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Immunology and Infection

Regulamento baseada MicroRNA de Picornavirus tropismo

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/55033
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic College of Medicine

Introduction

O desenvolvimento de um método amplamente aplicável, fácil e eficaz para a engenharia de um vector com tropismo restrito proporciona uma grande oportunidade para melhorar a segurança, a compreensão biológica e utilidade terapêutica de vírus. Existem vários mecanismos para atingir tropismo viral incluindo transdução, da transcrição, e as técnicas baseadas em translação. No entanto, estes métodos não são geralmente aplicáveis ​​a todos os sistemas de vectores, pode exigir vias de sinalização defeituosos em células alvo ou exigir a inserção de sequências codificadoras grandes no genoma viral. Além disso, esses métodos podem resultar na atenuação do vírus, o que dificulta significativamente a sua actividade terapêutica e limitando uma visão sobre o sistema não modificado.

MicroRNAs são pequenos (22-25 nucleótidos), RNAs não-codificantes que medeiam o silenciamento de genes em células eucarióticas. função MicroRNAs ligando sequências alvo complementares (elementos de resposta) em RNAs mensageiro (mRNA) resulti ng na desestabilização da transcrição, a degradação ou a repressão de translação. MicroRNAs normalmente ligam-se elementos de resposta com complementaridade parcial e produzir pequenas modificações na expressão do gene 1, 2, 3, 4, 5. Alterações mais significativas na expressão do gene pode ser conseguido aumentando a complementaridade do elemento de resposta a seis. Milhares de microARNs maduros têm sido identificados numa variedade de espécies e muitas exibem padrões de expressão diferenciais em uma variedade de tipos de células e tecidos 7, 8, 9. Estas assinaturas microRNA pode ser explorada para a restrição específica da célula de amplificação do vírus, incorporando elementos de resposta perfeitamente complementares ao genoma viral 10,= "xref"> 11, 12, 13. O objetivo geral desta técnica de metas de microRNA é controlar o tropismo de um genoma vector sem atenuação adicional.

A utilidade deste método para regular o tropismo viral foi inicialmente demonstrada em vectores lentivirais para restringir a expressão do transgene em tecidos específicos, 14, 15, 16. Esta técnica foi subsequentemente aplicada a uma vasta gama de replicar e não replicantes vectores virais para terapia génica aumentada, bem como para melhorar os perfis de segurança de muitos vírus oncolí ticos, eliminando toxicidades indesejadas em tecidos normais 10, 11, 12, 13, 17 . Também tem sido utilizado para gerar e e seguravacinas vivas atenuadas FICAZ, bem como para melhorar o vírus e fabrico de vacinas de processos 18, 19, 20, 21. MicroRNA-alvo de um vector pode permitir a atenuação em hospedeiros vacinados ou sistemas segmentados, mantendo níveis de crescimento do tipo selvagem em sistemas de produtores. MicroRNA-direccionamento podem também ser utilizadas para melhorar a segurança biológica do vírus para fins de investigação, restringindo a transmissão em uma espécie (por exemplo, seres humanos), mantendo a transmissão em outros hospedeiros 22. Finalmente, microRNA-alvo pode permitir análises em profundidade de ciclo de vida viral e papéis específicos de tipos de células em patogênese e imunidade por segregar o crescimento viral 23, 24, 25, 26.

Esta técnica oferece uma alternative método que pode ser facilmente implementada e aplicáveis ​​segmentação para todos os sistemas de vírus. Além disso, a recolha em constante expansão de microARNs maduras, com padrões de expressão diferenciais em tipos específicos de células torna esta técnica altamente versátil. -MicroRNA segmentação baseada provou eficaz para uma variedade de sistemas vírus sem comprometer a função do sistema. As principais limitações desta técnica incluem tentativa e otimização de erro, o potencial para mutações de escape, e potenciais efeitos fora do alvo em transcrições endógenos. No entanto, estas limitações geralmente podem ser superados com design otimizado e racional elemento de resposta. vírus de ARN de sentido positivo tende a ser particularmente sensível a microARN-direccionamento devido à orientação de sentido positivo do seu genoma e a disponibilidade dos transcritos à maquinaria microARN durante o ciclo de replicação completamente citoplasmática. Aqui nós descrevemos um protocolo para gerar um picornavírus alvejado-microRNA eo experimmétodos ental para verificar a eficiência e especificidade de que a segmentação in vitro.

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Protocol

1. Clonagem microARN Elementos de Resposta no genoma viral

  1. Projeto de microRNA inserções de elementos de resposta.
    1. Identificar o microRNA desejado e sua sequência alvo correspondente. Vários bancos de dados estão disponíveis com sequências de microRNA maduros. Recomendado: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30.
  2. Clonar o elemento de resposta ao DNA de plasmídeo que codifica o genoma do vector ou transcrição.
    NOTA: Para dois ou mais elementos de resposta a cópia usando um único local de restrição para a inserção é mais fácil e mais versátil.
    1. Inserir elemento de resposta ou local de restrição único usando extensão emenda sobreposição (SOE) PCR. Este método tem sido descrito em pormenor 31.
    2. Se estiver usando um sítio de restrição para inserção, purperseguir comercialmente sintetizado, purificado sentido ultramers-PAGE e anti-sentido que codificam as sequências de inserção flanqueada pelas sequências de saliência do local de restrição único (Figura 2).
    3. Combine 0,5 ug sentido ultramer, 0,5 ug ultramer anti-sentido, ADN tampão de ligação até uma concentração final de 1x, e levar a 50 ul com H 2 O. emparelhar as ultramers por incubação da reacção a 85 ° C durante 10 min e, em seguida, a redução da temperatura através 0,5 ° C a cada 30 segundos até a reacção atingir 25 ° C.
    4. Combine 0,5 ug de ADN do vector que codifica para o novo local de restrição único, tampão de enzima para uma concentração final de 1x, 1 ul da enzima de restrição adequada, e levar a um volume final de 20 ul com H 2 O. Digest do vector a 37 ° C durante 2 h. Purifica-se o ADN linearizado por purificação em gel de agarose a 32.
    5. Ligar o ultramers recozidos no vector digerido durante a noite a 16 °; C utilizando uma mistura 3: 1 ultramers: proporção molar de vector e técnicas de ligação padrão 33.
      Nota: Quando se utiliza um único sítio de enzima de restrição para inserção que podem ser mais eficientes para desfosforilar as extremidades do vector digerido e fosforilar as extremidades dos oligonucleótidos recozidos.
    6. Transformar o ADN ligado em E. coli utilizando o método do choque térmico 34.
      NOTA: Os plasmídeos que codificam genomas virais são geralmente grandes, por conseguinte, utilizando células competentes optimizadas para absorção de grandes construções de ADN pode aumentar a eficiência de transformação.
    7. Purifica-se DNA de plasmídeo a partir de colónias individuais utilizando um kit de purificação disponível comercialmente 35. Identificar um clone apropriado, com o elemento de resposta microARN na orientação correcta (Figura 2) por sequenciação da região de inserção 36.

2. Resgatando Picornavirus alvejado-microRNA from O DNA de plasmídeo

  1. Picornavírus salvamento microARN-alvo de uma linha celular permissiva para a replicação do vírus que não expressa o microARN cognato (s). Este protocolo utiliza células HeLa-H1 porque não expressam o miR-142, o miR-124, ou o miR-125, no entanto, não é necessária a utilização de células HeLa-H1 para o salvamento.
    ATENÇÃO: Todas as orientações para o manuseio seguro e eliminação de agentes infecciosos devem ser seguidas em conformidade.
    1. Placa células HeLa-H1 em uma placa de 6 poços de tal modo que eles são ~ 80% confluentes no momento da transfecção (24 h após a semeadura). células da placa em 2 mL por poço de DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10%.
    2. Aquecer o reagente de transfecção até à temperatura ambiente. Combinar 250 uL meios isentos de soro, 2,5 ug de plasmídeo de ADN que codifica o genoma segmentado-microARN, e 7,5 mL de reagente de transfecção em um tubo de microcentrífuga estéril e pipeta cuidadosamente para misturar. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 15-30 min.
    3. Aspirar omídia das células plaqueadas e adicionar 2 mL de meio completo fresco.
    4. Adicionar toda a mistura de transfecção a partir do passo 2.1.2 para um poço da gota a gota, de 6 poços da placa. Adicionar cada gota para uma área diferente do poço.
    5. Incubar as células a 37 ° C até que os efeitos citopáticos (CPE) ou proteínas repórter são detectáveis ​​(~ 24-72 h).
  2. Colheita e passagem do vírus resgatado em células frescas.
    1. células placa numa placa de 6 poços de tal modo que eles são de 80-90% confluentes no momento da infecção (24 horas após sementeira).
      NOTA: Escala para cima ou para baixo, dependendo da quantidade de vírus necessária para todas as experiências subsequentes.
    2. Colheita cada salvamento bem por raspagem das células para o sobrenadante utilizando um raspador de células de borracha ou polícia de borracha. Suavemente arrastar o raspador através da parte inferior do poço. Transferir as células e o sobrenadante para um tubo de armazenamento criogénico.
    3. Congelar / descongelar as amostras duas vezes e, em seguida, sedimentar os detritos celulares porcentrifugação a 1200 xg durante 5 min a 4 ° C.
    4. Filtra-se o sobrenadante clarificado duas vezes usando filtros de seringa de 0,2 um. O sobrenadante salvamento filtrado contém o vírus.
      NOTA: filtro de tamanho de poro pode variar dependendo do tamanho de partículas de vírus e pode não ser aplicável a grandes vírus.
    5. Aspirar os meios de comunicação a partir de células plaqueadas, lavar uma vez com meio isento de soro e adicionar 1 ml de meio isento de soro fresco a cada poço.
    6. Adicionar 50 ul por poço de sobrenadante de resgate filtrada e agite levemente a placa para distribuir uniformemente vírus.
    7. Incubar a placa a 37 ° C durante 2 h e, em seguida, meios de aspirado de cada poço para remover vírus não incorporada.
    8. Adicionar 1,5-2 ml de meio fresco completo por poço e incubar a 37 ° C até CPE ou proteínas repórter são aparentes (~ 24-48 h).
    9. Repita os passos 2.2.2 a 2.2.4. Filtrada sobrenadante recuperação contém estoque de vírus. stocks de vírus loja em alíquotas de uso único em tubos de armazenamento criogénico a -80 °C.

3. Resgatando Virus-alvejado microRNA de ARN transcrito in vitro Transcrições

  1. Gerar transcritos de ARN a partir de ADN plasmídeo codificando o genoma viral alvo microRNA utilizando um promotor a montante.
    NOTA: Métodos padrão para a geração e manutenção de um ambiente livre de nuclease deve ser utilizado para todos os passos subsequentes.
  2. Linearizar o ADN de plasmídeo utilizando um local de enzima de restrição a jusante do transcrito. Combinar DNA de plasmídeo de 5 ug, tampão de enzima concentração final de 1x, ul da enzima de restrição 3 e levar a 50 ul com H 2 O. Incubar a reacção a 37 ° C durante 3 h.
  3. Adicionar 1/20 volume de EDTA 0,5 M, 1/10 volume de 5 M de NH 4 etilo, e 2 volumes de etanol a 100% para a reacção digerido e misturar. Incubar a -20 ° C durante 1 hora até durante a noite.
  4. Sedimentar o ADN precipitado durante 10 minutos a 17000 xg, a 4 ° C. Decantar a supernatant, ressuspender o sedimento em 500 mL de etanol frio a 70% e sedimentar o ADN por centrifugação a 17000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  5. Decantar o sobrenadante e centrifuga-se de novo durante 30 seg. Remover o sobrenadante residual com uma pipeta e ar-secar o sedimento. Ressuspender o sedimento de DNA em H estéril livre de nuclease 2 O a uma concentração de 0,5-1 ug / mL.
  6. Descongelar in vitro reagentes de transcrição à temperatura ambiente e coloque os ribonucleotídeos no gelo (enzimas em glicerol não congelar e devem ir diretamente em gelo). Manter o tampão de reacção à temperatura ambiente.
  7. Montar a reacção de transcrição em um tubo de PCR através da combinação de 2 mL cada de ATP, CTP, GTP, e soluções UTP, 2 ul de tampão 10X de reacção, 1 ug de ADN linearizado, 2 de enzima ul, e trazer para um volume final de 20 ul com nuclease H 2 O. -livre
  8. Incubar a reacção a 37 ° C durante 2 h.
  9. Purifica-se os transcritos de ARN.
  10. Trazer a reacção de transcrição para 100 mL com a solução de eluição (não-pré-aquecido). Adicionar 350 uL de solução de ligação concentrado e 250 mL de etanol a 100% a reacção e misturar.
  11. Transferir a amostra para um filtro de cartucho inserido um tubo de recolha e centrifugação durante 1 min a 12.000 x g. Descartar o fluxo de passagem.
  12. Adicionar 500 uL de solução de lavagem para o filtro de cartucho e centrifugar durante 1 min a 12.000 x g. Descartar flow-through. Repita este passo de lavagem mais uma vez. Descartar flow-through. Centrifugar durante 1 minuto a 12,0000 xg para remover o etanol residual.
  13. Transferir o cartucho de filtro a um tubo de recolha limpo e adicionar 50 uL da solução de eluição pré-aquecido para o cartucho de filtro. Centrifugar durante 1 min a 12.000 x g. Repetir esta etapa de eluição para um volume total de 100 ul de cont eluenteaining transcritos de ARN purificados. Descarte o filtro de cartucho.
  • Determinar a concentração de ARN do eluente através da medição da absorvância da amostra a 260 e 280 nm e usando a Lei de Beer-Lambert.
  • Avaliar a integridade do ARN utilizando electroforese em gel de ARN 37. Veja a Figura 3 para exemplos de boas e más integridade do RNA. ARN deveria ser dividido em alíquotas em tubos de utilização única e armazenado a -80 ° C para manter a integridade.
  • reagentes de transfecção aquecer a temperatura ambiente. Combinar 250 ul de meios isentos de soro, 2,5 g de transcritos de ARN purificados, 5 mL de solução de impulso, e 5 mL de reagente de transfecção em um tubo de microcentrífuga estéril e pipeta cuidadosamente para misturar. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 2-5 minutos.
  • Placa células HeLa-H1 em uma placa de 6 poços de tal modo que eles são ~ 80% confluentes no momento da transfecção (24 h após a semeadura). células da placa em 2 mL por poço de DMEM suplementado com 10% FETsoro bovino ai.
  • Aspirar a mídia a partir das células plaqueadas e adicionar 2 ml de meio completo fresco.
  • Adicionar toda a mistura de transfecção a partir do passo 3.12 a um poço da gota a gota, de 6 poços da placa. Adicionar cada gota para uma área diferente do poço.
  • Incubar as células a 37 ° C até que os efeitos citopáticos (CPE) ou proteínas repórter são detectáveis ​​(~ 24-72 h).
  • Continuar salvamento de virus em causa microRNA como descrito nas etapas 2.2 a 2.2.9.

    • 4. A titulação stocks de vírus por meio do cálculo de 50% da cultura de tecidos Dose Infecciosa (TCID 50)

    1. As células HeLa-H1 placa numa placa de 96 poços a 4 10 células por poço em DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10%. Incubar as células a 37 ° C durante a noite.
      NOTA: Titular vírus em células permissivas para a replicação do vírus que não expressam microRNAs cognatos.
    2. Adicione 10 diluições em série de vírus em cada uma um volume total de 1 mL de isento de soromeios de comunicação.
      NOTA: Use diluições mais baixas se mais precisão é necessária.
      NOTA: Alterar dicas após cada diluição para evitar a superestimação do título como o vírus pode ficar com dicas.
    3. Dica placa de 96 poços para o lado e aspirado de mídia a partir de células HeLa banhados. Adicionar 100 uL de cada diluição do vírus por poço a 8 poços da placa de 96 poços (uma linha por diluição). Adicionar 100 uL de meio isento de soro sem vírus a linha 1 e linha 12 na placa para os controlos.
      NOTA: Sempre aspirado e adicionar mídia para poços tocando ponta para o lado do poço para evitar a separação celular.
    4. Incubar a placa a 37 ° C durante 2 h. placa ponta para o lado e aspirar a mídia dos poços.
      NOTA: Alterar dicas entre cada fila de diluição.
    5. Adicionar 100 ul de meio completo a cada poço. Incubar a placa a 37 ° C durante 72 h.
    6. Visualizar os poços sob um microscópio e marcar cada poço positivo ou negativo para CPE.
    7. Calcular cada título do vírus com a seguinte equação: Lo10 g (TCID50 / ml) = L + D (S-0.5) + 10 log (1 / V). L é o logaritmo negativo 10 da diluição de vírus mais concentrada testada em que todas as cavidades são positivas. D é o log 10 do factor de diluição. S é a soma das proporções individuais (PI). PI é a proporção calculada de um indivíduo de diluição (quantidade de cavidades positivas / quantidade total de poços por diluição. V é o volume de inoculo (ml / poço).

    tabela 1
    Tabela 1: A quantificação de partículas de vírus infecciosas por meio do cálculo do TCID50. Os resultados representativos de células infectadas com uma série de diluições de dez vezes de um stock de virus. "L" é igual a 4, porque a última diluição, onde todas as cavidades são positivas para CPE é 10 -4. "D" é o log 10 de diluições 10 desde 10 vezesforam usadas e é portanto igual a 1. "S" representa a soma das proporções individuais. Neste exemplo, as proporções individuais são 1,0, 0,875, 0,375, 0,125, e 0. A soma destes (S) é 2,375. "V" é o volume de inoculo, em ml, utilizados para infectar as células inicialmente.

    5. avaliar a eficácia de metas de microRNA: Kinetics de uma etapa de crescimento

    1. Controles para este ensaio incluem células falsamente infectadas, o vírus não modificado e vírus contendo um elemento de resposta não-alvo ou não-funcional.
    2. Placa de células HeLa-H1 para uma experiência ao longo do tempo em 12 placas de cultura de tecido de tal modo que eles são de 80-90% confluentes no momento da infecção (24 horas após sementeira). células da placa em DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10% a 1 mL por poço.
      NOTA: Recomenda ao prato um prato separado para cada ponto de tempo. Este protocolo utiliza 7 pontos de tempo diferentes para um vírus com um ciclo de replicação 8-12 h. As células HeLa não-H1 são necessários para executar esta umassay. Este ensaio deve ser realizado em células permissivas que não expressam as microARNs segmentados. Este ensaio também pode ser realizado em células que expressam os microARNs cognatos para avaliar a cinética de crescimento sob pressão selectiva.
    3. Aspirar meios de poços. Lavar os poços por adição de 0,5 ml de meio isento de soro, a cada poço, rodar o prato, e meios aspirado dos poços. Adicionar 0,5 ml de meio isento de soro fresco a cada poço.
    4. Infect cada poço a uma elevada multiplicidade de infecção (MOI; número de partículas infecciosas por célula) para assegurar que todas as células são infectadas. Esse protocolo utiliza uma MOI de 3.
      1. Diluir stocks de vírus em meio isento de soro para uma concentração de MOI = 3 por 100 mL. Adiciona-se 100 ul de diluição de vírus de cada para sete diferentes poços e incuba-se a 37 ° C durante 2 h.
      2. Aspirar a mídia de todos os poços e lavar duas vezes por adição de 0,5 mL de mídia completo por poço, balançando suavemente e depois aspirar.
    5. Adicionar 1 ml de cmeios omplete a cada poço e incubar a 37 ° C até que ponto de tempo desejado.
    6. Coleta de amostras para titulação do vírus a nível de pós-infecção 2, 4, 6, 8, 10, 24 e 48 h (1 poço por ponto de tempo). Transferir 700 mL da mídia no poço para um tubo de armazenamento criogénico. Raspar as células para o sobrenadante remanescente, movendo suavemente um raspador de borracha ao longo de todo o poço. Transferir a mistura de células / sobrenadante para o tubo de armazenamento criogénico correspondente contendo 700 uL de sobrenadante.
      NOTA: Certifique-se para não espirrar sobrenadante de um poço para outro durante a raspagem resultando em amostras contaminadas. Transferir 700 mL antes da raspagem irá minimizar salpicos.
    7. Colocar as amostras a -80 ° C até que todas as amostras são recolhidas.
    8. Congelamento / descongelamento as amostras três vezes e remover os detritos celulares por centrifugação das amostras a 1200 xg durante 5 min a 4 ° C.
    9. Titular o vírus tal como descrito no ponto 4, e comparar cinética de crescimento ao longo do time.

    6. Avaliação da Especificidade de metas de microRNA: Mimics microRNA Synthetic Virus-se espalhando ensaio utilizando

    NOTA: O uso de um mímico microRNA sintética é realizada para mostrar especificidade do microRNA: interação microRNA-alvo.

    1. Incluem transfecção simulada, microRNA controlo negativo imitar e microRNA experimentais imitar só controla para cada ensaio para avaliar a toxicidade mediada por microRNA. É também ideal para incluir um controlo positivo (por exemplo, gene alvo-microARN ou genoma) de baixa eficiência de transfecção imita microRNA pode resultar em falsos negativos.
    2. As células HeLa-H1 placa numa placa de cultura de tecidos de 96 poços de modo a que eles são de 80-90% confluentes no momento da transfecção (24 h após a inoculação). células da placa em DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino a 0,1 mL por poço.
      NOTA: Executar este ensaio em células permissivas para a replicação viral que não expressam os microRNAs cognatos.
    3. th quentetransfecção reagentes e à temperatura ambiente. Combine media 9 ul isentos de soro, 200 nM concentração final por poço de estoque mímica microRNA, 0,18 mL impulso de reagentes, reagentes de transfecção 0,18 mL e misturar. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 2-5 minutos.
      NOTA: Os volumes indicados são por bem. Recomenda-se que uma mistura principal para ser montada transfecção de todos os poços, para manter a consistência e minimizar erros de pipetagem. A concentração óptima de microARN mímico irá variar. Consultar as instruções do fabricante que acompanha a imitar microARN para uma concentração de partida razoável. Esta estará geralmente na gama de 5-200 nM concentrações finais.
    4. Aspirar a mídia dos poços e adicionar 92 ul de meio completo fresco.
      NOTA: Se há um número significativo de amostras, completar este passo antes de montar a solução de transfecção e armazenar a placa a 37 ° C até que esteja pronto.
    5. Adicionar toda a i mistura de transfecçãon passo 6,3 para as células gota a gota.
    6. Incubar a 37 ° C durante 6 h.
    7. Infectar cada poço a uma MOI reduzida para garantir uma baixa percentagem de células são infectadas para permitir a análise da propagação do vírus. Esse protocolo utiliza uma MOI de 0,2.
      1. Diluir stocks de vírus em meio isento de soro para uma concentração de MOI = 0,2 por 100 mL. Remova a mídia dos poços e adicionar 100 mL de diluição do vírus por poço.
      2. Incubar a 37 ° C durante 2 h.
    8. meios aspirado de cada poço e adiciona-se 100 uL de meio completo fresco.
    9. Incubar a 37 ° C durante 20-22 h.
    10. Determinar a titulação do vírus nos sobrenadantes.
      1. Recolhe-se o sobrenadante de cada poço e substituir com 100 ul de meio completo fresco.
        NOTA: Se utilizando células em suspensão, ressuspender o sedimento celular a partir do seguinte passo em 100 ul de meio completo fresco e retornar ao poço de amostra para ensaio de viabilidade.
      2. Remover CelluLar detritos a partir dos sobrenadantes recolhidos por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
      3. Transferir o sobrenadante liberado para um novo tubo e titular vírus infeccioso em células permissivas que não expressam os microRNAs cognatos, como descrito no ponto 4.
        Nota: Mantenha todas as amostras em gelo para evitar a perda de infecciosidade.
    11. Determinar a viabilidade das células.
      1. Adicionam-se 10 ul de MTT (brometo de 3- (4,5-dimetiltiazolil-2) -2,5-difeniltetrazólio) reagente por poço.
      2. Incubar a 37 ° C durante 2-4 h até precipitado púrpura é visível.
      3. Adicionar 100 uL de reagente de detergente.
      4. Incubar à temperatura ambiente no escuro durante 2 h.
      5. Leia a absorvância de todos os poços a 570 nm.
        NOTA: Normalizar todas as amostras para zombar células transfectadas para a comparação de viabilidade celular por cento.

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    Representative Results

    A Tabela 1 representa os resultados típicos de um ensaio de titulação para um picornavírus e descreve a forma de calcular a dose infecciosa de cultura de tecido de 50%. Uma representação esquemática do conceito global de regulação baseada em microARN de tropismo viral descrito neste manuscrito é mostrado na Figura 1. A orientação do elemento de resposta para microARN durante interacções intracelulares, concepção adequada de elemento de resposta de oligonucleótidos para o recozimento e o plasmídeo de inserção, e uma mapa de plasmídeo de ADN que codifica um genoma viral alvo microRNA para a transcrição in vitro é apresentado na Figura 2. a Figura 3 mostra transcritos de ARN em vários graus de integridade visualizadas por electroforese em gel de agarose. manuseio e o uso de DNA templates desprovido de impurezas irão resultar em transcrições de RNA devidamente transcritos como mostrado na pista 3A 2. impurezas residuais dentro do lineaterizada moldes de ADN ou quantidades vestigiais de nuclease pode resultar em níveis baixos de ARN transcrito de forma inadequada e / ou produtos de degradação semelhantes ao observado na pista 3. 3A linearização incompleta do ADN de plasmídeo ou ADN contendo grandes quantidades de impurezas tais como o etanol residual resultará em produtos de transcrição e de degradação impróprias representados nas pistas 3A 4 e 5. a Figura 3 também mostra uma imagem de efeitos citopáticos Mengovirus-mediadas (CPE) após a transfecção de transcritos de RNA limpo. Figura dados representativos 4 exibe de uma experiência ao longo do tempo para avaliar a cinética de crescimento de Mengovirus não modificada e orientada-microRNA. Os resultados mostram que os elementos de resposta microRNA manipulado no genoma Mengovirus não alteram a cinética da replicação do vírus em células HeLa-H1, que não expressam qualquer um dos microARNs cognatos. No entanto, em RAW 264.7 de macrófagos, que expressam níveis intermediários de microRNA-125 e altos níveis de microRNA-142, os vírus que codificam os elementos de resposta correspondentes exibem uma cinética de replicação inibidos que se correlaciona com o grau de microARN expressa. Os dados na Figura 5 mostra a especificidade da regulação baseada em microARN de Mengovirus tropismo. A sobre-expressão de cada indivíduo microRNA em células HeLa-H1 inibe especificamente a propagação (títulos de vírus inferiores) e citotoxicidade (aumento da viabilidade celular) de Mengovirus que codifica o elemento de resposta microARN cognato.

    figura 1
    Figura 1: Representação esquemática de regulação baseado em microRNA de tropismo viral. elementos de resposta MicroRNA (RE) incorporadas num genoma viral será reconhecido por microARNs cognatos enriquecidas dentro de tipos específicos de células e podem resultar na degradação alvo dos transcritos virais / genomas. Esta replicação do vírus irá prevenir, difundir e toxicidade para the células circundantes. No entanto, a replicação virai irá ser mantido em células que não expressam as microARNs cognatos permitindo a propagação de vírus, a propagação e a morte celular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 2
    Figura 2: Projeto elemento de resposta MicroRNA. (A) Para bem sucedida segmentação região de sequência a semente da RE deve ser perfeitamente complementares. O RE devem ser orientados dentro do genoma viral de modo a que pode ser reconhecido pelo cognato madura microARN em transcritos de ARNm e / ou o genoma viral. A maioria dos ERs são colocados dentro de UTR 3 'dos ​​transcritos. (B) Representação de oligonucleotídeos adequadamente projetados e recozidos que codificam REs contendo em tandemrepetições de sequências de microRNA-alvo (Mirt) ladeado pelos nucleotídeos pendendo do sítio da enzima de restrição XhoI. Ao projetar REs repetição em tandem, não se esqueça de incluir nucleótidos espaçador (geralmente 4-6) entre cada cópia microRNA-alvo. (C) O ADN de plasmídeo que codifica um genoma viral de comprimento completo com um RE incorporada no UTR 3 ', um promotor de T7, e um único local de restrição para a linearização para a transcrição in vitro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 3
    Figura 3: Recuperação de vírus a partir de transcritos de ARN que codifica o genoma. Electroforese em gel (A) ARN de ARN transcritos in vitro que codificam genomas picornavírus para avaliar a integridade transcrição. faixa 1: Escada de RNA. Pista 2: correctamente transcritas de ARN com elevada integridade. Pista 3: transcritos de ARN com integridade moderada. banda maior é o tamanho correto e banda inferior é, potencialmente, um produto de degradação ou um RNA transcrito indesejada. Pista 4: ARN transcrito de forma inadequada. Pista 5: ARN baixa integridade. 500 ng de ARN transcrito in vitro foi carregado por poço. produtos de transcrição ou de degradação impróprios são provavelmente devido ao uso de baixa pureza ou de ADN linearizado de forma incompleta. (B) Imagem de células H1-HeLa falsamente transfectadas e células transfectadas com transcritos de ARN que codificam Mengovirus. A administração de reagentes de transfecção única (Mock) vai manter a viabilidade celular após transfecção, bem como a passagem para células frescas. A transfecção de transcritos de ARN que codificam um genoma Mengovirus VMC (24) resulta em efeitos citopáticos, que são mantidos seguintes filtração do sobrenadante e passagem em células HeLa-H1 frescos. Barra de escala = 100 pm.ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 4
    Figura 4: A cinética do crescimento de Mengoviruses não modificados e orientada-microRNA na presença ou ausência de microARNs cognatos. Modificado de referência 17. (A) células HeLa-H1 não expressam o miR-124, -125, ou -142. Todos os três Mengovirus microRNA codificação REs replicar com cinética similar como o vírus não modificado (VMC 24) indicando que a inserção dos microRNAs neste local (5 'UTR) não alteram a replicação do vírus. (B) RAW 264.7 de macrófagos expressam níveis intermediários de miR-125b e altos níveis de miR-142-3p, mas não expressam miR-124. Incorporação das sequências de microRNA-alvo correspondentes no genoma resulta em att vírusenuation consistente com o nível de expressão microARN. Os dados são representados como títulos virais médios +/- SD. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 5
    Figura 5: Análise de especificidade de metas de microRNA usando imita microRNA sintéticos. Modificado de referência 17. Células H1-HeLa transfectadas com imita microRNA individuais foram infectadas com vírus não modificado (VMC 24) ou vírus alvo microRNA (Mirt VMC-24) a uma MOI de 0,2. (A) A viabilidade celular normalizado para células pseudo-tratados foi determinada às 24 h pós-infecção através de ensaio de proliferação celular do MTT. (B) o título de vírus no sobrenadante de todas as amostras foi também determinado às 24 h pós-infecção. oos dados são representados como média viabilidade ou viral título +/- DP. Bicaudal teste t de Student não pareado com correção de Welch (para variâncias desiguais) foram utilizados para análise estatística. Um valor de p <0,01 foi considerado significativo. (**, P <0,01, *** p <0,001). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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    Discussion

    A concepção, a composição e a localização dos elementos de resposta microARN dentro do genoma viral ditará segmentação eficácia e especificidade. Otimizar estes irão exigir tentativa e erro. No entanto, design racional baseada na análise estrutural de RNA e estudos anteriores de replicação viral e microRNA assinaturas auxilia na implementação dessa técnica com otimização mínima 10, 11, 12, 13, 38.

    Ao iniciar o projeto de REs, os investigadores devem começar por compilar um conjunto de microRNAs que são expressos nas células alvo de interesse, são diminuídos nas células não-alvo de interesse, e que foram validadas experimentalmente. Seguindo esta compilação, várias análises baseadas em previsão deve ser conduzida para abordar a possibilidade de competir microRNA-targeinteracções T. Muitos vírus codificam microARNs ou RNAs não-codificantes que sequestram microARNs celulares, de modo a manipular a expressão de genes virais e de acolhimento. Além disso, vários virus de ARN foram mostrados para interagir com microARNs celulares, a fim de melhorar a sua capacidade de replicação 39, 40. Portanto, ao projetar REs, certifique-se de investigar se existe são conhecidas interações do vírus com microRNAs celulares ou se eles expressam microRNAs virais que poderiam reconhecer o alvo microRNA escolhido ou alterar a expressão endógena do microRNA escolhido. Além de pesquisas bibliográficas, o leitor deve considerar on-line ferramentas de previsão bioinformática e bases de dados que incluem informações de destino microRNA viral para auxiliar no desenho racional de REs. Tais bases de dados e instrumentos de previsão também pode facilitar a identificação de sequências alvo que podem ser reconhecidos por várias microARNs ou sequências sobrepostas de sementes pré enviada dentro do genoma viral. Para uma discussão mais aprofundada sobre os métodos de identificação de alvos de microRNA e os prós e contras de algumas das ferramentas de previsão on-line o leitor é remetido para referências 41, 42. Recomenda-se que estas ferramentas de previsão servem apenas como guias tantas vezes previsões podem produzir falsos positivos ou negativos. Para este fim, podem ser sequências de sementes que se sobrepõem, no entanto a extremidade 3 'do microARN também irão influenciar a eficiência de segmentação. Usando demasiado rigoroso de um conjunto de regras às vezes pode ser prejudicial.

    Uma vez que um conjunto de potenciais alvos de microRNA foram identificados, o investigador deve continuar classificando as metas com base nas propriedades biológicas dos microRNAs e previsões estruturais de RNA 10, 11, 12, 13,EF "> 38. A abundância absoluta do microARN madura em células-alvo e o seu nível de associação com uma proteína Argonaute irão ditar o grau de silenciamento do gene. Vários estudos têm demonstrado que microARNs única abundantemente expresso irá regular significativamente a expressão do gene 16, 43, 44. Além disso, enquanto alguns são microARNs abundantemente expressa a sua interacção com proteínas Argonaute e formação de RISC é insuficiente para reprimir tradução 44. Usando um microRNA altamente abundante com função validado também vai minimizar o potencial para a saturação microARN na célula-alvo e subsequente off- toxicidades alvo. uma abordagem diferente pode ser usar REs que são direcionados por vários miRNAs 45, 46, o que poderia permitir a um número de cópia reduzida enquanto ainda minimizando o potencial para toxiciti fora do alvoes. A proporção de ARNm alvo de microARN também terá um impacto significativo no sucesso desta abordagem. Um elevado rácio alvo para microARN irá reduzir o nível de repressão 42, 43, 47, 48. Isto é especialmente crítico com os vírus que se replicam rapidamente quando se indevidamente regulamentada precocemente durante a infecção irá acumular a níveis além do controle dos microRNAs endógenos. É essencial considerar essas propriedades ao escolher um microRNA para a segmentação; idealmente, usando um microRNA cuja função foi validada experimentalmente.

    A eficiência de silenciamento do gene alvo é também afectada pela percentagem de complementaridade do alvo ao microARN madura, bem como o número de cópias de sequências de microARN-alvo inseridos. A região 5 'do microRNA (nucleótidos 2-8) constitui a sequência de semente. É geralmente aceiteque esta região deve ser perfeitamente complementares para a segmentação de sucesso 48, 49. A maioria dos estudos utilizam elementos de resposta com complementaridade perfeita, porque pode aumentar a actividade de gene silenciador, promovendo a clivagem endonucleolítica de transcrição e rápida reciclagem do microARN. Esta clivagem endonucleolítica só ocorre quando um microRNA interage com uma proteína que tem actividade Argonaute endonucleolítica, que em células de mamíferos é restrita a Argonaute-2. Outras proteínas Argonaute promover a degradação do mRNA por deadenylation e ataque exonucleol�ica da transcrição. O leitor é remetido para referências 4, 5, 13, 50, 51, 52 para uma descrição detalhada de microRNA biogênese e função. Ele geralmente é pensado que incrfacilitando o número de cópias irá aumentar ainda mais a eficiência de segmentação. No entanto, isso também pode potenciar a saturação microARN e não tem provado mais eficaz. Por vezes, é melhor para incorporar sequências alvo para vários diferentes microARNs enriquecidas nas células alvo ou a utilização sequências alvo que são reconhecidas por várias microARNs. O número de cópias necessário também é altamente dependente da quantidade de transcrição que necessitam de silenciamento e a abundância relativa do microARN nas células alvo. Os transcritos que se acumulam rapidamente pode exigir mais cópias para impedi-los de competição com os níveis de microRNA. Experimentalmente a determinação do número de cópias do alvo ideal para cada microARN que resulta na segmentação suficiente, mantém a aptidão viral, e que minimiza a taxa de mutações de escape pode ser recomendada.

    A localização do elemento de resposta microARN dentro do genoma virai é extremamente importante. Um resultado negativo quando se analisaa eficiência alvo nem sempre significa que o vírus não pode ser segmentada por microRNA. Ele pode simplesmente significar o alvo não é acessível nesse local ou que a repressão do gene alvo não é suficiente para inibir a patogenicidade. A maioria dos elementos de resposta são inseridos nas regiões não traduzidas 3 '(UTR) do transcrito alvo. No entanto, a segmentação bem sucedida de genomas virais tem sido realizada e, por vezes, exibe estabilidade melhorada quando genética elementos de resposta são inseridos UTR a 5 'ou no interior das regiões de codificação dos genes essenciais 38. locais de inserção óptimas irão permitir alta acessibilidade da sequência alvo para o microARN. A acessibilidade pode ser prejudicado por estruturas secundárias de ARN e interferências estequiométrica. Portanto, que localizam elementos de resposta em regiões não estruturados que são altamente conservadas é um bom ponto de partida. As sequências a ser inserida pode também influenciar e ser influenciada pelas sequências vizinhas. Thus, uma localização ideal para a sequência alvo de um microRNA não é necessariamente ideal para outros elementos de resposta. Enquanto validação experimental e otimização da localização RE é necessário, utilizando software de previsão (por exemplo http://unafold.rna.albany.edu/; http://rna.urmc.rochester.edu/software.html) para rastrear sites de inserção potenciais por perturbação das estruturas circundantes de ARN é altamente recomendada 53, 54.

    A utilização de preparações de ácidos nucleicos limpas de elevada integridade também é crítico para a obtenção dos melhores resultados. A técnica asséptica e manutenção de um ambiente livre de RNase ao manusear transcrições de RNA ou imita microRNA é essencial. Para obter os melhores resultados transcritos de ARN, imita microRNA, e stocks de vírus titulados finais deve ser armazenado a -80 ° C em pequenas alíquotas para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, resultando na degradação de ARN e perda de infecciosidade do vírus. Quando em uso, estes reagentes devem ser mantidos em gelo em todos os momentos.

    É importante notar que muitas microARNs são membros de uma família de microARNs que partilham complementaridade. Portanto, quando a realização de estudos pode ser benéfico para incluir membros da família microRNA imediato para melhorar a avaliação especificidade de direcionamento. Isto torna-se crítico quando as células dentro do qual é desejada a replicação do vírus, expressam membros da família (por exemplo, família de miR-Let7). Deve também ser notado que o ensaio de especificidade utilizando imita microRNA é um sistema artificial e sobre-expressão de um microRNA em algumas células podem resultar em efeitos fora do alvo 55. Se isto ocorrer, a especificidade pode também ser avaliada em células que expressam os microARNs apropriados utilizando inibidores microRNA vez. Este ensaio iria permitir a análise da segmentação-especificidade com base na titulação do vírus e de viabilidade celular leituras na presença de níveis fisiologicamente relevantes de microARNs.

    10, 11, 12, 13. Muitos vírus exibem altas taxas de mutação e de mutantes de escape pode surgir rapidamente. Incluindo várias cópias de uma sequência alvo, incluindo alvos para mais do que um microRNA, que localizam os alvos dentro de múltiplas regiões altamente conservadas, ou a presença de fatores antivirais adicionais, incluindo uma resposta imune pode aliviar este. Além disso, a inserção de material genético estranho num genoma viral, muitas vezes, resultar em capacidade de replicação diminuída do vírus. Se isto ocorrer, o alvo microARN é susceptível de ser geneticamente instável e mutantes de escape irão surgir mais rapidamente. Inclusão de múltiplos microRNA cópias alvo can também aumentam o potencial para a eliminação de recombinação dos alvos de microRNA. Portanto, a determinação experimental do número mínimo exigido para a segmentação cópia suficiente é necessária. Localizando microRNA cópias alvo em vários locais ao longo do genoma contra usar repetições em tandem pode ajudar na ignorando essa restrição. No entanto, a identificação de configurações óptimas RE com o número mínimo de cópias necessárias alvo e locais de inserção que não resultam na cinética da replicação do vírus alterados é crítica para minimizar a taxa de recombinação e mutação alvo. Inclusão de muitas cópias de uma sequência alvo pode também aumentar o potencial de toxicidade off-alvo se resulta da saturação de microRNA. Uma alteração significativa na quantidade de microARN disponível para regular proteínas celulares normais podem resultar em efeitos indesejáveis 55. Para este fim, muitos vírus alterar o ambiente microARN dentro de uma célula 56 e se estainclui o microARN alvo, a eficiência da regulação pode ser diminuída se a replicação do vírus é mantida o suficiente. Todas essas preocupações podem ser tratadas por meio da otimização de resposta composição de elementos e / ou localização e com uma compreensão completa do sistema a ser alvo e as suas limitações.

    Os problemas típicos associados com outros métodos de direccionamento incluem fora do alvo de atenuação do vírus, as restrições de tamanho de material de direccionamento genético em vírus com capacidades de carga limitadas, e as preocupações de segurança associadas com o vírus de engenharia de células que normalmente não estão infectadas alvo. MicroRNA-segmentação permite a regulação do tropismo viral com modificação mínima do vírus. Requer espaço mínimo dentro de um genoma viral e pode ser adaptado com base em uma enorme gama de assinaturas de microRNA celulares. Esta técnica não introduzir novas tropismos para o vírus e, portanto, não introduzir quaisquer novas questões de segurança. Além disso, estemétodo pode ser utilizado para regular várias tropismos simultaneamente usando sequências alvo para vários diferentes microARNs enriquecidas em diferentes tipos de células 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61. Tudo isto pode ser realizado sem atenuar o vírus em células que não expressam as microARNs correspondentes e, por conseguinte, pode fornecer um mecanismo para melhorar a segurança do vírus terapêuticos com potência aumentada.

    A exploração de máquinas microARN celular pode ser utilizada para regular o tropismo de muitas classes diferentes de vírus. Os protocolos detalhados aqui são projetados para o resgate e caracterização de um picornavírus alvejado-microRNA, no entanto eles podem ser adaptados de acordo com um vírus "ciclo de replicação e rea repórter específicadouts. Embora os vírus têm diferentes estratégias de salvamento específicas, sequências alvo microRNA pode ser inserido no genoma virai, independentemente de todo o genoma é codificada num plasmídeo ou se o vírus tem um genoma de ARN ou de ADN. Enquanto as células produtoras não expressam os microRNAs cognatos, alvos de microRNA otimizados não deve perturbar resgate vírus. As experiências para analisar a cinética de crescimento do vírus e microARN-direccionamento especificidade pode ser modificado alterando os pontos de tempo recolhidos com base no comprimento de uma única volta de replicação de vírus e as leituras específicas para o vírus de replicação / toxicidade (por exemplo, proteínas repórter, citotoxicidade, quantificação genoma, etc). É importante notar que embora esta técnica pode, teoricamente, ser aplicadas a todas as classes de vírus, diversos factores podem afectar a eficiência do presente método. Por exemplo, os vírus de ARN de sentido negativo não provaram ser tão sensível como vírus de ARN de sentido positivo provavelmente devido à ac limitadacessibility do RNA genômico para a maquinaria miRNA 13. Assim, as propriedades biológicas de cada classe de vírus irá conferir restrições adicionais de optimização RE. Apesar destas limitações, esta técnica oferece um método alternativo para a segmentação de pesquisa tropismo viral facilitar envolvendo a segurança, utilidade e conhecimento básico de processos biológicos para todas as classes de vírus.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
    Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
    Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
    T4 DNA Ligase System NEB M0202S
    MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
    MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
    0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
    5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
    Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
    Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
    TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
    TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
    0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
    2 ml Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
    Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
    MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
    MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
    Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
    pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.

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    Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (120), e55033, doi:10.3791/55033 (2017).

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