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Immunology and Infection

Picornavirus 【tropism की MicroRNA आधारित विनियमन

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/55033
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic College of Medicine

Introduction

प्रतिबंधित tropism के साथ एक वेक्टर इंजीनियरिंग के लिए एक मोटे तौर पर लागू आसान और प्रभावी पद्धति के विकास के सुरक्षा, जैविक समझ और वायरस के चिकित्सीय उपयोगिता को बढ़ाने के लिए एक प्रमुख अवसर प्रदान करता है। कई तंत्र transductional, ट्रांसक्रिप्शनल, और translational आधारित तकनीकों सहित वायरल tropism को लक्षित करने के लिए मौजूद हैं। हालांकि, इन तरीकों नहीं आम तौर पर सभी वेक्टर सिस्टम के लिए लागू है, लक्षित कोशिकाओं में दोषपूर्ण संकेत दे रास्ते की आवश्यकता होती है या वायरल जीनोम में बड़े कोडिंग दृश्यों की प्रविष्टि की आवश्यकता हो सकती हैं। इसके अतिरिक्त, इन तरीकों वायरस के क्षीणन में परिणाम कर सकते हैं, काफी उनके चिकित्सीय गतिविधि निरोधक और असंशोधित प्रणाली में अंतर्दृष्टि सीमित।

MicroRNAs छोटे (22-25 न्यूक्लियोटाइड) गैर-कोडिंग RNAs कि कोशिकाओं में जीन मुंह बंद करने के लिए मध्यस्थता कर रहे हैं। मैसेंजर आरएनए में पूरक लक्ष्य दृश्यों (प्रतिक्रिया तत्व) बाध्यकारी (mRNA) resulti द्वारा MicroRNAs समारोह प्रतिलेख अस्थिरता, गिरावट या translational दमन में एनजी। MicroRNAs सामान्य रूप से आंशिक पूरकता के साथ प्रतिक्रिया तत्वों बाँध और जीन अभिव्यक्ति 1, 2, 3, 4, 5 में छोटे संशोधनों निकलेगा। जीन अभिव्यक्ति में अधिक महत्वपूर्ण परिवर्तन प्रतिक्रिया तत्व 6 की पूरकता बढ़ाने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। परिपक्व microRNAs हजारों सेल और ऊतक प्रकार 7, 8, 9 की एक किस्म में प्रजातियों और कई प्रदर्शनी अंतर अभिव्यक्ति पैटर्न के एक किस्म में पहचान की गई है। ये microRNA हस्ताक्षर, वायरल जीनोम 10 में पूरी तरह से पूरक प्रतिक्रिया तत्वों को शामिल करके वायरस प्रवर्धन की सेल विशिष्ट प्रतिबंध के लिए इस्तेमाल किया जा सकता= "xref"> 11, 12, 13। इस microRNA को लक्षित तकनीक के समग्र लक्ष्य के अतिरिक्त क्षीणन बिना एक वेक्टर जीनोम के tropism नियंत्रित करने के लिए है।

वायरल tropism को विनियमित करने के लिए इस विधि की उपयोगिता मूल lentiviral वैक्टर में प्रदर्शन किया गया विशिष्ट ऊतकों 14, 15, 16 में transgene अभिव्यक्ति को प्रतिबंधित करने के लिए। इस तकनीक को बाद में 17 नकल और बढ़ाया जीन थेरेपी के लिए वायरल वैक्टर गैर नकल के रूप में अच्छी तरह से सामान्य ऊतकों 10, 11, 12, 13 में अवांछित विषाक्तता को नष्ट करने से कई oncolytic वायरस की सुरक्षा प्रोफाइल में सुधार करने के लिए, का एक विशाल सरणी के लिए लागू किया गया है । यह भी सुरक्षित और ई उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया हैffective लिव-तनु टीके के रूप में भी सुधार करने के लिए वायरस और टीका विनिर्माण प्रक्रियाओं 18, 19, 20, 21। MicroRNA को लक्षित एक सदिश की जबकि निर्माता प्रणालियों में जंगली प्रकार के विकास के स्तर को बनाए रखने टीका मेजबान या लक्षित सिस्टम में क्षीणन के लिए अनुमति दे सकते हैं। MicroRNA-लक्ष्य-निर्धारण भी एक प्रजाति (जैसे मनुष्य) में संचरण सीमित है, जबकि अन्य मेजबान 22 में संचरण बनाए रखने के द्वारा अनुसंधान प्रयोजनों के लिए वायरस की जैव सुरक्षा में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, microRNA-लक्ष्य में गहराई से वायरल विकास 23, 24, 25, 26 को अलग से वायरल जीवन चक्र और रोगजनन और प्रतिरक्षा में प्रकार की कोशिकाओं के विशिष्ट भूमिकाओं के विश्लेषण के लिए अनुमति दे सकते हैं।

इस तकनीक में एक Alt प्रदान करता हैसभी वायरस सिस्टम के लिए लक्षित तरीका है कि आसानी से लागू किया जाता है और लागू ernative। इसके अतिरिक्त, विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में अंतर अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ परिपक्व microRNAs की कभी विस्तार संग्रह इस तकनीक अत्यधिक बहुमुखी बनाता है। MicroRNA आधारित लक्ष्य-निर्धारण प्रणाली समारोह समझौता किए बिना वायरस सिस्टम की एक किस्म के लिए प्रभावी साबित कर दी है। इस तकनीक के प्रमुख सीमाओं परीक्षण और त्रुटि के अनुकूलन, भागने म्यूटेशन के लिए क्षमता, और अंतर्जात टेप पर संभावित बंद लक्ष्य प्रभाव शामिल हैं। हालांकि, इन सीमाओं को आम तौर पर अनुकूलित और तर्कसंगत प्रतिक्रिया तत्व डिजाइन के साथ दूर किया जा सकता है। सकारात्मक भावना आरएनए वायरस उनके जीनोम की सकारात्मक भावना अभिविन्यास और पूरी तरह से cytoplasmic प्रतिकृति चक्र के दौरान microRNA मशीनरी के लिए टेप की उपलब्धता की वजह से microRNA-लक्षित करने के लिए विशेष रूप से संवेदनशील हो जाते हैं। यहाँ हम एक microRNA-लक्षित picornavirus और experim पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णनअंदरूनी तरीकों दक्षता और है कि इन विट्रो में लक्षित की विशिष्टता को सत्यापित करने के लिए।

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Protocol

1. क्लोनिंग microRNA रिस्पांस वायरल जीनोम में तत्वों

  1. डिजाइन microRNA प्रतिक्रिया तत्व सम्मिलित करता है।
    1. वांछित microRNA और अपनी इसी लक्ष्य अनुक्रम को पहचानें। कई डेटाबेस परिपक्व microRNA दृश्यों के साथ उपलब्ध हैं। अनुशंसित: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30।
  2. प्लास्मिड डीएनए वेक्टर जीनोम या प्रतिलिपि एन्कोडिंग में प्रतिक्रिया तत्व क्लोन।
    नोट: दो या अधिक प्रतिलिपि प्रतिक्रिया तत्वों प्रविष्टि के लिए एक अद्वितीय प्रतिबंध साइट का उपयोग करने के लिए आसान और अधिक बहुमुखी है।
    1. प्रतिक्रिया तत्व या अद्वितीय प्रतिबंध साइट का उपयोग ब्याह-ओवरलैप एक्सटेंशन (SOE) पीसीआर डालें। इस विधि को विस्तार 31 में वर्णित किया गया है।
    2. अगर प्रविष्टि के लिए कोई प्रतिबंध साइट का उपयोग, पुरव्यावसायिक रूप से संश्लेषित, Page-शुद्ध भावना और अद्वितीय प्रतिबंध साइट (चित्रा 2) की अधिकता के दृश्यों से घिरे डालने दृश्यों एन्कोडिंग antisense ultramers का पीछा।
    3. 1x के अंतिम एकाग्रता के लिए 0.5 माइक्रोग्राम प्रति भावना ultramer, 0.5 माइक्रोग्राम antisense ultramer, डीएनए बंधाव बफर का मिश्रण है, और एच 2 के साथ 50 μl के लिए ला ओ ultramers पानी रखना 10 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया incubating और तब तक के तापमान को कम करने से 0.5 डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रिया जब तक हर 30 सेकंड 25 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है।
    4. गठबंधन वेक्टर डीएनए के 0.5 माइक्रोग्राम नए अद्वितीय प्रतिबंध साइट, एक 1x अंतिम एकाग्रता के लिए एंजाइम बफर, उचित प्रतिबंध एंजाइम की 1 μl एन्कोडिंग, और 37 डिग्री सेल्सियस पर एच 2 ओ डाइजेस्ट वेक्टर के साथ 20 μl के अंतिम मात्रा के लिए लाना 2 घंटे के लिए। Agarose जेल शुद्धि 32 से linearized डीएनए शुद्ध।
    5. 16 डिग्री पर रात भर पचा वेक्टर में annealed ultramers ligate; सी एक 3 का उपयोग: 1 ultramers: वेक्टर दाढ़ अनुपात और मानक बंधाव तकनीक 33।
      नोट: जब प्रविष्टि के लिए एक भी प्रतिबंध एंजाइम साइट का उपयोग कर इसे और अधिक पचा वेक्टर के सिरों dephosphorylate और annealed ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स के सिरों phosphorylate करने के लिए कुशल हो सकता है।
    6. गर्मी झटका विधि का उपयोग कर 34 ई कोलाई में ligated डीएनए रूपांतरण।
      नोट: वायरल जीनोम एन्कोडिंग plasmids आम तौर पर बड़े हैं, इसलिए बड़े डीएनए निर्माणों तेज करने के लिए परिवर्तन दक्षता में वृद्धि हो सकती अनुकूलित सक्षम कोशिकाओं का उपयोग कर।
    7. व्यक्ति एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शुद्धि किट का उपयोग कर 35 कालोनियों से प्लास्मिड डीएनए शुद्ध। सम्मिलित क्षेत्र 36 अनुक्रमण द्वारा सही ओरिएंटेशन में microRNA प्रतिक्रिया तत्व (चित्रा 2) के साथ एक उपयुक्त क्लोन को पहचानें।

2. microRNA-लक्षित Picornavirus इधर-उधर बचावएम प्लास्मिड डीएनए

  1. एक सेल लाइन वायरस प्रतिकृति कि आत्मीय microRNA (ओं) व्यक्त नहीं करता है के लिए अनुमोदक में बचाव microRNA-लक्षित picornavirus। इस प्रोटोकॉल H1-हेला कोशिकाओं का उपयोग करता है, क्योंकि वे मीर 142, मीर 124, या मीर 125 व्यक्त नहीं करते, लेकिन यह बचाव के लिए H1-हेला कोशिकाओं का उपयोग करने की आवश्यकता नहीं है।
    चेतावनी: सुरक्षित हैंडलिंग और संक्रामक एजेंटों के निपटान के लिए सभी दिशा निर्देशों के हिसाब से पालन किया जाना चाहिए।
    1. एक 6 अच्छी तरह से थाली ऐसी है कि वे कर रहे हैं ~ अभिकर्मक के समय (24 घंटे के बाद बोने) में 80% मिला हुआ में प्लेट H1-हेला कोशिकाओं। DMEM के प्रति अच्छी तरह से 2 एमएल में प्लेट कोशिकाओं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक।
    2. कमरे के तापमान को अभिकर्मक अभिकर्मक गर्म। 250 μL सीरम मुक्त मीडिया, प्लास्मिड डीएनए एन्कोडिंग microRNA-लक्षित जीनोम के 2.5 माइक्रोग्राम, और एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में अभिकर्मक अभिकर्मक के 7.5 μL और pipet गठबंधन धीरे मिश्रण करने के लिए। 15-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते हैं।
    3. महाप्राणचढ़ाया कोशिकाओं से मीडिया और ताजा पूरा मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. 6 अच्छी तरह से थाली बूंद के लिहाज से एक अच्छी तरह से करने के लिए कदम 2.1.2 से पूरे अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें। अच्छी तरह से एक अलग क्षेत्र के लिए प्रत्येक बूंद जोड़ें।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं जब तक cytopathic प्रभाव (सीपीई) या रिपोर्टर प्रोटीन detectable (~ 24-72 ज) कर रहे हैं।
  2. फसल और पारित होने के ताजा कोशिकाओं पर बचाया वायरस।
    1. 6 अच्छी तरह से थाली में प्लेट कोशिकाओं वे संक्रमण का समय (24 घंटे के बाद बोने) पर 80-90% मिला हुआ हैं कि इस तरह के।
      नोट: ऊपर और नीचे पैमाने या वायरस की मात्रा बाद के सभी प्रयोगों के लिए की जरूरत पर निर्भर करता है।
    2. एक रबर सेल खुरचनी या रबर पुलिसकर्मी का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला में कोशिकाओं scraping द्वारा अच्छी तरह से प्रत्येक बचाव हार्वेस्ट। धीरे अच्छी तरह से नीचे के पार खुरचनी खींचें। एक क्रायोजेनिक भंडारण ट्यूब में कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
    3. / फ्रीज पिघलना नमूने दो बार और फिर से सेलुलर मलबे गोली4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,200 XG पर centrifuging।
    4. मंजूरी दे दी सतह पर तैरनेवाला दो बार 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर। फ़िल्टर बचाव सतह पर तैरनेवाला वायरस होते हैं।
      नोट: फिल्टर ताकना आकार वायरस कणों के आकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं और बड़ी वायरस के लिए लागू नहीं हो सकता।
    5. चढ़ाया कोशिकाओं से महाप्राण मीडिया, सीरम मुक्त मीडिया के साथ एक बार धोने और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए ताजा सीरम मुक्त मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    6. फ़िल्टर बचाव सतह पर तैरनेवाला के प्रति अच्छी तरह से 50 μL जोड़ें और धीरे प्लेट में समान रूप से वितरित करने के लिए वायरस रॉक।
    7. अनिगमित वायरस को दूर करने के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक से 2 घंटे के लिए और फिर महाप्राण मीडिया के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
    8. अच्छी तरह से प्रति ताजा पूरा मीडिया के 1.5-2 एमएल जोड़ें और (~ 24-48 ज) 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक सीपीई या रिपोर्टर प्रोटीन स्पष्ट कर रहे हैं।
    9. दोहराएँ 2.2.4 के लिए 2.2.2 कदम। छानने का बचाव सतह पर तैरनेवाला वायरस शेयर शामिल हैं। -80 डिग्री पर क्रायोजेनिक भंडारण ट्यूबों में एकल उपयोग aliquots में स्टोर वायरस स्टॉक्ससी।

3. से microRNA-लक्षित वायरस बचाव इन विट्रो लिखित शाही सेना टेप में

  1. microRNA-लक्षित वायरल जीनोम एक नदी के ऊपर प्रमोटर का उपयोग कर एन्कोडिंग प्लास्मिड डीएनए से शाही सेना टेप उत्पन्न करता है।
    नोट: पैदा करने और बनाए रखने के एक nuclease मुक्त पर्यावरण के लिए मानक तरीकों बाद के सभी चरणों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  2. प्लास्मिड डीएनए Linearize एक एंजाइम प्रतिबंध साइट प्रतिलेख के बहाव का उपयोग कर। गठबंधन 5 माइक्रोग्राम प्रति प्लास्मिड डीएनए, 1x अंतिम एकाग्रता एंजाइम बफर, 3 μl प्रतिबंध एंजाइम और 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया एच 2 ओ सेते के साथ 50 μl करने के लिए ले आओ।
  3. 0.5 एम EDTA के 1/20 वें मात्रा 1/10 वें मात्रा 5 एम एनएच 4 एसीटेट, और पचा प्रतिक्रिया के लिए 100% इथेनॉल के 2 संस्करणों और मिश्रण जोड़ें। 1 घंटे रात भर तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 17,000 XG पर 10 मिनट के लिए उपजी डीएनए गोली। supernata डालोNT, ठंड से 70% इथेनॉल के 500 μL में गोली resuspend और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 17,000 XG पर centrifuging द्वारा डीएनए गोली।
  5. 30 सेकंड के लिए फिर से सतह पर तैरनेवाला और सेंट्रीफ्यूज डालो। एक pipet के साथ अवशिष्ट तैरनेवाला निकालें और गोली हवा सूखी। 0.5-1 माइक्रोग्राम / μL की एकाग्रता में बाँझ nuclease मुक्त एच 2 ओ में डीएनए गोली Resuspend।
  6. कमरे के तापमान पर इन विट्रो प्रतिलेखन अभिकर्मकों गला लें और बर्फ पर ribonucleotides जगह (ग्लिसरॉल में एंजाइमों स्थिर नहीं है और बर्फ पर सीधे जाना चाहिए)। कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया बफर रखें।
  7. 2 μL के संयोजन के द्वारा एक पीसीआर ट्यूब में प्रतिलेखन प्रतिक्रिया इकट्ठा एटीपी, सीटीपी, जीटीपी, और UTP समाधान, 2 μL 10x प्रतिक्रिया बफर, 1 माइक्रोग्राम linearized डीएनए, 2 μl एंजाइम, और nuclease के साथ 20 μL के अंतिम मात्रा करने के लिए लाने के प्रत्येक मुक्त एच 2 ओ
  8. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं।
  9. शाही सेना टेप शुद्ध।
  10. क्षालन समाधान (नहीं-preheated) के साथ 100 μL के लिए प्रतिलेखन प्रतिक्रिया लाओ। बाध्यकारी समाधान ध्यान केंद्रित करने के 350 μL और प्रतिक्रिया के लिए 100% इथेनॉल के 250 μL और मिश्रण जोड़ें।
  11. एक फिल्टर कारतूस पर 12,000 एक्स जी 1 मिनट के लिए एक संग्रह ट्यूब और अपकेंद्रित्र में डाला करने के लिए नमूना हस्तांतरण। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  12. 12,000 पर 1 मिनट के लिए फिल्टर कारतूस और सेंट्रीफ्यूज को धोने के समाधान के 500 μL जोड़े x जी। त्यागें प्रवाह के माध्यम से। इस धोने कदम एक बार और दोहराएँ। त्यागें प्रवाह के माध्यम से। 12,0000 XG पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र अवशिष्ट इथेनॉल हटा दें।
  13. एक साफ संग्रह ट्यूब के लिए फिल्टर कारतूस स्थानांतरण और फिल्टर कारतूस के लिए preheated क्षालन समाधान के 50 μL जोड़ें। 12,000 एक्स जी 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। eluent शेष भाग के 100 μl की कुल मात्रा के लिए इस चरण को दोहराएँ क्षालनशुद्ध शाही सेना टेप aining। त्यागें फिल्टर कारतूस।
  • 260 और 280 एनएम पर नमूना के absorbance मापने और बीयर-लैम्बर्ट कानून का उपयोग करके eluent में शाही सेना एकाग्रता का निर्धारण।
  • आरएनए आरएनए जेल वैद्युतकणसंचलन 37 का उपयोग करने की अखंडता का आकलन करें। अच्छे और बुरे आरएनए अखंडता के उदाहरण के लिए चित्रा 3 देखें। आरएनए एकल उपयोग ट्यूबों में aliquotted और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत अखंडता को बनाए रखने के लिए किया जाना चाहिए।
  • कमरे के तापमान को गर्म अभिकर्मक अभिकर्मकों। गठबंधन 250 μl सीरम मुक्त मीडिया, शुद्ध शाही सेना टेप के 2.5 माइक्रोग्राम, को बढ़ावा देने के समाधान के 5 μL, और एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में अभिकर्मक अभिकर्मक के 5 μL और pipet धीरे मिश्रण करने के लिए। 2-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते हैं।
  • एक 6 अच्छी तरह से थाली ऐसी है कि वे कर रहे हैं ~ अभिकर्मक के समय (24 घंटे के बाद बोने) में 80% मिला हुआ में प्लेट H1-हेला कोशिकाओं। DMEM के प्रति अच्छी तरह से 2 एमएल में प्लेट कोशिकाओं 10% FET के साथ पूरकअल गोजातीय सीरम।
  • चढ़ाया कोशिकाओं से मीडिया Aspirate और ताजा पूरा मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  • 6 अच्छी तरह से थाली बूंद के लिहाज से एक अच्छी तरह से करने के लिए कदम 3.12 से पूरे अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें। अच्छी तरह से एक अलग क्षेत्र के लिए प्रत्येक बूंद जोड़ें।
  • 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं जब तक cytopathic प्रभाव (सीपीई) या रिपोर्टर प्रोटीन detectable (~ 24-72 ज) कर रहे हैं।
  • 2.2 2.2.9 के लिए कदम के रूप में वर्णित microRNA-लक्षित वायरस के बचाव के लिए आगे बढ़ें।

    • 4. गणना के द्वारा वायरस स्टॉक्स titrating 50% ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक (TCID 50)

    1. DMEM में अच्छी तरह से प्रति 10 4 कोशिकाओं में एक 96 अच्छी तरह से थाली में प्लेट H1-हेला कोशिकाओं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
      ध्यान दें: वायरस प्रतिकृति कि आत्मीय microRNAs व्यक्त नहीं करते के लिए अनुमोदक कोशिकाओं में वायरस titrate।
    2. सीरम मुक्त के 1 एमएल की कुल मात्रा में 10 गुना वायरस के धारावाहिक dilutions प्रत्येकमीडिया।
      नोट: कम dilutions का प्रयोग करें अगर अधिक सटीक आवश्यक है।
      नोट: प्रत्येक कमजोर पड़ने के बाद सुझावों के बदले अनुमापांक की overestimation रोकने के रूप में वायरस सुझावों के लिए छड़ी कर सकते हैं।
    3. चढ़ाया हेला कोशिकाओं से पक्ष और महाप्राण मीडिया को टिप 96 अच्छी तरह से थाली। प्रति प्रत्येक वायरस के कमजोर पड़ने के 100 μL अच्छी तरह से करने के लिए 96 अच्छी तरह से थाली (कमजोर पड़ने प्रति 1 पंक्ति) के 8 कुओं जोड़ें। 1 पंक्ति और नियंत्रण के लिए थाली पर 12 पंक्ति वायरस के बिना सीरम मुक्त मीडिया के 100 μL जोड़ें।
      नोट: हमेशा महाप्राण और टिप छू सेल टुकड़ी को रोकने के लिए अच्छी तरह से की ओर करने के द्वारा कुओं के लिए मीडिया जोड़ें।
    4. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं। पक्ष को टिप प्लेट और कुओं से मीडिया aspirate।
      नोट: प्रत्येक कमजोर पड़ने पंक्ति के बीच सुझाव दिए बदलें।
    5. प्रत्येक अच्छी तरह से पूरा मीडिया के 100 μl जोड़ें। 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
    6. एक खुर्दबीन के नीचे कुओं कल्पना और प्रत्येक अच्छी तरह से सकारात्मक या नकारात्मक सीपीई के लिए निशान।
    7. निम्न समीकरण के साथ प्रत्येक वायरस अनुमापांक गणना: लोजी 10 (TCID 50 / एमएल) एल + D (एस 0.5) + लॉग 10 (1 / वी) =। एल सबसे केंद्रित वायरस का परीक्षण कमजोर पड़ने जिसमें सभी कुओं सकारात्मक रहे हैं के नकारात्मक लॉग 10 है। डी कमजोर पड़ने कारक का लॉग 10 है। व्यक्तिगत अनुपात (पीआई) का योग है। पीआई एक व्यक्ति के कमजोर पड़ने (सकारात्मक कुओं / कमजोर पड़ने प्रति कुओं की कुल राशि की राशि की गणना की अनुपात है। वी inoculum की मात्रा (एमएल / अच्छी तरह से) है।

    तालिका एक
    तालिका 1: TCID 50 की गणना के द्वारा संक्रामक वायरस कणों बढ़ाता। कोशिकाओं से एक प्रतिनिधि के परिणाम वायरस शेयर के दस गुना dilutions की एक श्रृंखला से संक्रमित। 'एल' 4 के लिए equates क्योंकि पिछले कमजोर पड़ने जहां सभी कुओं सीपीई के लिए सकारात्मक रहे हैं 10 -4 है। 'डी' में 10 के बाद से 10 गुना dilutions की लॉग 10इस्तेमाल किया गया है और इसलिए करने के लिए 1. "एस" बराबर है अलग-अलग अनुपात के योग है। इस उदाहरण में अलग-अलग अनुपात में 1.0, 0.875, 0.375, 0.125, और 0. इन का योग (एस) 2.375 है। "वी" शुरू में कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल मिलीलीटर में inoculum की मात्रा है।

    एकल-कदम विकास कैनेटीक्स: 5. microRNA-लक्ष्य प्रभावकारिता का मूल्यांकन

    1. इस परख के लिए नियंत्रण नकली संक्रमित कोशिकाओं, असंशोधित वायरस और वायरस एक गैर लक्षित या गैर कार्यात्मक प्रतिक्रिया तत्व युक्त शामिल हैं।
    2. ऐसी है कि वे संक्रमण का समय (24 घंटे के बाद बोने) पर 80-90% मिला हुआ हैं 12 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में एक समय के पाठ्यक्रम के प्रयोग के लिए प्लेट H1-हेला कोशिकाओं। DMEM में प्लेट कोशिकाओं अच्छी तरह से प्रति 1 एमएल में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक।
      नोट: प्रत्येक समय बिंदु के लिए एक अलग प्लेट थाली करने के लिए सिफारिश की है। इस प्रोटोकॉल एक 8-12 मानव संसाधन प्रतिकृति चक्र के साथ एक वायरस के लिए 7 अलग अलग समय बिंदुओं का उपयोग करता है। H1-हेला कोशिकाओं को इस एक प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक नहीं हैंssay। इस परख अनुमोदक कोशिकाओं है कि लक्षित microRNAs व्यक्त नहीं करते में किया जाना चाहिए। यह परख भी आत्मीय microRNAs व्यक्त चयनात्मक दबाव में विकास कैनेटीक्स का मूल्यांकन करने के लिए कोशिकाओं में प्रदर्शन किया जा सकता है।
    3. कुओं से महाप्राण मीडिया। खैर, प्रत्येक के लिए सीरम मुक्त माध्यम के 0.5 एमएल जोड़कर कुओं धो थाली, और कुओं से महाप्राण मीडिया ज़ुल्फ़। ताजा सीरम मुक्त मीडिया के 0.5 एमएल प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें।
    4. संक्रमण के एक उच्च बहुलता पर प्रत्येक अच्छी तरह से संक्रमित (MOI, सेल प्रति संक्रामक कणों की संख्या) सुनिश्चित करने के लिए सभी कोशिकाओं को संक्रमित मिलता है। इस प्रोटोकॉल 3 के MOI उपयोग करता है।
      1. सीरम मुक्त मीडिया में वायरस शेयरों पतला MOI की एकाग्रता = 3 100 प्रति μL करने के लिए। वायरस के कमजोर पड़ने के 100 μL प्रत्येक सात अलग-अलग कुओं में जोड़ें और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      2. सभी कुओं से मीडिया Aspirate और अच्छी तरह से प्रति 0.5 एमएल पूरा मीडिया उनका कहना है, धीरे कमाल की है और उसके बाद श्वास द्वारा दो बार धो लो।
    5. सी के 1 एमएल जोड़ेंप्रत्येक के लिए omplete मीडिया अच्छी तरह से और वांछित समय बिंदु तक 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    6. 2, 4, 6, 8, 10, 24 और 48 घंटे के बाद संक्रमण (समय बिंदु प्रति 1 अच्छी तरह से) पर वायरस अनुमापन के लिए नमूने ले लीजिए। एक क्रायोजेनिक भंडारण ट्यूब करने के लिए अच्छी तरह से मीडिया के हस्तांतरण के 700 μL। शेष सतह पर तैरनेवाला में धीरे पूरे अच्छी तरह से भर में एक रबर खुरचनी ले जाकर कोशिकाओं परिमार्जन। सतह पर तैरनेवाला के 700 μL युक्त इसी क्रायोजेनिक भंडारण ट्यूब सेल / सतह पर तैरनेवाला मिश्रण स्थानांतरण।
      नोट: दूषित नमूनों में जिसके परिणामस्वरूप स्क्रैप के दौरान अच्छी तरह से दूसरे में एक से सतह पर तैरनेवाला छिड़काव करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें। 700 μL splashing कम कर देंगे स्क्रैप से पहले स्थानांतरण।
    7. -80 डिग्री सेल्सियस पर प्लेस के नमूने जब तक सभी नमूने एकत्र कर रहे हैं।
    8. रुक / नमूने तीन बार पिघलना और सेलुलर मलबे 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,200 XG पर नमूने centrifuging द्वारा हटा दें।
    9. धारा 4 में वर्णित के रूप में वायरस titrate और टी पर विकास कैनेटीक्स तुलनाIME।

    वायरस फैल परख का उपयोग सिंथेटिक microRNA Mimics: 6. microRNA-लक्ष्य विशिष्टता का मूल्यांकन

    नोट: microRNA लक्ष्य बातचीत: एक कृत्रिम microRNA नकल का उपयोग microRNA की विशिष्टता को दिखाने के लिए किया जाता है।

    1. नकली अभिकर्मक शामिल करें, नकारात्मक नियंत्रण microRNA नकल और प्रयोगात्मक microRNA केवल नियंत्रित करता है हर परख microRNA की मध्यस्थता विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए नकल। यह भी एक सकारात्मक नियंत्रण (यानी microRNA-लक्षित जीन या जीनोम) microRNA mimics के रूप में कम अभिकर्मक दक्षता झूठी नकारात्मक परिणाम कर सकते हैं शामिल करने के लिए आदर्श है।
    2. प्लेट H1-हेला एक 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में कोशिकाओं को ऐसी है कि वे अभिकर्मक के समय (24 घंटे के बाद बोने) पर 80-90% मिला हुआ हैं। DMEM में प्लेट कोशिकाओं अच्छी तरह से प्रति 0.1 मिलीग्राम से कम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक।
      ध्यान दें: वायरल प्रतिकृति कि आत्मीय microRNAs व्यक्त नहीं करते के लिए अनुमोदक कोशिकाओं में इस परख प्रदर्शन।
    3. गर्म वेंकमरे के तापमान को ई अभिकर्मक अभिकर्मकों। 9 μL सीरम मुक्त मीडिया, microRNA नकल शेयर की अच्छी तरह से प्रति 200 एनएम अंतिम एकाग्रता, 0.18 μL को बढ़ावा देने के अभिकर्मक, 0.18 μL अभिकर्मक अभिकर्मक का मिश्रण है और मिश्रण। 2-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते हैं।
      नोट: सूचीबद्ध वॉल्यूम में अच्छी तरह से प्रति कर रहे हैं। यह सिफारिश की है कि एक मास्टर मिश्रण निरंतरता बनाए रखने और pipetting त्रुटि को कम करने के लिए सभी कुओं के अभिकर्मक के लिए इकट्ठा किया। microRNA नकल का इष्टतम एकाग्रता अलग अलग होंगे। परामर्श करें microRNA साथ निर्माता के निर्देशों का एक उचित शुरुआती एकाग्रता के लिए नकल। यह आम तौर पर 5-200 एनएम अंतिम सांद्रता से लेकर जाएगा।
    4. कुओं से मीडिया Aspirate और ताजा पूरा मध्यम के 92 μl जोड़ें।
      नोट: यदि वहाँ के नमूनों की एक महत्वपूर्ण संख्या में हैं, अभिकर्मक समाधान कोडांतरण से पहले इस कदम को पूरा करने और तैयार है जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट की दुकान।
    5. पूरे अभिकर्मक मिश्रण मैं जोड़n कोशिकाओं को 6.3 कदम बूंद के लिहाज से।
    6. 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    7. एक कम MOI में अच्छी तरह से प्रत्येक संक्रमित कोशिकाओं के कम प्रतिशत सुनिश्चित करने के लिए वायरस के प्रसार के विश्लेषण की अनुमति के लिए संक्रमित हो। इस प्रोटोकॉल 0.2 के MOI उपयोग करता है।
      1. सीरम मुक्त मीडिया में वायरस शेयरों पतला MOI की एकाग्रता = 0.2 100 प्रति μL करने के लिए। कुओं से मीडिया निकालें और अच्छी तरह से प्रति वायरस कमजोर पड़ने के 100 μL जोड़ें।
      2. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    8. प्रत्येक अच्छी तरह से महाप्राण मीडिया और ताजा पूरा मीडिया के 100 μL जोड़ें।
    9. 20-22 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    10. Supernatants में वायरस अनुमापन निर्धारित करते हैं।
      1. प्रत्येक अच्छी तरह से सतह पर तैरनेवाला लीजिए और ताजा पूरा मीडिया के 100 μL के साथ बदलें।
        नोट: निलंबन कोशिकाओं का उपयोग करते हैं, तो ताजा पूरा मीडिया के 100 μL में निम्नलिखित कदम से सेल गोली resuspend और व्यवहार्यता परख के लिए अच्छी तरह से नमूने के लिए वापसी।
      2. cellu हटाये4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifuging द्वारा एकत्र supernatants से LAR मलबे।
      3. एक ताजा ट्यूब को मंजूरी दे दी सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण और अनुमोदक कोशिकाओं है कि आत्मीय microRNAs धारा 4 में वर्णित के रूप में व्यक्त नहीं करते पर संक्रामक वायरस titrate।
        ध्यान दें: बर्फ पर सभी नमूने रखें संक्रामकता के नुकसान को रोकने के लिए।
    11. कोशिकाओं की व्यवहार्यता का निर्धारण।
      1. MTT के 10 μL (3- (4,5-dimethylthiazolyl -2) -2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड) अच्छी तरह से प्रति अभिकर्मक जोड़ें।
      2. 2-4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक बैंगनी वेग दिख रहा है।
      3. डिटर्जेंट अभिकर्मक के 100 μL जोड़ें।
      4. 2 घंटे के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर सेते हैं।
      5. 570 एनएम पर सभी कुओं के absorbance पढ़ें।
        नोट: सभी नमूने मानक के अनुसार प्रतिशत सेल व्यवहार्यता की तुलना के लिए ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं नकली करने के लिए।

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    Representative Results

    तालिका 1 एक picornavirus के लिए एक अनुमापन परख की ठेठ परिणामों का प्रतिनिधित्व करता है और बताता है कि 50% टिशू कल्चर संक्रामक खुराक की गणना करने के लिए। इस पांडुलिपि में वर्णित वायरल tropism की microRNA आधारित विनियमन की समग्र अवधारणा का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व intracellular बातचीत, annealing और प्लाज्मिड प्रविष्टि के लिए प्रतिक्रिया तत्व ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स के उचित डिजाइन के दौरान प्रतिक्रिया तत्व को चित्रा 1. microRNA के अभिविन्यास में दिखाया गया है, और एक प्लास्मिड डीएनए इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए एक microRNA-लक्षित वायरल जीनोम एन्कोडिंग के नक्शे चित्रा में चित्रित 2. चित्रा 3 agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा कल्पना अखंडता की डिग्री बदलती में शाही सेना टेप से पता चलता है। के रूप में LINEA भीतर 3 ए लेन में दिखाया गया है 2. अवशिष्ट अशुद्धियों उचित हैंडलिंग और डीएनए के उपयोग अशुद्धियों को ठीक से लिखित शाही सेना टेप में परिणाम होगा से रहित टेम्पलेट्सrized डीएनए टेम्पलेट्स या nuclease की मात्रा का पता लगाने को अनुचित तरीके से लिखित शाही सेना और / या गिरावट उत्पादों के निम्न स्तर 3 ए लेन में मनाया समान में परिणाम कर सकते हैं 3. प्लास्मिड डीएनए या डीएनए ऐसे अवशिष्ट इथेनॉल का परिणाम देगा के रूप में अशुद्धियों की उच्च मात्रा युक्त का अधूरा linearization 3 ए गलियों 4 और 5 चित्रा 3 में प्रतिनिधित्व अनुचित प्रतिलेखन और गिरावट उत्पादों को भी Mengovirus की मध्यस्थता cytopathic प्रभाव (सीपीई) स्वच्छ शाही सेना टेप के अभिकर्मक निम्न में से एक छवि को दर्शाता है। चित्रा 4 दिखाता डेटा एक समय बेशक प्रयोग असंशोधित और microRNA-लक्षित Mengovirus के विकास कैनेटीक्स के मूल्यांकन के प्रतिनिधि। परिणाम बताते हैं कि microRNA प्रतिक्रिया Mengovirus जीनोम में इंजीनियर तत्वों H1-हेला कोशिकाओं में वायरस प्रतिकृति के कैनेटीक्स, जो आत्मीय microRNAs के किसी भी व्यक्त नहीं करते बदल नहीं है। हालांकि, कच्चे 264.7 मैक्रोफेज, जो microRNA-125 के मध्यवर्ती स्तर और microRNA-14 के उच्च स्तर को अभिव्यक्त में2, वायरस इसी प्रतिक्रिया तत्वों एन्कोडिंग हिचकते प्रतिकृति कैनेटीक्स कि microRNA के स्तर व्यक्त के साथ संबद्ध प्रदर्शित करते हैं। चित्रा 5 में डेटा Mengovirus tropism की microRNA आधारित विनियमन की विशिष्टता से पता चलता है। H1-हेला कोशिकाओं में प्रत्येक व्यक्ति microRNA की overexpression विशेष प्रचार (कम वायरस titers) और Mengovirus की cytotoxicity (बढ़ा सेल व्यवहार्यता) आत्मीय microRNA प्रतिक्रिया तत्व एन्कोडिंग को रोकता है।

    आकृति 1
    चित्रा 1: वायरल tropism की microRNA आधारित विनियमन की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। MicroRNA प्रतिक्रिया तत्वों (आरई) एक वायरल जीनोम में शामिल विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के भीतर समृद्ध आत्मीय microRNAs द्वारा मान्यता प्राप्त है और वायरल टेप / जीनोम की लक्षित गिरावट में परिणाम होगा। यह कर पाएगा वायरस प्रतिकृति, फैला है और वें विषाक्तताई कोशिकाओं के आसपास। हालांकि, वायरल प्रतिकृति कोशिकाओं है कि वायरस प्रचार, प्रसार और कोशिका मृत्यु के लिए अनुमति आत्मीय microRNAs व्यक्त नहीं करते में बनाए रखा जाएगा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    चित्रा 2: MicroRNA प्रतिक्रिया तत्व डिजाइन। (ए) सफल लक्षित कर रहे हैं के बीज अनुक्रम क्षेत्र पूरी तरह से पूरक होना चाहिए। आरई वायरल जीनोम ऐसी है कि यह mRNA टेप और / या वायरल जीनोम में आत्मीय परिपक्व microRNA द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता भीतर उन्मुख होना चाहिए। रेस के बहुमत टेप के 3 'UTR के भीतर रखा जाता है। (बी) अच्छी तरह से डिजाइन और annealed ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स मिलकर युक्त आर ई एन्कोडिंग का चित्रणmicroRNA लक्ष्य दृश्यों (MIRT) XhoI प्रतिबंध एंजाइम साइट के ऊपर न्यूक्लियोटाइड से घिरे को दोहराता है। जब मिलकर दोहराने आर ई डिजाइनिंग, प्रत्येक microRNA लक्ष्य नकल के बीच स्पेसर न्यूक्लियोटाइड (आम तौर पर 4-6) को शामिल कर लें। (सी) प्लास्मिड डीएनए एक फिर 3 'UTR, एक T7 प्रमोटर में शामिल किया है, और इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए linearization के लिए एक अनूठा प्रतिबंध साइट के साथ एक पूर्ण लंबाई वायरल जीनोम एन्कोडिंग। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    चित्रा 3: जीनोम एन्कोडिंग शाही सेना टेप से वायरस का बचाव। इन विट्रो लिखित picornavirus जीनोम एन्कोडिंग प्रतिलेख अखंडता का मूल्यांकन करने के RNAs के (ए) आरएनए जेल वैद्युतकणसंचलन। गली 1: शाही सेना सीढ़ी। लेन 2: ठीक से उच्च अखंडता के साथ शाही सेना लिखित। लेन 3: मध्यम ईमानदारी के साथ शाही सेना टेप। उच्च बैंड सही आकार और कम बैंड संभवतः एक गिरावट उत्पाद या किसी अवांछित शाही सेना प्रतिलेख है। लेन 4: अनुचित लिखित आरएनए। लेन 5: कम अखंडता आरएनए। इन विट्रो लिखित शाही सेना के 500 एनजी प्रति अच्छी तरह से भरी हुई थी। अनुचित प्रतिलेखन या गिरावट उत्पादों कम शुद्धता या अधूरे linearized डीएनए के उपयोग के कारण होने की संभावना है। (बी) के नकली ट्रांसफ़ेक्ट H1-हेला कोशिकाओं और कोशिकाओं Mengovirus एन्कोडिंग शाही सेना टेप के साथ ट्रांसफ़ेक्ट की छवि। अभिकर्मक अभिकर्मकों केवल (नकली) का प्रशासन सेल व्यवहार्यता ताजा कोशिकाओं पर अभिकर्मक के रूप में अच्छी तरह से पारित होने के बाद बनाए रखना होगा। एक Mengovirus जीनोम एन्कोडिंग शाही सेना टेप (वीएमसी 24) cytopathic प्रभाव में परिणाम बनाए रखा जो ताजा H1-हेला कोशिकाओं पर तैरनेवाला और पारित होने के छानने का काम कर रहे हैं निम्नलिखित के अभिकर्मक। स्केल बार = 100 माइक्रोन।ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    चित्रा 4: उपस्थिति या आत्मीय microRNAs के अभाव में असंशोधित और microRNA-लक्षित Mengoviruses के विकास कैनेटीक्स। संदर्भ 17 से संशोधित। (ए) H1-हेला कोशिकाओं मीर 124, -125, या -142 व्यक्त नहीं करते। तीनों Mengovirus एन्कोडिंग microRNA आर ई समान असंशोधित वायरस के रूप में कैनेटीक्स (वीएमसी 24) इस स्थान (5 'UTR) पर microRNAs की कि प्रविष्टि संकेत के साथ दोहराने वायरस प्रतिकृति को बदल नहीं है। (बी) रॉ 264.7 मैक्रोफेज मीर 125B और मीर 142-3p के उच्च स्तर के मध्यवर्ती स्तर व्यक्त, लेकिन मीर 124 व्यक्त नहीं करते। वायरस एटीटी में जीनोम परिणामों में इसी microRNA लक्ष्य दृश्यों का समावेशenuation microRNA अभिव्यक्ति के स्तर के अनुरूप है। डेटा मतलब वायरल titers के रूप में एसडी प्रतिनिधित्व किया है +/-। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 5
    चित्रा 5: microRNA-लक्ष्य विशिष्टता सिंथेटिक microRNA mimics का उपयोग करने का विश्लेषण। संदर्भ 17 से संशोधित। H1-हेला कोशिकाओं व्यक्ति microRNA mimics के साथ ट्रांसफ़ेक्ट 0.2 के MOI पर असंशोधित वायरस (वीएमसी 24) या microRNA-लक्षित वायरस (MIRT-वीएमसी 24) से संक्रमित थे। (ए) सेल व्यवहार्यता नकली इलाज कोशिकाओं के लिए सामान्यीकृत MTT सेल प्रसार परख के माध्यम से 24 घंटा के बाद संक्रमण पर निर्धारित किया गया था। (बी) के सभी नमूनों की सतह पर तैरनेवाला में वायरस अनुमापांक भी 24 घंटा के बाद संक्रमण पर निर्धारित किया गया था।डेटा मतलब व्यवहार्यता या वायरल अनुमापांक +/- एसडी के रूप में प्रतिनिधित्व किया है। दो पूंछ unpaired छात्र टी (असमान प्रसरण के लिए) वेल्च के सुधार के साथ परीक्षण सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया। एक पी मूल्य <0.01 महत्वपूर्ण माना जाता था। (**, पी <0.01, ***, पी <0.001)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    Discussion

    डिजाइन, रचना और वायरल जीनोम के भीतर microRNA प्रतिक्रिया तत्वों के स्थानीयकरण को निशाना प्रभावकारिता और विशिष्टता हुक्म चलाना होगा। इन अनुकूलन परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता होगी। हालांकि, आरएनए संरचनात्मक विश्लेषण और न्यूनतम अनुकूलन 10, 11, 12, 13, 38 के साथ वायरल प्रतिकृति और इस तकनीक के कार्यान्वयन में microRNA हस्ताक्षर एड्स के पिछले अध्ययनों के आधार पर तर्कसंगत डिजाइन।

    जब रेस के डिजाइन की शुरुआत, जांचकर्ताओं microRNAs है कि ब्याज का लक्ष्य कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं का एक सेट के संकलन से शुरू करना चाहिए, ब्याज की गैर लक्ष्य कोशिकाओं में कम हो रहे हैं, और यह कि प्रयोगात्मक मान्य किया गया है। इस संकलन के बाद, कई भविष्यवाणी के आधार पर विश्लेषण प्रतिस्पर्धा microRNA-targe की संभावना को संबोधित करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिएटी बातचीत। कई वायरस microRNAs या गैर-कोडिंग RNAs कि आदेश में वायरल और मेजबान जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने में सेलुलर microRNAs पृथक सांकेतिक शब्दों में बदलना। इसके अलावा, कई आरएनए वायरस के क्रम में उनकी प्रतिकृति क्षमता 39, 40 को बढ़ाने के लिए सेलुलर microRNAs के साथ बातचीत करने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, जब आर ई डिजाइनिंग, जांच करने के लिए कि क्या वहाँ सेलुलर microRNAs के साथ वायरस की बातचीत में जाना जाता है या अगर वे वायरल microRNAs कि संभावित चुना microRNA लक्ष्य को पहचान या चुना microRNA की अंतर्जात अभिव्यक्ति को बदल सकता है अभिव्यक्त सुनिश्चित हो। साहित्य की खोजों के अलावा, पाठक ऑनलाइन जैव सूचना विज्ञान भविष्यवाणी उपकरण और डेटाबेस है कि रेस के तर्कसंगत डिजाइन में सहायता करने के लिए वायरल microRNA लक्ष्य जानकारी शामिल करने पर विचार करना चाहिए। ऐसे डेटाबेस और भविष्यवाणी उपकरण भी लक्ष्य दृश्यों कि कई microRNAs या ओवरलैपिंग बीज दृश्यों पूर्व से पहचाना जा सकता है की पहचान की सुविधा कर सकते हैं वायरल जीनोम के भीतर भेज दिया। और microRNA लक्ष्यों की पहचान करने के तरीकों के पेशेवरों और ऑनलाइन भविष्यवाणी उपकरणों में से कुछ के विपक्ष पर एक और अधिक में गहराई से चर्चा के लिए पाठक संदर्भों 41, 42 के लिए जाना जाता है। यह सिफारिश की है कि इन उपकरणों भविष्यवाणी की सेवा ही मार्गदर्शक के रूप में कई बार के रूप में भविष्यवाणी झूठी सकारात्मक या नकारात्मक उपज कर सकते हैं। यह अंत करने के लिए, वहाँ बीज दृश्यों कि ओवरलैप करते हैं, हालांकि microRNA के 3 'अंत भी निशाना बना दक्षता को प्रभावित करती है हो सकता है। एक नियम के सेट के भी कड़े का प्रयोग कभी कभी हानिकारक हो सकता है।

    एक बार जब संभावित microRNA लक्ष्यों का एक सेट पहचान की गई है, अन्वेषक रैंकिंग लक्ष्यों microRNAs और आरएनए संरचनात्मक भविष्यवाणियों 10, 11, 12, 13 के जैविक गुणों पर आधारित द्वारा जारी रखना चाहिए,एफई "> 38। लक्षित कोशिकाओं में परिपक्व microRNA और एक आर्गोनॉट प्रोटीन जीन मुंह बंद करने की डिग्री को निर्देशित करेंगे के सहयोग के अपने स्तर का पूर्ण बहुतायत है। कई अध्ययनों से दिखा दिया है कि केवल बहुतायत से व्यक्त microRNAs काफी जीन अभिव्यक्ति 16, 43 को विनियमित होगा, 44। इसके अलावा, जबकि कुछ microRNAs बहुतायत आर्गोनॉट प्रोटीन और RISC के गठन के साथ उनकी बातचीत में व्यक्त कर रहे अनुवाद 44 को दबाने के लिए अपर्याप्त है। मान्य समारोह के साथ एक अत्यधिक प्रचुर मात्रा में microRNA का उपयोग करना भी लक्ष्य सेल और बाद बंद में microRNA संतृप्ति के लिए क्षमता को कम कर देंगे लक्ष्य विषाक्तता। एक अलग दृष्टिकोण आर ई है कि कई miRNAs 45, 46 से लक्षित कर रहे हैं, जो जबकि अभी भी बंद लक्ष्य toxiciti के लिए क्षमता को कम करने के लिए एक कम प्रतिलिपि संख्या के लिए अनुमति दे सकता है का उपयोग करने के लिए हो सकता हैतों। microRNA करने के लिए लक्ष्य mRNA के अनुपात से भी इस दृष्टिकोण की सफलता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ेगा। MicroRNA अनुपात करने के लिए एक उच्च लक्ष्य दमन 42, 43, 47, 48 का स्तर कम हो जाएगा। यह विशेष रूप से वायरस है कि तेजी से दोहराने जब अगर अनुचित तरीके से संक्रमण के दौरान जल्दी विनियमित अंतर्जात microRNAs के नियंत्रण से परे स्तर तक जमा करेंगे साथ महत्वपूर्ण है। ऐसा नहीं है जब लक्षित करने के लिए एक microRNA चुनने के इन गुणों पर विचार करने के लिए आवश्यक है, आदर्श रूप में, एक microRNA जिसका समारोह प्रयोगात्मक मान्य किया गया है का उपयोग कर।

    लक्षित जीन मुंह बंद करने की दक्षता भी परिपक्व microRNA करने के लिए लक्ष्य का प्रतिशत पूरकता के रूप में अच्छी तरह के रूप में सम्मिलित microRNA लक्ष्य दृश्यों की प्रतियों की संख्या से प्रभावित है। microRNA (न्यूक्लियोटाइड 2-8) के 5 'क्षेत्र बीज अनुक्रम का गठन किया। यह आम तौर पर स्वीकार किया जाता हैकि इस क्षेत्र में सफल लक्ष्य-निर्धारण 48, 49 के लिए पूरी तरह से पूरक होना चाहिए। क्योंकि यह प्रतिलेख के endonucleolytic दरार और microRNA के तेजी से रीसाइक्लिंग को बढ़ावा देने के द्वारा जीन मुंह बंद गतिविधि में वृद्धि कर सकते हैं अध्ययन के बहुमत सही पूरकता के साथ प्रतिक्रिया तत्वों का उपयोग करें। जब एक microRNA एक आर्गोनॉट प्रोटीन endonucleolytic गतिविधि है, जो स्तनधारी कोशिकाओं में आर्गोनॉट -2 के लिए प्रतिबंधित है साथ सूचना का आदान यह endonucleolytic दरार केवल तब होता है। अन्य आर्गोनॉट प्रोटीन deadenylation और प्रतिलेख के exonucleolytic हमले से mRNA गिरावट को बढ़ावा देने के। पाठक microRNA जीवजनन और समारोह की एक में गहराई से विवरण के लिए संदर्भ 4, 5, 13, 50, 51, 52 के लिए जाना जाता है। यह आम तौर पर उस incr सोचा हैनकल संख्या सहजता आगे को निशाना बनाने की दक्षता में वृद्धि होगी। बहरहाल, यह भी microRNA संतृप्ति शक्ति प्रदान कर सकते हैं और हमेशा अधिक प्रभावी नहीं साबित कर दी है। यह कभी कभी बेहतर लक्ष्य कोशिकाओं में समृद्ध कई अलग अलग microRNAs के लिए लक्ष्य दृश्यों को शामिल करने या लक्ष्य दृश्यों कि कई microRNAs द्वारा मान्यता प्राप्त हैं का उपयोग करने के लिए है। प्रतिलिपि आवश्यक संख्या में भी प्रतिलेख की राशि और लक्ष्य कोशिकाओं में microRNA के रिश्तेदार बहुतायत है कि मुंह बंद करने की आवश्यकता होगी पर अत्यधिक निर्भर है। देखिए कि जल्दी जमा करेंगे उन्हें microRNA स्तरों outcompeting से रोकने के लिए और अधिक प्रतियां आवश्यकता हो सकती है। प्रयोगात्मक प्रत्येक microRNA लक्ष्य है कि पर्याप्त लक्ष्य-निर्धारण में परिणाम के लिए इष्टतम प्रतिलिपि संख्या का निर्धारण करने, वायरल फिटनेस को बनाए रखता है, और है कि कम से कम भागने म्यूटेशन की दर की सिफारिश की है।

    वायरल जीनोम के भीतर microRNA प्रतिक्रिया तत्व का स्थानीयकरण अत्यंत महत्वपूर्ण है। एक नकारात्मक परिणाम का विश्लेषण करने के लिए जबको निशाना दक्षता हमेशा मतलब यह नहीं है वायरस microRNA-लक्षित नहीं हो सकता। यह बस मतलब हो सकता है लक्ष्य उस स्थान में सुलभ नहीं है या लक्षित जीन के उस दमन pathogenicity को बाधित करने के लिए पर्याप्त नहीं है। प्रतिक्रिया तत्वों के बहुमत को निशाना बनाया प्रतिलेख के 3 'ग़ैर-अनुवादित क्षेत्रों (UTR) में डाला जाता है। हालांकि, वायरल जीनोम की सफल लक्ष्य-निर्धारण पूरा किया गया है और कभी-कभी दर्शाती आनुवंशिक स्थिरता बढ़ाया जब प्रतिक्रिया तत्वों 5 'UTR में या आवश्यक जीन 38 की कोडिंग क्षेत्रों के भीतर डाला जाता है। इष्टतम प्रविष्टि साइटों microRNA करने के लिए लक्ष्य अनुक्रम के उच्च पहुंच की अनुमति देगा। पहुँच आरएनए माध्यमिक संरचनाओं और stoichiometric हस्तक्षेप द्वारा बाधा जा सकता है। इसलिए, असंरचित क्षेत्रों में स्थानीयकृत प्रतिक्रिया तत्वों है कि अत्यधिक संरक्षित कर रहे हैं एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। दृश्यों डाला जा रहा है भी प्रभावित कर सकते हैं और आसपास के दृश्यों से प्रभावित हो। टीहुसैन, एक microRNA लक्ष्य अनुक्रम के लिए एक इष्टतम स्थान अन्य प्रतिक्रिया तत्वों के लिए जरूरी इष्टतम नहीं है। जबकि प्रायोगिक सत्यापन और आरई स्थानीयकरण के अनुकूलन के लिए आवश्यक है, भविष्यवाणी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर (जैसे http://unafold.rna.albany.edu/; http://rna.urmc.rochester.edu/software.html) संभावित डालने साइट्स स्क्रीन करने के लिए आसपास के शाही सेना संरचनाओं की गड़बड़ी के लिए अत्यधिक, 54, 53 की सिफारिश की है।

    उच्च अखंडता की साफ न्यूक्लिक एसिड की तैयारियों का उपयोग भी सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। सड़न रोकनेवाला तकनीक और एक RNase मुक्त वातावरण के रखरखाव जब शाही सेना टेप या microRNA mimics से निपटने के लिए आवश्यक है। सबसे अच्छा परिणाम शाही सेना टेप के लिए, microRNA mimics, और अंतिम titrated वायरस शेयरों छोटे aliquots में डिग्री सेल्सियस -80 में संग्रहित किया जाना चाहिए दोहराया ठंड और विगलन आरएनए गिरावट और वायरस संक्रामकता के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप से बचने के लिए। जब उपयोग में, इन अभिकर्मकसब समय पर बर्फ पर रखा जाना चाहिए।

    यह ध्यान रखें कि कई microRNAs microRNAs का हिस्सा है कि पूरकता के एक परिवार के सदस्य हैं महत्वपूर्ण है। इसलिए जब यह अध्ययन करने को लक्षित विशिष्टता मूल्यांकन में सुधार के लिए तत्काल microRNA परिवार के सदस्यों को शामिल करने के लिए फायदेमंद हो सकता है। यह महत्वपूर्ण है जब कोशिकाओं के भीतर जो वायरस प्रतिकृति वांछित है, परिवार (जैसे मीर Let7 परिवार) के सदस्यों को व्यक्त हो जाता है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि विशिष्टता microRNA mimics का उपयोग परख एक कृत्रिम प्रणाली है और अधिक अभिव्यक्ति कुछ कोशिकाओं में एक microRNA के बंद लक्ष्य प्रभाव 55 में परिणाम हो सकता है। यदि ऐसा होता है, विशिष्टता भी है कि कोशिकाओं के बजाय microRNA अवरोधकों का उपयोग कर उचित microRNAs व्यक्त करने में मूल्यांकन किया जा सकता है। इस परख को निशाना विशिष्टता microRNAs की physiologically प्रासंगिक स्तरों की उपस्थिति में वायरस अनुमापन और सेल व्यवहार्यता readouts के आधार पर विश्लेषण की अनुमति होगी।

    10, 11, 12, 13 पर वायरस की मध्यस्थता प्रभाव हैं। कई वायरस उच्च उत्परिवर्तन दरों प्रदर्शन और म्यूटेंट से बचने के लिए जल्दी से उत्पन्न हो सकती है। एक से अधिक microRNA के लिए लक्ष्यों सहित एक लक्ष्य अनुक्रम के कई प्रतियां, कई अत्यधिक संरक्षित क्षेत्रों के भीतर लक्ष्य स्थानीयकरण, या एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया इस कम कर सकते हैं सहित अतिरिक्त एंटीवायरल कारकों की उपस्थिति भी शामिल है। इसके अतिरिक्त, एक वायरल जीनोम में विदेशी आनुवंशिक सामग्री की प्रविष्टि अक्सर वायरस के कम प्रतिकृति क्षमता में परिणाम होगा। यदि ऐसा होता है, microRNA लक्ष्य आनुवंशिक रूप से अस्थिर हो और म्यूटेंट से बचने के लिए और अधिक तेजी से पैदा होगा की संभावना है। कई microRNA लक्ष्य प्रतियां सीए का समावेशn भी microRNA लक्ष्यों की recombinatorial हटाने के लिए संभावित वृद्धि हुई है। इसलिए, पर्याप्त लक्ष्य-निर्धारण के लिए आवश्यक न्यूनतम प्रतिलिपि संख्या की प्रयोगात्मक दृढ़ संकल्प आवश्यक है। जीनोम भर में विभिन्न स्थानों में microRNA लक्ष्य प्रतियां लोकलाइजिंग मिलकर दोहराता का उपयोग कर बनाम इस बाधा को दरकिनार करने में सहायता कर सकते हैं। हालांकि, जरूरत लक्ष्य प्रतियां और डालने साइटों की न्यूनतम संख्या है कि वायरस की बदल प्रतिकृति कैनेटीक्स में परिणाम नहीं के साथ इष्टतम आरई विन्यास की पहचान पुनर्संयोजन और लक्ष्य उत्परिवर्तन की दर को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। अगर यह microRNA संतृप्ति में परिणाम एक लक्ष्य अनुक्रम के भी कई प्रतियां का समावेश भी बंद लक्ष्य विषाक्तता के लिए संभावित वृद्धि हो सकती है। MicroRNA की राशि सामान्य सेलुलर प्रोटीन को विनियमित करने अवांछित प्रभाव 55 में परिणाम सकता है के लिए उपलब्ध में एक प्रमुख परिवर्तन। यह अंत करने के लिए, कई वायरस एक सेल 56 के भीतर और यह अगर microRNA पर्यावरण में परिवर्तनलक्षित microRNA भी शामिल है, विनियमन की दक्षता में यदि पर्याप्त वायरस प्रतिकृति बनाए रखा है कम किया जा सकता है। इन चिंताओं के सभी प्रतिक्रिया तत्व संरचना और / या स्थानीयकरण के अनुकूलन के द्वारा और प्रणाली की एक पूरी तरह से समझ निशाना बनाया जा रहा है और इसकी सीमाओं के साथ संबोधित किया जा सकता है।

    अन्य लक्ष्यीकरण विधियों के साथ जुड़े विशिष्ट समस्याओं बंद लक्ष्य वायरस के क्षीणन शामिल हैं, सीमित ले जाने की क्षमता है, और सुरक्षा चिंताओं इंजीनियरिंग वायरस के साथ जुड़े के साथ वायरस में आनुवंशिक लक्ष्यीकरण सामग्री के लिए आकार की कमी कोशिकाओं है कि सामान्य रूप से संक्रमित नहीं कर रहे हैं निशाना बनाने के लिए। MicroRNA-लक्ष्यीकरण वायरस के न्यूनतम संशोधन के साथ वायरल tropism के नियमन के लिए अनुमति देता है। यह एक वायरल जीनोम के भीतर कम से कम जगह की आवश्यकता है और सेलुलर microRNA हस्ताक्षरों की एक विशाल सरणी पर आधारित अनुरूप किया जा सकता है। इस तकनीक को वायरस के लिए नए tropisms परिचय नहीं है और इसलिए किसी भी नई सुरक्षा चिंताओं को पेश नहीं करता। साथ ही, इसविधि एक साथ विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61 के भीतर समृद्ध कई अलग अलग microRNAs के लिए लक्ष्य दृश्यों का उपयोग करके एकाधिक tropisms विनियमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह सभी कोशिकाओं है कि इसी microRNAs व्यक्त नहीं करते और इसलिए बढ़ाया शक्ति के साथ चिकित्सीय वायरस की सुरक्षा में सुधार लाने के लिए एक तंत्र प्रदान कर सकते हैं में वायरस attenuating बिना पूरा किया जा सकता है।

    सेलुलर microRNA मशीनरी का शोषण वायरस के कई अलग अलग वर्गों के tropism को विनियमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल यहाँ विस्तृत बचाव और एक microRNA-लक्षित picornavirus के लक्षण वर्णन के लिए तैयार कर रहे हैं एक 'वायरस प्रतिकृति चक्र और विशिष्ट संवाददाता के अनुसार इसकी वजह हालांकि वे रूपांतरित किया जा सकता है,douts। हालांकि अलग वायरस विशिष्ट बचाव रणनीति है, microRNA लक्ष्य दृश्यों पूरे जीनोम एक भी प्लाज्मिड में या कि वायरस एक डीएनए या आरएनए जीनोम है इनकोडिंग है चाहे वायरल जीनोम में डाला जा सकता है। जब तक उत्पादक कोशिकाओं आत्मीय microRNAs व्यक्त नहीं करते, अनुकूलित microRNA लक्ष्यों वायरस बचाव को बाधित नहीं करना चाहिए। प्रयोगों वायरस विकास कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए और microRNA-लक्ष्य विशिष्टता वायरस नकल का एक भी गोल की लंबाई पर और वायरस प्रतिकृति / विषाक्तता के लिए विशिष्ट readouts (जैसे रिपोर्टर प्रोटीन, cytotoxicity, जीनोम मात्रा का ठहराव के आधार पर एकत्र समय अंक बदलकर संशोधित किया जा सकता है, आदि)। यह ध्यान रखें कि हालांकि इस तकनीक सैद्धांतिक रूप से वायरस के सभी वर्गों के लिए लागू किया जा सकता है, कई कारकों इस विधि की क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, नकारात्मक भावना आरएनए वायरस सीमित एसी के कारण सकारात्मक भावना आरएनए वायरस के रूप में उत्तरदायी होने की संभावना साबित नहीं किया हैmiRNA मशीनरी से 13 जीनोमिक शाही सेना के cessibility। इस प्रकार, वायरस के प्रत्येक वर्ग के जैविक गुणों आरई अनुकूलन पर अतिरिक्त बाधाओं प्रदान करेगा। इन बाधाओं के बावजूद, इस तकनीक वायरल tropism की सुविधा अनुसंधान सुरक्षा, उपयोगिता शामिल है, और वायरस के सभी वर्गों के लिए जैविक प्रक्रियाओं की बुनियादी समझ को निशाना बनाने के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
    Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
    Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
    T4 DNA Ligase System NEB M0202S
    MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
    MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
    0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
    5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
    Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
    Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
    TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
    TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
    0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
    2 ml Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
    Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
    MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
    MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
    Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
    pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.

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    इम्यूनोलॉजी अंक 120 microRNA microRNA-लक्ष्यीकरण picornavirus oncolytic tropism वायरस cytotoxicity प्रतिकृति जीन अभिव्यक्ति
    Picornavirus 【tropism की MicroRNA आधारित विनियमन
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    Ruiz, A. J., Russell, S. J.… More

    Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (120), e55033, doi:10.3791/55033 (2017).

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