Abstract
A oócitos de Xenopus como um sistema de expressão heteróloga de proteínas, foi primeiramente descrito por Gurdon et ai. 1 e tem sido amplamente utilizadas desde a sua descoberta (Referências: 2 - 3, e suas referências). Uma característica que faz com que o oócito atraente para expressão do canal estrangeira é o pobre abundância de canais de iões endógenos 4. Este sistema de expressão tem se mostrado útil para a caracterização de muitas proteínas, entre eles, canais iónicos dependentes de ligandos.
A expressão de receptores de GABAA em oócitos de Xenopus e sua caracterização funcional é aqui descrita, incluindo o isolamento de oócitos, micro-injecções com ARNc, a remoção das camadas de células foliculares, e alterações solução rápida em experiências electrofisiológicas. Os procedimentos foram otimizados neste laboratório 5,6 e desviar os utilizados rotineiramente 7-9. Tradicionalmente, os oócitos são desnudados preparadocom um tratamento prolongado colagenase de lóbulos de ovário à TA, e estes são desnudados oócitos microinjectados com ARNm. Usando os métodos optimizados, proteínas de membrana diferentes foram expressos e estudada com este sistema, tais como os receptores recombinantes GABA A, os canais de cloreto 10-12 recombinantes humanos de tripanosomas, 13 canais de potássio 14, e um transportador 15 de mio-inositol, 16.
Os métodos descritos aqui podem ser aplicados para a expressão de qualquer proteína de escolha em oócitos de Xenopus, e a mudança rápida solução pode ser utilizada para estudar outros canais iónicos dependentes de ligandos.
Introduction
Oócitos de Xenopus são amplamente utilizados como um sistema de expressão (Referências: 2 - 3, e suas referências). Eles são capazes de montar correctamente e incorporar proteínas de múltiplas subunidades funcionalmente activos nas suas membranas plasmáticas. Usando este sistema, é possível investigar funcionalmente proteínas da membrana por si só ou em combinação com outras proteínas, a fim de estudar as propriedades de mutantes, ou proteínas quiméricas concatenados, e para pesquisar potenciais drogas.
Vantagens da utilização de oócitos em relação a outros sistemas de expressão heterólogos incluem o manuseamento simples das células gigantes, a elevada proporção de células que expressam a informação genética estrangeira, o controlo simples do ambiente do oócito por meio de perfusão de banho, e o controlo do potencial de membrana .
O inconveniente deste sistema de expressão é a variação sazonal observado em muitos laboratórios 17-20. A razão para esta variaçãoestá longe de ser clara. Além disso, a qualidade dos oócitos é frequentemente observado de variar fortemente. Os métodos tradicionais 7-9 incluíram o isolamento de lóbulos de ovário, a exposição dos lóbulos de ovário de colagenase para algumas horas, a selecção de oócitos desnudados, e a microinjecção de oócitos. Aqui, uma série de procedimentos alternativos, rápidos são informou que nos permitiram trabalhar com este sistema de expressão por mais de 30 anos sem variação sazonal e pouca variação na qualidade do oócito.
Os métodos melhorados e modificados descritos aqui para o isolamento de oócitos, microinjecção com ARNc, e a remoção de camadas de células foliculares podem ser utilizados para a expressão de qualquer proteína de escolha no oócito de Xenopus. O método muito simples para modificações solução rápida do meio em volta do oócito pode ser aplicada ao estudo de qualquer receptor ionotrópico e dos transportadores.
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Protocol
Experiências com animais foram aprovados pelo comitê local do cantão de Berna Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85 / 15).
1. Preparação de Xenopus Os oócitos
- Manter rãs (Xenopus laevis) em uma de 12 h / 12 h de luz / escuro no ciclo de água, que é estritamente mantida a 20 ° C.
- Retire os lobos dos ovários de rãs do sexo feminino 9.
NOTA: A remoção dos lóbulos é um estímulo para a regeneração, e muitas vezes a qualidade dos oócitos melhora com a cirurgia. O oócito é coberto por uma camada vitelino, uma camada de células do folículo, e tecido conjuntivo contendo os vasos sanguíneos 21. Toda a estrutura é denominado o "folículo." - Coloque os lobos dos ovários, que são densamente embalado com os folículos contendo os oócitos em estéreis de Barth Saline 7 (MBS) suplementado com penicilina e estreptomicina (NaCl 88 mM, KCl 1 mM, 2,4 mMNaHCO3, MgSO4 0,82 mM, CaCl 0,41 mM de 2, Ca 0,33 mM (NO 3) 2, 10 mM de ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazina; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 ug / mL de penicilina, e 100 ug / mL de estreptomicina).
- Single-out fase V-VI 21 folículos. Segurar o lóbulo ovário com uma pinça. Diminuir a ansa de platina (Figura 1) ao longo dos folículos e suavemente retirar o circuito para perturbar o tecido conjuntivo contendo o folículo do tecido do ovário.
NOTA: Fase V-VI 21 folículos são caracterizados por seu tamanho (1,0-1,2 mm de diâmetro), e pelo bom contraste entre o hemisfério animais pigmentada escura e do hemisfério vegetal amarelada. - Transferir apenas folículos saudáveis de aspecto (isto é perfeitamente esféricas e com pigmentação intacta) para uma placa de Petri de diâmetro de 35 milímetros por meio de uma pipeta de Pasteur de plástico (cortar a parte de trás até um diâmetro de 1,5 milímetros de abertura).
Nota: O sistema de microinjeção aqui descrito é derivado do que a relatada por Kressmann e Birnstiel 22.
- Prepare ARNc a partir dos respectivos ADNc que codificam para as subunidades da α 4 β 2 δ receptor GABA A por transcrição in vitro, a adição de um poli (A +) de cauda, e quantificação de ARN por electroforese em gel de 23.
- Prepare pipetas de microinjecção de capilares de vidro de borossilicato (1,0 mm de diâmetro externo (OD), diâmetro interno de 0,58 mm (ID), 100 mm de comprimento) utilizando um extractor de micropipeta. Romper as pontas dos capilares de vidro sob um microscópio usando um micromanipulador e microfilamentos para criar um diâmetro da ponta de 12 - 15 um, com uma ponta chanfrada.
- Backfill as pipetas de microinjeção com óleo de parafina utilizando uma seringa de 10 ml, e depois montar a pipeta de microinjeção para um micr homebuiltoinjection aparelho (Figura 2).
NOTA: O aparelho de injecção de óleo hidráulico homebuilt consiste de um motor da grade controlado por um interruptor de pedal. Um interruptor adicional muda o modo de viragem do motor. Este motor acciona um parafuso micrômetro (0,5 mm / volta) que avança ou retrai o êmbolo de uma seringa de vidro de 10 mL. A injecção é a uma velocidade de cerca de 3 rpm e uma volta de 0,5 corresponde a uma injecção de nL 50 em um folículo. A ponta da seringa está ligada ao tubo de politetrafluoretileno de paredes espessas que está ele próprio ligado à agulha de injecção por um período muito curto de tubagem Tygon peça. O capilar de injecção é mantida por um mandril que é controlada por um micromanipulador. O sistema inteiro é preenchido com óleo de parafina. As bolhas de ar devem ser evitados, uma vez que irá prejudicar o sistema de injeção. A configuração é iluminada com uma fonte de luz fria. Um estereomicroscópio é necessário para controlo óptico. Folículos são visualizados sob luz fria com um stereomicroscope (40X). Desempenho da instalação de injecção é testado pela injecção de marcador radioactivo em oócitos de Xenopus. Um volume de 45 - 55 nL deve ser administrada por injecção. - Com uma pipeta com uma ponta de plástico estéril, testar a configuração, colocando uma gota de água estéril para o interior limpo de um termoplástico resistente à umidade (2 x 2 cm). Imergir a ponta da pipeta de injecção para esta gota, e, em seguida, ligar o motor para retrair o êmbolo (pressão negativa no interior da pipeta de injecção).
NOTA: A água deve inserir a pipeta e formam uma interface com o óleo visível. - Retrair a ponta da pipeta a partir da gotícula e aplicar pressão positiva para o interior da pipeta de injecção. Uma gota de água deve formar-se a ponta da pipeta de injecção.
- Preparar para a injecção dos folículos, alinhando-as com os pólos vegetais que aponta para cima nos interstícios de uma malha de nylon (G: 0,8 mm) coladas à parte inferior de um Peprato de tri (60 mm) coberto com MBS.
- Dispensar 2 mL de mRNA usando uma pipeta com uma ponta de plástico estéril para o interior de um termoplástico limpo. Tome-se o ARNm para a pipeta de injecção por aplicação de pressão negativa para o interior da pipeta de injecção.
- Posicionar a pipeta de injeção mais de um folículo individual usando o micromanipulador.
- Inserir a agulha de injecção no centro do pólo vegetal e injectar 50 nL de ARNm a uma taxa de fluxo de 0,6 mL / min através da aplicação de pressão positiva para o interior da pipeta. Espere 5 - 10 s antes de remover a ponta de injecção pipeta a partir do folículo para evitar mRNA fuga.
NOTA: O ARNm deve ser injectado no pólo vegetal (amarelado) para evitar a injecção para dentro do núcleo, que está localizado no hemisfério animal. - Transferir os folículos injetados para uma nova placa de Petri (35 mm) carregada com 2 mL de MBS. Coloque o prato em um refrigerador de vinho fixada em 18 ° C. Incubar os folículos injetados para 1 -7 d antes da gravação, em função da identidade da proteína expressa recentemente.
3. decapagem dos folículos (Figura 3)
NOTA: Como mencionado acima, o oócito coberta por uma camada vitelino, as células do folículo e do tecido conjuntivo, o qual contém os vasos sanguíneos 24, é conhecido como um "folículo." Todas as camadas, excepto para a camada de vitelina, que proporciona estabilidade mecânica sem impedir o acesso das soluções para a superfície da célula, deve ser removido antes de experiências electrofisiológicas. O folículo, sem as camadas de células circundantes tenha sido previamente denominado um oócito "arruinado" 25. Este passo é normalmente realizada no mesmo dia que as experiências electrofisiológicas.
- Transferência de dez folículos injectado para um tubo de vidro de borosilicato contendo 0,5 mL de MBS, 1 mg / mL de colagenase, e 0,1 mg / mL de inibidor de tripsina. Mergulha-se o tubo num banho de água mantido a 36 ° C. incubar afolículos durante 20 minutos e agitar os tubos ocasionalmente.
- Lavar os folículos, transferindo-os para um segundo tubo contendo 1 ml de MBS à TA. Deixá-los no tubo durante cerca de 10 s.
- Transferir os folículos com um terceiro tubo contendo 0,5 ml de MBS duplamente concentrada contendo 4 mM de etilenoglicol-bis (2-aminoetiléter) - N, N, N ', N'-tetra-acético (EGTA), e incubar durante 4 min a RT. Agitar o tubo de vez em quando.
NOTA: A solução hipertónica (MBS duplamente concentrada) é utilizado para induzir a retracção dos oócitos dentro de camadas de células do folículo, destacando-se, assim, as camadas de células foliculares do oócito; EGTA é adicionado para inibir a actividade da colagenase. - Lavar os folículos, transferindo-os para um segundo tubo contendo 1 ml de MBS à TA. Deixá-los no tubo durante cerca de 10 s.
- Transferir os oócitos para uma placa de Petri (35 mm de diâmetro) contendo 2 mL de MBS. Sob um microscópio estereoscópico, separar os envelopes exteriores dos folículos porbasta apertar o oócito nua distância utilizando o aro de platina.
NOTA: Os envelopes exteriores dos oócitos manter firmemente a placa de cultura e podem ser facilmente separados dos oócitos. Alguns ovócitos espontaneamente perder seus envelopes exteriores e será recuperado como oócitos desnudados. Este procedimento resulta em uma preparação relativamente estável, que mantém a aparência esférica dos oócitos.
4. Rápido Solução Mudança em torno do ovócito
- Realizar um experimento de fixação de voltagem, como descrito 9,26.
- Mudar a solução de perfusão do sistema alimentado por gravidade, rodando os interruptores de perfusão tal como exigido pela experiência.
- Aplicar a solução de perfusão de 6 ml / min através de um capilar de vidro com um diâmetro interno de 1,35 mm, a boca do qual é colocado cerca de 0,4 mm a partir da superfície do oócito, para permitir trocas rápidas na concentração de agonista em torno do oócito.
NOTA: A taxa de variação foi anteriormente estimativad como 70% em menos de 0,5 s 27.
- Aplicar a solução de perfusão de 6 ml / min através de um capilar de vidro com um diâmetro interno de 1,35 mm, a boca do qual é colocado cerca de 0,4 mm a partir da superfície do oócito, para permitir trocas rápidas na concentração de agonista em torno do oócito.
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Representative Results
Oócitos de Xenopus foram mecanicamente escolhido usando uma ansa de platina (Figura 1). Os oócitos foram micro-injectados com ARNm que codifica para as subunidades GABA A do receptor a 4, P 2, δ, 0,5: 0,5: 2,5 fmol / oócito (Figura 2). Após 4 d, camadas de células foliculares foram removidos (Figura 3). Os oócitos foram voltagem fixada em -80 mV e expostos a concentrações crescentes de ácido γ-aminobutírico (GABA) na presença de 1 uM 3α, 21-di-hidroxi-5α-pregnan-20-ona (THDOC), um potente modulador alostérico positivo de do receptor GABA a. Figura 4A mostra traços atuais originais gravados em tal experimento. A Figura 4B mostra a amplitude da corrente elicitada dependendo das concentrações de GABA. Isto permite a determinação da sensibilidade da combinação da subunidade para GABA. As curvas individuais erammontado e padronizado para I max e, posteriormente, em média. A equação utilizada foi I (c) = / (n 1 + (EC 50 / c)), em que c é a concentração de GABA, CE 50, a concentração de GABA (na presença de 1 uM THDOC) provocando uma meia I max -maximal amplitude da corrente, I max é a amplitude de corrente máxima, que representa a amplitude da corrente, e n é o coeficiente de Hill. A EC 50 do α 4 β 2 δ GABA A receptor ascendeu a 0,41 ± 0,12 mM, e n foi de 0,76 ± 0,04.
Figura 1: Platina Loop. A alça de fio de platina mencionado no passo protocolo 1.4. A platina é um metal que pode ser dobrado sem produzir estilhaços, e não se atera material biológico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Homebuilt Aparelho de microinjeção. O aparelho encontra-se descrito na etapa 2. protocolo, um motor de grade; b, parafuso micrométrico; c, mola entre seringa e êmbolo; d, 10 uL seringa de vidro; e, tubos de politetrafluoretileno de paredes espessas; f, mão bucha; g, pipeta de injecção; h, estereomicroscópio; e eu, o controle motor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Esquema Mostrando o Defolliculation de um oócito. Os oócitos são inicialmente incubadas em solução de colagenase num banho de água a 36 ° C durante 20 min. Os oócitos são, em seguida, lavou-se em um meio de Barth modificada. O passo final de incubação é de uma solução de EGTA hipertónica à temperatura ambiente durante 4 min. Como resultado, o tecido conjuntivo e as células do folículo são removidos para dar forma ao oócito desnudada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Traços corrente de uma Two-eletrodo de tensão Braçadeira experimento. UMA, Current vestígios de uma curva de resposta à concentração de GABA no prescia de um THDOC uM obtido a partir de um oócito de Xenopus expressando a GABA α 4 β 2 δ Um receptor. As barras indicam o período de tempo de GABA / 1 uM THDOC perfusão. O aumento das concentrações de GABA foram aplicados ao oócitos, e as amplitudes de corrente correspondentes foram determinadas. As concentrações de GABA são indicados por cima das barras. B, As curvas de resposta de concentração média da α 4 β 2 δ receptor GABA A. curvas individuais foram primeiro normalizados para a amplitude de corrente máxima e equipada foram subsequentemente média. Os dados são apresentados como média ± SD, n = 3. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os métodos descritos neste artigo desviar os utilizados tradicionalmente 7-9. É padrão para expor os lóbulos do ovário para uma 1 a 2 h colagenase tratamento 8; isolar intactas, oócitos desnudados; e injectar-los com mRNA usando dispositivos de injecção comerciais. Este procedimento clássico tem os seguintes inconvenientes: 1) Os oócitos são susceptíveis de ser danificadas pela longa exposição a altas concentrações de colagenase. 2) Os oócitos desnudados instáveis deve ser armazenada até que o experimento. 3) ovócitos desnudados são mais propensos a sofrer durante a microinjeção de folículos. dispositivos de injeção de uso comercial de grande diâmetro (cerca de 20 mm) agulhas de injeção, provavelmente resultará em uma taxa relativamente alta de dano. As vantagens do processo melhorado descrito aqui são como se segue: a exposição a colagenase é limitado a 20 minutos, os oócitos desnudados não têm de ser armazenados, e o pequeno diâmetro da ponta das pipetas (aproximadamente 12 - 15 um) utilizado para microinjectise em não requer "defolliculation" antes dos folículos para a injeção mRNA. O único passo crítico é que a temperatura de incubação folículo em solução de colagenase deve ser cuidadosamente ajustado para 36 ° C e não deverá exceder esse valor.
Para solução muda em experiências electrofisiológicas, muito frequentemente, a solução na câmara de medição é alterada, o que leva uma quantidade de tempo substancial, dependendo do tamanho da câmara, e a taxa de perfusão. Usando a perfusão capilar evitado este.
A maior desvantagem da expressão de canais de iões em oócitos de Xenopus é o seu tamanho gigante. controle de tensão mais rápido do que cerca de 2 ms é difícil, e muito rápido (<0,5 s) solução muda requerem procedimentos elaborados. Além disso, fortemente substâncias hidrofóbicas podem ser quase irreversivelmente ligado à gema de ovo do oócito.
Os métodos descritos aqui nos permitiu investigarde uma maneira que economiza tempo as propriedades funcionais de receptores GABA A recombinantes, a sua modulação por compostos sintéticos e substâncias de plantas, o seu arranjo de subunidades, e a localização dos locais de ligação da droga em receptores de composição de subunidades diferentes. Os métodos aqui descritos são adequados para a expressão de qualquer proteína de escolha no oócito de Xenopus. O método muito simples para modificações solução rápida do meio em volta do oócito pode ser aplicada ao estudo de qualquer receptor ionotrópico ou transportador.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/mL and 100 μg streptomycin/mL |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μL, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, G: 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD x 0.69 ID x 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
References
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