Introduction
El desarrollo de un método ampliamente aplicable, fácil y eficaz para la ingeniería de un vector con tropismo restringido ofrece una gran oportunidad para mejorar la seguridad, la comprensión biológica y utilidad terapéutica de los virus. Existen varios mecanismos para orientar tropismo viral incluyendo transduccional, de la transcripción, y las técnicas basadas en la traducción. Sin embargo, estos métodos no son aplicables en general a todos los sistemas de vectores, pueden requerir vías de señalización defectuosos en las células diana o requerir la inserción de grandes secuencias de codificación en el genoma viral. Además, estos métodos pueden dar lugar a la atenuación del virus, lo que dificulta considerablemente su actividad terapéutica y la limitación de penetración en el sistema sin modificar.
Los microARN son pequeñas (22-25 nucleótidos), los ARN no codificantes que median el silenciamiento de genes en células eucariotas. Los microARN función de secuencias diana complementarias (elementos de respuesta) en unión a ARN mensajeros (ARNm) resultadoi ng en la desestabilización transcripción, la degradación o la represión de traducción. MicroARNs normalmente se unen elementos de respuesta con complementariedad parcial y producen pequeñas modificaciones en la expresión génica 1, 2, 3, 4, 5. Más alteraciones significativas en la expresión génica se puede lograr mediante el aumento de la complementariedad del elemento de respuesta a 6. Miles de microRNAs maduros se han identificado en una variedad de especies y muchos patrones de expresión diferenciales de exposiciones en una variedad de tipos de células y tejidos 7, 8, 9. Estas firmas de microARN pueden ser explotados para la restricción específica de la célula de amplificación de virus mediante la incorporación de elementos de respuesta perfectamente complementarias en el genoma viral 10,= "xref"> 11, 12, 13. El objetivo general de esta técnica microRNA objetivo es controlar el tropismo de un genoma vector sin atenuación adicional.
La utilidad de este método para regular el tropismo viral se demostró originalmente en vectores lentivirales para restringir la expresión del transgén en tejidos específicos 14, 15, 16. Esta técnica posteriormente se ha aplicado a una amplia gama de replicarse y no replicante vectores virales para la terapia génica mejorada, así como para mejorar los perfiles de seguridad de muchos virus oncolíticos mediante la eliminación de las toxicidades no deseadas en los tejidos normales 10, 11, 12, 13, 17 . También se ha utilizado para generar seguro y evacunas vivas atenuadas EFECTIVA, así como para mejorar virus y fabricación de vacunas procesos 18, 19, 20, 21. El microARN-focalización de un vector puede permitir que la atenuación en huéspedes vacunados o sistemas específicos, manteniendo los niveles de crecimiento de tipo salvaje en los sistemas de producción. MicroRNA orientación también puede utilizarse para mejorar la seguridad de la biotecnología de los virus para fines de investigación mediante la restricción de la transmisión en una especie (por ejemplo, seres humanos) mientras se mantiene la transmisión en otros huéspedes 22. Por último, microRNA orientación puede permitir el análisis en profundidad de los ciclos de vida virales y las funciones específicas de tipos de células en la patogénesis e inmunidad mediante la segregación de crecimiento viral 23, 24, 25, 26.
Esta técnica ofrece una alternative método que se implementa fácilmente aplicable y la orientación para todos los sistemas de virus. Además, la colección cada vez mayor de los microRNAs maduros con los patrones de expresión diferencial en tipos específicos de células hace que esta técnica altamente versátil. la focalización basada en microARN ha demostrado su eficacia para una variedad de sistemas de virus sin comprometer la función del sistema. Las principales limitaciones de esta técnica incluyen el juicio y la optimización de error, el potencial de mutaciones de escape, y los posibles efectos fuera de la meta en transcripciones endógenos. Sin embargo, estas limitaciones se pueden superar por lo general con un diseño optimizado y racional elemento de respuesta. los virus de ARN de sentido positivo tienden a ser particularmente sensible a microRNA-orientación debido a la orientación de sentido positivo de su genoma y la disponibilidad de los transcritos a la maquinaria microRNA durante el ciclo de replicación completamente citoplasmática. Aquí se describe un protocolo para la generación de un picornavirus microRNA específico y la experimentales métodos para verificar la eficiencia y la especificidad de que la selección in vitro.
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Protocol
1. Clonación Elementos de Respuesta microARN en el genoma viral
- Diseño de microARN inserciones elemento de respuesta.
- Identificar el microARN deseado y su secuencia diana correspondiente. Varias bases de datos están disponibles con secuencias de microARN maduros. Recomendado: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30.
- Clonar el elemento de respuesta en el ADN plásmido que codifica el genoma del vector o transcripción.
NOTA: Para dos o más elementos de respuesta de copia con un único sitio de restricción para la inserción es más fácil y más versátil.- Insertar elemento de respuesta o un sitio de restricción único con la extensión de empalme de solape (SOE) PCR. Este método ha sido descrito en detalle 31.
- Si se utiliza un sitio de restricción para la inserción, purperseguir sintetizado comercialmente, el sentido PAGE-purificado y ultramers antisentido que codifican las secuencias de inserción flanqueada por las secuencias de voladizo del único sitio de restricción (Figura 2).
- Combinar 0,5 g ultramer sentido, 0,5 g ultramer antisentido, tampón de ligación de ADN a una concentración final de 1x, y llevar a 50 l con H 2 O. recocer la ultramers mediante la incubación de la reacción a 85 ° C durante 10 min y luego la reducción de la temperatura por 0,5 ° C cada 30 segundos hasta que la reacción alcanza 25 ° C.
- Combinar 0,5 g de ADN vector que codifica el nuevo sitio de restricción único, tampón de enzima a una concentración final de 1x, 1 l de la enzima de restricción apropiada, y llevar a un volumen final de 20 l con H 2 O. Se digiere el vector a 37 ° C durante 2 h. Se purifica el ADN linealizado mediante purificación en gel de agarosa 32.
- Se liga el ultramers recocidas en el vector digerido durante la noche a 16 °; C usando una mezcla 3: 1 ultramers: relación molar vector y técnicas de unión estándar 33.
NOTA: Cuando se utiliza un sitio de enzima de restricción único para la inserción puede ser más eficiente para dephosphorylate los extremos del vector digerido y fosforilar los extremos de los oligonucleótidos hibridados. - Transformar el ADN ligado en E. coli utilizando el procedimiento de choque térmico 34.
NOTA: Los plásmidos que codifican genomas virales son generalmente grandes, por tanto, el uso de células competentes optimizados para absorber grandes construcciones de ADN puede aumentar la eficiencia de transformación. - Se purifica ADN de plásmido a partir de colonias individuales usando un kit de purificación disponible comercialmente 35. Identificar un clon apropiado con el elemento de respuesta microRNA en la orientación correcta (Figura 2) mediante la secuenciación de la región de inserción 36.
2. El rescate de picornavirus microARN-dirigida lado a otroEl ADN del plásmido m
- Picornavirus rescate microARN-dirigida en una línea celular permisiva para la replicación del virus que no expresa el microARN (s) afín. Este protocolo utiliza células H1-HeLa, ya que no expresan el miR-142, miR-124 o miR-125, sin embargo, no es necesario para utilizar las células H1-HeLa para el rescate.
PRECAUCIÓN: Todas las directrices para el manejo y la eliminación de agentes infecciosos se deben seguir en consecuencia.- células de la placa H1-HeLa en una placa de 6 pocillos tal que son ~ 80% de confluencia en el momento de la transfección (24 h después de la siembra). células de la placa en 2 ml por pocillo de DMEM suplementado con suero bovino fetal 10%.
- Calentar el reactivo de transfección a temperatura ambiente. Combinar 250 mu L medios libres de suero, 2,5 g de plásmido ADN que codifica el genoma microARN-dirigido, y 7,5 l de reactivo de transfección en un tubo estéril de microcentrífuga y pipeta suavemente para mezclar. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15-30 min.
- Aspirar ellos soportes de las células cultivadas en placas y añadir 2 ml de medio completo fresco.
- Añadir toda la mezcla de transfección de la etapa 2.1.2 a un pocillo de la placa de 6 pocillos gota a gota. Añadir cada gota para un área diferente del pozo.
- Se incuban las células a 37 ° C hasta que los efectos citopáticos (CPE) o proteínas informadoras son detectables (~ 24-72 h).
- Cosecha y el paso del virus rescatado a las células frescas.
- células de la placa en una placa de 6 pocillos tal que son 80 a 90% de confluencia en el momento de la infección (24 h después de la siembra).
NOTA: Escala hacia arriba o hacia abajo dependiendo de la cantidad de virus necesaria para todos los experimentos posteriores. - Cosecha de cada rescate bien raspando las células en el sobrenadante utilizando un rascador de células de caucho o goma de policía. arrastrar suavemente el raspador a través de la parte inferior del pozo. Transferencia de las células y el sobrenadante en un tubo de almacenamiento criogénico.
- Congelar / descongelar las muestras dos veces y luego sedimentar los residuos celulares porcentrifugación a 1200 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Filtrar el sobrenadante aclarado dos veces utilizando 0,2 micras filtros de jeringa. El sobrenadante de rescate filtrado contiene el virus.
NOTA: El filtro de tamaño de poro puede variar dependiendo del tamaño de partículas de virus y puede no ser aplicable para virus de gran tamaño. - Aspirar los medios de las células cultivadas en placas, se lavan una vez con medio libre de suero y se añade 1 ml de medio libre de suero fresco a cada pocillo.
- Añadir 50 l por pocillo de sobrenadante de rescate se filtró y se mueva suavemente la placa para distribuir uniformemente virus.
- Incubar la placa a 37 ° C durante 2 h y a continuación, los medios de comunicación de aspirado de cada pocillo para eliminar el virus no incorporada.
- Añadir 1,5 a 2 ml de medio completo fresco por pocillo y se incuba a 37 ° C hasta CPE o reportero proteínas son aparente (~ 24-48 h).
- Repita los pasos 2.2.2 a 2.2.4. Se filtra el sobrenadante de rescate contiene una reserva de virus. las reservas del virus de la tienda en alícuotas de un solo uso en tubos criogénicos de almacenamiento a -80 °DO.
- células de la placa en una placa de 6 pocillos tal que son 80 a 90% de confluencia en el momento de la infección (24 h después de la siembra).
3. el virus de rescate microARN-apuntado de ARN transcrito in vitro transcripciones
- Generar transcritos de ARN a partir del ADN plásmido que codifica el genoma viral microRNA objetivo usando un promotor aguas arriba.
NOTA: Las prácticas estándar para generar y mantener un ambiente libre de nucleasa se deben utilizar para todas las etapas posteriores. - Linealizar el ADN plásmido utilizando un sitio de enzima de restricción aguas abajo de la transcripción. Combinar plásmido ADN 5 mg, tampón enzimático concentración final 1x, con enzimas de restricción 3 l y llevar a 50 l con H 2 O. Incubar la reacción a 37 ° C durante 3 horas.
- Añadir 1/20 volumen de 0,5 M EDTA, 1/10 volumen de 5 M NH 4 de etilo, y 2 volúmenes de etanol al 100% a la reacción digerido y mezclar. Se incuba a -20 ° C durante 1 h hasta durante la noche.
- Sedimentar las ADN precipitado durante 10 minutos a 17.000 xga 4 ° C. Se retira la supernatant, resuspender el precipitado en 500 l de etanol frío al 70% y sedimentar el ADN por centrifugación a 17.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Verter el sobrenadante y centrifugar de nuevo durante 30 seg. Eliminar el sobrenadante residual con una pipeta y aire secar el pellet. Resuspender el sedimento de ADN en estéril libre de nucleasa H 2 O a una concentración de 0,5 a 1 g / l.
- Descongelar los reactivos de transcripción in vitro a temperatura ambiente y colocar los ribonucleótidos en hielo (enzimas en glicerol no se congelan y deben ir directamente en hielo). Mantenga el tampón de reacción a temperatura ambiente.
- Montar la reacción de transcripción en un tubo de PCR mediante la combinación de 2 l cada uno de ATP, CTP, GTP, y las soluciones UTP, 2 l de 10x tampón de reacción, 1 g de ADN linealizado, 2 enzima l, y llevar a un volumen final de 20 l con nucleasa H 2 O. exento
- Incubar la reacción a 37 ° C durante 2 hr.
- Purificar las transcripciones de ARN.
- Llevar la reacción de transcripción a 100 l con la solución de elución (no-precalentado). Añadir 350 l de concentrado de solución de unión y 250 l de etanol al 100% a la reacción y mezclar.
- Transferir la muestra a un cartucho de filtro insertado en un tubo de recogida y centrifugar durante 1 min a 12.000 x g. Descartar el flujo continuo.
- Añadir 500 l de solución de lavado en el cartucho de filtro y centrifugar durante 1 min a 12.000 x g. Descarte el filtrado. Repita este paso de lavado una vez más. Descarte el filtrado. Centrifugar durante 1 min a 12.0000 xg para eliminar el etanol residual.
- Transferir el cartucho de filtro a un tubo de recogida limpio y añadir 50 l de la solución de elución precalentado al cartucho de filtro. Centrifugar durante 1 min a 12.000 x g. Repita este paso de elución de un volumen total de 100 l de eluyente containing transcritos de ARN purificados. Desechar el filtro de cartucho de impresión.
4. Titulante reservas de virus calculando el 50% del cultivo de tejidos dosis infecciosa (TCID 50)
- Células de la placa H1-HeLa en una placa de 96 pocillos a 10 4 células por pocillo en DMEM suplementado con suero bovino fetal 10%. Se incuban las células a 37 ° C durante la noche.
NOTA: Valorar virus en células permisivas para la replicación de virus que no expresan microRNAs afines. - Hacer 10 veces diluciones seriadas de virus cada una en un volumen total de 1 ml de suero libre demedios de comunicación.
NOTA: El uso de diluciones más bajas si se requiere más precisión.
NOTA: Cambie las puntas después de cada dilución para no sobrevalorar el título como el virus puede pegarse a las puntas. - Tip placas de 96 pocillos a los medios de lado y aspirar el contenido de las células HeLa plateados. Añadir 100 ml de cada dilución de virus por pocillo a 8 pocillos de placas de 96 pocillos (1 fila por dilución). Añadir 100 ml de medio libre de suero sin virus a la fila 1 y la fila 12 en la placa para los controles.
NOTA: Siempre aspirar y se suman los medios de comunicación a los pozos tocando la punta a lado del pozo para evitar el desprendimiento de células. - Incubar la placa a 37 ° C durante 2 horas. placa de boquillas a un lado y aspirar los medios de comunicación de los pozos.
NOTA: Cambie las puntas entre cada fila de dilución. - Añadir 100 l de medio completo a cada pocillo. Incubar la placa a 37 ° C durante 72 horas.
- Visualizar los pozos bajo un microscopio y marcar cada pocillo positivo o negativo para el CPE.
- Calcula cada título de virus con la siguiente ecuación: Log 10 (TCID 50 / ml) = L + D (S-0.5) + log 10 (1 / V). L es el logaritmo negativo 10 de la dilución de virus más concentrada probado en el que todos los pocillos son positivos. D es el log 10 del factor de dilución. S es la suma de las proporciones individuales (pi). pi es la proporción calculada de una dilución individuo (cantidad de pocillos positivos / cantidad total de pocillos por dilución. V es el volumen de inóculo (ml / pocillo).
Tabla 1: La cuantificación de partículas de virus infecciosas mediante el cálculo de la TCID 50. Los resultados representativos de las células infectadas con una serie de diluciones de diez veces de una población de virus. "L" es igual a 4, porque la última dilución que todos los pozos son positivos para el CPE es 10 -4. "D" es el registro de 10 diluciones de 10, ya que de 10 vecesfueron utilizados y por lo tanto es igual a 1. "S" es la suma de las proporciones individuales. En este ejemplo las proporciones individuales son 1,0, 0,875, 0,375, 0,125, y 0. La suma de estos (S) es 2,375. "V" es el volumen de inóculo en ml se usaron para infectar las células inicialmente.
5. La evaluación de la eficacia de microARN-focalización: Cinética de crecimiento de un solo paso
- Los mandos de este ensayo incluyen células infectadas, el virus no modificado y el virus que contienen un elemento de respuesta no específica o no funcional.
- células H1-HeLa en láminas para un experimento de curso de tiempo en placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos de tal manera que son 80 a 90% de confluencia en el momento de la infección (24 h después de la siembra). células de la placa en DMEM complementado con suero bovino fetal al 10% a 1 ml por pocillo.
NOTA: Se recomienda a la placa una placa separada para cada punto de tiempo. Este protocolo utiliza 7 puntos de tiempo diferentes para un virus con un ciclo de replicación 8-12 h. no se requieren células H1-HeLa para realizar esta unassay. Este ensayo se debe realizar en células permisivas que no expresan los microRNAs específicos. Este ensayo también puede realizarse en células que expresan los microRNAs afines para evaluar la cinética de crecimiento bajo presión selectiva. - Aspirar los medios de pozos. Lavar los pocillos mediante la adición de 0,5 ml de medio libre de suero a cada pocillo, agitar la placa, y los medios de aspiración de los pozos. Añadir 0,5 ml de medio libre de suero fresco a cada pocillo.
- Infect cada pocillo a una alta multiplicidad de infección (MOI; número de partículas infecciosas por célula) para asegurar que todas las células se infectan. Este protocolo utiliza una MOI de 3.
- Diluir las reservas de virus en medio libre de suero a una concentración de MOI = 3 100 por mL. Añadir 100 ml de dilución de virus cada uno a siete pozos diferentes y se incuba a 37 ° C durante 2 h.
- Aspirar los medios de comunicación de todos los pocillos y lavar dos veces mediante la adición de 0,5 ml de medio completo por pocillo, meciéndose suavemente y luego aspirar.
- Añadir 1 ml de cmedios ompleta a cada pocillo y se incuba a 37 ° C hasta el punto de tiempo deseado.
- Recoger muestras para la titulación del virus a los 2, 4, 6, 8, 10, 24 y 48 h después de la infección (1 bien por punto de tiempo). Transferir 700 l de los medios de comunicación en el pozo para un tubo de almacenamiento criogénico. Raspar las células en el sobrenadante restante moviendo suavemente un raspador de goma a través de todo el pozo. Transfiera la mezcla de células / sobrenadante en el tubo de almacenamiento criogénico correspondiente que contiene los 700 l de sobrenadante.
NOTA: Asegúrese de no derramar líquido sobrenadante de un pozo a otro durante el raspado resulta en muestras contaminadas. La transferencia de los 700 l antes de raspar minimizará las salpicaduras. - Colocar las muestras a -80 ° C hasta que se recogen todas las muestras.
- De congelación / descongelación de las muestras tres veces y eliminar desechos celulares por centrifugación de las muestras a 1200 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Valorar el virus como se describe en la sección 4 y comparar la cinética de crecimiento del soyo me.
6. La evaluación de microARN-focalización Especificidad: Imitadores de microARN-Virus sintético difusión ensayo utilizando
NOTA: El uso de un mimético sintético microARN se lleva a cabo para mostrar la especificidad del microARN: interacción microARN-objetivo.
- Incluir transfección simulada, micro ARN control negativo imitan y microARN experimentales imitan sólo controla para cada ensayo para evaluar la toxicidad mediada por microARN. También es ideal para incluir un control positivo (es decir, gen o genoma microARN-dirigida) como la baja eficiencia de transfección de imita microRNA puede dar lugar a falsos negativos.
- células de la placa H1-HeLa en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos de tal manera que son 80 a 90% de confluencia en el momento de la transfección (24 h post-siembra). células de la placa en DMEM complementado con suero bovino fetal al 10% a 0,1 ml por pocillo.
NOTA: Realice este ensayo en células permisivas para la replicación viral que no expresan los microRNAs afines. - º tibiae transfección reactivos a temperatura ambiente. Combinar 9 mu l medio libre de suero, 200 nM concentración final por pocillo de microARN Stock mímica, reactivos impulso 0,18 l, 0,18 l de reactivo de transfección y mezclar. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 2-5 min.
NOTA: Los volúmenes indicados son por así. Se recomienda que una mezcla maestra ser ensamblado para la transfección de todos los pocillos para mantener la consistencia y minimizar el error de pipeteado. La concentración óptima de microRNA imitador puede variar. Consulte las instrucciones del fabricante que acompañan a la micro ARN imitan a una concentración de partida razonable. Esta variará generalmente de 5-200 nM concentraciones finales. - Aspirar los medios de los pocillos y añadir 92 l de medio completo fresco.
NOTA: Si hay un número significativo de muestras, completar este paso antes de montar la solución de transfección y almacenar la placa a 37 ° C hasta que esté listo. - Añadir toda la i mezcla de transfecciónn 6.3 paso a las células gota a gota.
- Se incuba a 37 ° C durante 6 h.
- Infectar a cada pocillo a una MOI baja para asegurar un bajo porcentaje de células se infectan para permitir el análisis de la propagación del virus. Este protocolo utiliza una MOI de 0,2.
- Diluir las reservas de virus en medio libre de suero a una concentración de MOI = 0,2 por 100 mL. Retire el medio de los pocillos y añadir 100 l de dilución de virus por pocillo.
- Incubar a 37 ° C durante 2 h.
- Aspirar los medios de cada pocillo y añadir 100 l de medio completo fresco.
- Incubar a 37 ° C durante 20-22 h.
- Determinar la titulación del virus en los sobrenadantes.
- Recoger el sobrenadante de cada pocillo y reemplazar con 100 l de medio completo fresco.
NOTA: Si está usando células en suspensión, suspensión del sedimento celular desde el siguiente paso en 100 L de medio completo fresco y volver a muestrear bien para ensayo de viabilidad. - Retire celluescombros lar a partir de los sobrenadantes recogidos por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Transferir el sobrenadante clarificado a un tubo nuevo y se valora un virus infeccioso en células permisivas que no expresan los microRNAs afines como se describe en la sección 4.
NOTA: Mantenga todas las muestras en hielo para evitar la pérdida de infectividad.
- Recoger el sobrenadante de cada pocillo y reemplazar con 100 l de medio completo fresco.
- Determinar la viabilidad de las células.
- Añadir 10 l de MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2) -2,5-difeniltetrazolio) reactivo por pocillo.
- Incubar a 37 ° C durante 2-4 h hasta precipitado púrpura es visible.
- Añadir 100 ml de reactivo de detergente.
- Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 2 h.
- Leer la absorbancia de todos los pocillos a 570 nm.
NOTA: Normalizar todas las muestras para burlarse de las células transfectadas para la comparación de la viabilidad celular por ciento.
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Representative Results
Tabla 1 representa los resultados típicos de un ensayo de valoración para un picornavirus y describe cómo calcular la dosis infecciosa de cultivo de tejidos 50%. Una representación esquemática del concepto general de la regulación basada en microRNA del tropismo viral se describe en este manuscrito se muestra en la figura 1. La orientación de microRNA a elemento de respuesta durante las interacciones intracelulares, un diseño adecuado de oligonucleótidos elemento de respuesta para la inserción de recocido y el plásmido, y una mapa de plásmido de ADN que codifica un genoma viral microRNA orientada para la transcripción in vitro se representa en la Figura 2. la Figura 3 muestra las transcripciones de ARN en diferentes grados de integridad visualizados por electroforesis en gel de agarosa. El manejo adecuado y el uso de ADN desprovisto de impurezas plantillas se traducirá en transcripciones de ARN transcritos correctamente, como se muestra en el carril 3A 2. impurezas residuales dentro de la lineaplantillas de ADN AUTORIZADO o trazas de nucleasa puede dar como resultado niveles bajos de RNA transcrito incorrectamente y / o productos de degradación similares a la observada en el carril 3A 3. linealización incompleta de ADN plásmido o ADN que contiene altas cantidades de impurezas tales como el etanol residual resultará en productos de la transcripción y de degradación indebidos representados en los carriles 3A 4 y 5. la figura 3 también muestra una imagen de efectos citopáticos mediadas por Mengovirus (CPE) después de la transfección de transcritos de ARN limpias. La figura 4 muestra los datos representativos de un tiempo experimento evaluar la cinética de crecimiento de Mengovirus sin modificar y microARN-dirigida. Los resultados muestran que los elementos de respuesta de microARN de ingeniería en el genoma Mengovirus no alteran la cinética de la replicación del virus en las células H1-HeLa, que no expresan ninguna de las microRNAs afines. Sin embargo, en macrófagos RAW 264.7, que expresan niveles intermedios de microRNA-125 y altos niveles de microARN-142, los virus que codifican los elementos de respuesta correspondientes muestran la cinética de replicación inhibidos que se correlaciona con el nivel de microRNA expresado. Los datos en la Figura 5 muestra la especificidad de la regulación basada en microARN de Mengovirus tropismo. La sobreexpresión de cada individuo microARN en células H1-HeLa inhibe específicamente la propagación (bajos títulos de virus) y la citotoxicidad (aumento de la viabilidad celular) de Mengovirus que codifica el elemento de respuesta microARN afín.
Figura 1: Representación esquemática de la regulación basada en microARN del tropismo viral. elementos de respuesta (RE) MicroARN incorporados en un genoma viral serán reconocidos por microRNAs afines enriquecidos dentro de tipos específicos de células y dan como resultado la degradación específica de los transcritos virales / genomas. Esta replicación del virus impedirá, la propagación y la toxicidad a THe las células circundantes. Sin embargo, la replicación viral se mantendrá en las células que no expresan los microRNAs afines que permiten la propagación de virus, la propagación y la muerte celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diseño elemento de respuesta microARN. (A) Para el éxito de la focalización de la región secuencia de semillas de la RE debe ser perfectamente complementarios. El RE debe orientarse dentro del genoma viral tal que puede ser reconocido por el cognado madura microRNA en transcritos de ARNm y / o el genoma viral. La mayoría de las FER se coloca dentro de la UTR 3 'de los transcritos. (B) Representación de oligonucleótidos diseñados adecuadamente y recocidas que codifican las RE que contienen tándemrepeticiones de las secuencias de microARN-objetivo (MIRT), flanqueada por los nucleótidos que sobresalen del sitio de la enzima de restricción XhoI. En el diseño de la ER de repetición en tándem, asegúrese de incluir nucleótidos espaciadores (generalmente 4-6) entre cada copia microARN-objetivo. (C) El ADN de plásmido que codifica un genoma viral de longitud completa con un RE incorporado en el 3 'UTR, un promotor T7, y un sitio de restricción único para la linealización para la transcripción in vitro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Rescate de virus de transcritos de ARN del genoma que codifica. Electroforesis en gel (A) ARN de los ARNs transcritos in vitro que codifican genomas de picornavirus para evaluar la integridad transcripción. carril 1: Escala de ARN. Carril 2: ARN transcrito correctamente con alta integridad. Carril 3: transcripciones de ARN con la integridad moderada. banda superior es el tamaño correcto y banda inferior es potencialmente un producto de degradación o una transcripción de ARN no deseado. Carril 4: incorrectamente transcrito de ARN. Carril 5: ARN de baja integridad. 500 ng de ARN transcrito in vitro se cargó por pocillo. de transcripción o productos de degradación inadecuadas son probablemente debido a la utilización de baja pureza o ADN linealizado de forma incompleta. (B) Imagen de células H1-HeLa transfectadas de manera simulada y células transfectadas con transcritos de ARN que codifican Mengovirus. La administración de reactivos de transfección solamente (Mock) mantendrá la viabilidad celular después de la transfección, así como el paso a las células frescas. La transfección de las transcripciones de ARN que codifican un genoma Mengovirus (VMC 24) da lugar a efectos citopáticos, que se mantuvo tras la filtración del sobrenadante y el paso sobre células H1-HeLa frescas. Barra de escala = 100 micras.ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cinética de crecimiento de Mengoviruses no modificados y microRNA-dirigida en la presencia o ausencia de microRNAs afines. Modificado de referencia 17. Células (A) H1-HeLa no expresan el miR-124, -125, -142 o. Los tres Mengovirus de codificación de microARN REs replican con una cinética similar como el virus sin modificar (VMC 24) que indican que la inserción de los microRNAs en esta ubicación (5 'UTR) no alteran la replicación del virus. (B) RAW 264,7 macrófagos expresan niveles intermedios de miR-125b, y altos niveles de miR-142-3p, pero no expresan el miR-124. La incorporación de las correspondientes secuencias de micro ARN diana en los resultados del genoma del virus en attenuation consistente con el nivel de expresión de microARN. Los datos se representan como títulos virales medias +/- SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis de la especificidad de microARN-focalización usando imita microARN sintéticos. Modificado de referencia 17. Células H1-HeLa transfectadas con imita microARN individuales fueron infectadas con el virus sin modificar (VMC 24) o el virus de microARN-dirigida (VMC MIRT-24) a una MOI de 0,2. (A) La viabilidad de las células se normalizó a las células tratados de forma simulada se determinó a las 24 horas después de la infección a través de ensayo de proliferación celular MTT. (B) el título de virus en el sobrenadante de todas las muestras se determinó también a las 24 horas post-infección. loslos datos se representan como la viabilidad media o título viral +/- SD. Pruebas t de Student no apareado con corrección de Welch (para varianzas desiguales) de dos colas se utilizaron para el análisis estadístico. Un valor de p <0,01 fue considerado significativo. (** P <0,01, *** p <0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El diseño, composición y localización de los elementos de respuesta microRNA dentro del genoma viral dictarán la orientación eficacia y especificidad. La optimización de los cuales habrá que ensayo y error. Sin embargo, el diseño racional basado en el análisis estructural del ARN y estudios previos de la replicación viral y microARN firmas auxiliares en la aplicación de esta técnica de optimización con un mínimo de 10, 11, 12, 13, 38.
Al iniciar el diseño de cosa, los investigadores deben empezar por compilar un conjunto de microARN que se expresan en las células diana de interés, están disminuidos en las células que no son objeto de interés, y que han sido validada experimentalmente. A raíz de esta compilación, varios análisis basados en predicciones deben llevarse a cabo para hacer frente a la posibilidad de competir microARN-Target interacciones. Muchos virus codifican microRNAs o ARN no codificantes que secuestran microRNAs celulares con el fin de manipular la expresión de genes virales y del huésped. Por otra parte, varios virus de ARN se han demostrado interactuar con microRNAs celulares con el fin de mejorar su capacidad de replicación 39, 40. Por lo tanto, en el diseño de ER, asegúrese de investigar si existen interacciones del virus conocidos con microARN celulares o si expresan microRNAs virales que podrían reconocer el objetivo de microARN elegido o alteraciones en la expresión endógena del microARN elegido. Además de búsquedas en la literatura, el lector debe tener en cuenta herramientas de predicción de la bioinformática en línea y bases de datos que incluyen información de destino microRNA viral para ayudar en el diseño racional de cosa. Tales bases de datos y herramientas de predicción también pueden facilitar la identificación de secuencias diana que pueden ser reconocidos por múltiples microRNAs o secuencias de semillas superpuestas pre enviado dentro del genoma viral. Para una discusión más a fondo sobre los métodos de identificación de objetivos de microARN y los pros y contras de algunas de las herramientas de predicción en línea se remite al lector a las referencias 41, 42. Se recomienda que estas herramientas de predicción sólo sirven como guías tantas veces predicciones pueden producir falsos positivos o negativos. Con este fin, puede haber secuencias de semillas que se superponen, sin embargo, el extremo 3 'del microARN también influir en la eficacia de dirección. El uso de demasiado estrictas de un conjunto de reglas a veces puede ser perjudicial.
Una vez que se han identificado una serie de posibles objetivos de microARN, el investigador debe continuar mediante la clasificación de los objetivos basados en las propiedades biológicas de los microARN y predicciones estructurales del ARN 10, 11, 12, 13,ef "> 38. La abundancia absoluta de la microRNA madura en las células diana y su nivel de asociación con una proteína Argonaute dictará el grado de silenciamiento de genes. Varios estudios han demostrado que microRNAs solamente expresa abundantemente regularán de manera significativa la expresión del gen 16, 43, 44. por otra parte, mientras que algunos microRNAs se expresan abundantemente su interacción con proteínas Argonaute y formación de RISC es insuficiente para reprimir traducción 44. el uso de un microRNA muy abundante con la función validado también minimizará el potencial para la saturación microRNA en la célula diana y la posterior off- las toxicidades de destino. un enfoque diferente puede ser el uso de ER que son el blanco de múltiples miRNAs 45, 46, lo que podría permitir a un número de copia reducido al tiempo que minimiza el potencial de toxiciti fuera del objetivoES. La relación de ARNm diana para microRNA también tendrá un impacto significativo en el éxito de este enfoque. Una alta proporción de destino para microARN reducirá el nivel de represión 42, 43, 47, 48. Esto es especialmente crítico con el virus que se replican rápidamente cuando si se reglamentan indebidamente la fase inicial de la infección se acumulan a niveles más allá del control de microRNAs endógeno. Es esencial tener en cuenta estas propiedades al elegir un microARN para la orientación; Idealmente, el uso de un microARN cuya función ha sido validada experimentalmente.
La eficiencia del silenciamiento génico dirigido también se ve afectada por el porcentaje de complementariedad de la diana a la microRNA maduro, así como el número de copias de secuencias de microARN diana insertados. La región 5 'de los microARN (nucleótidos 2-8) constituye la secuencia de semillas. En general se aceptaque esta región debe ser perfectamente complementarios de una selección adecuada 48, 49. La mayoría de los estudios utilizan elementos de respuesta con complementariedad perfecta, ya que puede aumentar la actividad de la silenciación del gen mediante la promoción de la escisión endonucleolítica de la transcripción y el reciclaje rápido de la microRNA. Esta escisión endonucleolítica sólo se produce cuando un microARN interactúa con una proteína Argonaute que tiene actividad endonucleolítica, que en células de mamífero se limita a Argonaute-2. Otras proteínas Argonaute promueven la degradación del ARNm por deadenilación y el ataque exonucleolıtica de la transcripción. Se remite al lector a las referencias 4, 5, 13, 50, 51, 52 para una descripción en profundidad de microARN la biogénesis y función. En general se cree que incrfacilitando el número de copias mejorará aún más la eficacia de dirección. Sin embargo, esto también puede potenciar la saturación microRNA y no siempre ha demostrado ser más eficaz. A veces es mejor para incorporar secuencias diana para múltiples microRNAs diferentes enriquecidas en las células diana o para utilizar secuencias diana que son reconocidos por múltiples microRNAs. El número de copias requerido depende también de la cantidad de transcripción que necesitará el silenciamiento y la abundancia relativa de la microRNA en las células diana altamente. Las transcripciones que se acumulan rápidamente pueden requerir más copias para evitar que se outcompeting los niveles de microARN. determinar experimentalmente el número óptimo de copia para cada objetivo microRNA que resulta en la orientación suficiente, mantiene la aptitud viral, y que minimiza se recomienda la tasa de mutaciones de escape.
La localización del elemento de respuesta microRNA dentro del genoma viral es extremadamente importante. Un resultado negativo en el análisisla eficacia de dirección no siempre significa que el virus no puede ser microARN-dirigida. Puede significar simplemente el objetivo no es accesible en ese lugar o que la represión del gen diana no es suficiente para inhibir la patogenicidad. La mayoría de los elementos de respuesta se insertan en las regiones no traducidas 3 '(UTR) de la transcripción específica. Sin embargo, la orientación satisfactoria de los genomas virales se ha logrado ya veces exhibe una mayor estabilidad genética cuando los elementos de reacción se insertan en la UTR 5 'o dentro de las regiones codificantes de los genes esenciales 38. sitios de inserción óptimos permitirán alta accesibilidad de la secuencia diana a la microRNA. La accesibilidad puede ser obstaculizada por estructuras secundarias de ARN de interferencia y estequiométrica. Por lo tanto, localizando los elementos de respuesta en regiones no estructurados que son altamente conservadas es un buen punto de partida. Las secuencias se insertan también puede influir y ser influenciados por las secuencias circundantes. THus, el lugar más adecuado para la secuencia diana de un microARN no es necesariamente óptimo para otros elementos de respuesta. Si bien la validación experimental y optimización de la localización RE es necesario, el uso de software de predicción (por ejemplo http://unafold.rna.albany.edu/; http://rna.urmc.rochester.edu/software.html) a la pantalla de posibles sitios de inserción para la perturbación de las estructuras de ARN que rodea es muy recomendable 53, 54.
El uso de preparaciones de ácido nucleico limpias de alta integridad es también crítica para la obtención de los mejores resultados. La técnica aséptica y mantenimiento de un ambiente libre de RNasa al manipular las transcripciones de ARN o imita microARN es esencial. Para obtener los mejores resultados de las transcripciones de ARN, imita microARN, y las reservas de virus tituladas finales deben ser almacenadas a -80 ° C en alícuotas pequeñas para evitar la congelación y descongelación repetida resulta en la degradación del ARN y la pérdida de la infectividad del virus. Cuando está en uso, estos reactivoss se debe mantener en hielo en todo momento.
Es importante señalar que muchos microRNAs son miembros de una familia de microRNAs que comparten complementariedad. Por lo tanto cuando se realizan estudios puede ser beneficioso para incluir a miembros de la familia inmediata microARN para mejorar la evaluación de orientación-especificidad. Esto se vuelve crítica cuando las células dentro de las que se desea la replicación del virus, expresan miembros de la familia (por ejemplo, familia miR-let7). También hay que señalar que el ensayo de especificidad utilizando imita microARN es un sistema artificial y la sobre expresión de un microARN en algunas células puede resultar en efectos fuera de objetivo 55. Si esto ocurre, la especificidad también se puede evaluar en células que expresan los microRNAs apropiadas usando inhibidores de microARN en su lugar. Este ensayo permitiría el análisis de la focalización especificidad basado en la titulación del virus y la viabilidad celular lecturas en la presencia de niveles fisiológicamente relevantes de microARN.
10, 11, 12, 13. Muchos virus presentan altas tasas de mutación y escapar mutantes pueden surgir rápidamente. Incluyendo múltiples copias de una secuencia diana, tales como metas de más de un microARN, localizando los objetivos dentro de varias regiones altamente conservadas, o la presencia de factores antivirales adicionales, incluyendo una respuesta inmune puede aliviar esto. Además, la inserción de material genético extraño en un genoma viral dará lugar a menudo en la capacidad de replicación disminuida del virus. Si esto ocurre, el objetivo microRNA es probable que sea genéticamente inestables y mutantes de escape surgirán más rápidamente. La inclusión de múltiples copias microRNA objetivo can también aumentan las posibilidades de eliminación de recombinación de los objetivos de microARN. Por lo tanto, la determinación experimental de la copia número mínimo requerido para la orientación suficiente es necesario. La localización de microARN copias diana en varios lugares del genoma en comparación con el uso de repeticiones en tándem puede ayudar a pasar por esta restricción. Sin embargo, la identificación de las configuraciones óptimas de ER con el mínimo número de copias diana necesarios y los sitios de inserción que no conducen a una alteración de la cinética de replicación del virus es fundamental para reducir al mínimo la tasa de recombinación y mutación de destino. La inclusión de demasiadas copias de una secuencia diana también puede aumentar la posibilidad de toxicidades fuera de objetivo si da lugar a la saturación de microARN. Una alteración importante en la cantidad de microARN disponible para la regulación de las proteínas celulares normales podría dar lugar a efectos no deseados 55. Con este fin, muchos virus alteran el medio ambiente microRNA dentro de una célula 56 y si esteincluye el micro ARN objetivo, la eficiencia de la regulación se puede disminuir si se mantiene lo suficientemente replicación del virus. Todos estos pueden ser expresadas mediante la optimización de la composición y / o localización elemento de respuesta y con un conocimiento profundo del sistema que está siendo dirigida y sus limitaciones.
Los problemas típicos asociados con otros métodos de selección incluyen la atenuación fuera del objetivo del virus, las limitaciones de tamaño para el material de modificación genética dirigida en los virus con capacidad de carga limitados y problemas de seguridad asociados con el virus de ingeniería a las células diana que normalmente no están infectadas. El microARN-focalización permite la regulación del tropismo viral con una mínima modificación del virus. Se requiere un espacio mínimo dentro de un genoma viral y puede ser adaptado en base a una extensa variedad de firmas de microARN celulares. Esta técnica no introduce nuevas tropismos para el virus y por lo tanto no introduce ningún nuevo problema de seguridad. Además, estemétodo se puede utilizar para regular múltiples tropismos simultáneamente mediante el uso de secuencias diana para múltiples microRNAs diferentes enriquecidos en diferentes tipos de células 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61. Todo esto se puede lograr sin atenuar el virus en las células que no expresan los microRNAs correspondientes y por lo tanto puede proporcionar un mecanismo para mejorar la seguridad de los virus terapéuticos con potencia mejorada.
La explotación de la maquinaria microRNA celular se puede utilizar para regular el tropismo de muchas clases diferentes de virus. Los protocolos detallados aquí están diseñados para el rescate y la caracterización de un picornavirus microARN-dirigida, sin embargo, puede adaptarse en función de un virus 'ciclo de replicación y rea reportero en particulardouts. Aunque diferentes virus tienen estrategias de rescate específicas, secuencias diana de microARN se pueden insertar en el genoma viral, independientemente de si el genoma completo se codifica en un único plásmido o si el virus tiene un genoma de ADN o ARN. Mientras las células productoras no expresan los microRNAs afines, los objetivos de microARN optimizados no deben interferir con el rescate de virus. Experimentos para analizar la cinética de crecimiento del virus y microRNA de metas de especificidad pueden ser modificados por el cambio de los puntos de tiempo recogidos en base a la longitud de una sola ronda de replicación del virus y en lecturas específicas para el virus de replicación / toxicidad (por ejemplo, proteínas reportero, la citotoxicidad, la cuantificación del genoma, etc.). Es importante señalar que aunque esta técnica en teoría se puede aplicar a todas las clases de virus, muchos factores pueden afectar a la eficacia de este método. Por ejemplo, los virus de ARN de sentido negativo no han demostrado ser tan sensible como los virus de ARN de sentido positivo probablemente debido a la limitada accesibilidad del ARN genómico a la maquinaria miRNA 13. Por lo tanto, las propiedades biológicas de cada clase de virus impartirán limitaciones adicionales a la optimización RE. A pesar de estas limitaciones, esta técnica ofrece un método alternativo para la orientación viral tropismo facilitando la investigación relativas a la seguridad, utilidad y comprensión básica de los procesos biológicos para todas las clases de virus.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RE encoding Oligonucleotides | IDT | PAGE-Purified Ultramer | Sequence Designed by Investigator |
| Oligonucleotides encoding unique restriction site | IDT | 25nM | Sequence Designed by Investigator |
| Expand High Fidelity PCR Kit | Sigma Aldrich | 11732641001 | Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available |
| T4 DNA Ligase System | NEB | M0202S | |
| MEGAscript Kit | ThermoFisher Scientific | AM1333 | |
| MEGAclear Kit | ThermoFisher Scientific | AM1908 | |
| 0.5 M EDTA | ThermoFisher Scientific | AM9260G | RNase-free |
| 5 M NH4 Acetate | ThermoFisher Scientific | N/A | Comes in MEGAclear Kit |
| Ethanol | ThermoFisher Scientific | BP2818100 | |
| Nuclease-free Water | Fisher Scientific | AM9938 | |
| TransIT-2020 Transfection Reagent | Mirus | MIR 5404 | |
| TransIT-mRNA Transfection Reagent | Mirus | MIR 2225 | |
| 0.2 μm syringe filter | Millipore | SLGP033RS | |
| 2 ml Screw-Cap Tubes | Sarstedt | 72.694.005 | |
| Cell Scrapers | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| MicroRNA Mimics | Dharmacon | Varied | |
| MTT Cell Proliferation Assay | ATCC | 30-1010K | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | ThermoFisher Scientific | 18265017 | |
| pBlueScript II Vectors | Agilent Technologies | Variable (e.g. 212205) | There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription. |
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