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Immunology and Infection

Règlement de Picornavirus Tropisme base microARN-

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/55033
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic College of Medicine

Introduction

Le développement d'une méthode largement applicable, facile et efficace pour l'ingénierie d'un vecteur à tropisme restreint offre une opportunité majeure pour améliorer la sécurité, la compréhension biologique et une utilité thérapeutique des virus. Il existe plusieurs mécanismes pour cibler tropisme viral comprenant traductionnelle, la transcription, et des techniques à base de traduction. Cependant, ces procédés ne sont généralement pas applicables à tous les systèmes de vecteurs, peut nécessiter des voies de signalisation défectueux dans des cellules ciblées ou nécessitent l'insertion de grandes séquences codantes dans le génome viral. En outre, ces procédés peuvent conduire à une atténuation du virus, ce qui entrave considérablement leur activité thérapeutique et limitant un aperçu du système non modifié.

Les microARN sont de petits (22-25 nucléotides), ARNs non codants qui interviennent dans le silençage génique dans des cellules eucaryotes. fonction microARN par des séquences cibles complémentaires (éléments de réponse) en ARN messagers de liaison (ARNm) resulti ng dans la transcription déstabilisation, la dégradation ou la répression traductionnelle. Les microARN se lient normalement des éléments de réponse avec une complémentarité partielle et donnent de petites modifications dans l' expression des gènes 1, 2, 3, 4, 5. Plus de modifications significatives dans l' expression génique peut être obtenue en augmentant la complémentarité de l'élément de réponse 6. Des milliers de micro - ARN matures ont été identifiés dans une variété d'espèces et de nombreux motifs d'expression différentiels d'exposition dans une variété de types cellulaires et tissulaires 7, 8, 9. Ces signatures de microARN peuvent être exploitées pour la restriction spécifique à la cellule d'amplification du virus en y incorporant des éléments de réponse parfaitement complémentaires dans le génome viral 10,= "xref"> 11, 12, 13. L'objectif global de cette technique de microRNA-ciblage est de contrôler le tropisme d'un génome de vecteur sans atténuation supplémentaire.

L'utilité de cette méthode de régulation tropisme viral a été démontrée dans des vecteurs lentiviraux pour limiter l' expression du transgène dans des tissus spécifiques 14, 15, 16. Cette technique a ensuite été appliquée à un large éventail de se répliquer et ne se répliquant pas des vecteurs viraux pour la thérapie génique accrue, ainsi que pour améliorer les profils de nombreux virus oncolytiques de sécurité en éliminant les effets toxiques indésirables dans les tissus normaux 10, 11, 12, 13, 17 . Il a également été utilisée pour générer sûre et eles vaccins vivants atténués EFFICACE ainsi que pour améliorer le virus et la fabrication de vaccins traite 18, 19, 20, 21. MicroARN-ciblage d'un vecteur peut permettre à l'atténuation dans des hôtes vaccinés ou systèmes ciblés, tout en maintenant les niveaux de croissance de type sauvage dans les systèmes de production. MicroARN-ciblage peut également être utilisé pour améliorer la biosécurité des virus à des fins de recherche en limitant la transmission dans une espèce (par exemple les humains) , tout en maintenant la transmission dans d' autres hôtes 22. Enfin, microRNA-ciblage peut permettre des analyses en profondeur des cycles de vie viraux et des rôles spécifiques de types de cellules dans la pathogénie et l' immunité en séparant la croissance virale 23, 24, 25, 26.

Cette technique offre une alternative méthode qui est facilement mis en oeuvre et applicables à tous les systèmes de ciblage de virus. En outre, la collection sans cesse croissante de microARN matures avec des profils d'expression différentielle dans des types cellulaires spécifiques rend cette technique très polyvalent. le ciblage basé sur microARN se sont révélées efficaces pour une variété de systèmes de virus sans compromettre le fonctionnement du système. Les principales limites de cette technique comprennent essai et l'optimisation d'erreur, le potentiel de mutations d'échappement, et potentiels hors-cible des effets sur les transcriptions endogènes. Toutefois, ces limitations peuvent généralement être surmontés avec la conception des éléments de réponse optimisée et rationnelle. Les virus à ARN de sens positif ont tendance à être particulièrement sensible aux micro-ARN-cible due à l'orientation de sens positif de leur génome et de la disponibilité des transcriptions à la machine de microARN au cours du cycle de réplication complètement cytoplasmique. Nous décrivons ici un protocole pour générer un picornavirus microRNA-ciblée et l'expérimméthodes entales pour vérifier l'efficacité et la spécificité de ce ciblage in vitro.

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Protocol

1. Clonage Éléments de réponse microARN dans le génome viral

  1. Inserts d'éléments de réponse Conception de microARN.
    1. Identifier les micro-ARN souhaité et sa séquence cible correspondante. Plusieurs bases de données sont disponibles avec des séquences de microARN matures. Recommandé: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30.
  2. Cloner l'élément de réponse à l' ADN plasmidique codant pour le génome du vecteur ou de la transcription.
    NOTE: Pour les deux ou plusieurs éléments de réponse à la copie en utilisant un site unique de restriction pour l'insertion est plus simple et plus polyvalent.
    1. Insérer élément de réponse ou d'un site unique de restriction en utilisant l'extension d'épissage chevauchement (SOE) PCR. Cette méthode a été décrite en détail 31.
    2. Si l'on utilise un site de restriction pour l'insertion, purchasser synthétisé dans le commerce, le sens PAGE purifié et ultramers antisens codant pour les séquences d'insertion flanqués par les séquences d'extrémité protubérante du site de restriction unique (figure 2).
    3. Combiner 0,5 ug sens ultramer, 0,5 pg anti - sens ultramer, un tampon de ligature d' ADN à une concentration finale de 1 x, et porter à 50 ul avec du H 2 O. recuire le ultramers en incubant la réaction à 85 ° C pendant 10 min, puis réduction de la température par 0,5 ° C toutes les 30 secondes jusqu'à ce que la réaction atteigne 25 ° C.
    4. Combiner 0,5 pg d'ADN du vecteur codant pour le nouveau site de restriction unique, une enzyme tampon jusqu'à une concentration finale de 1 x, 1 pl de l'enzyme de restriction appropriée, et amener à un volume final de 20 ul avec du H 2 O. Digest du vecteur à 37 ° C pendant 2 heures. On purifie l'ADN linéarisé par purification sur gel d' agarose 32.
    5. Ligaturer les ultramers recuits dans le vecteur digéré pendant la nuit à 16 °; C en utilisant un mélange 3: 1 ultramers: rapport molaire vecteur et des techniques de ligature standard 33.
      Remarque: Lors de l'utilisation d'un site unique d'enzyme de restriction pour l'insertion, il peut être plus efficace pour déphosphoryler les extrémités du vecteur digéré et phosphoryler les extrémités des oligonucléotides recuits.
    6. Transformer l'ADN ligaturé dans E. coli en utilisant le procédé de choc thermique 34.
      NOTE: Plasmides codant pour les génomes viraux sont généralement de grande taille, donc en utilisant des cellules compétentes optimisées pour l'absorption de grandes constructions d'ADN peuvent augmenter l'efficacité de transformation.
    7. On purifie l' ADN plasmidique à partir de colonies individuelles en utilisant un kit de purification disponible dans le commerce 35. Identifier un clone approprié avec l'élément de réponse microRNA dans l'orientation correcte (figure 2) , par séquençage de la région d'insertion 36.

2. Secourir microRNA ciblées Picornavirus from ADN plasmidique

  1. Picornavirus sauvetage microARN ciblée dans une lignée cellulaire permissive pour la réplication du virus qui ne l'exprime pas microARN (s) idoine. Ce protocole utilise des cellules H1-HeLa parce qu'ils n'expriment pas miR-142, miR-124, ou miR-125, mais il est pas nécessaire d'utiliser des cellules H1-HeLa pour le sauvetage.
    ATTENTION: Toutes les lignes directrices pour la manipulation et l'élimination des agents infectieux doivent être respectées en conséquence.
    1. Plaque de cellules H1-HeLa dans une plaque à 6 puits de telle sorte qu'ils sont ~ 80% de confluence au moment de la transfection (24 h après l'ensemencement). cellules de la plaque dans 2 ml par puits de DMEM supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 10%.
    2. Chauffer le réactif de transfection à la température ambiante. Combinez 250 médias uL sans sérum, 2,5 pg de plasmide ADN codant pour le génome de microRNA ciblée, et 7,5 pi de réactif de transfection dans un tube à centrifuger stérile et pipette doucement pour mélanger. Incuber le mélange à température ambiante pendant 15 à 30 min.
    3. Aspirer lemédias à partir des cellules ensemencées et ajouter 2 mL de milieu complet frais.
    4. Ajouter le mélange de transfection ensemble de l'étape 2.1.2 à un puits de la goutte à goutte plaque à 6 puits. Ajouter chaque goutte à une autre zone du puits.
    5. Incuber les cellules à 37 ° C jusqu'à ce que des effets cytopathiques (CPE) ou de protéines rapporteurs sont détectables (~ 24 à 72 heures).
  2. La récolte et le passage du virus récupéré sur des cellules fraîches.
    1. les cellules de plaque dans une plaque à 6 puits de telle sorte qu'elles sont confluentes à 80-90% au moment de l'infection (24 heures après l'ensemencement).
      REMARQUE: l'échelle vers le haut ou vers le bas en fonction de la quantité de virus nécessaire pour toutes les expériences ultérieures.
    2. Récolter chaque puits de secours en raclant les cellules dans le surnageant en utilisant un grattoir de cellules en caoutchouc ou spatule en caoutchouc. faites glisser doucement le racleur à travers le fond du puits. Transférer les cellules et le surnageant dans un tube de stockage cryogénique.
    3. Congélation / décongélation des échantillons deux fois, puis sédimenter les débris cellulaires parcentrifuger à 1200 xg pendant 5 min à 4 ° C.
    4. Filtrer le surnageant clarifié deux fois en utilisant 0,2 um filtres de seringue. Le surnageant filtré contenant de sauvetage du virus.
      REMARQUE: la taille des pores du filtre peut varier en fonction de la taille des particules de virus et peut ne pas être applicable à de grands virus.
    5. Aspirer le milieu des cellules étalées, laver une fois avec des milieux sans sérum et ajouter 1 ml de milieu sans sérum frais à chaque puits.
    6. Ajouter 50 ul par puits de surnageant filtré de sauvetage et balancer doucement la plaque pour répartir uniformément le virus.
    7. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 2 h et les médias alors aspirés de chaque puits pour éliminer le virus non constituée en société.
    8. Ajouter 1,5-2 ml de milieu complet frais par puits et incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les protéines de CPE ou rapporteurs sont apparents (~ 24-48 h).
    9. Répétez les étapes 2.2.2 à 2.2.4. Filtré surnageant de secours contient stock de virus. stocks de virus de magasin à usage unique aliquotes dans des tubes de stockage cryogénique à -80 °C.

3. Secourir Virus microRNA ciblée de transcrits in vitro des ARN transcrits

  1. Générer des transcrits d'ARN à partir d'ADN plasmidique codant pour le génome viral microRNA ciblée au moyen d'un promoteur en amont.
    NOTE: Les pratiques standard pour créer et maintenir un environnement sans nucléase doivent être utilisés pour toutes les étapes ultérieures.
  2. Linéariser l'ADN plasmidique en utilisant un site d'enzyme de restriction en aval de la transcription. Combiner l' ADN de plasmide 5 pg, 1 x tampon concentration finale d'enzyme, 3 ul d' enzyme de restriction et porter à 50 ul avec du H 2 O. On incube la réaction à 37 ° C pendant 3 h.
  3. Ajouter 1/20 ème volume de 0,5 M EDTA, 1/10 ème volume de 5 M NH 4 acétate et 2 volumes d'éthanol à 100% à la réaction digéré et mélanger. Incuber à -20 ° C pendant 1 h jusqu'à la nuit.
  4. Pellet l'ADN précipité pendant 10 min à 17 000 xg à 4 ° C. Verser le supernatant, remettre en suspension le culot dans 500 ul d'éthanol froid à 70% et un culot l'ADN par centrifugation à 17 000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
  5. Décanter le surnageant et on centrifuge à nouveau pendant 30 sec. Retirer le surnageant résiduel avec une pipette et air-sécher la pastille. Remettre en suspension la pastille d'ADN dans stérile sans nucléase H 2 O à une concentration de 0,5 à 1 ug / ul.
  6. Décongeler les réactifs in vitro de transcription dans à la température ambiante et placez les ribonucléotides sur la glace (enzymes dans le glycérol ne gèlent pas et doivent aller directement sur la glace). Maintenir le tampon de réaction à la température ambiante.
  7. Assembler la réaction de transcription dans un tube de PCR en combinant 2 ul chacun d'ATP, CTP, GTP et des solutions UTP, 2 pi 10 x tampon de réaction, 1 pg d'ADN linéarisé, 2 ul de l'enzyme, et amener à un volume final de 20 pi avec de la nuclease H 2 O. -free
  8. Laisser incuber la réaction à 37 ° C pendant 2 heures.
  9. Purifier les transcrits d'ARN.
  10. Amener la réaction de transcription à 100 ul avec la solution d'élution (non préchauffé). Ajouter 350 pi de concentré de solution de liaison et de 250 ul d'éthanol à 100% à la réaction et mélanger.
  11. Transférer l'échantillon dans une cartouche filtrante insérée dans un tube de collecte et centrifuger pendant 1 min à 12 000 x g. Jeter l'écoulement.
  12. Ajouter 500 pi de solution de lavage à la cartouche filtrante et centrifuger pendant 1 min à 12 000 x g. Jeter l'effluent. Répétez cette étape de lavage une fois de plus. Jeter l'effluent. Centrifuger pendant 1 min à 12,0000 xg pour éliminer l'éthanol résiduel.
  13. Transférer la cartouche de filtre à un tube collecteur et ajouter 50 ul de la solution d'élution préchauffé à la cartouche filtrante. Centrifuger 1 min à 12000 x g. Répéter cette étape d'élution, pour un volume total de 100 pi d'eluant suiteaining transcrits d'ARN purifié. Jeter le filtre-cartouche.
  • Déterminer la concentration d'ARN dans l'éluant en mesurant l'absorbance de l'échantillon à 260 et 280 nm et en utilisant la loi de Beer-Lambert.
  • Évaluer l'intégrité de l'ARN en utilisant un gel d' ARN électrophorèse 37. Voir Figure 3 pour des exemples de bonnes et mauvaises intégrité de l' ARN. ARN doit être aliquote dans des tubes à usage unique et stocké à -80 ° C pour maintenir l'intégrité.
  • transfection réactifs chauds à la température ambiante. Combinez 250 médias ul sans sérum, 2,5 pg de transcrits d'ARN purifiés, 5 pi de solution d'amplification, et 5 pi de réactif de transfection dans un tube à centrifuger stérile et pipette doucement pour mélanger. Incuber le mélange à température ambiante pendant 2-5 min.
  • Plaque de cellules H1-HeLa dans une plaque à 6 puits de telle sorte qu'ils sont ~ 80% de confluence au moment de la transfection (24 h après l'ensemencement). cellules de la plaque dans 2 ml par puits de DMEM additionné de 10% fetsérum bovin al.
  • Aspirer les médias des cellules étalées et ajouter 2 ml de milieu complet frais.
  • Ajouter le mélange de transfection ensemble de l'étape 3.12 à un puits de la goutte à goutte plaque à 6 puits. Ajouter chaque goutte à une autre zone du puits.
  • Incuber les cellules à 37 ° C jusqu'à ce que des effets cytopathiques (CPE) ou de protéines rapporteurs sont détectables (~ 24 à 72 heures).
  • Continuer le sauvetage du virus de la microRNA ciblée comme décrit dans les étapes 2.2 à 2.2.9.

    • 4. Titrer Stocks de virus par calcul Tissue-culture de 50% la dose infectieuse (DICT 50)

    1. Cellules Plate H1-HeLa dans une plaque à 96 puits à 10 4 cellules par puits dans DMEM supplémenté avec du sérum de veau fœtal à 10%. Incuber les cellules à 37 ° C pendant une nuit.
      REMARQUE: Titrer virus dans les cellules permissives pour la réplication du virus qui ne se traduit pas microARN parentes.
    2. Faire 10 fois des dilutions en série de virus chacune dans un volume total de 1 ml de exempt de sérummédias.
      REMARQUE: Utiliser des dilutions inférieures si une plus grande précision est requise.
      REMARQUE: Modifier conseils après chaque dilution pour éviter une surestimation du titre que le virus peut coller des conseils.
    3. Astuce plaque à 96 puits pour les médias de côté et aspirée à partir de cellules HeLa plaqué. Ajouter 100 ul de chaque dilution de virus par puits à 8 puits de plaque à 96 puits (1 ligne par dilution). Ajouter 100 pi de milieu sans sérum sans virus à la ligne 1 et ligne 12 sur la plaque pour les contrôles.
      NOTE: Toujours aspirer et ajouter des médias à des puits en touchant la pointe à l'autre de bien pour empêcher le détachement des cellules.
    4. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 2 heures. plaque Astuce sur le côté et aspirer les médias des puits.
      REMARQUE: Modifier conseils entre chaque rangée de dilution.
    5. Ajouter 100 ul de milieu complet par puits. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 72 heures.
    6. Visualisez les puits sous un microscope et marquer chaque puits positif ou négatif pour CPE.
    7. Calculer chaque titre viral à l'équation suivante: Log 10 (DICT 50 / ml) = L + D (S-0.5) + log 10 (1 / V). L est le logarithme négatif 10 de dilution de virus le plus concentré testé dans lequel tous les puits sont positifs. D est le log 10 du facteur de dilution. S est la somme des proportions individuelles (pi). pi est la proportion calculée d'une dilution individuelle (quantité de puits positifs / nombre total de puits par dilution. V est le volume de l'inoculum (ml / puits).

    Tableau 1
    Tableau 1: Quantification des particules virales infectieuses en calculant la TCID50. Les résultats représentatifs à partir de cellules infectées par une série de dilutions de dix fois d'un stock de virus. "L" équivaut à 4 parce que la dernière dilution où tous les puits sont positifs pour CPE est de 10 -4. "D" est le journal 10 des dilutions 10 depuis 10 foisont été utilisés et il est donc égal à 1. «S» est la somme des proportions individuelles. Dans cet exemple, les proportions individuelles sont 1,0, 0,875, 0,375, 0,125 et 0. La somme de ces derniers (S) est 2,375. "V" est le volume en ml de l'inoculum utilisé pour infecter des cellules initialement.

    5. Évaluer l'efficacité microARN-ciblage: Cinétique de croissance unique étape

    1. Les commandes de cet essai comprennent des cellules pseudo-infectées, le virus non modifié et le virus contenant un élément de réponse non-ciblé ou non fonctionnel.
    2. Plaque de cellules H1-HeLa pour une expérience de décours temporel dans les 12 puits des plaques de culture de tissu de telle sorte qu'elles sont confluentes à 80-90% au moment de l'infection (24 heures après l'ensemencement). cellules de la plaque dans du DMEM supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 10% à 1 ml par puits.
      NOTE: Nous vous recommandons de plaquer une plaque séparée pour chaque point de temps. Ce protocole utilise 7 points de temps différents pour un virus avec un cycle de replication de 8 à 12 heures. cellules H1-HeLa ne sont pas tenus d'effectuer cette uneéssayé. Cet essai doit être effectué dans des cellules permissives qui ne manifestent pas les micro-ARN ciblés. Ce dosage peut également être effectuée dans des cellules exprimant les micro-ARN apparentés afin d'évaluer la cinétique de croissance sous une pression sélective.
    3. Aspirer le milieu des puits. Laver les puits en ajoutant 0,5 ml de milieu sans sérum à chaque puits, agiter la plaque, et les médias d'aspiration des puits. Ajouter 0,5 ml de milieu sans sérum frais à chaque puits.
    4. Infect chaque puits à une multiplicité d'infection élevé (MOI; nombre de particules infectieuses par cellule) pour assurer que toutes les cellules sont infectées. Ce protocole utilise une MOI de 3.
      1. Diluer les stocks de virus dans le milieu sans sérum à une concentration de MOI = 3 pour 100 ul. Ajouter 100 ul de dilution de virus chacun à sept puits différents et incuber à 37 ° C pendant 2 h.
      2. Aspirer les médias de tous les puits et laver deux fois en ajoutant 0,5 ml de milieu complet par puits, balançant doucement, puis aspirer.
    5. Ajouter 1 mL de cmédias emplissez à chaque puits et incuber à 37 ° C jusqu'à ce point de temps désiré.
    6. Prélever des échantillons pour le titrage du virus au post-infection 2, 4, 6, 8, 10, 24 et 48 h (1 puits par point de temps). Transférer 700 ul des médias dans le puits d'un tube de stockage cryogénique. Grattez les cellules dans le surnageant restant en déplaçant doucement un racloir en caoutchouc sur l'ensemble du bien. Transférer le mélange de cellules / surnageant dans le tube correspondant de stockage cryogénique contenant 700 ul de surnageant.
      REMARQUE: Assurez-vous de ne pas éclabousser surnageant d'un puits dans un autre au cours de grattage résultant dans des échantillons contaminés. Le transfert des 700 pi avant raclage permettra de minimiser les éclaboussures.
    7. Placer les échantillons à -80 ° C jusqu'à ce que tous les échantillons soient collectés.
    8. Geler / dégeler les échantillons trois fois et éliminer les débris cellulaires par centrifugation les échantillons à 1200 g pendant 5 min à 4 ° C.
    9. Titrer le virus tel que décrit dans la section 4 et de comparer la cinétique de croissance sur time.

    6. Évaluer microARN ciblant Spécificité: Imite microRNA synthétique Virus répartition Assay Utilisation

    NOTE: L'utilisation d'un microARN mimétique synthétique est réalisée pour montrer la spécificité du microARN: interaction microRNA-cible.

    1. Inclure la transfection simulée, microRNA témoins négatifs imitent et microRNA expérimentales imitent seules commandes pour chaque test pour évaluer la toxicité de microRNA-médiée. Il est également idéal pour inclure un contrôle positif (ie gène ou génome microRNA ciblée) comme la faible efficacité de transfection imite microARN peut entraîner des faux négatifs.
    2. Plaque de cellules H1-HeLa dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits de telle sorte qu'elles sont confluentes à 80-90% au moment de la transfection (24 h après l'ensemencement). cellules de la plaque dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin à 0,1 ml par puits.
      REMARQUE: Effectuez ce test dans les cellules permissives pour la réplication virale qui n'expriment pas les microARN parentes.
    3. e chaude transfection réactifs à température ambiante. Combiner les médias sans sérum 9 pi, 200 nM concentration finale par puits de microRNA Stock mimique, 0,18 ul de réactif d'amplification, 0,18 ul de réactif de transfection et mélanger. Incuber le mélange à température ambiante pendant 2-5 min.
      NOTE: Les volumes indiqués sont par bien. Il est recommandé un mélange maître être assemblé pour la transfection de tous les puits pour maintenir la cohérence et de minimiser les erreurs de pipetage. La concentration optimale des micro-ARN mimétique peut varier. Consulter les instructions du fabricant accompagnant le microARN miment pour une concentration de départ raisonnable. En général, cela se situera entre 5-200 concentrations finales nM.
    4. Aspirer les médias des puits et ajouter 92 ul de milieu complet frais.
      NOTE: S'il y a un nombre important d'échantillons, effectuer cette étape avant d'assembler la solution de transfection et de stocker la plaque à 37 ° C jusqu'au moment.
    5. Ajouter la totalité du mélange de transfection in étape 6.3 aux cellules goutte à goutte.
    6. Incuber à 37 ° C pendant 6 h.
    7. Infect chaque puits à un faible MOI pour assurer un faible pourcentage de cellules sont infectées pour permettre une analyse de la propagation du virus. Ce protocole utilise une MOI de 0,2.
      1. Diluer les stocks de virus dans le milieu sans sérum à une concentration de MOI = 0,2 pour 100 ul. Retirez le support des puits et ajouter 100 pi de dilution de virus par puits.
      2. Incuber à 37 ° C pendant 2 h.
    8. Aspirer le milieu de chaque puits et ajouter 100 pi de milieu complet frais.
    9. Incuber à 37 ° C pendant 20-22 h.
    10. Déterminer le titrage du virus dans les surnageants.
      1. Recueillir le surnageant de chaque puits et le remplacer par 100 ul de milieu complet frais.
        Remarque: Si l'on utilise des cellules en suspension, remettre en suspension le culot de cellules provenant de l'étape suivante dans 100 ul de milieu complet frais et revenir à puits échantillon pour analyse de la viabilité.
      2. Retirer celludébris lar à partir des surnageants collectés par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C.
      3. Transférer le surnageant clarifié dans un nouveau tube et titrez virus infectieux sur les cellules permissives qui n'expriment pas les microARN parentes comme décrit dans la section 4.
        REMARQUE: Conservez tous les échantillons sur la glace pour empêcher la perte de l'infectivité.
    11. Déterminer la viabilité des cellules.
      1. Ajouter 10 ul de MTT (bromure de 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5-diphényltétrazolium) réactif par puits.
      2. Incuber à 37 ° C pendant 2-4 h jusqu'à ce précipité violet est visible.
      3. Ajouter 100 ul de réactif de détergent.
      4. Incuber à température ambiante dans l'obscurité pendant 2 h.
      5. Lire l'absorbance de tous les puits à 570 nm.
        REMARQUE: Normaliser tous les échantillons pour se moquer de cellules transfectées pour la comparaison de la viabilité pour cent des cellules.

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    Representative Results

    Le tableau 1 représente les résultats typiques d'une analyse de titrage pour un picornavirus et décrit comment calculer la dose infectieuse de culture tissulaire à 50%. Une représentation schématique du concept global de la réglementation sur la base microRNA-du tropisme viral décrit dans ce manuscrit est illustré à la figure 1. L'orientation de microARN à l' élément de réponse au cours des interactions intracellulaires, une bonne conception d'oligonucléotides d'éléments de réponse pour le recuit et le plasmide d' insertion, et un carte d'ADN de plasmide codant pour un génome viral micro - ARN ciblé pour la transcription in vitro est représentée sur la figure 2. la figure 3 montre des transcrits d'ARN à des degrés d'intégrité visualisés par électrophorèse sur gel d' agarose variable. Une manipulation correcte et l'utilisation de l'ADN gabarits exempt d'impuretés se traduira par des transcrits d'ARN transcrits correctement comme indiqué dans 3A voie 2. impuretés résiduelles dans le lineades matrices d'ADN risé ou des quantités infimes de nuclease peuvent entraîner de faibles niveaux d'ARN incorrectement transcrit et / ou des produits de dégradation similaire à celle observée dans 3A voie 3. Linéarisation incomplète de l'ADN plasmidique ou de l'ADN contenant de grandes quantités d'impuretés telles que l'éthanol résiduel se traduira produits de transcription et de dégradation inappropriés représentés dans les voies 3A 4 et 5. la figure 3 montre également une image des effets cytopathiques Mengovirus médiées (CPE) après la transfection des transcrits d'ARN propres. Figure 4 données affiche représentant d'une expérience au cours du temps d' évaluer la cinétique de non modifiée et microRNA ciblées Mengovirus croissance. Les résultats montrent que des éléments de réponse microARN d'ingénierie dans le génome Mengovirus ne modifient pas la cinétique de la réplication du virus dans les cellules HeLa-H1, qui n'expriment aucune des microARN parentes. Cependant, dans RAW 264.7 macrophages, qui expriment des niveaux intermédiaires de microARN-125 et des niveaux élevés de microARN-142, les virus codant pour les éléments de réponse correspondants présentent une cinétique de réplication inhibés qui est en corrélation avec le niveau de micro-ARN exprimé. Les données de la figure 5 montre la spécificité de la réglementation fondée sur microRNA-de Mengovirus tropisme. La surexpression de chaque micro-ARN particulier dans les cellules H1-HeLa inhibe spécifiquement la propagation (les titres de virus plus faibles) et la cytotoxicité (augmentation de la viabilité cellulaire) de Mengovirus codant pour l'élément de réponse microRNA idoine.

    Figure 1
    Figure 1: Représentation schématique de la régulation du tropisme viral à base de microARN. éléments de réponse de microARN (RE) incorporés dans un génome viral seront reconnus par microARN parentes enrichis dans les types cellulaires spécifiques et entraînent la dégradation ciblée des transcriptions virales / génomes. Cette réplication virale empêchera, la propagation et la toxicité pour les the cellules environnantes. Cependant, la réplication virale sera maintenue dans les cellules qui n'expriment pas les microARN parentes permettant la propagation du virus, la propagation et la mort cellulaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 2
    Figure 2: microARN conception des éléments de réponse. (A) pour cibler avec succès la région de la séquence d'amorçage du RE doit être parfaitement complémentaire. RE doit être orienté à l'intérieur du génome viral, de telle sorte qu'elle puisse être reconnue par la même origine matures microARN dans transcrits d'ARNm et / ou dans le génome viral. La majorité des ER sont placés à l'intérieur de l'UTR 3 'de la transcription. (B) Représentation d'oligonucléotides correctement conçus et recuits codant REs contenant tandemrépétitions de séquences microRNA-cibles (MIRT) flanqués par les nucléotides en surplomb du site d'enzyme de restriction Xhol. Lors de la conception tandem REs répétées, assurez-vous d'inclure espaceurs nucléotides (généralement 4-6) entre chaque copie microRNA-cible. (C) un ADN de plasmide codant pour un génome viral de pleine longueur avec un RE incorporé dans la 3 'UTR, un promoteur T7 et un site de restriction unique pour la linéarisation pour la transcription in vitro. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    figure 3
    Figure 3: Rescue du virus à partir des transcrits d'ARN génomique codant. (A) ARN électrophorèse sur gel in vitro des ARN transcrits codant dans les génomes de picornavirus pour évaluer l' intégrité de la transcription. voie 1: ARN échelle. Lane 2: correctement transcrit ARN avec une grande intégrité. Lane 3: transcrits d'ARN avec intégrité modérée. bande supérieure est de taille correcte et la bande inférieure est un produit de dégradation ou d'un transcrit d'ARN indésirable potentiellement. Piste 4: Improperly ARN transcrit. Lane 5: ARN Faible intégrité. 500 ng d'ARN transcrit in vitro a été chargé par puits. transcription ou de dégradation des produits impropres sont probablement dues à l'utilisation d'une faible pureté ou de l'ADN incomplètement linéarisé. (B) Image de cellules transfectées simulacres H1-HeLa et les cellules transfectées avec des transcrits d'ARN codant pour Mengovirus. L'administration de transfection réactifs seulement (Mock) maintiendra la viabilité des cellules après transfection ainsi que le passage sur des cellules fraîches. Transfection de transcrits d'ARN codant pour un génome Mengovirus (vmc 24) se traduit par des effets cytopathiques, qui sont maintenues après filtration du surnageant et le passage sur des cellules HeLa-H1 frais. Barre d'échelle = 100 um.ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 4
    Figure 4: cinétique de Mengoviruses non modifiés et microARN ciblée en présence ou en absence de microARN parentes croissance. Modifié de référence 17. Cellules (A) H1-HeLa n'expriment pas miR-124, -125 ou -142. Tous les trois Mengovirus microARN d'encodage REs répliquent avec une cinétique similaire que le virus non modifié (vmc 24) indiquant que l' insertion des microARN dans ce lieu (5 'UTR) ne modifient pas la réplication du virus. (B) RAW 264.7 macrophages expriment des niveaux intermédiaires de miR-125b et des niveaux élevés de miR-142-3p, mais ne reflètent pas miR-124. L'incorporation des séquences microRNA-cibles correspondants dans les résultats du génome en att virusenuation compatible avec le niveau d'expression de microARN. Les données sont représentées comme des titres viraux moyenne +/- SD. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 5
    Figure 5: Analyse de la spécificité des microRNA-ciblage à l' aide imite microARN synthétiques. Modifié de référence 17. Cellules H1-HeLa transfectées avec imite microARN individuelles ont été infectées par le virus non modifié (vmc 24) ou le virus de la microRNA ciblée (MIRT-vmc 24) à une MOI de 0,2. (A) La viabilité cellulaire normalisée à cellules pseudo-traitées a été déterminée à 24 heures après l'infection par le MTT dosage de prolifération cellulaire. (B) Le titrage du virus dans le surnageant de tous les échantillons a également été déterminée à 24 h après l'infection. leles données sont représentées en tant que moyen pour la viabilité virale ou titre +/- DS. Deux-tailed test t de Student apparié avec correction de Welch (pour variances inégales) ont été utilisées pour l' analyse statistique. Une valeur de p <0,01 a été considérée comme significative. (**, P <0,01, *** p <0,001). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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    Discussion

    La conception, la composition et la localisation des éléments de réponse microARN dans le génome viral dicteront ciblant l'efficacité et la spécificité. Optimisation de ceux-ci, il faudra essais et erreurs. Cependant, la conception rationnelle basée sur l' analyse structurelle de l' ARN et des études antérieures de la réplication virale et microARN signatures aides à la mise en œuvre de cette technique avec l' optimisation minimale 10, 11, 12, 13, 38.

    Lors du lancement de la conception de REs, les enquêteurs devraient commencer par la compilation d'un ensemble de microARN qui sont exprimés dans les cellules cibles d'intérêt, sont diminuées dans les cellules non-cibles d'intérêt, et qui ont été validées expérimentalement. Après cette compilation, plusieurs analyses fondées sur la prévision devraient être menées pour répondre à la possibilité de concurrencer microRNA-target interactions. De nombreux virus codent microARN ou ARNs non codants qui séquestrent les microARN cellulaires afin de manipuler l'expression virale et hôte gène. En outre, plusieurs virus à ARN ont été montrés pour interagir avec les micro - ARN cellulaire afin d'accroître leur capacité de réplication 39, 40. Par conséquent, lors de la conception REs, assurez-vous de vérifier si on connaît les interactions du virus avec les microARN cellulaires ou si elles expriment microARN virales qui pourraient reconnaître la cible de microARN choisi ou modifier l'expression endogène du microARN choisi. En plus de recherches documentaires, le lecteur doit tenir compte en ligne des outils de prédiction de la bioinformatique et des bases de données qui contiennent des informations virale cible de microARN pour aider à la conception rationnelle de REs. Ces bases de données et des outils de prédiction peuvent également faciliter l'identification des séquences cibles qui peuvent être reconnus par plusieurs microARN ou séquences de semences se chevauchent pré envoyé dans le génome viral. Pour une discussion plus approfondie sur les méthodes d'identification des cibles microARN et les avantages et les inconvénients de certains des outils de prévision en ligne , le lecteur est renvoyé aux références 41, 42. Il est recommandé que ces outils de prédiction ne servent que de guides autant de fois les prédictions peuvent donner des faux positifs ou négatifs. A cette fin, il peut y avoir des séquences d'amorçage qui se chevauchent, mais l'extrémité 3 'du microRNA qui sera également influer sur l'efficacité du ciblage. L'utilisation trop stricte d'un ensemble de règles peut parfois être préjudiciable.

    Une fois un ensemble de cibles de microARN potentiels ont été identifiés, l'enquêteur devrait se poursuivre en classant les cibles basées sur les propriétés biologiques des microARN et ARN prédictions structurales 10, 11, 12, 13,ef "> 38. L'abondance absolue de la microARN mature dans des cellules ciblées et son niveau d'association avec une protéine Argonaute dictera le degré de silençage génique. Plusieurs études ont démontré que seulement abondamment exprimé microARN régleront de manière significative l' expression du gène 16, 43, 44. en outre, alors que certains microARN sont abondamment exprimé leur interaction avec les protéines Argonaute et formation de RISC est insuffisante pour réprimer la traduction 44. l' utilisation d' un microARN très abondante avec fonction validée également minimiser le potentiel de microRNA saturation dans la cellule cible et hors ultérieure toxicités cibles. une approche différente peut être d'utiliser REs qui sont ciblés par plusieurs miARN 45, 46, ce qui pourrait permettre un numéro de copie réduite tout en minimisant le potentiel de hors-cible toxicities. Le rapport de l'ARNm cible à microRNA aura également un impact significatif sur le succès de cette approche. Un objectif élevé ratio microRNA permettra de réduire le niveau de répression 42, 43, 47, 48. Cela est particulièrement important avec des virus qui se répliquent rapidement quand il est mal réglé tôt pendant l'infection va accumuler à des niveaux au-delà du contrôle des microARN endogènes. Il est essentiel de tenir compte de ces propriétés lors du choix d'un microARN pour le ciblage; idéalement, en utilisant un microARN dont la fonction a été validé expérimentalement.

    L'efficacité de l'inactivation du gène ciblé est également affectée par la complémentarité pour cent de la cible à la microRNA ainsi que le nombre de copies de séquences microRNA-cibles insérées. La région 5 'des microARN (nucléotides 2-8) constitue la séquence d'amorçage. Il est généralement admisque cette région doit être parfaitement complémentaire pour ciblage réussi 48, 49. La majorité des études utilisent des éléments de réponse avec une parfaite complémentarité, car il peut augmenter l'activité la neutralisation des gènes en favorisant le clivage endonucléolytique de la transcription et de recyclage rapide du microARN. Ce clivage endonucléolytique se produit uniquement lorsque un microARN interagit avec une protéine Argonaute qui a une activité endonucléolytique, qui, dans les cellules de mammifères est limitée à Argonaute-2. D'autres protéines Argonaute favorisent la dégradation de l'ARNm par désadénylation et l'attaque exonucléolytique de la transcription. Le lecteur est renvoyé aux références 4, 5, 13, 50, 51, 52 pour une description en profondeur de microRNA biogenèse et la fonction. On pense généralement que incralléger le nombre de copies améliorera encore l'efficacité du ciblage. Cependant, cela peut aussi potentialiser microRNA saturation et n'a pas toujours avérée plus efficace. Il est parfois préférable d'incorporer des séquences cibles pour de multiples micro-ARN différents enrichies en les cellules cibles ou d'utiliser des séquences cibles qui sont reconnus par plusieurs microARN. Le nombre de copies requis est également fortement dépendante de la quantité de transcription qui aura besoin silençage et l'abondance relative de la micro-ARN dans les cellules cibles. Transcriptions qui accumulent rapidement peuvent nécessiter plus de copies pour les empêcher de supplantant les niveaux microARN. déterminer expérimentalement le nombre de copies optimale pour chaque cible de microARN qui se traduit par un ciblage suffisant, maintient remise en forme virale, et qui minimise le taux de mutations d'échappement est recommandée.

    La localisation de l'élément de réponse à l'intérieur de micro-ARN du génome viral est extrêmement important. Un résultat négatif lors de l'analysel'efficacité du ciblage ne signifie pas toujours le virus ne peut pas être microRNA ciblée. Il peut simplement signifier que la cible est non accessible en cet endroit ou la répression du gène ciblé est insuffisante pour inhiber la pathogénicité. La majorité des éléments de réponse sont insérés dans les régions 3 'non traduites (UTR) du transcript cible. Cependant, le ciblage réussi des génomes viraux a été accomplie et , parfois , présente une meilleure stabilité génétique lorsque les éléments de réponse sont insérés dans l' UTR 5 'ou à l' intérieur des régions de codage des gènes essentiels 38. sites d'insertion optimales permettront une grande accessibilité de la séquence cible à la microARN. L'accessibilité peut être entravée par des structures secondaires d'ARN et des interférences stoechiométrique. Par conséquent, les éléments de réponse localisant dans les régions non structurées qui sont hautement conservées est un bon point de départ. Les séquences étant insérées peuvent également influencer et être influencée par les séquences environnantes. Thus, un emplacement optimal pour la séquence cible d'un microARN est pas nécessairement optimale pour d'autres éléments de réponse. Bien que la validation expérimentale et l'optimisation de la localisation RE est nécessaire, en utilisant un logiciel de prédiction (par exemple http://unafold.rna.albany.edu/; http://rna.urmc.rochester.edu/software.html) pour dépister les sites d'insertion potentiels pour perturbation des structures d'ARN environnantes est fortement recommandé 53, 54.

    L'utilisation des propres préparations d'acide nucléique de haute intégrité est également critique pour obtenir les meilleurs résultats. Une technique aseptique et la maintenance d'un environnement sans RNase lors de la manipulation des transcrits d'ARN ou imite microARN est essentielle. Pour obtenir les meilleurs résultats transcrits d'ARN, imite microARN, et les stocks finaux de virus titrés doivent être conservés à -80 ° C en petites portions pour éviter la congélation et la décongélation répétées aboutissant à la dégradation de l'ARN et la perte de l'infectiosité du virus. Lors de l'utilisation, ce réactifs doivent être conservés sur la glace en tout temps.

    Il est important de noter que de nombreux microARN sont membres d'une famille de microARN qui partagent la complémentarité. Par conséquent, lorsque la réalisation d'études, il peut être utile d'inclure les membres de la famille de microARN immédiates pour améliorer l'évaluation ciblant la spécificité. Cela devient critique lorsque les cellules dans lesquelles la réplication du virus est souhaité, d' exprimer des membres de la famille (par exemple de la famille miR-Let7). Il convient également de noter que le dosage de la spécificité à l' aide mimétiques microARN est un système artificiel et la sur-expression d'un micro - ARN dans certaines cellules peut entraîner des effets hors-cible 55. Dans ce cas, la spécificité peut également être évaluée dans des cellules qui expriment les microARN appropriés en utilisant des inhibiteurs microARN place. Ce dosage permettrait analyse de la spécificité de ciblage basée sur le titrage du virus et la viabilité cellulaire en présence des affichages de niveaux physiologiquement pertinents de microARN.

    10, 11, 12, 13. De nombreux virus présentent des taux de mutation élevés et d'échapper à des mutants peuvent survenir rapidement. Y compris des copies multiples d'une séquence cible, y compris des cibles pour plus d'un microARN, localisant les cibles dans plusieurs régions hautement conservées, ou la présence de facteurs antiviraux supplémentaires, y compris une réponse immunitaire peut atténuer cela. En outre, l'insertion d'un matériel génétique étranger dans un génome viral se traduit souvent par une diminution de la capacité de réplication du virus. Si cela se produit, la cible microARN est susceptible d'être génétiquement instables et échapper mutants se posera plus rapidement. Inclusion de plusieurs microRNA copies cibles can augmentent également le potentiel de suppression recombinatoire des cibles de microARN. Par conséquent, la détermination expérimentale du nombre de copies minimum requis pour le ciblage suffisante est nécessaire. Localisation des microARN cibles exemplaires en divers endroits dans le génome par rapport à l'aide des répétitions en tandem peut aider à contourner cette contrainte. Toutefois, l'identification des configurations optimales RE avec le nombre minimal de copies cibles nécessaires et les sites d'insertion ne se traduit pas par une cinétique de réplication du virus altéré est critique pour réduire au minimum le taux de recombinaison et de mutation de la cible. L'inclusion de trop de copies d'une séquence cible peut également augmenter le potentiel de toxicités hors-cible si elle aboutit à microRNA saturation. Une modification importante de la quantité de microRNA disponible pour la régulation des protéines cellulaires normales peut entraîner des effets indésirables 55. A cette fin, de nombreux virus changent l'environnement microARN dans une cellule 56 et si celacomprend le microARN cible, l'efficacité de la régulation peut être diminuée si la réplication du virus suffisant est maintenu. Toutes ces préoccupations peuvent être adressées par l'optimisation de la composition et / ou la localisation élément de réponse et une compréhension approfondie du système étant ciblé et ses limites.

    Les problèmes typiques associés à d'autres méthodes de ciblage comprennent l'atténuation hors-cible du virus, des contraintes de taille pour le matériel de ciblage génétique des virus avec des capacités de transport limitées, et les problèmes de sécurité associés aux virus de l'ingénierie pour cibler les cellules qui normalement ne sont pas infectées. MicroARN-ciblage permet la régulation de tropisme viral avec une modification minimale du virus. Il nécessite un minimum d'espace dans un génome viral et peut être adapté sur la base d'un tableau large de signatures de microARN cellulaires. Cette technique ne présente pas de nouveaux tropismes pour le virus et donc ne créent pas de nouveaux problèmes de sécurité. En outre, cetteprocédé peut être utilisé pour réguler plusieurs tropismes simultanément en utilisant des séquences cibles pour de multiples micro - ARN différents enrichies au sein de différents types de cellules 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61. Cela peut être accompli sans atténuer le virus dans les cellules qui n'expriment pas les microARN correspondants et peut donc fournir un mécanisme pour améliorer la sécurité des virus thérapeutiques avec puissance accrue.

    L'exploitation des machines de micro-ARN cellulaire peut être utilisée pour réguler le tropisme de nombreuses classes différentes de virus. Les protocoles détaillés ici sont conçus pour le sauvetage et la caractérisation d'un picornavirus microRNA ciblée, mais ils peuvent être adaptés en fonction d'un virus «cycle de réplication et reporter rea spécifiquedouts. Bien que différents virus ont adopté des stratégies de secours spécifiques, les séquences cibles de micro-ARN peuvent être insérés dans le génome viral, indépendamment du fait que le génome entier est codé dans un seul plasmide ou si le virus a un génome d'ADN ou d'ARN. Tant que les cellules productrices n'expriment pas les microARN parentes, les cibles de microARN optimisés ne devraient pas perturber le sauvetage de virus. Des expériences pour analyser la cinétique de croissance du virus et microARN une spécificité de ciblage peuvent être modifiés en changeant les points de temps collectées en fonction de la longueur d'un seul cycle de replication du virus et sur les affichages spécifiques pour le virus de réplication / toxicité (par exemple des protéines rapporteurs, la cytotoxicité, le génome de quantification, etc.). Il est important de noter que, bien que cette technique peut théoriquement être appliquée à toutes les classes de virus, de nombreux facteurs peuvent influer sur l'efficacité de cette méthode. Par exemple, des virus à ARN de sens négatif se sont pas révélés aussi sensible que les virus à ARN de sens positif probablement dû à courant alternatif limitéaccessi- de l'ARN génomique de la machine 13 miARN. Ainsi, les propriétés biologiques de chaque classe de virus vont conférer des contraintes supplémentaires sur l'optimisation des RE. En dépit de ces contraintes, cette technique offre une méthode alternative pour cibler la recherche de tropisme viral facilitant impliquant la sécurité, l'utilité et la compréhension de base des processus biologiques pour toutes les classes de virus.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
    Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
    Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
    T4 DNA Ligase System NEB M0202S
    MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
    MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
    0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
    5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
    Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
    Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
    TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
    TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
    0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
    2 ml Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
    Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
    MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
    MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
    Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
    pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.

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    References

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    Immunologie numéro 120 microARN microRNA-ciblage picornavirus oncolytique tropisme virus cytotoxicité la réplication l'expression des gènes
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    Ruiz, A. J., Russell, S. J.… More

    Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (120), e55033, doi:10.3791/55033 (2017).

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