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Immunology and Infection

Regolamento MicroRNA basata su Picornavirus Tropismo

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/55033
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic College of Medicine

Introduction

Lo sviluppo di un metodo ampiamente applicabile, facile ed efficace per ingegneria un vettore con tropismo limitata offre una grande opportunità per migliorare la sicurezza, la comprensione biologica e l'utilità terapeutica del virus. Diversi meccanismi esistono per indirizzare tropismo virale tra cui trasduzionali, trascrizione, e le tecniche di traslazionali-based. Tuttavia, questi metodi non sono generalmente applicabili a tutti i sistemi vettoriali, può richiedere vie di segnalazione difettosi in cellule bersaglio o richiedere l'inserimento di grandi sequenze codificanti nel genoma virale. Inoltre, questi metodi possono provocare un'attenuazione del virus, ostacolando significativamente la loro attività terapeutica e limitando la visibilità nel sistema non modificato.

I microRNA sono piccole (22-25 nucleotidi), RNA non codificanti che mediano silenziamento genico nelle cellule eucariotiche. funzione di microRNA legandosi sequenze target complementari (elementi di risposta) in RNA messaggero (mRNA) resulti ng in trascrizione di destabilizzazione, il degrado o la repressione traslazionale. I microRNA normalmente si legano elementi di risposta con complementarità parziale e cedono piccole modifiche nell'espressione genica 1, 2, 3, 4, 5. Più significative alterazioni nell'espressione genica possono essere realizzati aumentando complementarietà dell'elemento risposta 6. Migliaia di microRNAs mature sono state identificate in una varietà di specie e molti modelli di espressione mostra differenziali in una varietà di cellule e tessuti tipi 7, 8, 9. Queste firme microRNA possono essere sfruttati per la restrizione specifica delle cellule di amplificazione del virus, incorporando elementi di risposta perfettamente complementari nel genoma virale 10,= "xref"> 11, 12, 13. L'obiettivo generale di questa tecnica di microRNA-targeting è quello di controllare il tropismo di un genoma vettore senza attenuazione supplementare.

L'utilità di questo metodo per regolare tropismo virale è stato originariamente dimostrata in vettori lentivirali per limitare l'espressione del transgene in tessuti specifici 14, 15, 16. Questa tecnica è stata successivamente applicato ad un'ampia gamma di replicare e non replicanti vettori virali per la terapia genica intenso nonché per migliorare i profili di sicurezza di molti virus oncolitici eliminando tossicità indesiderati nei tessuti normali 10, 11, 12, 13, 17 . E 'stato anche utilizzato per generare e sicura effective vaccini vivi attenuati, nonché per migliorare virus e produzione di vaccini processi 18, 19, 20, 21. MicroRNA-targeting di un vettore può consentire per l'attenuazione in ospiti vaccinati o sistemi mirati, pur mantenendo livelli di crescita wild-type in sistemi di produttori. MicroRNA targeting può essere utilizzato anche per migliorare la sicurezza biologica del virus per scopi di ricerca, limitando la trasmissione in una specie (ad esempio, gli esseri umani), pur mantenendo la trasmissione in altri host 22. Infine, microRNA-targeting possono consentire approfondite analisi del ciclo di vita virali e ruoli specifici di tipi di cellule nella patogenesi e immunità segregando crescita virale 23, 24, 25, 26.

Questa tecnica offre un alternative metodo che viene facilmente implementata e applicabile il targeting per tutti i sistemi di virus. Inoltre, la collezione in continua espansione dei microRNA maturi con pattern di espressione differenziali in specifici tipi cellulari rende questa tecnica molto versatile. MicroRNA basata Targeting è dimostrato efficace per una varietà di sistemi di virus senza compromettere la funzione di sistema. I principali limiti di questa tecnica sono tentativi ed errori di ottimizzazione, il potenziale di mutazioni di fuga, e potenziali effetti fuori bersaglio sulla trascrizioni endogene. Tuttavia, queste limitazioni possono generalmente essere superati con design ottimizzato e razionale elemento di risposta. virus a RNA positivo-senso tendono ad essere particolarmente sensibili alle microRNA-targeting causa dell'orientamento positivo-senso della loro genoma e la disponibilità dei trascritti ai macchinari microRNA durante il ciclo di replica completamente citoplasmatica. Qui si descrive un protocollo per la generazione di Picornavirus microRNA-mirata e la sperimMetodi ental per verificare l'efficienza e la specificità di tale targeting in vitro.

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Protocol

1. La clonazione microRNA Risposta elementi nel genoma virale

  1. Progettazione microRNA elemento di risposta inserti.
    1. Identificare il microRNA desiderata e la corrispondente sequenza bersaglio. Diverse banche dati sono disponibili con sequenze microRNA maturi. Consigliato: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30.
  2. Clonare l'elemento di risposta in plasmide DNA che codifica del genoma vettore o di trascrizione.
    NOTA: per due o più elementi di risposta copia con un sito di restrizione unico per l'inserimento è più facile e più versatile.
    1. Inserire elemento di risposta o sito di restrizione unico con estensione giuntura-sovrapposizione (SOE) PCR. Questo metodo è stato descritto in dettaglio 31.
    2. Se si utilizza un sito di restrizione per l'inserimento, purinseguire commercialmente sintetizzato, senso PAGE-purificato e ultramers antisenso che codificano le sequenze dell'inserto fiancheggiate dalle sequenze sporgenza del sito di restrizione unico (Figura 2).
    3. Combinare 0,5 mg senso ultramer, 0,5 mg antisenso ultramer, tampone di ligasi del DNA di concentrazione finale di 1x, e portare a 50 ml con H 2 O. ricuocere i ultramers incubando la reazione a 85 ° C per 10 min e quindi ridurre la temperatura di 0,5 ° C ogni 30 sec finché la reazione raggiunge i 25 ° C.
    4. Combinare 0,5 mg di DNA vettore codificante il nuovo sito di restrizione unico, buffer di enzima ad una concentrazione finale 1x, 1 ml di enzima di restrizione adeguato, e portare a volume finale di 20 microlitri con H 2 O. Digest vettore a 37 ° C per 2 ore. Purificare il DNA linearizzato dal gel di purificazione 32.
    5. Legare le ultramers ricotto nel vettore digerito durante la notte a 16 °; C usando un 3: 1 ultramers: rapporto molare vettore e le tecniche di legatura standard di 33.
      NOTA: Quando si utilizza un singolo sito di restrizione enzimatica per l'inserimento può essere più efficace di defosforilare estremità del vettore digerito e fosforilare le estremità dei oligonucleotidi ricottura.
    6. Trasformare il DNA legatura in E. coli con il metodo shock termico 34.
      NOTA: I plasmidi che codificano genomi virali sono generalmente grandi, quindi, utilizzando le cellule competenti ottimizzati per l'assorbimento di grandi costrutti di DNA può aumentare l'efficienza di trasformazione.
    7. Purificare DNA plasmidico da singole colonie utilizzando un kit di purificazione disponibile in commercio 35. Identificare un clone del caso con l'elemento di risposta microRNA con l'orientamento corretto (Figura 2) sequenziando la regione inserto 36.

2. Salvataggio microRNA-mirato Picornavirus from plasmidi DNA

  1. Picornavirus Rescue microRNA-mirata in una linea di cellule permissive per la replicazione del virus che non esprime il microRNA cognate (s). Questo protocollo utilizza cellule HeLa H1-perché non esprimono miR-142, miR-124, miR-125 o, comunque, non è necessaria per utilizzare le cellule HeLa H1-per il salvataggio.
    ATTENZIONE: Tutte le linee guida per la manipolazione e lo smaltimento di agenti infettivi devono essere seguite di conseguenza.
    1. cellule Piastra H1-HeLa in un 6-pozzetti in modo tale che essi sono ~ 80% confluenti al momento della trasfezione (24 ore dopo la semina). cellule piastra in 2 mL per pozzetto di DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino.
    2. Riscaldare il reagente di trasfezione a temperatura ambiente. Unire 250 microlitri mezzi privi di siero, 2.5 mg di plasmide DNA codificante del genoma microRNA-mirati, e 7.5 ml di reagente di trasfezione in una provetta sterile e pipetta delicatamente per miscelare. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 15-30 min.
    3. Aspirare ilsupporti dalle cellule placcato e aggiungere 2 ml di mezzi freschi completo.
    4. Aggiungere l'intera miscela di trasfezione dal punto 2.1.2 a un pozzo della 6-pozzetti goccia a goccia. Aggiungere ogni goccia di una diversa area del pozzo.
    5. Incubare le cellule a 37 ° C fino effetto citopatico (CPE) o proteine ​​reporter sono rilevabili (~ 24-72 h).
  2. Harvest e il passaggio del virus in salvo sulle cellule fresche.
    1. cellule piastra in una piastra da 6 pozzetti in modo che siano 80-90% confluenti al momento dell'infezione (24 ore dopo la semina).
      NOTA: Scale alto o in basso a seconda della quantità di virus necessaria per tutti gli esperimenti successivi.
    2. Raccolto ogni salvataggio ben raschiando le cellule in surnatante con un raschietto cellulare gomma o poliziotto in gomma. trascinare delicatamente il raschiatore attraverso il fondo del pozzo. Trasferire le cellule e il surnatante in un tubo di stoccaggio criogenico.
    3. Congelamento / scongelamento dei campioni due volte e poi pellet l'detriti cellulari dacentrifugazione a 1200 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    4. Filtrare il surnatante eliminato due volte con 0,2 micron filtri per siringa. Il supernatante salvataggio filtrato contiene il virus.
      NOTA: Filtro dimensione dei pori può variare a seconda delle dimensioni delle particelle virali e può non essere applicabile per grandi virus.
    5. mezzi Aspirare dalle cellule placcato, lavare una volta con mezzi privi di siero e aggiungere 1 ml di mezzi freschi senza siero in ciascun pozzetto.
    6. Aggiungere 50 ml per pozzetto di surnatante salvataggio filtrato e rock delicatamente la piastra per distribuire uniformemente il virus.
    7. Incubare la piastra a 37 ° C per 2 ore e dei media poi aspirato di ogni bene per rimuovere il virus senza personalità giuridica.
    8. Aggiungere 1,5-2 ml di mezzi freschi completo per pozzetto e incubare a 37 ° C fino CPE o reporter di proteine ​​sono evidenti (~ 24-48 h).
    9. Ripetere i punti 2.2.2 a 2.2.4. Filtrato surnatante salvataggio contiene virus magazzino. le riserve di virus Conservare in aliquote monouso in tubi di stoccaggio criogenico a -80 °C.

3. Salvataggio Virus microRNA mirati da trascritto in vitro RNA trascrizioni

  1. Generare trascritti di RNA da DNA plasmide che codifica del genoma virale microRNA-mirata utilizzando un promotore a monte.
    NOTA: le pratiche standard per generare e mantenere un ambiente privo di nucleasi dovrebbero essere utilizzati per tutte le fasi successive.
  2. Linearizzare DNA plasmide utilizzando un sito di enzima di restrizione a valle della trascrizione. Combinare 5 mg di DNA plasmidico, tampone concentrazione dell'enzima finale 1x, 3 microlitri enzima di restrizione e portare a 50 ml con H 2 O. Incubare la reazione a 37 ° C per 3 ore.
  3. Aggiungere 1/20 volume di 0,5 M EDTA, 1/10 volume di 5 M NH 4 acetato, e 2 volumi di etanolo 100% per la reazione digerito e mescolare. Incubare a -20 ° C per 1 h fino a tutta la notte.
  4. Pellet il DNA precipitato per 10 minuti a 17.000 xg a 4 ° C. Eliminare il supernatant, risospendere il pellet in 500 ml di etanolo al 70% freddo e pellet del DNA per centrifugazione a 17.000 xg per 10 min a 4 ° C.
  5. Eliminare il surnatante e centrifugare nuovamente per 30 sec. Rimuovere il surnatante residuo con una pipetta e aria asciugare il pellet. Risospendere il pellet di DNA in sterili H priva di nucleasi 2 O ad una concentrazione di 0,5-1 mg / mL.
  6. Scongelare il vitro reagenti in trascrizione a temperatura ambiente e posizionare i ribonucleotidi sul ghiaccio (enzimi in glicerolo Non congelare e dovrebbero andare direttamente sul ghiaccio). Mantenere il tampone di reazione a temperatura ambiente.
  7. Montare la reazione di trascrizione in un tubo di PCR combinando 2 ml ciascuno di ATP, CTP, GTP, e soluzioni UTP, 2 microlitri 10x tampone di reazione, 1 ug di DNA linearizzato, 2 microlitri enzima, e portare ad un volume finale di 20 microlitri con nucleasi H-free 2 O.
  8. Incubare la reazione a 37 ° C per 2 ore.
  9. Purificare i trascritti di RNA.
  10. Portare la reazione di trascrizione a 100 microlitri della soluzione di eluizione (non-preriscaldato). Aggiungere 350 ml di Binding Solution concentrato e 250 ml di etanolo al 100% per la reazione e mescolare.
  11. Trasferire il campione ad una cartuccia filtro inserito in un tubo di raccolta e centrifugare per 1 min a 12.000 x g. Gettare il flow-through.
  12. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di lavaggio per la cartuccia del filtro e centrifugare per 1 min a 12.000 x g. Eliminare flow-through. Ripetere questa fase di lavaggio ancora una volta. Eliminare flow-through. Centrifugare per 1 min a 12,0000 xg per rimuovere l'etanolo residuo.
  13. Trasferire la cartuccia del filtro in una provetta di raccolta pulita e aggiungere 50 ml della soluzione di eluizione preriscaldato alla cartuccia del filtro. Centrifugare per 1 min a 12.000 x g. Ripetere questo passaggio di eluizione per un volume totale di 100 ml di eluente containing trascritti di RNA purificati. Gettare il filtro-cartuccia.
  • Determinare la concentrazione di RNA nel eluente misurando l'assorbanza del campione a 260 e 280 nm ed utilizzando la legge di Lambert-Beer.
  • Valutare l'integrità dell'RNA utilizzando RNA gel elettroforesi 37. Vedere la Figura 3 per esempi di bene e male l'integrità dell'RNA. RNA dovrebbe essere in aliquote in provette monouso e conservato a -80 ° C per mantenere l'integrità.
  • reagenti di trasfezione caldi a temperatura ambiente. Unire 250 microlitri mezzi senza siero, 2.5 mg di trascritti di RNA purificati, 5 ml di soluzione di spinta, e 5 ml di reagente di trasfezione in una provetta sterile e pipetta delicatamente per miscelare. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 2-5 min.
  • cellule Piastra H1-HeLa in un 6-pozzetti in modo tale che essi sono ~ 80% confluenti al momento della trasfezione (24 ore dopo la semina). cellule piastra in 2 ml per pozzetto di DMEM supplementato con 10% fetsiero bovino al.
  • Aspirare il supporto dalle cellule placcato e aggiungere 2 ml di mezzi freschi completo.
  • Aggiungere l'intera miscela di trasfezione dal punto 3.12 a un pozzo della 6-pozzetti goccia a goccia. Aggiungere ogni goccia di una diversa area del pozzo.
  • Incubare le cellule a 37 ° C fino effetto citopatico (CPE) o proteine ​​reporter sono rilevabili (~ 24-72 h).
  • Continuare salvataggio del virus microRNA mirati come descritto nei punti 2.2 a 2.2.9.

    • 4. titolazione riserve di virus calcolando il 50% del tessuto-cultura infettiva Dose (TCID50)

    1. Cellule Piastra H1-HeLa in una piastra a 96 pozzetti a 10 4 cellule per pozzetto in DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino. Incubare le cellule a 37 ° C durante la notte.
      NOTA: Titolare virus nelle cellule permissive per la replicazione del virus che non esprimono microRNA affini.
    2. Fare 10 volte diluizioni seriali del virus ciascuno in un volume totale di 1 ml di senza sieromedia.
      NOTA: utilizzare diluizioni inferiori se è richiesta una maggiore precisione.
      NOTA: Modificare suggerimenti dopo ogni diluizione per prevenire sovrastima del titolo come virus può attaccare alle punte.
    3. Tip 96 pozzetti per il supporto laterale e aspirato da cellule HeLa placcato. Aggiungere 100 ml di ogni diluizione di virus per pozzetto a 8-pozzetti di 96 pozzetti (1 riga per diluizione). Aggiungere 100 ml di mezzi senza siero, senza virus per riga 1 e la riga 12 sulla piastra per i controlli.
      NOTA: Sempre aspirato e aggiungere media per pozzi toccando punta al lato del bene per evitare il distacco delle cellule.
    4. Incubare la piastra a 37 ° C per 2 ore. Piastra punta di lato e aspirare i media dai pozzi.
      NOTA: Modificare le punte tra ogni fila di diluizione.
    5. Aggiungere 100 ml di completo media per ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C per 72 ore.
    6. Visualizza i pozzi sotto un microscopio e contrassegnare ogni bene positiva o negativa per il CPE.
    7. Calcolare ogni titolo virale con la seguente equazione: Log 10 (TCID50 / ml) = L + D (S-0,5) + log 10 (1 / V). L è il logaritmo negativo 10 della diluizione virus più concentrata testato in cui tutti i pozzetti sono positivi. D è il registro 10 del fattore di diluizione. S è la somma delle singole percentuali (PI). pi è la percentuale calcolata di una diluizione individuale (quantità di pozzetti positivi / quantità totale di pozzetti per diluizione. V è il volume di inoculo (ml / pozzetto).

    Tabella 1
    Tabella 1: Quantificare particelle virali infettive calcolando la TCID50. I risultati rappresentativi da cellule infettate con una serie di Dieci diluizioni di uno stock di virus. "L" corrisponde a 4 perché l'ultima diluizione dove tutti i pozzetti sono positivi per CPE è 10 -4. "D" è il registro 10 di diluizioni 10 dal 10-foldsono stati utilizzati ed è quindi pari a 1. "S" è la somma delle singole percentuali. In questo esempio le singole proporzioni sono 1,0, 0,875, 0,375, 0,125, e 0. La somma di questi (S) è 2.375. "V" è il volume di inoculo in ml utilizzati per infettare le cellule inizialmente.

    5. Valutare efficacia microRNA-targeting: Cinetica Single-step di crescita

    1. Controlli per questo test includono cellule mock-infettate, il virus non modificato e il virus che contengono un elemento di risposta non mirati o non funzionale.
    2. cellule HeLa-H1 placca per un esperimento andamento nel tempo nei 12 pozzetti di coltura tissutale, che sono 80-90% confluenti al momento dell'infezione (24 ore dopo la semina). cellule portapiatti in DMEM supplementato con 10% siero bovino fetale a 1 ml per pozzetto.
      NOTA: consigliato al piatto un piatto a parte per ogni punto di tempo. Questo protocollo utilizza 7 diversi punti di tempo per un virus con un ciclo di replicazione 8-12 ore. cellule HeLa-H1 non sono tenuti a eseguire questa unassay. Questo test deve essere eseguito in cellule permissive che non esprimono i microRNA mirati. Questo test può essere eseguita anche in cellule che esprimono i microRNA affini per valutare cinetica di crescita sotto pressione selettiva.
    3. supporti Aspirare da pozzi. Lavare i pozzetti con l'aggiunta di 0,5 ml di mezzo privo di siero in ogni pozzetto, agitare la piastra, e dei media aspirato dai pozzi. Aggiungere 0,5 ml di mezzi freschi senza siero in ciascun pozzetto.
    4. Infect ciascun pozzetto ad alta molteplicità di infezione (MOI; numero di particelle infettive per cellula) per garantire tutte le cellule vengono infettati. Questo protocollo utilizza un MOI di 3.
      1. Diluire le riserve di virus nei mezzi senza siero ad una concentrazione di MOI = 3 per 100 ml. Aggiungere 100 ml di diluizioni di virus ciascuno a sette pozzi diversi e incubare a 37 ° C per 2 ore.
      2. Aspirare il supporto da tutti i pozzetti e lavare due volte con l'aggiunta di 0,5 ml di completo supporto per pozzetto, dondolo delicatamente e poi aspirare.
    5. Aggiungere 1 ml di cmezzi omplete in ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C fino a punto di tempo desiderato.
    6. Raccogliere campioni per titolazione virale a 2, 4, 6, 8, 10, 24 e 48 ore dopo l'infezione (1 pozzetto per punto di tempo). Trasferire 700 ml di mezzi di comunicazione nel pozzo di un tubo di stoccaggio criogenico. Raschiare le cellule in surnatante rimanente spostando delicatamente un raschietto di gomma su tutto il bene. Trasferire la miscela di cellule / surnatante al tubo di stoccaggio criogenico corrispondente contenente 700 ml di surnatante.
      NOTA: Assicurarsi di non schizzare surnatante da un pozzo in un altro durante la raschiatura con conseguente campioni contaminati. Trasferire i 700 ml prima di raschiare ridurrà al minimo gli spruzzi.
    7. I campioni a -80 ° C fino a quando tutti i campioni vengono raccolti.
    8. Congelamento / scongelamento dei campioni tre volte e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione dei campioni a 1200 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    9. Titolare il virus come descritto nella sezione 4 e confrontare cinetica di crescita su time.

    6. Valutare microRNA-targeting Specificità: Mimics microRNA sintetico Virus-diffusione Assay Utilizzando

    NOTA: l'uso di una mimica microRNA sintetico viene eseguita per mostrare la specificità del microRNA: interazione microRNA-bersaglio.

    1. Includi trasfezione finto, microRNA controllo negativo imitano e microRNA sperimentali imitano solo i controlli per ogni test per valutare la tossicità microRNA-mediata. E 'ideale anche per includere un controllo positivo (cioè gene microRNA-mirati o genoma) a partire efficienza di trasfezione di imita microRNA può portare a falsi negativi.
    2. cellule Piastra H1-HeLa in una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti tale che sono 80-90% confluenti al momento della transfezione (24 h post-semina). cellule portapiatti in DMEM supplementato con 10% di siero bovino fetale a 0.1 ml per pozzetto.
      NOTA: Eseguire questo test in cellule permissive per la replicazione virale che non esprimono i microRNA affini.
    3. warm °e trasfezione reagenti a temperatura ambiente. Combina mezzi privi di siero 9 microlitri, 200 Nm concentrazione finale per pozzetto di microRNA magazzino mimica, 0,18 ml spinta reagenti, 0,18 ml di reagente di trasfezione e mescolare. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 2-5 min.
      NOTA: I volumi indicati si intendono bene. Si raccomanda che una master mix montato per trasfezione di tutti i pozzetti di mantenere la coerenza e ridurre al minimo l'errore di pipettamento. La concentrazione ottimale di microRNA mimica varierà. Consultare le istruzioni del produttore che accompagnano il microRNA imitano per una concentrazione di partenza ragionevole. Questo in genere compreso tra 5-200 concentrazioni finali nM.
    4. Aspirare il supporto dai pozzi e aggiungere 92 ml di mezzo fresco completo.
      NOTA: Se ci sono un numero significativo di campioni, completare questo passaggio prima di assemblare la soluzione di trasfezione e conservare la piastra a 37 ° C fino al momento.
    5. Aggiungere l'intero i miscela di trasfezionen passo 6.3 alle cellule goccia a goccia.
    6. Incubare a 37 ° C per 6 h.
    7. Infettare ogni bene ad un basso MOI per garantire una bassa percentuale di cellule vengono infettati per consentire l'analisi di diffusione del virus. Questo protocollo utilizza un MOI di 0,2.
      1. Diluire le riserve di virus nei mezzi senza siero ad una concentrazione di MOI = 0,2 per 100 ml. Rimuovere i supporti dai pozzi e aggiungere 100 ml di diluizioni di virus per pozzetto.
      2. Incubare a 37 ° C per 2 ore.
    8. supporti Aspirare di ogni bene e aggiungere 100 ml di mezzi freschi completo.
    9. Incubare a 37 ° C per 20-22 h.
    10. Determinare la titolazione del virus nei surnatanti.
      1. Raccogliere il surnatante da ogni pozzetto e sostituirlo con 100 ml di mezzi freschi completo.
        NOTA: Se si utilizza cellule in sospensione, risospendere il pellet cellulare dal passo successivo in 100 ml di mezzi freschi completi e tornare per assaggiare bene per test di vitalità.
      2. rimuovere Celludetriti lar da surnatanti raccolti per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C.
      3. Trasferire il surnatante eliminato in una nuova provetta e titolare virus infettivo sulle cellule permissive che non esprimono i microRNA affini come descritto nella sezione 4.
        Nota: tenere tutti i campioni in ghiaccio per evitare la perdita di infettività.
    11. Determinare la vitalità delle cellule.
      1. Aggiungere 10 ml di MTT (3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) reagente per bene.
      2. Incubare a 37 ° C per 2-4 h fino precipitato viola è visibile.
      3. Aggiungere 100 ml di reagente detergente.
      4. Incubare a temperatura ambiente al buio per 2 h.
      5. Leggere l'assorbanza di tutti i pozzetti a 570 nm.
        NOTA: Normalizza tutti i campioni per deridere cellule trasfettate per il confronto della vitalità cellulare per cento.

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    Representative Results

    La tabella 1 rappresenta i risultati tipici di un test di titolazione per Picornavirus e descrive come calcolare la dose infettante coltura tissutale del 50%. Una rappresentazione schematica del concetto generale di regolazione microRNA a base di tropismo virale descritto in questo manoscritto è mostrato in Figura 1. L'orientamento di microRNA all'elemento di risposta durante le interazioni intracellulari, corretta progettazione di oligonucleotidi elemento di risposta per l'inserimento ricottura e plasmide, e mappa di plasmide DNA codificante un genoma virale microRNA targeting per la trascrizione in vitro è illustrato nella figura 2. la figura 3 mostra trascritti di RNA in vari gradi di integrità visualizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio. Corretta gestione e l'uso del DNA templates privo di impurità si tradurrà in trascritti di RNA correttamente trascritte come mostrato nella 3A corsia 2. impurità residue all'interno della lineatemplates DNA rizzato o tracce di nucleasi possono determinare bassi livelli di RNA trascritto impropriamente e / o prodotti di degradazione simile a quello osservato in 3A corsia 3. linearizzazione incompleta del DNA plasmidico o DNA contenenti elevate quantità di impurità come etanolo residuo provocherà improprie di trascrizione e di degradazione prodotti rappresentati nelle corsie 3A 4 e 5. la figura 3 mostra anche un'immagine di effetti citopatici Mengovirus-mediata (CPE) seguito trasfezione di trascritti di RNA puliti. Figura 4 mostra i dati rappresentativi di un esperimento naturalmente tempo a valutare la cinetica di crescita di non modificato e microRNA-mirato Mengovirus. I risultati mostrano che gli elementi di risposta microRNA ingegnerizzati nel genoma Mengovirus non alterano la cinetica della replicazione virale nelle cellule H1-HeLa, che non esprimono nessuno dei microRNA affini. Tuttavia, in RAW 264.7 macrofagi, che esprimono livelli intermedi di microRNA-125 e alti livelli di microRNA-142, i virus che codificano per gli elementi di risposta corrispondente visualizzazione cinetica replica inibiti che correla con il livello di microRNA espresso. I dati nella Figura 5 mostra la specificità della regolazione microRNA a base di Mengovirus tropismo. Sovraespressione di ogni singolo microRNA in cellule HeLa-H1 inibisce specificamente propagazione (titoli del virus inferiori) e citotossicità (aumento della vitalità cellulare) del Mengovirus codifica dell'elemento risposta microRNA cognate.

    Figura 1
    Figura 1: Rappresentazione schematica della regolazione microRNA a base di tropismo virale. elementi di risposta MicroRNA (RE) incorporati in un genoma virale saranno riconosciuti da microRNA cognate arricchiti entro specifici tipi cellulari e determinano degrado mirata dei virali trascrizioni / genomi. Questo replicazione del virus impedirà, la diffusione e la tossicità in Oce che circonda le cellule. Tuttavia, la replicazione virale sarà mantenuto in cellule che non esprimono i microRNA cognate consentendo la propagazione del virus, la diffusione e la morte cellulare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    figura 2
    Figura 2: MicroRNA disegno elemento di risposta. (A) Per il successo di mira la regione di sequenza seme del RE dovrebbe essere perfettamente complementari. Il RE deve essere orientato all'interno del genoma virale, che può essere riconosciuto dal cognate maturo microRNA in trascritti di mRNA e / o del genoma virale. La maggior parte delle ER sono collocati all'interno UTR 3 'dei trascritti. (B) Rappresentazione di oligonucleotidi correttamente progettati e ricotto codificano ER contenenti tandemripetizioni delle sequenze microRNA bersaglio (Mirt) fiancheggiate da nucleotidi sporgenti del sito enzima di restrizione XhoI. Durante la progettazione di tandem repeat ER, assicurarsi di includere nucleotidi distanziatori (generalmente 4-6) tra ogni copia microRNA-bersaglio. (C) Plasmid DNA che codifica un genoma virale full-length con una RE incorporato nel 3 'UTR, un promotore T7, e un sito di restrizione unico per linearizzazione per la trascrizione in vitro. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 3
    Figura 3: Salvataggio di virus da trascritti di RNA genoma-codifica. Elettroforesi su gel (A) RNA in vitro RNA trascritti che codificano genomi picornavirus per valutare l'integrità trascrizione. corsia 1: scala di RNA. Corsia 2: correttamente trascritto RNA con elevata integrità. Corsia 3: trascritti di RNA con integrità moderata. banda superiore è corretta dimensione e la fascia inferiore è potenzialmente un prodotto di degradazione o di una trascrizione di RNA indesiderato. Corsia 4: non correttamente trascritto RNA. Corsia 5: Low RNA integrità. 500 ng di RNA trascritto in vitro è stato caricato per pozzetto. Impropri di trascrizione o di degradazione prodotti sono probabilmente dovuti all'uso di bassa purezza o DNA non completamente linearizzato. (B) L'immagine di cellule trasfettate finte H1-HeLa e cellule trasfettate con trascritti di RNA codificanti Mengovirus. La somministrazione di reagenti di trasfezione solo (mock) manterrà la vitalità delle cellule dopo trasfezione così come il passaggio sulle cellule fresche. Transfection di trascritti di RNA che codifica per un genoma Mengovirus (VMC 24) si traduce in effetti citopatico, che sono osservati per la filtrazione del surnatante e di passaggio sulle cellule HeLa H1-freschi. Barra di scala = 100 micron.ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 4
    Figura 4: la cinetica di crescita di Mengoviruses non modificate e microRNA-mirata in presenza o assenza di microRNA affini. Modificato da riferimento 17. Cellule (A) H1-HeLa non esprimono miR-124, -125, -142 o. Tutti e tre i Mengovirus microRNA codifica ER replicano con cinetiche simili come il virus non modificato (VMC 24) indicano che l'inserimento dei microRNA in questa posizione (5 'UTR) non alterano la replicazione del virus. (B) RAW 264.7 macrofagi esprimono livelli intermedi di miR-125b e alti livelli di miR-142-3p, ma non esprimono miR-124. L'incorporazione delle corrispondenti sequenze microRNA bersaglio nei risultati genoma in att virusenuation coerente con il livello di espressione di microRNA. I dati vengono rappresentati come titoli virali media +/- SD. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 5
    Figura 5: Analisi di specificità microRNA-targeting utilizzando imita microRNA sintetici. Modificato da riferimento 17. Cellule H1-HeLa trasfettate con i singoli imita microRNA sono stati infettati con il virus non modificato (VMC 24) o il virus microRNA mirati (Mirt-VMC 24) ad una MOI di 0,2. (A) La vitalità cellulare normalizzato alle cellule mock-trattati è stato determinato a livello post-infezione 24 ore tramite saggio di proliferazione cellulare MTT. (B) titolo virale nel supernatante di tutti i campioni è stata determinata anche dopo l'infezione 24 hr. Ili dati sono rappresentati come la vitalità media o virale titolo +/- SD. A due code test t di Student con correzione di Welch (per varianze ineguali) sono stati utilizzati per l'analisi statistica. Un valore di p <0.01 è stato considerato significativo. (** P <0.01, ***, p <0.001). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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    Discussion

    Il design, la composizione e la localizzazione degli elementi di risposta microRNA all'interno del genoma virale detterà mira efficacia e specificità. Ottimizzazione questi richiederà tentativi ed errori. Tuttavia, progettazione razionale sulla base di RNA analisi strutturale e studi precedenti di replicazione virale e microRNA firme aiuti per l'attuazione di questa tecnica con l'ottimizzazione minimo 10, 11, 12, 13, 38.

    Quando si inizia la progettazione di ER, gli investigatori dovrebbero iniziare compilando una serie di microRNA che sono espresse nelle cellule bersaglio di interesse, sono diminuite nelle cellule non-target di interesse, e che sono stati sperimentalmente validati. A seguito di questa compilation, diverse analisi di predizione basati dovrebbero essere condotti per affrontare la possibilità di competere microRNA-targeinterazioni t. Molti virus codificano microRNA o RNA non codificanti di sequestro del microRNA cellulari al fine di manipolare l'espressione genica virale e host. Inoltre, diversi virus a RNA hanno dimostrato di interagire con microRNA cellulari, al fine di migliorare la loro capacità di replica 39, 40. Pertanto, quando si progetta ER, essere sicuri di indagare se vi sono noti interazioni del virus con microRNA cellulari o se essi esprimono microRNA virali che potrebbero riconoscere il target microRNA scelto o alterare l'espressione endogena del microRNA prescelto. Oltre a ricerche bibliografiche, il lettore dovrebbe prendere in considerazione gli strumenti e le basi di dati che includono virale informazioni di destinazione microRNA per aiutare nella progettazione razionale di ER bioinformatica di previsione in linea. Tali banche dati e strumenti di previsione possono anche facilitare l'identificazione di sequenze bersaglio che possono essere riconosciuti da più microRNA o sequenze di semi sovrapposte pre inviato all'interno del genoma virale. Per una discussione più approfondita sui metodi di identificazione degli obiettivi microRNA e i pro ei contro di alcuni degli strumenti di previsione in linea si rimanda ai riferimenti 41, 42. Si raccomanda che questi strumenti di previsione servono solo da guida, come tante volte previsioni possono produrre falsi positivi o negativi. A tal fine, ci possono essere sequenze seme che si sovrappongono, tuttavia all'estremità 3 'del microRNA anche influenzare l'efficienza di targeting. Usando troppo severi di un set di regole a volte può essere dannoso.

    Una volta che una serie di potenziali obiettivi microRNA sono stati identificati, l'investigatore deve continuare da classifica gli obiettivi sulla base delle proprietà biologiche dei microRNA e le previsioni strutturali RNA 10, 11, 12, 13,ef "> 38. L'abbondanza assoluta del microRNA maturo in cellule bersaglio e il suo livello di associazione con una proteina Argonaute detterà il grado di silenziamento genico. Diversi studi hanno dimostrato che solo abbondantemente espresso microRNA regoleranno in modo significativo l'espressione del gene 16, 43, 44. inoltre, mentre alcuni microRNA sono abbondantemente espresso la loro interazione con le proteine Argonaute e la formazione di RISC è insufficiente a reprimere traduzione 44. Utilizzando un microRNA altamente abbondante con funzione di convalidato anche ridurre al minimo il rischio di microRNA saturazione nella cella di destinazione e la successiva off- tossicità di destinazione. un approccio diverso potrebbe essere quello di utilizzare RE che sono indirizzate da più miRNA 45, 46, che potrebbe consentire a un numero copia ridotta, pur riducendo al minimo il potenziale di toxiciti fuori bersaglioes. Il rapporto di mRNA target microRNA avrà anche un impatto significativo sul successo di questo approccio. Un alto target rapporto microRNA ridurrà il livello di rimozione 42, 43, 47, 48. Ciò è particolarmente importante con i virus che si replicano rapidamente quando se impropriamente regolati in anticipo durante l'infezione si accumulano a livelli che sfuggono al controllo dei microRNA endogeni. E 'essenziale considerare queste proprietà nella scelta di un microRNA per il targeting; idealmente, utilizzando un microRNA la cui funzione è stata sperimentalmente validati.

    L'efficienza di silenziamento genico mirata risente anche la percentuale complementarità del bersaglio alla microRNA maturo nonché il numero di copie di sequenze microRNA bersaglio inseriti. regione dei microRNA (nucleotidi 2-8) Il 5 'costituisce la sequenza di seme. E 'generalmente accettatoche questa regione deve essere perfettamente complementari per il targeting di successo 48, 49. La maggior parte degli studi utilizzare elementi di risposta con una perfetta complementarità perché può aumentare l'attività dei geni-silenziamento promuovendo taglio endonucleolitico della trascrizione e rapido riciclaggio del microRNA. Questo taglio endonucleolitico si verifica solo quando un microRNA interagisce con una proteina Argonaute che ha attività endonucleolitico, che in cellule di mammifero è limitato a Argonaute-2. Altre proteine ​​Argonaute promuovere la degradazione dell'mRNA per deadenylation e attacco exonucleolytic della trascrizione. Si rimanda ai riferimenti 4, 5, 13, 50, 51, 52 per una descrizione approfondita di microRNA biogenesi e funzione. In generale si ritiene che incrfacilitando il numero di copie migliorerà ulteriormente l'efficienza di targeting. Tuttavia, questo può anche potenziare microRNA saturazione e non è sempre dimostrata più efficace. A volte è meglio incorporare sequenze target per più microRNA diversi arricchito di cellule bersaglio o di utilizzare sequenze target che sono riconosciuti da più microRNA. Il numero di copie richiesto è fortemente dipendente dalla quantità di trascrizione che avrà bisogno di silenziamento e la relativa abbondanza del microRNA nelle cellule bersaglio. Le trascrizioni che si accumulano rapidamente possono richiedere più copie per impedire loro di outcompeting i livelli di microRNA. Sperimentalmente determinare il numero di copie ottimale per ogni target microRNA che si traduce in termini di orientamento sufficiente, mantiene in forma virale, e che riduce al minimo si raccomanda il tasso di mutazioni di fuga.

    La localizzazione della risposta elemento microRNA all'interno del genoma virale è estremamente importante. Un risultato negativo durante l'analisil'efficienza mira non sempre significa che il virus non può essere microRNA-mirato. Si può semplicemente significa che il bersaglio non è accessibile in quella posizione o che la repressione del gene bersaglio non è sufficiente ad inibire patogenicità. La maggior parte degli elementi di risposta sono inseriti nelle 3 "regioni non tradotte (UTR) della trascrizione mirato. Tuttavia, il successo di targeting dei genomi virali è stato compiuto e, talvolta, espone una maggiore stabilità genetica quando gli elementi di risposta sono inseriti nella UTR 5 'o all'interno delle regioni codificanti di geni essenziali 38. siti di inserzione ottimali consentiranno elevata accessibilità della sequenza bersaglio al microRNA. L'accessibilità può essere ostacolata da strutture secondarie di RNA e le interferenze stechiometrico. Pertanto, localizzando elementi di risposta nelle regioni non strutturati, che sono altamente conservate è un buon punto di partenza. Le sequenze di essere inseriti possono anche influenzare ed essere influenzati dalle sequenze circostanti. Thus, in una posizione ottimale per un microRNA sequenza bersaglio non è necessariamente ottimale per altri elementi di risposta. Mentre validazione sperimentale e l'ottimizzazione della localizzazione RE è necessaria, utilizzando il software di previsione (per esempio http://unafold.rna.albany.edu/; http://rna.urmc.rochester.edu/software.html) per lo screening dei potenziali siti di inserimento per perturbazione delle strutture di RNA circostanti è altamente raccomandato 53, 54.

    L'uso di puliti preparazioni di acidi nucleici di alta integrità è anche essenziale per ottenere i migliori risultati. una tecnica asettica e il mantenimento di un ambiente privo di RNasi durante la manipolazione di trascritti di RNA o imita microRNA è essenziale. Per ottenere i migliori risultati trascrizioni di RNA, imita microRNA, e le riserve di virus titolati finali devono essere conservati a -80 ° C in piccole aliquote per evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti con conseguente degradazione dell'RNA e la perdita di infettività del virus. Quando è in uso, questi reagentis dovrebbero essere tenuti in ghiaccio in ogni momento.

    È importante notare che molti microRNAs sono membri di una famiglia di microRNA che condividono complementarità. Quindi, quando la conduzione di studi può essere utile per includere i membri della famiglia microRNA immediato di migliorare la valutazione mira specificità. Questo diventa critica quando le cellule entro cui si desideri la replicazione del virus, esprimono i membri della famiglia (per esempio la famiglia miR-Let7). Va inoltre notato che il saggio specificità utilizzando imita microRNA è un sistema artificiale e sovra-espressione di un microRNA in alcune cellule può provocare effetti fuori bersaglio 55. In questo caso, la specificità può anche essere valutato in cellule che esprimono i microRNA appropriate utilizzando inibitori microRNA invece. Questo test permetterebbe analisi di colpire specificità sulla base di titolazione del virus e vitalità cellulare letture in presenza di livelli fisiologicamente rilevanti di microRNA.

    10, 11, 12, 13. Molti virus presentano elevati tassi di mutazione e la fuga mutanti possono sorgere rapidamente. Compresi più copie di una sequenza bersaglio, tra gli obiettivi per più di un microRNA, localizzando gli obiettivi all'interno di più regioni altamente conservati, o la presenza di fattori antivirali aggiuntive, tra cui una risposta immunitaria in grado di alleviare questo. Inoltre, l'inserimento di materiale genetico estraneo in un genoma virale risulta spesso in capacità di replicazione diminuita del virus. Se si verifica ciò, l'obiettivo microRNA è probabile che sia geneticamente instabile e sfuggire mutanti sorgeranno più rapidamente. L'inclusione di molteplici copie microRNA bersaglio can anche aumentare il potenziale per l'eliminazione recombinatorial degli obiettivi microRNA. Pertanto, determinazione sperimentale del numero minimo copie richiesto per il targeting sufficiente è necessario. Localizzazione di microRNA copie bersaglio in varie località in tutto il genoma rispetto all'utilizzo di ripetizioni in tandem può aiutare a bypassare questo vincolo. Tuttavia, l'individuazione delle configurazioni ottimali RE con il numero minimo di copie bersaglio necessari e siti di inserimento che non comportano la cinetica di replica alterati del virus è fondamentale per ridurre al minimo il tasso di ricombinazione e mutazione di destinazione. L'inclusione di un numero eccessivo di copie di una sequenza bersaglio può anche aumentare il rischio di tossicità fuori bersaglio se si traduce in microRNA saturazione. Un importante modifica nella quantità di microRNA disponibili per regolare normali proteine cellulari potrebbe causare effetti indesiderati 55. A tal fine, molti virus alterano l'ambiente microRNA all'interno di una cella 56 e se questocomprende il microRNA mirato, l'efficienza del regolamento può essere diminuita se la replicazione del virus sufficiente è mantenuta. Tutte queste preoccupazioni possono essere sollevate dai ottimizzando la risposta composizione elementare e / o localizzazione e con una conoscenza approfondita del sistema di essere preso di mira e le sue limitazioni.

    I problemi tipici associati con altri metodi di targeting comprendono l'attenuazione fuori bersaglio del virus, i vincoli di dimensione per il targeting materiale genetico dei virus con capacità di carico limitate, e problemi di sicurezza associati a virus di ingegneria per colpire le cellule che normalmente non sono infetti. MicroRNA targeting consente la regolazione del tropismo virale con una minima modifica del virus. Richiede lo spazio minimo all'interno di un genoma virale e può essere adattato in base a una serie espansiva di firme microRNA cellulari. Questa tecnica non introduce nuove tropismo per il virus e quindi non introducono nuove preoccupazioni per la sicurezza. Inoltre, questometodo può essere utilizzato per regolare più tropismi simultaneamente utilizzando sequenze bersaglio per più microRNAs differenti arricchiti entro diversi tipi cellulari 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61. Tutto questo può essere realizzato senza attenuare il virus in cellule che non esprimono i microRNAs corrispondenti e quindi può fornire un meccanismo per migliorare la sicurezza del virus terapeutici con maggiore potenza.

    Lo sfruttamento delle macchine microRNA cellulare può essere utilizzato per regolare il tropismo di diverse classi di virus. I protocolli descritti qui sono stati progettati per il salvataggio e la caratterizzazione di Picornavirus microRNA-mirati, ma possono essere adattati in funzione di un virus 'ciclo di replicazione e specifico rea giornalistadouts. Sebbene diversi virus hanno strategie di soccorso specifici, microRNA sequenze bersaglio può essere inserito nel genoma virale indipendentemente l'intero genoma è codificato in un singolo plasmide o se il virus ha un DNA o RNA genoma. Finché le cellule produttrici non esprimono i microRNA cognate, obiettivi microRNA ottimizzati non dovrebbero interferire con salvataggio virus. Gli esperimenti per analizzare la cinetica di crescita di virus e microRNA-targeting specificità possono essere modificati cambiando i punti di tempo raccolti in base alla lunghezza di un singolo round di replicazione del virus e sulle letture specifiche per il virus replica / tossicità (per esempio proteine reporter, citotossicità, genoma quantificazione, ecc). È importante notare che, sebbene questa tecnica può teoricamente essere applicata a tutte le classi di virus, molti fattori possono influenzare l'efficienza di questo metodo. Ad esempio, virus a RNA negativo-senso, non si sono dimostrati così sensibile come virus a RNA positivo-senso probabilmente a causa di ac limitataaccessi- dell'RNA genomico alla macchina miRNA 13. Così, le proprietà biologiche di ciascuna classe di virus saranno impartire ulteriori vincoli di ottimizzazione RE. Nonostante questi limiti, questa tecnica offre un metodo alternativo per il targeting tropismo facilitando la ricerca virale riguardanti la sicurezza, l'utilità e comprensione di base dei processi biologici per tutte le classi di virus.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
    Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
    Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
    T4 DNA Ligase System NEB M0202S
    MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
    MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
    0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
    5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
    Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
    Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
    TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
    TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
    0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
    2 ml Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
    Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
    MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
    MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
    Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
    pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.

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    References

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    Ruiz, A. J., Russell, S. J.… More

    Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (120), e55033, doi:10.3791/55033 (2017).

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