2014).
    31. Heckman, K. L., Pease, L. R. Gene Splicing and Mutagenesis By PCR-Driven Overlap Extension. Nat Protoc. 2 (4), 924-932 (2007).
    32. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. . , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5063/gel-purification (2016).
    33. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Ligation Reactions. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5069/dna-ligation-reactions (2016).
    34. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method (2016).
    35. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA From Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
    36. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
    37. Separation of RNA in Agarose Gels. Sourcebook for Electrophoresis. Lonza. , Available from: http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_BenchGuides_SourceBook_Section_VIII_-_Separation_of_RNA_in_Agarose_Gels.pdf 132-145 (2016).
    38. Kueberuwa, G., Cawood, R., Tedcastle, A., Seymour, L. W. Tissue-Specific Attenuation of Oncolytic Sindbis Virus Without Compromised Genetic Stability. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 154-165 (2014).
    39. Grundhoff, A., Sullivan , C. S. Virus-Encoded MicroRNAs. Virology. 411 (2), 325-343 (2011).
    40. Kincaid, R. P., Sullivan, C. S. Virus-Encoded MicroRNAs: An Overview and a Look to the Future. PLoS Pathog. 8 (12), e1003018 (2012).
    41. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental Strategies for MicroRNA Target Identification. Nucleic Acids Res. 39 (16), 6845-6853 (2011).
    42. Thomson, D. W., Dinger, M. E. Endogenous MicroRNA Sponges: Evidence and Controversy. Nat Rev Genet. 17 (5), 272-283 (2016).
    43. Mullokandov, G., et al. High-Throughput Assessment of MicroRNA Activity and Function Using MicroRNA Sensor and Decoy Libraries. Nat Methods. 9 (8), 840-846 (2012).
    44. Thomson, D. W., et al. Assessing the Gene Regulatory Properties of Argonaute-Bound Small RNAs of Diverse Genomic Origin. Nucleic Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
    45. Wu, S., et al. Multiple MicroRNAs Modulate P21cip1/waf1 Expression By Directly Targeting Its 3' Untranslated Region. Oncogene. 29 (15), 2302-2308 (2010).
    46. Vo, N. K., Dalton, R. P., Liu, N., Olson, E. N., Goodman, R. H. Affinity Purification of MicroRNA-133a With the Cardiac Transcription Factor, Hand2. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19231-19236 (2010).
    47. Arvey, A., Larsson, E., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Target mRNA Abundance Dilutes MicroRNA and siRNA Activity. Mol Syst Biol. 6, 363 (2010).
    48. Garcia, D. M., Baek, D., Shin, C., Bell, G. W., Grimson, A., Bartel, D. P. Weak Seed-Pairing Stability and High Target-Site Abundance Decrease the Proficiency of Lsy-6 and Other MicroRNAs. Nat Struct Mol Biol. 18 (10), 1139-1146 (2011).
    49. Jinek, M., Doudna, J. A. A Three-Dimensional View of the Molecular Machinery of RNA Interference. Nature. 457 (7228), 405-412 (2009).
    50. Pasquinelli, A. E. MicroRNAs and Their Targets: Recognition, Regulation and an Emerging Reciprocal Relationship. Nat Rev Genet. 13 (4), 271-282 (2012).
    51. Finnegan, E. F., Pasquinelli, A. E. MicroRNA Biogenesis: Regulating the Regulators. Crit Rev Biochem Mol Biol. 48 (1), 51-68 (2013).
    52. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of MicroRNA Biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
    53. Zuker, M. Mfold Web Server for Nucleic Acid Folding and Hybridization Prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
    54. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA Secondary Structure Prediction and Analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
    55. Khan, A. A., Betel, D., Miller, M. L., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Transfection of Small RNAs Globally Perturbs Gene Regulation By Endogenous MicroRNAs. Nat Biotechnol. 27 (6), 549-555 (2009).
    56. Skalsky, R. L., Cullen, B. R. Viruses, MicroRNAs, and Host Interactions. Annu Rev Microbiol. 64, 123-141 (2010).
    57. Sugio, K., et al. Enhanced Safety Profiles of the Telomerase-Specific Replication-Competent Adenovirus By Incorporation of Normal Cell-Specific MicroRNA-Targeted Sequences. Clin Cancer Res. 17 (9), 2807-2818 (2011).
    58. Fu, X., Rivera, A., Tao, L., De Geest, B., Zhang, X. Construction of an Oncolytic Herpes Simplex Virus That Precisely Targets Hepatocellular Carcinoma Cells. Mol Ther. 20 (2), 339-346 (2012).
    59. Yao, W., Guo, G., Zhang, Q., Fan, L., Wu, N., Bo, Y. The Application of Multiple MiRNA Response Elements Enables Oncolytic Adenoviruses to Possess Specificity to Glioma Cells. Virology. 458-459, 69-82 (2014).
    60. Bofill-De Ros, X., Gironella, M., Fillat, C. Mir-148a- and Mir-216a-regulated Oncolytic Adenoviruses Targeting Pancreatic Tumors Attenuate Tissue Damage Without Perturbation of MiRNA Activity. Mol Ther. 22 (9), 1665-1677 (2014).
    61. Baertsch, M. A., et al. MicroRNA-Mediated Multi-Tissue Detargeting of Oncolytic Measles Virus. Cancer Gene Ther. 21 (9), 373-380 (2014).

    Tags

    İmmünoloji Sayı 120 mikroRNA mikroRNA-hedefleme picomavirüs onkolitik tropizm virüs sitotoksisite çoğaltma gen ifadesi
    Picornavirüs tropizm MicroRNA tabanlı Yönetmelik
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Ruiz, A. J., Russell, S. J.More

    Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (120), e55033, doi:10.3791/55033 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter