Introduction
一个广泛适用，方便，有效的方法，为工程受限取向载体的发展提供了重大机遇，以提高安全性，生物的理解和病毒的治疗效用。一些机制来瞄准病毒嗜包括转导，转录和翻译基础的技术。然而，这些方法都没有普遍适用于所有的载体系统，可能需要在靶细胞缺陷信号传导途径，或需要大的编码序列插入到病毒基因组中。此外，可能会导致该病毒的衰减这些方法中，显著妨碍它们的治疗活性和限制性洞察未修改的系统。
微小RNA是小的（22-25个核苷酸），介导基因沉默在真核细胞中的非编码RNA。通过结合在信使RNA互补的靶序列（反应元件）（mRNA）的微RNA resulti功能纳克在成绩单不稳定，降解或翻译抑制。微RNA通常结合具有部分互补性反应的元件，基因表达的1，2，3，4，5，得到小的修改。在基因表达更显著改变可通过增加反应元件6的互补性来实现。数千成熟微RNA的已在各种细胞和组织类型7，8，9的多种物种和许多表现出差异表达模式的已确定。这些微小RNA签名可通过将完全互补的反应元件到病毒基因组10被利用为病毒扩增的细胞特异性的限制，=“外部参照”> 11，12，13。这种微小RNA靶向技术的总体目标是控制一个载体基因组的取向，而不附加衰减。
这种方法用于调节病毒嗜性的实用程序最初被证实在慢病毒载体，以限制在特定的组织14，15，16的转基因表达。这种技术随后被应用于复制型或非复制型病毒载体增强基因治疗以及通过消除在正常组织10，11，12，13不希望的毒性，改善的许多溶瘤病毒的安全性概况，17的繁多。它也被用来生成安全和电子ffective减毒活疫苗，以及改善病毒和疫苗制造工艺18，19，20，21。微RNA靶向载体的可允许在接种疫苗的主机或目标系统的衰减，同时保持生产者系统的野生型的增长水平。微RNA靶向也可以使用通过在一个物种（ 例如人类）限制传输，同时保持其他主机22传输来改善病毒用于研究目的的生物安全。最后，微小RNA-定位可以允许深度通过分离病毒生长23，24，25，26分析病毒的生命周期和发病机理和免疫细胞类型的特定角色。
这种技术提供一个alternative定位方法，很容易实现的，并适用于所有病毒系统。此外，在特定的细胞类型差异表达模式成熟的microRNA的不断扩大，使收集这种技术高度灵活。微RNA为基础的定位已被证明有效的，适用于各种病毒的系统，而不会影响系统的功能。该技术的主要局限性包括试验和错误的优化，为逃逸突变的可能性，并在内源性转录物的潜在的脱靶效应。但是，这些限制一般都可以与优化，合理的反应元件设计克服。正链RNA病毒的趋向是特别响应于微小RNA-靶向由于它们的基因组的正义方向和转录到微小RNA机械的完全细胞质复制周期中的可用性。在这里，我们描述了一个协议，用于产生微小RNA靶向小核糖核酸病毒和experimental方法来验证体外靶向的效率和特异性。
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Protocol
1.克隆的microRNA反应元件到病毒基因组
- 设计的microRNA反应元件插入。
- 识别所需的微RNA及其相应的靶序列。几个数据库都可以与成熟的microRNA序列。推荐：http://www.mirbase.org/ 9，27，28，29，30。
- 克隆应答元件到编码的载体基因组或转录物的质粒DNA。
注：对于采用了独特的限制性位点用于插入两个或更多个拷贝的反应的元素是更容易和更灵活。- 插入响应元件或使用拼接重叠延伸（SOE）PCR的独特限制性位点。这种方法已经详细31进行了描述。
- 如果使用限制位点用于插入，PUR追商业合成，PAGE纯化的有义和编码由独特的限制性位点（ 图2）的突出端序列侧接插入序列的反义ultramers。
- 结合0.5微克感ultramer，0.5微克的反义ultramer，DNA连接缓冲液为1X的终浓度，并带来至50微升用H 2 O退火ultramers通过孵育在85℃下反应10分钟，然后通过降低温度0.5℃下，每隔30秒，直到反应达到25℃。
- 结合0.5微克载体DNA的编码该新的独特的限制性位点，酶缓冲液，以1倍终浓度，1微升合适的限制性酶，并带来了20微升用H 2 O文摘载体的最终体积在37℃下2小时。净化用琼脂糖凝胶纯化32的线性化的DNA。
- 结扎退火ultramers到消化的载体过夜在16℃温度下用3：1的ultramers：载体的摩尔比和标准连接技术33。
注意：当使用一个单一限制性酶切位点用于插入它可以是更有效的脱磷酸化的消化的载体的端部和磷酸化退火的寡核苷酸的末端。 - 变换连接的DNA到使用热休克方法34大肠杆菌。
注：编码病毒基因组的质粒一般都很大，因此使用优化摄取大量DNA结构可能会增加转化效率的感受态细胞。 - 净化从使用市售的试剂盒纯化35单个菌落的质粒DNA。通过测序插入区域36识别与在正确的方向（ 图2）的微小RNA响应元件的适当克隆。
2.救援微小RNA靶向RNA病毒来回米质粒DNA
- 在细胞系容许对不表达的同源微RNA（多个）病毒复制救援微小RNA靶向微小核糖核酸病毒。该协议使用H1-HeLa细胞，因为它们不表达的miR-142中，miR-124，或miR-125，但它是不使用H1-HeLa细胞救援所需的。
注意：对传染性病原体的安全处理和处置的所有准则应严格遵守。- 板H1-HeLa细胞在6孔板使得它们〜在转染的时间（24小时后播种）80％汇合。在每DMEM中孔2mL板细胞在补充有10％胎牛血清。
- 暖转染试剂至室温。结合250微升无血清培养基，质粒DNA编码微小RNA靶向基因组的2.5微克，和在无菌的离心管转染试剂的7.5微升和吸管轻轻混合。在室温下孵育混合物15-30分钟。
- 吸出从接种的细胞培养基中加入2毫升的新鲜完整的媒体。
- 从步骤2.1.2添加整个转染混合物至6孔板滴的一个孔中。每滴添加到孔的不同区域。
- 孵育所述细胞在37℃，直至细胞病变效应（CPE）或报告蛋白是可检测的（〜24-72小时）。
- 采收和通道获救病毒到新鲜细胞。
- 在一个6孔板板的细胞，使得它们在感染的时间（24小时后播种）80-90％汇合。
注：扩张或收缩取决于所需的所有后续实验中的病毒量。 - 通过使用橡胶细胞刮棒或橡胶淀刮细胞进入上清液收获各救援良好。轻轻拖曳穿过井底部的刮刀。转移细胞和上清液成低温储存管。
- 冷冻/解冻的样品两次，然后通过沉淀细胞碎片在1200 xg离心离心5分钟，4℃。
- 使用过滤0.2微米的针头式过滤器的两倍澄清的上清液。过滤的救援上清液包含病毒。
注意：滤波器孔径大小可以取决于病毒颗粒的尺寸变化，并且可能不适用于大型病毒。 - 从接种的细胞吸出培养基，用无血清培养基洗一次，并加入1毫升新鲜的无血清培养基的各孔中。
- 加入50微升每过滤救援上清液好，轻轻摇动板均匀地分布病毒。
- 孵育在37℃的板对从各2小时，然后吸出介质以及以除去未掺入的病毒。
- 添加1.5-2毫升每孔新鲜完全培养基中，并在37℃孵育直至CPE或报告蛋白是显而易见的（〜24-48小时）。
- 重复步骤2.2.2至2.2.4。过滤救援上清含有病毒的股票。存储病毒储存在低温储存管一次性使用分装在-80°C。
- 在一个6孔板板的细胞，使得它们在感染的时间（24小时后播种）80-90％汇合。
3.从救援微小RNA靶向病毒体外转录的RNA转录
- 生成从质粒DNA编码使用上游启动子的微小RNA靶向病毒基因组RNA转录物。
注：应用于所有后续步骤，用于产生和保持一个无核酸环境标准的做法。 - 使用转录下游的酶切位点线性化的质粒DNA。结合5微克质粒DNA，1×最终浓度的酶缓冲液，3微升限制酶，并把50微升用H 2 O在37℃下反应3小时。
- 添加的0.5M的EDTA 1/20体积1/10体积的5M NH 4乙酸盐，和2体积的100％乙醇的消化反应并混合。孵育在-20℃1小时至过夜。
- 沉淀10分钟的沉淀的DNA在4℃下17000 xg离心。倒掉supernata核苷酸，重悬在冷的70％乙醇500微升沉淀并通过于4℃在17000 xg离心离心10分钟沉淀DNA。
- 30秒再次倒掉上清和离心。用吸管除去残留的上清液并空气干燥沉淀。在0.5-1微克/微升的浓度重悬DNA沉淀在无菌无核酸酶的 H 2 O操作。
- 解冻在室温下在体外转录试剂和放置的核糖核苷酸在冰上（在甘油的酶不冻结，并应直接在冰上）。保持反应缓冲液中于室温。
- 通过组合2微升装配在PCR管中的转录反应的每一个的ATP，CTP，GTP，和UTP溶液，2微升10X反应缓冲液，1微克线性化的DNA，2微升酶，并带来对20μL的用核酸酶的终体积-free H 2 O
- 孵育在37℃下2小时进行反应。
- 净化RNA转录。
- 使转录反应以100μL的用洗脱溶液（未预热）。添加粘合溶液浓缩物的350微升和250微升的100％乙醇，以反应和混合。
- 将样品转移到以12,000×g的插入收集管和离心1分钟的过滤器滤芯。丢弃的流量通过。
- 加的洗涤液500μL到滤筒和离心1分钟，在12,000×克弃流过。重复该洗涤步骤一次。弃流过。在12,0000 XG离心1分钟以去除残留的乙醇。
- 滤筒转移到一个干净的收集管，加入预热的洗提溶液的50微升到滤筒。离心12,000×g下1分钟。重复加入100μl洗脱液续的总体积此洗脱步骤癌宁纯化RNA转录。丢弃过滤器滤芯。
4.通过计算滴定病毒储存50％组织培养感染剂量（TCID 50）
- 板H1-HeLa细胞在96孔板中，每孔10 4个细胞在DMEM补充有10％胎牛血清。孵育细胞在37℃下过夜。
注意：对于许可不表达的microRNA同源病毒复制的细胞滴定病毒。 - 使病毒的10倍系列稀释液各以1毫升无血清的总体积媒体。
注意：如果需要更精确地使用较低的稀释液。
注意：每次稀释后更改提示，以防止滴度高估病毒能够坚持提示。 - 尖端96孔板的侧面和抽吸媒体从铺板的HeLa细胞。添加每每种病毒稀释度的100微升井到96孔板（每稀释1行）的8孔中。加100μL无血清培养基的无病毒排1和板排12的控制。
注：请始终吸并通过触摸尖端能很好的防止细胞分离介质添加到水井。 - 在37℃下孵育板2小时。前端板的一侧和从孔中吸出介质。
注：每个稀释度排之间变化的提示。 - 添加100微升完全培养基的各孔中。在37℃下孵育板72小时。
- 可视显微镜下孔中，并标记每个井阳性或阴性的CPE。
- 计算用下面的公式每种病毒滴度：螺克10（TCID 50 /毫升）= L + D（S-0.5）+日志10（1 / V）。 L是所测试的最集中的病毒稀释，其中所有孔都是正的负log 10。 D是稀释因子的对数10。 S是个体的比例（PI）的总和。圆周率是一个单独的稀释液（阳性孔/每稀释孔的总金额的金额的计算比例。V是种菌的体积（ml /孔）。
表1：通过计算TCID 50 量化感染性病毒颗粒 。从细胞中代表性结果感染的一连串的病毒原液的十倍稀释液。 “L”等于4，因为最后的稀释，所有的水井都积极为CPE 10-4。 “D”是10，因为10倍稀释液的对数10被使用，并且因此等于1的“S”是个体的比例的总和。在本实施例的各个比例是1.0，0.875，0.375，0.125，和0的这些的总和（S）为2.375。的“V”是接种在用于最初感染细胞毫升的体积。
5.评估微小RNA靶向功效：单步生长动力学
- 对于该测定控制包括假感染的细胞，未经修饰的病毒和病毒含有非靶向或无功能的响应元素。
- 板H1-HeLa细胞在12孔组织培养板中的时间过程实验，使得它们在感染的时间（24小时后播种）80-90％汇合。在DMEM板细胞在补充有10％胎牛血清以每孔1mL的。
注：推荐到板为每个时间点的单独板。该协议使用7种不同的时间点为病毒与8-12小时的复制周期。不需要H1-HeLa细胞来执行此一SSAY。该测定应在不表达的靶向微小RNA允许细胞来进行。该测定也可以在表达同源微RNA选择性压力下，以评估生长动力学的细胞进行。 - 从水井吸媒体。通过加入0.5毫升无血清培养基中，以每洗井孔，漩涡的板，和从井抽吸介质。加入0.5毫升新鲜无血清培养基的各孔中。
- 在具有高感染复数感染每个孔（MOI;每个细胞感染性颗粒的数量），以确保所有的细胞被感染。该协议使用3的MOI。
- 稀释病毒储存在无血清培养基以MOI的浓度= 3每100微升。添加100μL的病毒稀释度的各七个不同的孔中，并在37℃孵育2小时。
- 从所有孔吸媒体，并加入0.5毫升完整的媒体，每孔，轻轻摇摆，然后吸洗两次。
- 加入1毫升的complete介质到每个孔中，并孵育在37℃，直到所希望的时间点。
- 在2，4，6，8，10，24和48小时后的感染（每个时间点1孔）收集病毒滴定样本。在阱转移媒体700μL到低温储存管。轻轻移动整个井橡皮刮刀刮去细胞进入剩余的上清液。小区/上清液混合物转移到含有上清液的700微升相应低温储存管。
注意：确保不要从一个刮擦造成污染样品中飞溅期间以及上清液到另一个。转让之前，刮将最大限度地减少飞溅的700微升。 - 在-80℃，将样品直到所有样品的采集。
- 冷冻/解冻样品三次，并通过离心将样品在1200 xg离心在4℃下除去细胞碎片5分钟。
- 滴定病毒作为第4节及以上牛逼比较生长动力学我。
6.评估微小RNA靶向特异性：病毒传播的测定使用合成的microRNA模仿
注：一种合成的microRNA模拟的使用进行显示的microRNA特异性：微RNA为目标的互动。
- 包括模拟转染，阴性对照microRNA的模拟和实验的microRNA模仿只能控制每一个实验，以评估微小RNA介导的毒性。这也是理想，包括阳性对照（ 即微小RNA靶向基因或基因组）的microRNA模仿的低转染效率可能会导致假阴性。
- 板H1-HeLa细胞在96孔组织培养板上，使得它们在转染的时间（24小时后播种）80-90％汇合。在DMEM板细胞以0.1ml每孔补充有10％胎牛血清。
注意：对于许可不表达同源的microRNA病毒复制的细胞执行此法。 - 暖日Ë转染试剂室温。结合9微升无血清培养基，200nM的每微小RNA模拟库存以及终浓度，0.18微升升压试剂，0.18微升转染试剂混合。在室温下孵育该混合物2-5分钟。
注：所列的卷每口井。建议在一个主混合物被组装为所有孔的转染保持一致性和最小化移液误差。微RNA模拟物的最佳浓度会有所不同。参考随附的微小RNA的制造商的说明模仿一个合理的起始浓度。这将一般为5-200纳米的最终浓度。 - 从油井吸媒体，并添加92微升的新鲜完全培养基。
注意：如果有样本的显著数，完成组装转染溶液之前这个步骤，该板在37℃下储存直至准备。 - 加入整个转染混合物我n步6.3到细胞逐滴。
- 孵育在37℃下6小时。
- 感染每口井在低MOI，以确保细胞的比例很低被感染，使病毒传播的分析。该协议使用的0.2的MOI。
- 稀释病毒储存在无血清培养基以MOI的浓度= 0.2每100微升。从井中取出介质，每孔加入病毒稀释的100微升。
- 孵育在37℃下2小时。
- 从每孔吸媒体和补充新鲜完整的媒体的100微升。
- 孵育在37℃进行20-22小时。
- 确定上清液中的病毒滴定。
- 收集从每个孔的上清液，用100μL的新鲜完全培养基更换。
注意：如果使用悬浮细胞，在100微升新鲜完全培养基的接下来的步骤重悬细胞沉淀，并返回到用于活力测定样品井。 - 删除cellu通过在4℃以300 xg离心离心5分钟从收集的上清液拉尔碎屑。
- 转移澄清的上清液到新的管中，并在如第4描述不表达同源微RNA允许细胞滴定感染性病毒。
注：保持冰的所有样本，以防止感染的损失。
- 收集从每个孔的上清液，用100μL的新鲜完全培养基更换。
- 确定细胞的生存能力。
- 添加MTT10μL的（3-（4,5-二dimethylthiazolyl-2）-2,5-二苯基溴化）每孔试剂。
- 孵育在37℃下2-4小时，直到紫色沉淀是可见的。
- 加100μL洗涤剂试剂。
- 在室温下孵育在黑暗中为2小时。
- 在570 nm处读取所有井的吸收。
注：规范化所有样品模拟转染细胞百分比细胞活力的比较。
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Representative Results
表1表示对于一个小核糖核酸病毒典型滴定测定的结果，并说明如何计算50％组织培养感染剂量。在这个手稿所述病毒嗜性的基于微RNA调控的整体概念的示意图期间胞内相互作用，用于退火和质粒的插入响应元件的寡核苷酸的适当的设计示于图1的微RNA的取向，以响应元件，和一个编码用于体外转录的微小RNA靶向病毒基因组的质粒DNA的图图中描绘。 图3示出的RNA转录在不同的通过琼脂糖凝胶电泳显现程度的完整性。作为LINEA内3A车道2所示。残留的杂质正确处理和使用DNA模板泯灭的杂质会导致正常转录的RNA转录授权的DNA模板或核酸的微量可导致类似于在图3A泳道观察到低水平的不正确转录的RNA和/或降解产物的3，含有高量的杂质如残余的乙醇会导致质粒DNA或DNA的不完全线性化在图3A泳道4和5 所示 。 图3表示不当转录和降解产物也显示下列清洁RNA转录物转染Mengovirus介导的细胞病变效应（CPE）的图像。 图4显示的数据代表一个时间过程的实验评估不变并微小RNA靶向Mengovirus的生长动力学。结果表明，工程化到Mengovirus基因组微RNA响应元件不改变病毒复制在H1-HeLa细胞的动力学，其不表达任何同源的microRNA。但是，在的RAW 264.7巨噬细胞，其中表达微小RNA-125的中间级和高水平微小RNA-14的2，病毒编码相应的响应元素显示与微RNA的表达水平抑制了相关动力学的复制。 图5中的数据显示Mengovirus取向的基于微RNA调控的特异性。在H1-HeLa细胞每个个体微RNA的表达特异性地抑制传播（低级病毒滴度）和Mengovirus的细胞毒性（增加细胞活力）编码同源微小RNA响应元素。
图1： 病毒嗜性的基于微RNA调控的示意图。并入病毒基因组中的微RNA响应元素（RE）将由特定的细胞类型中富集的同源微RNA被识别，并导致病毒转录/基因组的靶向降解。这将阻止病毒的复制，传播和毒性为thË周围的细胞。然而，病毒复制将在不表达的同源微RNA允许病毒繁殖，传播和细胞死亡的细胞被维持。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 微RNA应答元件设计。 （ 一 ）对于成功的瞄准RE的种子序列区域应该是完全互补的。对RE应的病毒基因组，使得它可以通过同源成熟微RNA在mRNA转录物和/或病毒基因组被识别内定向。大多数的RE被放置的转录物的3'非编码区中。 （b）编码含有串联的RE适当的设计和退火的寡核苷酸的描写由XhoI限制酶位点的突出端核苷酸侧翼的微RNA靶序列（MIRT）的重复。当设计串联重复资源，一定要包括每一个微小RNA-目标副本之间的间隔核苷酸（一般4-6）。编码（C）的质粒DNA用掺入3'UTR，T7启动子RE和独特的限制性位点线性化用于体外转录的全长病毒基因组中。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 从基因组编码RNA转录病毒的救援。编码小RNA病毒的基因组，以评估成绩单完整性体外转录的RNA（A）RNA凝胶电泳。车道 1：RNA的阶梯。泳道2：正确转录RNA具有很高的完整性。泳道3：RNA转录中度完整性。较高频段是正确的尺寸和更低的频带是一个潜在的降解产物或不希望的RNA转录物。泳道4：不当转录RNA。泳道5：低完整性RNA。 体外转录的RNA的500纳克每孔加载。不当转录或降解产物有可能由于使用低纯度或不完全线性化的DNA。用编码Mengovirus RNA转录转模拟转染的H1-HeLa细胞和细胞（B）的图像。转染试剂只（模拟）的管理将维持细胞活力转染以及通道到新鲜细胞。编码Mengovirus基因组RNA转录物（VMC 24）导致细胞病变效应，这是保持后的上清液和通道的过滤到新鲜的H1-HeLa细胞转染。比例尺= 100微米。ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图 4： 同源的microRNA的存在或不存在不变并微小RNA靶向Mengoviruses的生长动力学。从参考17修改。 （A）H1-HeLa细胞中不表达的miR-124，-125，-142或。所有三个Mengovirus编码微RNA的RE与表示在此位置（5'非编码区）的微小RNA的插入相似动力学与未修饰的病毒（VMC 24）复制不改变病毒的复制。 （B）的RAW 264.7巨噬细胞表达的miR-125B和高水平的miR-142-3p的中间水平，但不表达的miR-124。相应的微RNA靶序列掺入病毒ATT基因组的结果enuation与microRNA表达水平是一致的。数据被表示为平均病毒滴度+/- SD。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5： 用合成的microRNA的microRNA模仿靶向特异性分析。从参考17修改。与个别的microRNA模拟转H1-HeLa细胞在0.2的MOI感染了病毒未修改（VMC 24）或微RNA靶向病毒（MIRT-VMC 24）。 （A）中标准化为模拟处理的细胞的细胞存活率在通过MTT细胞增殖试验后24小时感染测定。在所有样品的上清液（B）中病毒滴度也在24小时后的感染测定。该数据被表示为平均存活率或病毒滴度+/- SD。双尾与韦尔奇的修正非配对t检验（对于不等方差）用于统计分析。 P值<0.01被认为是显著。 （**，P <0.01，***，P <0.001）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
设计，组合物和病毒基因组中的微小RNA应答元件的定位将决定靶向功效和特异性。优化这些将需要试验和错误。然而，设计合理的基础上的RNA结构分析，并在该技术的实施病毒复制和微RNA特征助剂以最少的优化10，11，12，13，38之前的研究。
当发起RE的设计，调查人员应通过编译一组在感兴趣的靶细胞中表达的微小RNA的开始，是减少在感兴趣的非靶细胞，并已通过实验验证。在此之后编译，几个基于预测的分析，应该进行解决竞争的microRNA-圆盾的可能性Ť相互作用。许多病毒编码的微RNA或为了操控病毒和宿主基因表达的螯合细胞微RNA的非编码RNA。此外，一些RNA病毒已经示出，以提高其复制能力39，40与蜂窝微RNA相互作用。因此，在设计时的RE，一定要调查是否有已知病毒的相互作用与细胞的microRNA，或者如果他们表达了可能认识到选择的microRNA靶或改变所选择的微小RNA的内源表达的microRNA病毒。除了文献检索，读者应该考虑网上的生物信息学预测工具和数据库，包括病毒microRNA靶信息RE的合理设计提供帮助。这样的数据库和预测工具也可以方便的通过预多个microRNA的或重叠的种子序列识别靶序列的识别在病毒基因组内发送。有关识别的microRNA目标的方法和一些在线预测工具的利弊进行更深入的讨论，读者可以参考参考41,42。建议将这些预测工具仅作为指导多次预测可以产生假阳性或阴性。为此目的，可能有重叠，但是在3'微小RNA的端也将影响靶向效率种子序列。使用太严格的规则集的有时可能是有害的。
一旦一组潜在的微RNA靶已经确定，研究者应当通过基于所述微RNA和RNA结构的预测10，11，12，13的生物性质居目标继续，EF“> 38。绝对丰度在目标细胞的成熟微小RNA和其与的Argonaute蛋白将决定基因沉默的关联程度的水平。几项研究已经表明，只有大量表达的微小RNA会显著调节基因表达16，43， 44。此外，虽然有些微RNA大量与Argonaute蛋白和地层的RISC的表示它们相互作用不足以抑制翻译44。使用高丰度的微RNA与验证功能也将最小化在靶细胞和随后摘为微小RNA饱和的电位目标毒性。另一种方法可能是使用由多个miRNA的45，46针对性的资源，这可能允许缩小复印数量，同时还减少了对脱靶toxiciti的潜力上课。靶mRNA的微小RNA的比例也会对这种方法的成功显著影响。高目标microRNA的比例将减少42的压制，43，47，48的水平。这与快速复制时，如果不正确地感染期间早期调节将累积到超出内源性的微RNA的对照水平的病毒特别重要。这是必不可少的目标选择的microRNA时要考虑这些属性;理想的是，使用一个微RNA，其功能已被实验证实。
靶基因沉默的效率也受目标到成熟微小RNA的百分比互补性以及插入微小RNA靶序列的拷贝数。微RNA（核苷酸2-8）的5'区构成的种子序列。人们普遍这个区域必须是成功的目标48，49完全互补。大多数研究使用具有完全的互补性反应的元素，因为它可以通过促进转录的核酸内切裂解和微RNA的快速回收增加基因沉默活性。只有当一个微RNA与的Argonaute蛋白具有核酸内切酶活性，其在哺乳动物细胞中被限制的Argonaute-2相互作用，会出现此核酸内切裂解。其它Argonaute蛋白促进脱腺苷和转录物核酸外切攻击mRNA降解。的读者可参考，引用4，5，13 50，51，52为微小RNA生物合成和功能的深入说明。人们普遍认为，增量宽松的拷贝数将进一步增强靶向性。然而，这也可以使可能的microRNA饱和和不总是被证明更有效。它有时是较好掺入靶序列在靶细胞中富集的多个不同的微小RNA或者使用由多个微RNA识别靶序列。所需要的拷贝数也高度依赖于转录的，将需要沉默的量和微小RNA的靶细胞的相对丰度。转录，将迅速累积，可能需要更多的拷贝，以防止它们outcompeting微小RNA水平。实验确定每个微RNA靶，其导致足够的定位的最佳拷贝数，保持病毒健身，以及最小化，建议逃逸突变的速率。
在病毒基因组中的微小RNA响应元件的定位是非常重要的。在分析时，阴性结果靶向效率并不总是意味着病毒不能微小RNA定位。它可以简单地意味着目标不是在该位置访问或靶基因的抑制是不足以抑制致病性。多数反应元件被插入到靶向转录物的3'非翻译区（UTR）。然而，病毒基因组的成功的定位已完成，并当响应元件被插入到5'非编码区或必需基因38的编码区域内有时表现出增强的遗传稳定性。最佳的插入位点将使靶序列的微小RNA的高可达性。辅助可以通过RNA二级结构和化学计量的干扰受到阻碍。因此，在非结构化地区的本地化响应元素是高度保守的是一个很好的起点。被插入的序列也可以影响和由周围序列的影响。 ŧHUS，对于一个微RNA靶序列的最佳位置是不为其他反应元件不一定最佳。虽然稀土本地化实验验证和优化是必要的，使用预测软件（如http://unafold.rna.albany.edu/; http://rna.urmc.rochester.edu/software.html）来筛选潜在插入位点周围的RNA结构的扰动强烈推荐53,54。
使用高完整性的清洁核酸制剂也是获得最佳效果的关键。一个无RNA酶环境的无菌技术操作和维修搬运RNA转录或微小RNA模仿时是必不可少的。为了获得最佳效果的RNA转录，微小RNA模仿和最终滴定病毒储存应储存在-80°C，在小分装以避免反复冻融导致RNA降解和病毒感染的损失。在使用时，这些试剂小号应始终保持在冰上。
要注意的是许多微RNA是一个家庭共享的互补性的微小RNA的成员是很重要的。因此在进行研究时，它可能是有利的，以包括直接微小RNA家族的成员，以改善靶向特异性的评价。这变得很关键，当其内病毒复制需要的细胞，表达家族（ 如的miR-Let7家族）的成员。还应当指出的是，使用微RNA模仿的特异性测定是人工系统和过度表达在某些细胞中微小RNA可能导致脱靶效应55。如果发生这种情况，特异性也可以在表达用微RNA抑制剂代替相应的微RNA的细胞进行评价。该测定将允许基于病毒滴定和细胞生存力读数中微RNA的生理相关水平的存在靶向特异性的分析。
10，11，12，13病毒介导的作用。许多病毒具有高突变率和逃避突变可能会迅速出现。包括靶序列的多个拷贝，其中包括一个以上的微RNA靶，本地化多个高度保守的区域内的目标，或者额外抗病因子的存在，包括免疫应答可缓解此。此外，外源遗传物质插入到病毒基因组中通常会导致病毒的减弱复制能力。如果发生这种情况，微RNA靶可能是遗传上不稳定和逃避突变体将产生更迅速。多个microRNA靶副本CA纳入ñ还增加对microRNA的目标recombinatorial删除的潜力。因此，对于足够定位所需的最小副本数的实验测定是必要的。本地化在不同地点microRNA靶拷贝整个基因组与使用串联重复序列可以绕过这个约束帮助。然而，识别与所需靶拷贝和插入位点的最小数目不导致病毒的改变的复制动力学最优RE配置为最小化重组和目标突变率的关键。如果它导致微RNA饱和的靶序列的太多副本列入也可能会增加对脱靶毒性的潜力。微RNA可用于调节正常细胞的蛋白质可能会导致不良影响55量的一个主要改变。为此，许多病毒改变小区56内，并且，如果这微小RNA环境包括靶向微小RNA，如果有足够的病毒复制被保持调节的效率可能会降低。所有的这些问题可以通过优化反应元件组合物和/或定位并与系统的透彻理解成为目标和它的局限性来解决。
与其他定位方法相关的典型问题包括病毒的脱靶衰减，对于有限的承受能力，以及与工程病毒有关的安全问题病毒的基因靶向材料尺寸的限制目标通常不感染的细胞。微RNA靶向允许与病毒稍加修改病毒嗜性的调节。它需要一个病毒基因组中最小的空间，可以根据细胞微RNA特征的一个广阔的阵列上进行定制。该技术不为病毒引入新向性，因此不会引入任何新的安全问题。此外，此方法可用于通过靶序列的不同类型的细胞16，17，57，58，59，60，61中富含多种不同的microRNA同时调节多向性。这都可以不用在不表达相应的微RNA，因此可用于改善与增强的效力的治疗病毒的安全性的机制的细胞衰减病毒来完成。
蜂窝微RNA机械开采可用于调节许多不同的类病毒的嗜性。这里详细的协议是根据病毒“复制周期和具体的记者REA专为微小RNA靶向小核糖核酸病毒的救援和表征，但他们可以适应douts。虽然不同的病毒具有特定的救援策略，微RNA的靶序列可以被插入到病毒基因组不管整个基因组是否在一个单一的质粒或病毒是否有DNA或RNA的基因组编码。只要生产者细胞不表达同源的microRNA，优化小RNA的目标不应该破坏病毒拯救。实验分析病毒生长动力学和微小RNA靶向特异性可以通过改变所收集的时间点基于单个圆形病毒复制的长度和对病毒复制/毒性特定读数（ 例如报告蛋白，细胞毒性，基因组量化进行修改， 等 ）。要注意的是，虽然该技术可以在理论上被应用到的病毒的所有类，许多因素可以影响该方法的效率是重要的。例如，负链RNA病毒还没有由于有限的交流证明可能作为响应作为正链RNA病毒基因组RNA与miRNA机械13的cessibility。因此，每个类的病毒的生物学性质会赋予对稀土优化额外的约束。尽管有这些限制，该技术提供了用于靶向病毒嗜性促进研究涉及安全，效用，以及病毒的所有类的生物过程的基本理解的替代方法。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RE encoding Oligonucleotides | IDT | PAGE-Purified Ultramer | Sequence Designed by Investigator |
| Oligonucleotides encoding unique restriction site | IDT | 25nM | Sequence Designed by Investigator |
| Expand High Fidelity PCR Kit | Sigma Aldrich | 11732641001 | Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available |
| T4 DNA Ligase System | NEB | M0202S | |
| MEGAscript Kit | ThermoFisher Scientific | AM1333 | |
| MEGAclear Kit | ThermoFisher Scientific | AM1908 | |
| 0.5 M EDTA | ThermoFisher Scientific | AM9260G | RNase-free |
| 5 M NH4 Acetate | ThermoFisher Scientific | N/A | Comes in MEGAclear Kit |
| Ethanol | ThermoFisher Scientific | BP2818100 | |
| Nuclease-free Water | Fisher Scientific | AM9938 | |
| TransIT-2020 Transfection Reagent | Mirus | MIR 5404 | |
| TransIT-mRNA Transfection Reagent | Mirus | MIR 2225 | |
| 0.2 μm syringe filter | Millipore | SLGP033RS | |
| 2 ml Screw-Cap Tubes | Sarstedt | 72.694.005 | |
| Cell Scrapers | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| MicroRNA Mimics | Dharmacon | Varied | |
| MTT Cell Proliferation Assay | ATCC | 30-1010K | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | ThermoFisher Scientific | 18265017 | |
| pBlueScript II Vectors | Agilent Technologies | Variable (e.g. 212205) | There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription. |
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