Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

MikroRNA-baserte Regulering av picornavirus tropisme

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/55033
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic College of Medicine

Introduction

Utviklingen av en bredt anvendelig, enkel og effektiv metode for å konstruere en vektor med begrenset tropisme gir en stor mulighet til å forbedre sikkerheten, biologisk forståelse og terapeutisk nytte av virus. Flere mekanismer eksisterer for å målrette Virustropisme inkludert transductional, transkripsjonen, og translasjonsforskning-baserte teknikker. Men disse fremgangsmåter er ikke generelt anvendelige for alle vektorsystemer, kan kreve defekte signalveier i målceller eller krever innføring av store kodende sekvenser inn i det virale genomet. I tillegg kan disse fremgangsmåter resulterer i svekkelse av viruset, i betydelig grad hindrer deres terapeutiske aktivitet og begrense innsikt i den umodifiserte system.

MicroRNAs er små (22-25 nukleotider), ikke-kodende RNA som medierer genet Slå i eukaryote celler. MicroRNAs funksjon ved å binde komplementære målsekvenser (responselementer) i messenger RNA (mRNA) resulti ng i avskrift destabilisering, degradering eller translasjonsforskning undertrykkelse. MicroRNAs normalt binde responselementer med delvis komplementære og gir små endringer i genekspresjon 1, 2, 3, 4, 5. Flere betydelige endringer i genekspresjon kan oppnås ved å øke komplementaritet av responselementet 6. Tusenvis av modne microRNAs er blitt identifisert i en rekke arter og mange utstillingsdifferensial ekspresjonsmønstre i en rekke celletyper og vev 7, 8, 9. Disse mikroRNA signaturer kan utnyttes for celle-spesifikk begrensning av virus-amplifikasjon ved å innlemme alle komplementære responselementer inn i det virale genomet 10,= "xref"> 11, 12, 13. Det overordnede målet med denne mikroRNA-targeting teknikk er å kontrollere tropisme av en vektor genom uten ekstra demping.

Nytten av denne fremgangsmåte for regulering Virustropisme ble opprinnelig påvist i lentivirale vektorer for å begrense transgene ekspresjon i spesifikke vev 14, 15, 16. Denne teknikken har senere blitt brukt til et bredt spekter av replikere og ikke-reproduserende virale vektorer for økt genterapi, samt å forbedre sikkerhetsprofilen til mange onkolytiske virus ved å eliminere uønskede toksisitet i normalt vev 10, 11, 12, 13, 17 . Det har også blitt benyttet til å generere trygg og effective levende-svekkede vaksiner, så vel som for å forbedre virusvaksine og produksjonsprosesser 18, 19, 20, 21. MikroRNA målretting av en vektor kan tillate demping hos vaksinerte verter eller målrettede systemer og samtidig opprettholde villtype vekstnivå i produsentsystemer. MikroRNA-målretting kan også brukes til å forbedre biosikkerhet av virus for forskningsformål ved å begrense overføring i én art (f.eks mennesker) og samtidig opprettholde overføring i andre verter 22. Endelig mikroRNA målretting kan tillate inngående analyser av virus livssyklus og spesifikke roller celletyper i patogenesen og immunitet ved segregerende viral vekst 23, 24, 25, 26.

Denne teknikken gir en alternative målrettingsmetode som er lett implementert og gjelder for alle virus systemer. I tillegg er stadig voksende samling av modne microRNAs med differensial uttrykk mønstre i spesifikke celletyper som gjør denne teknikken svært allsidig. MikroRNA-basert målretting har vist seg effektiv for en rekke virus systemer uten å kompromittere systemet fungerer. De store begrensningene ved denne teknikken omfatter prøving og feiling optimalisering, er potensialet for evakuerings mutasjoner, og potensielle off-target-effekter på endogene transkripter. Imidlertid kan disse begrensningene vanligvis overvinnes med optimalisert og rasjonell responselement design. Positive-sense RNA virus pleier å være spesielt lydhør overfor mikroRNA-targeting på grunn av den positive-sense orientering av deres genom og tilgjengeligheten av transkripsjoner til mikroRNA maskiner under helt cytoplasmatiske replikasjonssyklus. Her beskriver vi en protokoll for å generere en mikroRNA-målrettet picornavirus og experimental metodene for å kontrollere effektiviteten og spesifisiteten som målgruppe in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kloning mikroRNA Response Elements inn i Viral Genome

  1. Design mikroRNA respons element innsatser.
    1. Identifisere den ønskede mikroRNA og dens tilsvarende målsekvens. Flere databaser er tilgjengelige med modne mikroRNA sekvenser. Anbefalt: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30.
  2. Klone responselementet inn i plasmid-DNA som koder for vektorgenomet eller transkripsjon.
    MERK: For to eller flere kopier responselementer ved hjelp av et unikt restriksjonssete for innsetting er enklere og mer allsidig.
    1. Sett respons element eller unike restriksjonssete ved hjelp spleise-overlapping forlengelse (SOE) PCR. Denne fremgangsmåten er blitt beskrevet i detalj 31.
    2. Hvis du bruker et restriksjonssete for innsetting, purjage kommersielt syntetisert, PAGE-renset fornuft og antisense ultramers koder innleggs sekvenser flankert av overhenget sekvenser av det unike restriksjonssete (figur 2).
    3. Kombiner 0,5 ug forstand ultramer, 0,5 ug antisense ultramer, DNA-ligeringsbuffer til endelig konsentrasjon på 1 x, og bringe til 50 pl med H2O anneal ultramers ved inkubering av reaksjonen ved 85 ° C i 10 minutter og deretter redusere temperaturen av 0,5 ° C hvert 30. sekund inntil reaksjonen når 25 ° C.
    4. Kombiner 0,5 ug av vektor-DNA som koder for det nye unike restriksjonssete, enzym-buffer til en sluttkonsentrasjon 1x, 1 ul av det passende restriksjonsenzym, og bringe til et sluttvolum på 20 pl med H2O Digest vektoren ved 37 ° C i 2 timer. Rens linearisert DNA ved agarosegel-rensing 32.
    5. Ligere glødet ultramers inn i vektoren fordøyd over natten ved 16 °; C ved anvendelse av en 3: 1 ultramers: vektor molforhold og standard-ligeringsteknikker 33.
      MERK: Ved bruk av et enkelt restriksjonsenzymsete for innsetting kan det være mer effektivt å dephosphorylate endene av det spaltede vektor og fosforylere endene av rekombinerte oligonukleotidene.
    6. Omforme det ligerte DNA inn i E. coli ved hjelp av varmesjokk-metoden 34.
      MERK: plasmider som koder virale genomer er generelt stor, derfor bruker kompetente celler optimalisert for opptak store DNA-konstruksjoner kan øke transformasjon effektivitet.
    7. Rense plasmid DNA fra individuelle kolonier ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig rensesett 35. Identifisere en passende klone med mikroRNA respons element i riktig retning (figur 2) ved å sekvensere innsatsen region 36.

2. Redning mikroRNA-målrettet picornavirus from Plasmid DNA

  1. Rescue mikroRNA-målrettet picornavirus i en cellelinje givende for virusreplikasjon som ikke uttrykker beslektet mikroRNA (e). Denne protokollen bruker H1-HeLa celler fordi de ikke uttrykker Mir-142, MIR-124, eller MIR-125, men det er ikke nødvendig å bruke H1-HeLa celler for redning.
    FORSIKTIG: Alle retningslinjer for sikker håndtering og destruksjon av smittestoffer bør følges deretter.
    1. Plate H1-HeLa-celler i en 6-brønns plate slik at de er ~ 80% konfluent ved transfeksjon (24 timer etter seeding). Plate-celler i 2 ml pr brønn av DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum.
    2. Varm transfeksjon reagens til romtemperatur. Kombiner 250 mL serum-frie medier, 2,5 mikrogram av plasmid DNA-koding mikroRNA-målrettet genom, og 7,5 mL av transfeksjon reagens i et sterilt mikrosentrifugerør og pipette forsiktig for å blande. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 15-30 min.
    3. Aspirermedier fra belagt celler og tilsett 2 ml av frisk komplett media.
    4. Tilsett hele transfeksjon blandingen fra trinn 2.1.2 til en brønn på 6-brønners plate dråpevis. Legg hvert fall til et annet område av brønnen.
    5. Inkuber cellene ved 37 ° C til cytopatiske effekter (CPE) eller reporter-proteiner kan påvises (~ 24-72 h).
  2. Harvest og passasjen reddet virus på friske celler.
    1. Plate celler i en 6-brønns plate slik at de er 80-90% konfluent på tidspunktet for infeksjon (24 timer etter seeding).
      MERK: skalere opp eller ned avhengig av mengden virus som trengs for alle etterfølgende eksperimenter.
    2. Høste hver redning godt ved å skrape cellene i supernatanten ved hjelp av en gummicelle skrape eller gummi politimann. Forsiktig drar skrapen over bunnen av brønnen. Overfør cellene og supernatanten til en kryogen lagring rør.
    3. Fryse / tine prøvene to ganger og deretter pelletere cellerester ettersentrifugering ved 1200 xg i 5 min ved 4 ° C.
    4. Filtrer ryddet supernatanten to ganger ved hjelp av 0,2 mikrometer sprøytefilter. Den filtrerte redning Supernatanten inneholder viruset.
      MERK: Filter porestørrelse kan variere avhengig av størrelsen av viruspartikler, og kan ikke være anvendbar for store virus.
    5. Sug media fra de belagt celler, vaske en gang med serumfritt medium og tilsett 1 ml av friske serumfritt medium til hver brønn.
    6. Tilsett 50 mL per brønn av filtrert redning supernatant og rist den forsiktig plate å fordele virus.
    7. Inkuber platen ved 37 ° C i 2 timer og deretter aspirer media fra hver brønn for å fjerne ikke-inkorporerte virus.
    8. Legg 1,5-2 ml friskt komplett medium per brønn og inkuber ved 37 ° C inntil CPE eller rapportør proteiner er tilsynelatende (~ 24-48 h).
    9. Gjenta trinn 2.2.2 til 2.2.4. Filtrert redning supernatant inneholder virus lager. Oppbevares virus aksjer i engangs porsjoner i kryogeniske lagerrørene ved -80 °C.

3. Redning mikroRNA-målrettet Virus fra In Vitro transkribert RNA transkripsjoner

  1. Generere RNA transkripsjoner fra plasmid DNA som koder for mikroRNA-målrettet virusgenom ved hjelp av en oppstrøms promoter.
    MERK: bør brukes Standard praksis for å generere og opprettholde en nukleasefritt miljø for alle påfølgende trinn.
  2. Linear plasmid DNA ved hjelp av et enzym restriksjonssete nedstrøms av karakterutskriften. Kombiner 5 pg plasmid-DNA, 1 x sluttkonsentrasjon enzym buffer, 3 ul restriksjonsenzym og bringe til 50 pl med H2O Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 ° C i 3 timer.
  3. Legg 1/20 th volum av 0,5 M EDTA, 1/10 volum 5 M NH4-acetat, og 2 volumdeler av 100% etanol til spaltet reaksjonen og bland. Inkuber ved -20 ° C i 1 time opp til over natten.
  4. Pellet det utfelte DNA i 10 minutter ved 17.000 xg ved 4 ° C. Hell av supernatant, resuspender pelleten i 500 pl kald 70% etanol og pelletere DNA ved sentrifugering ved 17 000 xg i 10 min ved 4 ° C.
  5. Hell av supernatanten og sentrifuger på nytt i 30 sek. Fjern rester av supernatanten med en pipette og luft-tørke pellet. Resuspender DNA-pelleten i sterilt nuklease-fri H2O ved en konsentrasjon på 0,5-1 ug / ul.
  6. Tine in vitro transkripsjon reagenser ved romtemperatur og plassere ribonukleotider på is (enzymer i glycerol ikke fryse og skal gå direkte på is). Holde reaksjonsbuffer ved romtemperatur.
  7. Montere transkripsjonsreaksjon i et PCR-rør ved å kombinere 2 ul hver av ATP, CTP, GTP og UTP løsninger, 2 pl 10x reaksjonsbuffer, 1 ug linearisert DNA, 2 pl enzym, og bringer til et endelig volum på 20 ul med nuklease -Gratis H 2 O.
  8. Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 ° C i 2 timer.
  9. Rense RNA transkripsjoner.
  10. Bringe transkripsjonsreaksjon til 100 ul med elueringsoppløsningen (ikke-forvarmet). Legg 350 ul bindings oppløsning konsentrat og 250 pl 100% etanol for å reaksjon og bland.
  11. Overføre prøven til en filterpatron settes inn i et oppsamlingsrør og sentrifuger i 1 min ved 12 000 x g. Kast gjennomstrømnings.
  12. Legg 500 mL vaskeløsning til filterpatronen og sentrifuger i 1 min ved 12 000 x g. Forkast gjennomstrømning. Gjenta dette vasketrinn en gang til. Forkast gjennomstrømning. Sentrifuger i 1 min ved 12,0000 xg for å fjerne gjenværende etanol.
  13. Overfør filterpatronen til en ren samling rør og tilsett 50 pl av den forvarmede elueringsoppløsningen til filterpatronen. Sentrifuger i 1 min ved 12 000 x g. Gjenta dette eluering trinnet for et totalt volum på 100 ul elueringsmiddel fortsinnelukker renset RNA transkripsjoner. Kast filterpatronen.
  • Bestem RNA-konsentrasjon i elueringsmiddel ved å måle absorbansen av prøven ved 260 og 280 nm og ved hjelp av Beer-Lambert-loven.
  • Vurdere integriteten av RNA ved hjelp av RNA-gelelektroforese 37. Se figur 3 for eksempler på god og dårlig RNA integritet. RNA bør aliquotted til engangsbruk tuber og lagret ved -80 ° C for å opprettholde integritet.
  • Varme transfeksjon reagenser til romtemperatur. Kombiner 250 mL serum-frie medier, 2,5 mikrogram av renset RNA transkripsjoner, 5 mL av boost løsning, og 5 pl transfeksjon reagens i et sterilt mikrosentrifugerør og pipette forsiktig for å blande. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 2-5 minutter.
  • Plate H1-HeLa-celler i en 6-brønns plate slik at de er ~ 80% konfluent ved transfeksjon (24 timer etter seeding). Plate-celler i 2 ml pr brønn av DMEM supplert med 10% fetal bovin serum.
  • Aspirer medier fra belagt celler og tilsett 2 ml frisk komplett media.
  • Tilsett hele transfeksjon blandingen fra trinn 3,12 til en brønn på 6-brønners plate dråpevis. Legg hvert fall til et annet område av brønnen.
  • Inkuber cellene ved 37 ° C til cytopatiske effekter (CPE) eller reporter-proteiner kan påvises (~ 24-72 h).
  • Fortsett redning av mikroRNA-målrettet virus som beskrevet i trinn 2.2 til 2.2.9.

    • 4. titrere Virus Stocks ved å beregne 50% Tissue-kultur infeksiøs dose (TCID 50)

    1. Plate H1-HeLa-celler i en 96-brønns plate 10 4 celler per brønn i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum. Inkuber cellene ved 37 ° C over natten.
      MERK: Titrer virus i celler givende for virusreplikasjon som ikke uttrykker beslektede microRNAs.
    2. Gjøre 10-gangers seriefortynninger av virus som hver i et totalvolum på 1 ml serum-frittmedia.
      MERK: Bruk lavere fortynninger om mer presisjon er påkrevd.
      MERK: Endre tips etter hver fortynning for å unngå overvurdering av titer som virus kan holde oss til tips.
    3. Tips 96-brønns plate til siden og aspirer media fra belagt HeLa-celler. Tilsett 100 ul av hver fortynning virus per brønn til 8-brønner av 96-brønns plate (en rad per fortynning). Tilsett 100 ul serumfritt medium uten virus til rad 1 og rad 12 på tallerkenen for kontroller.
      MERK: Alltid aspirer og legge til medier i brønnene ved å berøre tuppen til side for godt til å forebygge celle løsrivelse.
    4. Inkuber platen ved 37 ° C i 2 timer. Tips plate til siden og aspirer media fra brønnene.
      MERK: Endre tips mellom hver fortynning rad.
    5. Tilsett 100 ul komplett medium til hver brønn. Inkuber platen ved 37 ° C i 72 timer.
    6. Visual brønnene under et mikroskop og merk hver brønn positiv eller negativ for CPE.
    7. Beregn hvert virus titer med følgende ligning: Log 10 (TCID50 / ml) = L + D (S-0,5) + log 10 (1 / V). L er den negative log 10 av den mest konsentrerte virus fortynning testet hvor alle brønnene er positive. D er en bjelke 10 av fortynningsfaktoren. S er summen av de enkelte proporsjoner (pi). pi er den beregnede andel av en individuell fortynning (mengden av positive brønner / og antall brønner per fortynning. V er volumet av inokulum (ml / brønn).

    Tabell 1
    Tabell 1: Kvantifisering av infeksiøse viruspartikler ved å beregne den TCID 50. Representative resultater fra celler infisert med en serie av ti-gangers fortynninger av et virus lager. "L" tilsvarer 4 fordi den siste fortynningen hvor alle brønnene er positive for CPE er 10 -4. "D" er loggen 10 av 10 siden 10-fold fortynningerble benyttet og er derfor lik 1. "S" er summen av de enkelte proporsjoner. I dette eksempelet de enkelte proporsjonene er 1,0, 0,875, 0,375, 0,125, og 0. Summen av disse (S) er 2,375. "V" er volumet av inokulum i ml anvendt for å infisere cellene i utgangspunktet.

    5. Evaluering mikroRNA-måls Effekt: Single-step Vekst Kinetics

    1. Kontroller for denne analysen inkluderer mock-infiserte celler, umodifiserte virus og virus som inneholder et ikke-målrettede eller ikke-funksjonell respons element.
    2. Plate H1-HeLa-celler for et tidsforløp eksperiment i 12-brønners vevskulturplater slik at de er 80-90% konfluent på tidspunktet for infeksjon (24 timer etter seeding). Plate celler i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum ved 1 mL per brønn.
      MERK: Anbefalt til plate en egen plate for hvert tidspunkt. Denne protokollen bruker 7 forskjellige tidspunkter for et virus med en 8-12 timers replikasjonssyklus. H1-HeLa-celler er ikke nødvendig å utføre dette enssay. Denne analysen bør utføres i givende celler som ikke uttrykker den målrettede microRNAs. Denne analysen kan også bli utført i celler som uttrykker de beslektede microRNAs for å vurdere vekstkinetikk i henhold til selektivt trykk.
    3. Sug media fra brønner. Vask brønnene ved å tilsette 0,5 ml av serumfritt medium til hver brønn, virvle plate, og aspireres media fra brønner. Tilsett 0,5 ml friskt serum-fritt medium til hver brønn.
    4. Infisere hver brønn på et høyt mangfold av infeksjon (MOI, antall infeksiøse partikler per celle) for å sikre at alle cellene får infisert. Denne protokollen bruker en MOI av tre.
      1. Fortynnet virus aksjer i serumfritt medium til en konsentrasjon av MOI = 3 per 100 mL. Tilsett 100 ul av virus fortynning hver til syv forskjellige brønner og inkuber ved 37 ° C i 2 timer.
      2. Aspirer media fra alle brønnene og vask to ganger ved å legge 0,5 ml komplett medie per brønn, gynge forsiktig og deretter aspirere.
    5. Tilsett 1 ml complete media til hver brønn og inkuber ved 37 ° C inntil ønsket tidspunkt.
    6. Samle inn prøver av virus titrering ved 2, 4, 6, 8, 10, 24 og 48 timer etter infeksjon (1 brønnen per tidspunkt). Overfør 700 mL av media i brønnen til en kryogen lagring tube. Skrape cellene inn i den gjenværende supernatanten ved forsiktig å bevege en gummiskraper på tvers av hele brønnen. Overfør celle / supernatanten blandingen til de tilsvarende kryogen lagring rør inneholdende 700 ul av supernatanten.
      MERK: Pass på å ikke sprute supernatant fra en brønn til en annen i løpet av skraping resulterer i forurensede prøver. Overføring av 700 mikroliter før skraping vil minimere sprut.
    7. Plasser prøvene ved -80 ° C inntil alle prøver er samlet.
    8. Fryse / tine prøvene tre ganger og fjerne celleavfall ved sentrifugering av prøvene ved 1200 xg i 5 min ved 4 ° C.
    9. Titrere viruset som beskrevet i kapittel 4 og sammenligne vekstkinetikk tjeg meg.

    6. Evaluering mikroRNA målretting spesifisitet: Virus-spredning Assay Bruke Syntetisk mikroRNA Ligner

    MERK: Bruk av et syntetisk mikroRNA ligne er utført for å vise spesifisitet av mikroRNA: mikroRNA-target interaksjon.

    1. Inkluder mock transfeksjon, negative kontroll mikroRNA ligne og eksperimentelle mikroRNA ligne bare kontrollerer for hver analyse for å vurdere mikroRNA-mediert toksisitet. Det er også ideelt for å inkludere en positiv kontroll (dvs. mikroRNA-målrettet genet eller genomet) så lav transfeksjon effektivitet av mikroRNA ligner kan føre til falske negative.
    2. Plate H1-HeLa-celler i en 96-brønners vevkulturplate, slik at de er 80-90% konfluent ved transfeksjon (24 timer etter seeding). Plate celler i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum til 0,1 ml per brønn.
      MERK: Utfør denne analysen i cellene givende for virusreplikasjon som ikke uttrykker beslektede microRNAs.
    3. varm the transfeksjon reagenser til romtemperatur. Kombiner 9 ul serum-frie medier, 200 nM endelig konsentrasjon per brønn av mikroRNA ligne lager, 0,18 mL boost Reagent, 0,18 mL transfeksjon reagenvolumer og bland. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 2-5 minutter.
      MERK: Volumene er oppført er per brønn. Det anbefales at en masterblanding settes sammen for transfeksjon av alle brønner for å opprettholde konsistens og minimalisere pipetteringsfeil. Den optimale konsentrasjonen av mikroRNA ligne vil variere. Ta kontakt med produsentens instruksjoner som følger med mikroRNA ligne for en rimelig start konsentrasjon. Dette vil generelt være i området fra 5-200 nM sluttkonsentrasjoner.
    4. Aspirer media fra brønnene og tilsett 92 mL av fersk komplett medium.
      MERK: Hvis det er et betydelig antall prøver, fullføre dette trinnet før montering av transfeksjon løsning og lagre platen ved 37 ° C til den er klar.
    5. Legg hele transfeksjon blandingen in steg 6,3 til cellene drop-klok.
    6. Inkuber ved 37 ° C i 6 timer.
    7. Infisere hver brønn ved en lav MOI for å sikre en lav prosentandel av celler blir infisert for å tillate analyse av virusspredning. Denne protokollen bruker en MOI på 0,2.
      1. Fortynnet virus aksjer i serumfritt medium til en konsentrasjon av MOI = 0,2 per 100 mL. Fjern media fra brønnene og tilsett 100 mL av virus fortynning per brønn.
      2. Inkuber ved 37 ° C i 2 timer.
    8. Sug media fra hver brønn og legge 100 mL av frisk komplett media.
    9. Inkuber ved 37 ° C i 20-22 timer.
    10. Bestemme viruset titreringen i supernatantene.
      1. Samle supernatanten fra hver brønn og erstatte med 100 mL av frisk komplett media.
        MERK: Hvis du bruker suspensjonsceller, cellepelleten suspenderes fra følgende skritt i 100 mL av frisk komplett media og gå tilbake til å smake godt for levedyktighet analysen.
      2. Fjern celluloselar rusk fra de oppsamlede supernatantene ved sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
      3. Overfør ryddet supernatanten til et nytt rør og titrere smittsomme virus på givende celler som ikke uttrykker de beslektede microRNAs som beskrevet i kapittel 4.
        MERK: Hold alle prøvene på is for å hindre tap av smittsomhet.
    11. Bestemme levedyktigheten av cellene.
      1. Tilsett 10 ul av MTT (3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5-difenyltetrazolium-bromid) reagens per brønn.
      2. Inkuber ved 37 ° C i 2-4 timer inntil fiolett bunnfall er synlig.
      3. Tilsett 100 ul av vaskemiddel reagens.
      4. Inkuber ved romtemperatur i mørke i 2 timer.
      5. Les absorbansen til alle brønner ved 570 nm.
        MERK: Normal alle prøver å gjøre narr av transfekterte celler for sammenligning av prosent celle levedyktighet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Tabell 1 viser resultatene som er typisk for en titrering analysen for en picornavirus og beskriver hvordan du beregner vevskultur smittsom dose 50%. En skjematisk fremstilling av den generelle begrepet mikroRNA basert regulering av Virustropisme som er beskrevet i dette manuskriptet er vist i figur 1. Orienteringen av mikroRNA til responselement i løpet av intracellulære interaksjoner, riktig utforming av responselement oligonukleotider for gløding og plasmid innsetting, og en kart av plasmid-DNA som koder for et mikroRNA-målrettet virale genomet for in vitro transkripsjon er vist i figur 2. Figur 3 viser RNA-transkripter med varierende grad av integritet synliggjort ved agarosegelelektroforese. Riktig håndtering og bruk av DNA-templater fritt for urenheter vil resultere i riktig transkriberte RNA-transkripter som vist i 3A kjørefelt 2. Resterende forurensninger i lineav e d DNA-templater eller spormengder av nuklease kan resultere i lave nivåer av feil transkriberte RNA, og / eller nedbrytningsprodukter som ligner på den som ble observert i 3A kjørefelt 3. Ufullstendig linearisering av plasmid-DNA eller DNA som inneholder høye mengder av urenheter så som gjenværende etanol medfører uriktig transkripsjons og nedbrytningsprodukter representert i 3A baner 4 og 5. Figur 3 viser også et bilde av Mengovirus-medierte cytopatiske effekter (CPE) etter transfeksjon av rene RNA transkripsjoner. Figur 4 viser data som representerer et tidsforløp eksperiment evaluere vekstkinetikk av umodifisert og mikroRNA-målrettet Mengovirus. Resultatene viser at mikroRNA responsinnretninger, en Mengovirus genomet ikke endrer kinetikken for virusreplikasjon i H1-HeLa-celler, som ikke uttrykker noen av de beslektede microRNAs. Men i RAW 264,7 makrofager, som uttrykker middels nivå av mikroRNA-125 og høye nivåer av mikroRNA-142, virus som koder for de tilsvarende responselementer vise inhiberte replikasjonskinetikken som korrelerer med graden av mikroRNA uttrykt. Dataene i figur 5 viser spesifisiteten av mikroRNA basert regulering av Mengovirus tropisme. Overekspresjon av hver enkelt mikroRNA i H1-HeLa-celler hemmer spesifikt forplantning (lavere Virustitere) og cytotoksisitet (økt celleviabilitet) av Mengovirus koding beslektet mikroRNA respons element.

    Figur 1
    Figur 1: Skjematisk fremstilling av mikroRNA basert regulering av Virustropisme. MikroRNA responselementer (RE) og inngår i et virusgenom vil bli gjenkjent av beslektede microRNAs anriket innenfor spesifikke celletyper og resulterer i målrettet nedbrytning av de virale transkripsjonene / genomer. Dette vil hindre virusreplikasjon, spre og toksisitet til the omkringliggende celler. Imidlertid vil viral replikasjon bli opprettholdt i celler som ikke uttrykker de beslektede microRNAs slik at for virus forplantning, spredning og celledød. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 2
    Figur 2: mikroRNA respons element design. (A) For vellykket rettet mot sæd sekvens regionen i RE bør være helt utfyllende. RE bør være orientert innenfor det virale genom, slik at det kan gjenkjennes av beslektet modne mikroRNA i mRNA-transkripter og / eller den virale genom. Flertallet av Res er plassert i 3 'UTR av transkriptene. (B) Visning av riktig utformet og glødet oligonukleotider som koder Res inneholder tandemgjentakelser av de mikroRNA sekvenser (Mirt) flankert av overhengende nukleotider i XhoI restriksjonsenzymsete. Ved utforming tandem gjenta Res, sørg for å inkludere avstands nukleotider (vanligvis 4-6) mellom hver mikroRNA-target kopi. (C) Plasmid-DNA som koder for et full-lengde virale genom med en RE inkorporert i 3 'UTR, en T7-promoter, og et unikt restriksjonssete for linearisering for in vitro transkripsjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 3
    Figur 3: Redning av virus fra genom-koding RNA transkripsjoner. (A) RNA-gel elektroforese av in vitro-transkriberte RNA-er som koder for picornavirus genomer for å evaluere transkripsjon integritet. Lane 1: RNA stige. Lane 2: Riktig transkribert RNA med høy integritet. Felt 3: RNA-transkripter med moderat integritet. Høyere bandet er riktig størrelse og lavere bandet er potensielt et nedbrytningsprodukt eller en uønsket RNA transkript. Felt 4: Feiltranskribert RNA. Lane 5: Lav integritet RNA. 500 ng av in vitro-transkribert RNA ble applisert per brønn. Feilaktige transkripsjons eller nedbrytningsprodukter er sannsynlig på grunn av bruk av lav renhet eller ufullstendig linearisert DNA. (B) Bilde av mock transfekterte H1-HeLa-celler og celler transfektert med RNA transkripsjoner koder Mengovirus. Administrasjon av transfeksjon reagenser bare (Mock) vil opprettholde celle levedyktighet etter transfeksjon samt passasje på friske celler. Transfeksjon av RNA-transkripter som koder for et Mengovirus genom (VMC 24) resulterer i cytopatiske effekter, som blir opprettholdt etter filtrering av supernatanten og passasjen på friske H1-HeLa-celler. Scale bar = 100 mikrometer.ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 4
    Figur 4: Vekstkinetikken for umodifiserte og mikroRNA-målrettet Mengoviruses i nærvær eller fravær av beslektede microRNAs. Modifisert fra referanse 17. (A) H1-HeLa-celler som ikke uttrykker Mir-124, -125, eller -142. Alle tre Mengovirus koding mikroRNA Res replikere med liknende kinetikk som den umodifiserte virus (VMC 24) indikerer at innsetting av microRNAs på dette stedet (5 'UTR) forandrer ikke virusreplikasjon. (B) RAW 264,7 makrofager uttrykker middels nivå av MIR-125b og høye nivåer av MIR-142-3p, men uttrykker ikke MIR-124. Innlemmelse av de tilsvarende mikroRNA-target-sekvenser inn i genomet resulterer i virus attenuation i samsvar med nivået av mikroRNA uttrykk. Data blir representert som gjennomsnitt +/- SD virale titere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 5
    Figur 5: Analyse av mikroRNA målretting spesifisitet bruke syntetiske mikroRNA etterligner. Modifisert fra referanse 17. H1-HeLa celler transfektert med individuelle mikroRNA ligner ble infisert med umodifisert virus (VMC 24) eller mikroRNA-målrettet virus (Mirt-VMC 24) ved en MOI på 0,2. (A) Et cellelevedyktighet normalisert til mock-behandlede celler ble bestemt ved 24 timer etter infeksjon via MTT-celleproliferasjonsanalyse. (B) Virus titer i supernatanten av alle prøvene ble også bestemt ved 24 timer etter infeksjon. Dedata blir representert som midlere levedyktighet eller viral titer +/- SD. To-tailed uparede Student t-tester med Welch korreksjon (for ulike variasjoner) ble brukt for statistisk analyse. En p-verdi <0,01 ble betraktet som signifikant. (**, P <0,01, *** p <0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Utformingen, sammensetning og lokaliseringen av de mikroRNA respons elementer innen det virale genomet vil diktere målretting effekt og spesifisitet. Optimalisering av disse vil kreve prøving og feiling. Imidlertid rasjonell design basert på RNA-strukturanalyse og tidligere studier av virusreplikasjon og mikroRNA signaturer hjelpemidler i gjennomføringen av denne teknikken med minimal optimalisering 10, 11, 12, 13, 38.

    Når initiere utforming av Res, bør etterforskere begynne med å utarbeide et sett med microRNAs som kommer til uttrykk i målcellene av interesse, er redusert i de ikke-målceller av interesse, og som har blitt eksperimentelt validert. Etter denne samlingen, bør flere prediksjon baserte analyser bli gjennomført for å undersøke muligheten for konkurrerende mikroRNA-TARGEt interaksjoner. Mange virus koder microRNAs eller ikke-kodende RNA som binder cellulære microRNAs for å manipulere virus og vert genekspresjon. Videre har flere RNA-virus blitt vist å interagere med cellulære microRNAs for å øke deres replikasjonskapasitet 39, 40. Derfor, når du utformer Res, sørg for å undersøke om det er kjente interaksjoner av viruset med mobilnettet microRNAs eller hvis de uttrykker virale microRNAs som potensielt kan gjenkjenne den valgte mikroRNA mål eller endre den endogene uttrykk for den valgte mikroRNA. I tillegg til litteratursøk, bør leseren vurdere online bioinformatikk prediksjon verktøy og databaser som inkluderer viral mikroRNA target informasjon til hjelp i rasjonell utforming av res. Slike databaser og prediksjon verktøy kan også legge til rette for identifisering av mål sekvenser som kan gjenkjennes av flere microRNAs eller overlappende frø sekvenser forhånds sendes innen viral genom. For en mer inngående diskusjon om metoder for å identifisere mikroRNA mål og fordeler og ulemper med noen av de elektroniske prediksjon verktøy leseren blir referert til referanser 41, 42. Det anbefales at disse prediksjon verktøyene tjener bare som guider så mange ganger spådommer kan gi falske positive eller negative. For dette formål kan det være frø sekvenser som overlapper hverandre, vil imidlertid den 3 'ende av mikroRNA også påvirke målretting effektivitet. Bruk av for strenge for en regelsettet kan noen ganger være skadelig.

    Når et sett av potensielle mikroRNA mål har blitt identifisert, bør etterforsker fortsette ved å rangere målene basert på de biologiske egenskapene til microRNAs og RNA strukturelle spådommer 10, 11, 12, 13,ef "> 38. Den absolutte mengde av det modne mikroRNA i målceller og dens grad av assosiasjon med en argonaute protein vil diktere den grad av genet Slå. Flere studier har vist at bare i mengde uttrykt microRNAs vil vesentlig regulere genekspresjon 16, 43, 44. Videre, mens noen microRNAs er rikelig uttrykt sin interaksjon med argonaute proteiner og dannelse av RISC er tilstrekkelig til å undertrykke oversettelse 44. Ved hjelp av en svært rik mikroRNA med validert funksjonen vil også begrense muligheten for mikroRNA metning i målcellen og påfølgende off- målet toksisitet. en annen tilnærming kan være å bruke Res som er målrettet av flere mirnas 45, 46, som kan gjøre det mulig for en redusert kopi nummer samtidig minimere potensialet for off-target toxicities. Forholdet mellom mål mRNA til mikroRNA vil også ha en betydelig innvirkning på suksessen til denne tilnærmingen. En høy mål å mikroRNA forholdet vil redusere nivået av undertrykkelse 42, 43, 47, 48. Dette er spesielt viktig med virus som kopierer seg raskt når hvis feil regulert tidlig under infeksjon vil akkumuleres til nivåer utenfor kontroll av endogene microRNAs. Det er viktig å vurdere disse egenskapene når du velger en mikroRNA for målretting; ideelt sett, ved hjelp av en mikroRNA hvis funksjon er blitt eksperimentelt validert.

    Effektiviteten av målrettet genet Slå er også påvirket av den prosent komplementaritet av målet til den modne mikroRNA samt antall kopier av mikroRNA sekvenser innsatt. 5'-regionen av mikroRNA (nukleotidene 2-8) utgjør frøet sekvensen. Det er generelt akseptertat denne regionen må være helt utfyllende for vellykket målretting 48, 49. Flertallet av studiene bruker responselementer med perfekt komplementaritet fordi det kan øke gen-Silencing aktivitet ved å fremme endonucleolytic spalting av transkripsjon og hurtig gjenvinning av mikroRNA. Dette endonucleolytic spalting oppstår bare når en mikroRNA samvirker med en argonaute protein som har endonucleolytic aktivitet, som i pattedyrceller er begrenset til argonaute-2. Andre argonaute proteiner fremme mRNA degradering av deadenylation og eksonukleo-lytisk angrepet av karakterutskriften. Leseren henvises til referanser 4, 5, 13, 50, 51, 52 for en grundig beskrivelse av mikroRNA biogenesis og funksjon. Det er generelt antatt at INCRlettelser kopiantallet vil ytterligere styrke rettet mot effektivitet. Men dette kan også forsterke mikroRNA metning og har ikke alltid vist seg mer effektivt. Noen ganger er det bedre å innlemme målsekvenser for flere ulike microRNAs beriket i målcellene eller å bruke target-sekvenser som er anerkjent av flere microRNAs. Kopiantall er også sterkt avhengig av mengden av transkriptet som må stanse og den relative overflod av mikroRNA i målcellene. Transkripsjoner som vil akkumulere raskt kan kreve flere eksemplarer for å hindre dem fra utkonkurrert de mikroRNA nivåer. Eksperimentelt bestemme optimal kopi nummer for hver mikroRNA mål som resulterer i tilstrekkelig målretting, opprettholder viral fitness, og som minimerer frekvensen av rømnings mutasjoner anbefales.

    Lokalisering av mikroRNA responselementet innenfor det virale genomet er ekstremt viktig. Et negativt resultat ved analysedet måls effektivitet betyr ikke alltid at viruset ikke kan være mikroRNA-målrettet. Det kan ganske enkelt bety at målet ikke er tilgjengelig på dette stedet, eller at undertrykkelse av den målrettede genet er ikke tilstrekkelig til å inhibere patogenisitet. Flertallet av responselementer er innført i de 3'-utranslaterte regioner (UTR) av målrettet transkriptet. Imidlertid er vellykket målretting av virale genomer blitt utført og noen ganger utstillinger forbedret genetisk stabilitet når responselementer er satt inn i den 5 'UTR eller innenfor de kodende regionene av essensielle gener 38. Optimale innsetting nettsteder vil tillate høy tilgjengelighet av målet sekvens til mikroRNA. Tilgjengelighet kan bli hindret av RNA sekundære strukturer og støkiometriske forstyrrelser. Derfor lokaliserende respons elementer i ustrukturerte regioner som er høyt konservert er et godt utgangspunkt. Sekvensene blir satt inn, kan også påvirke og bli påvirket av de omkringliggende sekvenser. Thus, er en optimal plassering for en mikroRNA målsekvens ikke nødvendigvis optimale for andre responselementer. Mens eksperimentell validering og optimalisering av RE lokalisering er nødvendig, ved hjelp av prediksjon programvare (f.eks http://unafold.rna.albany.edu/; http://rna.urmc.rochester.edu/software.html) til skjermen potensielle innleggssider for forstyrrelse av de omkringliggende RNA strukturer er sterkt anbefalt 53, 54.

    Bruken av ren nukleinsyre-preparater med høy integritet er også kritisk for å oppnå de beste resultatene. Aseptisk teknikk og vedlikehold av en RNase-fritt miljø ved håndtering av RNA transkripsjoner eller mikroRNA ligner er viktig. For best resultat RNA transkripsjoner bør mikroRNA etterligner, og endelig titrert virus aksjer oppbevares ved -80 ° C i små porsjoner for å unngå gjentatt frysing og tining resulterer i RNA degradering og tap av virus smittsomhet. Når du er i bruk, disse reagenss bør holdes på is til alle tider.

    Det er viktig å merke seg at mange microRNAs er medlemmer av en familie av microRNAs som deler komplementaritet. Derfor når gjennomføre studier kan det være gunstig å inkludere medlemmer av den nærmeste mikroRNA familien å bedre målretting-spesifisitet evaluering. Dette blir kritisk når cellene hvori virusreplikasjon er ønsket, uttrykker medlemmer av familien (for eksempel MIR-Let7 familie). Det bør også bemerkes at spesifisiteten analyse ved bruk av mikroRNA ligner er et kunstig system og over-ekspresjon av en mikroRNA i enkelte celler kan resultere i off-target effekter 55. Hvis dette skjer, kan spesifisiteten også bli vurdert i celler som uttrykker de riktige microRNAs bruker mikroRNA-hemmere i stedet. Denne analyse vil tillate analyse av målretting-spesifisitet basert på virus titrering og celleviabilitet avlesninger i nærvær av fysiologisk relevante nivåer av microRNAs.

    10, 11, 12, 13. Mange virus har høye mutasjon priser og flykte mutanter kan oppstå raskt. Inkludert flere kopier av en targetsekvens, inkludert mål for mer enn én mikroRNA, lokalisere mål innenfor flere høyt konserverte regioner, eller tilstedeværelse av flere antivirale faktorer, inkludert en immunrespons kan lindre dette. I tillegg vil innsettingen av fremmed genetisk materiale inn i et viralt genom ofte resultere i redusert replikasjonskapasitet av viruset. Hvis dette skjer, er det mikroRNA mål sannsynlig å være genetisk ustabile og rømme mutanter oppstår raskere. Inkludering av flere mikroRNA målet kopier can også øke potensialet for recombinatorial sletting av mikroRNA mål. Derfor er det nødvendig eksperimentell bestemmelse av den minimale antall kopier som kreves for tilstrekkelig målretting. Lokalisering av mikroRNA målet kopier på forskjellige steder i hele genomet versus bruker tandem repetisjoner kan hjelpe til med å omgå denne begrensningen. Men identifisere optimale RE konfigurasjoner med minimum antall mål eksemplarer som trengs og sette inn områder som ikke fører til endrede replikering kinetikk av viruset er avgjørende for å minimere frekvensen av rekombinasjon og målet mutasjon. Inkludering av for mange eksemplarer av en target-sekvensen kan også øke potensialet for off-target toksisitet hvis det resulterer i mikroRNA metning. En stor endring i mengden av mikroRNA tilgjengelig for regulering av normale cellulære proteiner kan føre til uønskede effekter 55. For dette formål er mange virus endre mikroRNA miljø i en celle 56, og hvis denneomfatter den målrettede mikroRNA, kan effektiviteten av reguleringen bli redusert hvis nok virusreplikasjon opprettholdes. Alle disse problemer kan løses ved å optimalisere responselement sammensetning og / eller lokalisering og med en grundig forståelse av systemet å være målrettet og begrensninger.

    Typiske problemer forbundet med andre målrettingsmetoder inkluderer off-target demping av viruset, størrelsesbegrensninger for genetisk målretting materialet i virus med begrenset bærekapasitet og sikkerhet bekymringer knyttet til prosjektering virus målrette celler som normalt ikke er smittet. MikroRNA-målretting gir mulighet for regulering av Virustropisme med minimal modifikasjon av viruset. Det krever minimalt med plass i løpet av en viral genom og kan skreddersys basert på en ekspansiv rekke cellulære mikroRNA signaturer. Denne teknikken ikke innføre nye tropisms for viruset, og derfor ikke innføre noen nye sikkerhetsaspekter. I tillegg gir denneFremgangsmåten kan brukes til å regulere flere tropisms samtidig ved hjelp av målsekvenser for flere forskjellige microRNAs anriket i ulike celletyper 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61. Dette kan alle oppnås uten å svekke viruset i celler som ikke uttrykker de tilsvarende microRNAs og kan derfor tilveiebringe en mekanisme for å bedre sikkerheten av terapeutiske virus med forbedret potens.

    Utnyttelse av cellulær mikroRNA maskineri kan anvendes for regulering av tropisme av mange forskjellige klasser av virus. Protokollene beskrevet her er designet for redning og karakterisering av en mikroRNA-målrettet picornavirus, men de kan tilpasses i henhold til en virusets replikasjonssyklus og spesifikk reporter readouts. Selv om forskjellige virus har spesifikke rednings strategier kan mikroRNA målsekvenser innføres i det virale genomet, uansett om hele genomet er kodet i et enkelt plasmid eller om viruset har en DNA eller RNA-genom. Så lenge produsent cellene ikke uttrykke beslektede microRNAs bør optimalisert mikroRNA mål ikke forstyrre virus redning. Forsøk å analysere virus vekstkinetikk og mikroRNA-målretting spesifisitet kan endres ved å endre tidspunktene innsamlede basert på lengden av en enkelt runde av virusreplikasjon og på bestemte avlesninger for virusreplikasjon / toksisitet (f.eks reporter proteiner, cytotoksisitet, genom kvantifisering, etc.). Det er viktig å merke seg at selv om denne teknikken kan teoretisk anvendes for alle klasser av virus, kan mange faktorer som påvirker effektiviteten av denne metode. For eksempel har negative-sense RNA virus ikke vist seg så responsiv som positiv-sense RNA virus sannsynlig på grunn av begrenset accessibility av genomisk RNA til miRNA maskiner 13. Dermed vil de biologiske egenskapene til hver klasse av virus formidle ytterligere begrensninger på RE optimalisering. Til tross for disse begrensningene, denne teknikken gir en alternativ metode for målretting Virustropisme til rette for forskning som involverer sikkerhet, nytte, og grunnleggende forståelse av biologiske prosesser for alle klasser av virus.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
    Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
    Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
    T4 DNA Ligase System NEB M0202S
    MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
    MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
    0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
    5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
    Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
    Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
    TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
    TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
    0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
    2 ml Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
    Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
    MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
    MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
    Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
    pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional Regulation of the Heterochronic Gene Lin-14 By Lin-4 Mediates Temporal Pattern Formation in C. Elegans. Cell. 75 (5), 855-862 (1993).
    2. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans Heterochronic Gene Lin-4 Encodes Small RNAs With Antisense Complementarity to Lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
    3. Ambros, V. The Functions of Animal MicroRNAs. Nature. 431 (7006), 350-355 (2004).
    4. Bartel, D. P. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
    5. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target Recognition and Regulatory Functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
    6. Benitez, A. A., Spanko, L. A., Bouhaddou, M., Sachs, D., Tenoever, B. R. Engineered Mammalian RNAi Can Elicit Antiviral Protection That Negates the Requirement for the Interferon Response. Cell Rep. 13 (7), 1456-1466 (2015).
    7. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Yalcin, A., Meyer, J., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of Tissue-Specific MicroRNAs From Mouse. Curr Biol. 12 (9), 735-739 (2002).
    8. Landgraf, P., et al. A Mammalian MicroRNA Expression Atlas Based on Small RNA Library Sequencing. Cell. 129 (7), 1401-1414 (2007).
    9. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: Tools for MicroRNA Genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
    10. Kelly, E. J., Russell, S. J. MicroRNAs and the Regulation of Vector Tropism. Mol Ther. 17 (3), 409-416 (2009).
    11. Brown, B. D., Naldini, L. Exploiting and Antagonizing MicroRNA Regulation for Therapeutic and Experimental Applications. Nat Rev Genet. 10 (8), 578-585 (2009).
    12. Tenoever, B. R. RNA Viruses and the Host MicroRNA Machinery. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 169-180 (2013).
    13. Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNAs and Oncolytic Viruses. Curr Opin Virol. 13, 40-48 (2015).
    14. Brown, B. D., Venneri, M. A., Zingale, A., Sergi Sergi, L., Naldini, L., L, Endogenous MicroRNA Regulation Suppresses Transgene Expression in Hematopoietic Lineages and Enables Stable Gene Transfer. Nat Med. 12 (5), 585-591 (2006).
    15. Brown, B. D., et al. A MicroRNA-Regulated Lentiviral Vector Mediates Stable Correction of Hemophilia B Mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
    16. Brown, B. D., et al. Endogenous MicroRNA Can be Broadly Exploited to Regulate Transgene Expression According to Tissue, Lineage and Differentiation State. Nat Biotechnol. 25 (12), 1457-1467 (2007).
    17. Ruiz, A. J., Hadac, E. M., Nace, R. A., Russell, S. J. MicroRNA-Detargeted Mengovirus for Oncolytic Virotherapy. J Virol. 90 (8), 4078-4092 (2016).
    18. Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. Engineering Attenuated Virus Vaccines By Controlling Replication Fidelity. Nat Med. 14 (2), 154-161 (2008).
    19. Barnes, D., Kunitomi, M., Vignuzzi, M., Saksela, K., Andino, R. Harnessing Endogenous MiRNAs to Control Virus Tissue Tropism as a Strategy for Developing Attenuated Virus Vaccines. Cell Host Microbe. 4 (3), 239-248 (2008).
    20. Perez, J. T., Pham, A. M., Lorini, M. H., Chua, M. A., Steel, J., Tenoever, B. R. MicroRNA-Mediated Species-Specific Attenuation of Influenza a Virus. Nat Biotechnol. 27 (6), 572-576 (2009).
    21. Saydaminova, K., et al. Efficient Genome Editing in Hematopoietic Stem Cells With Helper-Dependent Ad5/35 Vectors Expressing Site-Specific Endonucleases Under MicroRNA Regulation. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14057 (2015).
    22. Langlois, R. A., et al. MicroRNA-Based Strategy to Mitigate the Risk of Gain-of-function Influenza Studies. Nat Biotechnol. 31 (9), 844-847 (2013).
    23. Kelly, E. J., Hadac, E. M., Cullen, B. R., Russell, S. J. MicroRNA Antagonism of the Picornaviral Life Cycle: Alternative Mechanisms of Interference. PLoS Pathog. 6 (3), e1000820 (2010).
    24. Pham, A. M., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Replication in Cells of Hematopoietic Origin is Necessary for Dengue Virus Dissemination. PLoS Pathog. 8 (1), 1002465 (2012).
    25. Langlois, R. A., Varble, A., Chua, M. A., García-Sastre, A., Tenoever, B. R. Hematopoietic-Specific Targeting of Influenza a Virus Reveals Replication Requirements for Induction of Antiviral Immune Responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (30), 12117-12122 (2012).
    26. Chua, M. A., Schmid, S., Perez, J. T., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Influenza a Virus Utilizes Suboptimal Splicing to Coordinate the Timing of Infection. Cell Rep. 3 (1), 23-29 (2013).
    27. Griffiths-Jones, S. The MicroRNA Registry. Nucleic Acids Res. 32, D109-D111 (2004).
    28. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: MicroRNA Sequences, Targets and Gene Nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).
    29. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Integrating MicroRNA Annotation and Deep-Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 39, D152-D157 (2011).
    30. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Annotating High Confidence MicroRNAs Using Deep Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 42, D68-D73 (2014).
    31. Heckman, K. L., Pease, L. R. Gene Splicing and Mutagenesis By PCR-Driven Overlap Extension. Nat Protoc. 2 (4), 924-932 (2007).
    32. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. . , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5063/gel-purification (2016).
    33. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Ligation Reactions. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5069/dna-ligation-reactions (2016).
    34. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method (2016).
    35. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA From Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
    36. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
    37. Separation of RNA in Agarose Gels. Sourcebook for Electrophoresis. Lonza. , Available from: http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_BenchGuides_SourceBook_Section_VIII_-_Separation_of_RNA_in_Agarose_Gels.pdf 132-145 (2016).
    38. Kueberuwa, G., Cawood, R., Tedcastle, A., Seymour, L. W. Tissue-Specific Attenuation of Oncolytic Sindbis Virus Without Compromised Genetic Stability. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 154-165 (2014).
    39. Grundhoff, A., Sullivan , C. S. Virus-Encoded MicroRNAs. Virology. 411 (2), 325-343 (2011).
    40. Kincaid, R. P., Sullivan, C. S. Virus-Encoded MicroRNAs: An Overview and a Look to the Future. PLoS Pathog. 8 (12), e1003018 (2012).
    41. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental Strategies for MicroRNA Target Identification. Nucleic Acids Res. 39 (16), 6845-6853 (2011).
    42. Thomson, D. W., Dinger, M. E. Endogenous MicroRNA Sponges: Evidence and Controversy. Nat Rev Genet. 17 (5), 272-283 (2016).
    43. Mullokandov, G., et al. High-Throughput Assessment of MicroRNA Activity and Function Using MicroRNA Sensor and Decoy Libraries. Nat Methods. 9 (8), 840-846 (2012).
    44. Thomson, D. W., et al. Assessing the Gene Regulatory Properties of Argonaute-Bound Small RNAs of Diverse Genomic Origin. Nucleic Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
    45. Wu, S., et al. Multiple MicroRNAs Modulate P21cip1/waf1 Expression By Directly Targeting Its 3' Untranslated Region. Oncogene. 29 (15), 2302-2308 (2010).
    46. Vo, N. K., Dalton, R. P., Liu, N., Olson, E. N., Goodman, R. H. Affinity Purification of MicroRNA-133a With the Cardiac Transcription Factor, Hand2. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19231-19236 (2010).
    47. Arvey, A., Larsson, E., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Target mRNA Abundance Dilutes MicroRNA and siRNA Activity. Mol Syst Biol. 6, 363 (2010).
    48. Garcia, D. M., Baek, D., Shin, C., Bell, G. W., Grimson, A., Bartel, D. P. Weak Seed-Pairing Stability and High Target-Site Abundance Decrease the Proficiency of Lsy-6 and Other MicroRNAs. Nat Struct Mol Biol. 18 (10), 1139-1146 (2011).
    49. Jinek, M., Doudna, J. A. A Three-Dimensional View of the Molecular Machinery of RNA Interference. Nature. 457 (7228), 405-412 (2009).
    50. Pasquinelli, A. E. MicroRNAs and Their Targets: Recognition, Regulation and an Emerging Reciprocal Relationship. Nat Rev Genet. 13 (4), 271-282 (2012).
    51. Finnegan, E. F., Pasquinelli, A. E. MicroRNA Biogenesis: Regulating the Regulators. Crit Rev Biochem Mol Biol. 48 (1), 51-68 (2013).
    52. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of MicroRNA Biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
    53. Zuker, M. Mfold Web Server for Nucleic Acid Folding and Hybridization Prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
    54. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA Secondary Structure Prediction and Analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
    55. Khan, A. A., Betel, D., Miller, M. L., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Transfection of Small RNAs Globally Perturbs Gene Regulation By Endogenous MicroRNAs. Nat Biotechnol. 27 (6), 549-555 (2009).
    56. Skalsky, R. L., Cullen, B. R. Viruses, MicroRNAs, and Host Interactions. Annu Rev Microbiol. 64, 123-141 (2010).
    57. Sugio, K., et al. Enhanced Safety Profiles of the Telomerase-Specific Replication-Competent Adenovirus By Incorporation of Normal Cell-Specific MicroRNA-Targeted Sequences. Clin Cancer Res. 17 (9), 2807-2818 (2011).
    58. Fu, X., Rivera, A., Tao, L., De Geest, B., Zhang, X. Construction of an Oncolytic Herpes Simplex Virus That Precisely Targets Hepatocellular Carcinoma Cells. Mol Ther. 20 (2), 339-346 (2012).
    59. Yao, W., Guo, G., Zhang, Q., Fan, L., Wu, N., Bo, Y. The Application of Multiple MiRNA Response Elements Enables Oncolytic Adenoviruses to Possess Specificity to Glioma Cells. Virology. 458-459, 69-82 (2014).
    60. Bofill-De Ros, X., Gironella, M., Fillat, C. Mir-148a- and Mir-216a-regulated Oncolytic Adenoviruses Targeting Pancreatic Tumors Attenuate Tissue Damage Without Perturbation of MiRNA Activity. Mol Ther. 22 (9), 1665-1677 (2014).
    61. Baertsch, M. A., et al. MicroRNA-Mediated Multi-Tissue Detargeting of Oncolytic Measles Virus. Cancer Gene Ther. 21 (9), 373-380 (2014).

    Tags

    Immunologi mikroRNA mikroRNA-målretting picornavirus onkolytiske tropisme virus cytotoksisitet replikering genekspresjon
    MikroRNA-baserte Regulering av picornavirus tropisme
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Ruiz, A. J., Russell, S. J.… More

    Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (120), e55033, doi:10.3791/55033 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter