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Developmental Biology

सीरम का संग्रह और फीडर मुफ्त माउस भ्रूणीय एक सेल मुक्त दृष्टिकोण के लिए स्टेम सेल वातानुकूलित माध्यम

Published: January 8, 2017 doi: 10.3791/55035
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Smart-aging Convergence Research Center, College of Medicine, Yeungnam University, 2Physiology and Experimental Medicine Program, The Hospital for Sick Children Research Institute, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

Summary

(भ्रूण गोजातीय सीरम, FBS) इस प्रोटोकॉल माउस भ्रूणीय स्टेम सेल का संग्रह (mESC) -conditioned मध्यम (mESC-मुख्यमंत्री) सीरम से निकाली गई के लिए एक तरीका प्रदान करता है - और फीडर (माउस भ्रूणीय fibroblasts, MEFs) एक सेल के लिए मुक्त शर्तों मुक्त दृष्टिकोण। यह उम्र बढ़ने और बुढ़ापे से जुड़े रोगों के उपचार के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य माउस सीरम और फीडर मुक्त संस्कृति की स्थिति से भ्रूण स्टेम सेल (mESC) -conditioned मध्यम (mESC-मुख्यमंत्री) को इकट्ठा करने और अपने जैविक कार्यों को चिह्नित करने के लिए है।

सामान्य तौर पर, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) उनके pluripotency और आत्म नवीकरण 1-3 के लिए क्षमता के कारण पुनर्योजी चिकित्सा और सेल थेरेपी के लिए काफी संभावना है। हालांकि, स्टेम सेल के प्रत्यारोपण के प्रत्यक्ष ऐसे प्रतिरक्षा अस्वीकृति और ट्यूमर गठन 4,5 के रूप में कई सीमाओं की है। इसलिए, एक सेल मुक्त दृष्टिकोण पुनर्योजी चिकित्सा और उम्र बढ़ने के हस्तक्षेप 6.7 के लिए एक वैकल्पिक रणनीति चिकित्सकीय प्रदान कर सकता है।

बुढ़ापा ऊतकों और अंगों की उम्र बढ़ने, विकास की गिरफ्तारी, बदल सेल फिजियोलॉजी, और व्यवहार का एक स्थायी राज्य की विशेषता के लिए एक सेलुलर समकक्ष के रूप में देखा जाता है। एजिंग कैंसर सहित प्रचलित रोग, हृदय रोग, टी के लिए मुख्य जोखिम कारक है2 मधुमेह ype, और neurodegeneration 8। उम्र बढ़ने के स्पष्ट विशेषताओं में से एक के ऊतकों के पुनर्योजी क्षमता है, जो स्टेम सेल उम्र बढ़ने और थकावट 9 के कारण होता है में गिरावट आई है। कई महत्वपूर्ण अध्ययन में इस तरह के rapamycin 9, resveratrol 10, और मेटफार्मिन 11, और रक्त जनित प्रणालीगत कारकों, अर्थात् GDF11 12, लगातार उम्र बढ़ने में देरी और जीवन अवधि का विस्तार करने की क्षमता है के रूप में औषधीय अणुओं से पता चला है।

वर्तमान अध्ययन में, mESC-मुख्यमंत्री सीरम बिना सीरम कारकों और MEFs से स्रावी कारकों के प्रदूषण को बाहर करने के लिए (भ्रूण गोजातीय सीरम, FBS) और फीडर (माउस भ्रूणीय fibroblasts, MEFs) परतों काटा गया है। इन शर्तों में एक सीरम और फीडर मुफ्त सीएम कि फलस्वरूप mESC-विशिष्ट स्रावी कारकों की सटीक पहचान सक्षम करने के लिए अनुमति दी।

इस प्रस्तावित प्रोटोकॉल अत्यधिक कुशल, अपेक्षाकृत लागत प्रभावी है, और आसान हैसंचालित करने के लिए। इस तकनीक mESC व्युत्पन्न घुलनशील कारकों के लक्षण वर्णन है कि एक विरोधी वार्धक्य प्रभाव मध्यस्थता कर सकते हैं, जो उम्र बढ़ने जुड़े रोगों और अन्य पुनर्योजी के लिए हस्तक्षेप करने की ओर एक सुरक्षित और लाभप्रद संभावित सेल मुक्त चिकित्सकीय दृष्टिकोण के विकास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है उपचार।

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Protocol

नोट: सीरम और फीडर मुफ्त मुख्यमंत्री संग्रह प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया गया है।

1. सामग्री (MEFs की तैयारी, मध्यम, प्लेट्स, और समाधान)

  1. संस्कृति MEFs के लिए माध्यम की 500 मिलीलीटर की तैयारी। Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) अनुपूरक 10% FBS (ईएससी गुणवत्ता), 50 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, और 50 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ।
  2. रोजमर्रा की स्थापना की 13 प्रोटोकॉल निम्नलिखित भ्रूण से MEFs अलग करने और उन्हें MEF मध्यम में बनाए रखें।
  3. mESCs संस्कृति के लिए माध्यम की 500 मिलीलीटर की तैयारी। DMEM 15% FBS और 2 मिमी एल glutamine, 100 माइक्रोन के गैर आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA), 100 माइक्रोन के β-mercaptoethanol, 100 इकाइयों / मिलीलीटर ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (LIF), 50 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, और 50 के साथ पूरक है मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन।
  4. 0.1% जिलेटिन समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ कोटिंग 10 सेमी सेल संस्कृति व्यंजन द्वारा gelatinized प्लेट (5 gelatinized प्लेटें / 1 mESC प्लेट) तैयार करें। कम से कम 10 मिनट के लिए सेते कमरे के तापमान पर।
  5. mESCs की एक सीरम मुक्त हालत के लिए कम सीरम माध्यम से 500 मिलीलीटर की तैयारी। सोडियम बाइकार्बोनेट के 1.2 ग्राम (7.0 पीएच) के साथ सीरम मीडिया में कमी के पूरक है। एक 0.2 माइक्रोन बोतल शीर्ष फिल्टर के माध्यम से फिल्टर।
  6. वार्धक्य जुड़े β-galactosidase (एसए β-लड़की) वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं का पता लगाने के लिए धुंधला समाधान तैयार: 1 मिलीग्राम / एमएल एक्स-लड़की, 40 मिमी साइट्रिक एसिड / सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच 6.0) (dimethylformamide, DMF में भंग) 5 मिमी पोटेशियम ferricyanide, 5 मिमी पोटेशियम ferrocyanide, 150 मिमी NaCl, और 2 मिमी 2 MgCl 14।
    चेतावनी: (खतरनाक) DMF एक विषैले और संक्षारक समाधान है। व्यक्तिगत सुरक्षात्मक कपड़ों (जैसे, nitrile या लेटेक्स दस्ताने, एक प्रयोगशाला कोट, और काले चश्मे) पहनने के लिए जब समाधान से निपटने। एक धूआं हुड का प्रयोग करें।
  7. संस्कृति मानव त्वचीय fibroblasts (HDFS, NHDF-विज्ञापन डेर-तंतुकोशिका) के लिए माध्यम की 500 मिलीलीटर की तैयारी। 10% FBS और 100 यूनिट / एमएल पेनिसिलिन और 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन साथ DMEM अनुपूरक।
jove_title "> 2। माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति (चित्रा 1 ए और 2 ए)

ध्यान दें: एक सेल संस्कृति जैविक सुरक्षा हुड में सभी चरणों को बाहर ले।

  1. MEF एक 15 सेमी सेल संस्कृति डिश में mitomycin सी के 10 माइक्रोग्राम / एमएल युक्त मध्यम के 20 मिलीलीटर के साथ MEFs समझो। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं।
  2. MEFs से मध्यम aspirate। पीबीएस तीन बार के साथ कोशिकाओं को धो लें। Trypsin EDTA (ते, 1x) के 3 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं। 3 मिनट के बाद, 300 x जी 3 मिनट के लिए MEF मध्यम और सेंट्रीफ्यूज के 6 मिलीलीटर के साथ ते बेअसर।
  3. MEF मध्यम के 5 मिलीलीटर में Resuspend। trypan नीले रंग धुंधला हो जाना और एक hemocytometer का उपयोग परिणामस्वरूप सेल निलंबन में सेल नंबर निर्धारित करते हैं। MEF मध्यम में प्रति 10 सेमी सेल संस्कृति डिश 2 x 10 6 कोशिकाओं के घनत्व पर प्लेट निष्क्रिय MEFs (फीडर)। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं।
  4. फीडर (चढ़ाना पर बाद mESC माध्यम के साथ MEF मध्यम 24 घंटा बदलेंअगले दिन)।
  5. प्लेट mESCs (जी -4 F1 संकर ते सेल) mESC माध्यम के साथ फीडर पर 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं के घनत्व पर। 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं।
    नोट: mESC-मुख्यमंत्री के विरोधी उम्र बढ़ने के प्रभाव की संभावना मजबूत जब कम बीतने संख्या mESCs 15-17 उपयोग किया जाता है। हम Lunenfeld-Tanenbaum अनुसंधान संस्थान, माउंट सिनाई अस्पताल, 25 Orde स्ट्रीट, टोरंटो, पर, M5T 3H7, कनाडा में डॉ एनड्रास नागी से एक जी -4 mESC लाइन का अधिग्रहण किया।
  6. एक 70-80% उप मिला हुआ राज्य में एक अपेक्षाकृत उच्च घनत्व और पारित होने पर कोशिकाओं रखें। ताजा mESC माध्यम के साथ मध्यम दैनिक बदलें।

3. सीरम का संग्रह और फीडर मुफ्त वातानुकूलित मध्यम (चित्रा 1 बी और 2 बी)

ध्यान दें: एक सेल संस्कृति जैविक सुरक्षा हुड में सभी चरणों को बाहर ले।

  1. पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ mESC प्लेट कुल्ला। ते (2.5x) के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं। 3 मिनट के बाद, mESC mediu के 2 मिलीलीटर के साथ ते बेअसरमीटर और 300 x जी 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  2. mESC माध्यम में प्रत्येक जिलेटिन लेपित संस्कृति पकवान (5 gelatinized प्लेटें / 1 mESC प्लेट) में mESC मध्यम और प्लेट 1 मिलीलीटर की 5 मिलीलीटर में Resuspend। 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति और 5% सीओ 2 80-85 तक confluency% तक पहुँच जाता है।
  3. mESCs तीन washes के एक कुल के लिए, धोने प्रति 10 मिनट के लिए कोशिकाओं (प्रति 10 सेमी की थाली 8 मिलीलीटर) को कवर करने के लिए पर्याप्त पीबीएस के साथ धो लें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए कम सीरम मध्यम में सेते हैं।
    ध्यान दें: धोने कदम FBS प्रदूषण को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। यह ऊष्मायन समय 18,19 पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  4. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और 2500 x जी 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में mESC-मुख्यमंत्री लीजिए। centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला समाधान (मुख्यमंत्री) ले लीजिए। एक 0.2 माइक्रोन बोतल शीर्ष फिल्टर के माध्यम से फिल्टर।

4. माउस भ्रूणीय स्टेम सेल का प्रभाव वातानुकूलित मध्यम (mESC-मुख्यमंत्री)

नोट: mESC-मुख्यमंत्री के प्रभाव के रूप में इस तरह के कई तरीके हैं, द्वारा मान्य किया गयाSA β-लड़की परख, कोशिका चक्र विश्लेषण, और QRT- पीसीआर।

  1. SA β-लड़की परख (चित्रा 3 ए)
    1. HDF माध्यम में 6 अच्छी तरह प्लेटों में अच्छी तरह से प्रति 2 एक्स 10 4 कोशिकाओं के घनत्व पर बीज HDFS। 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं और 5% सीओ 2।
    2. एक रात ऊष्मायन के बाद, HDF माध्यम की त्यागने आधा और mESC-मुख्यमंत्री और नियंत्रण के माध्यम जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं। नियंत्रण मध्यम सीरम मुक्त मध्यम mESCs के अभाव में एक जिलेटिन लेपित डिश में (कम सीरम मीडिया) से ली गई है।
    3. कोशिकाओं दो washes के एक कुल के लिए, धोने प्रति 30 सेकंड के लिए कोशिकाओं (प्रति 6 अच्छी तरह से थाली 2 मिलीलीटर) को कवर करने के लिए पर्याप्त पीबीएस के साथ धो लें। निर्धारण के लिए 3.7% paraformaldehyde (पीएफए) जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
      चेतावनी: (खतरनाक) Paraformaldehyde एक विषैले और संक्षारक समाधान है। व्यक्तिगत सुरक्षात्मक कपड़ों (जैसे, nitrile या लेटेक्स दस्ताने, एक प्रयोगशाला कोट, और काले चश्मे) पहनने के लिए जब समाधान से निपटने।एक धूआं हुड का प्रयोग करें।
    4. नियतन समाधान Aspirate। कदम 4.1.3 में वर्णित के रूप में, दो बार पीबीएस के साथ तय की कोशिकाओं को धो लें।
    5. SA β-लड़की धुंधला समाधान (6 अच्छी तरह से थाली में 1-2 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 17.5 घंटे के लिए सेते हैं।
      नोट: यह एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में incubated होना नहीं है।
    6. SA β-लड़की धुंधला समाधान Aspirate और कदम 4.1.3 में वर्णित के रूप में, दो बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    7. जवाबी धुंधला के लिए Eosin समाधान जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। कदम 4.1.3 में वर्णित के रूप में, दो बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    8. बाद के विश्लेषण के लिए एक संलग्न डिजिटल कैमरे का उपयोग करके प्रकाश माइक्रोस्कोप और कब्जा छवियों का उपयोग 100X बढ़ाई छवि कोशिकाओं।
      नोट: कोशिकाओं की कुल संख्या एक अंधे तरीके से गिना जा सकता है और एसए β-लड़की सकारात्मक ब्लू कोशिकाओं का प्रतिशत की गणना की जा सकती है।
  2. सेल चक्र विश्लेषण (चित्रा 3 बी)
    1. के घनत्व पर बीज HDFSHDF माध्यम में एक 6 सेमी सेल संस्कृति डिश में अच्छी तरह से प्रति 8 x 10 4 कोशिकाओं। 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं और 5% सीओ 2।
    2. एक रात ऊष्मायन के बाद, HDF माध्यम की त्यागने आधा और mESC-मुख्यमंत्री और नियंत्रण के माध्यम जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं।
    3. कोशिकाओं Trypsinize, 300 x जी 5 मिनट के लिए 3.1 में वर्णित कदम है, और सेंट्रीफ्यूज के रूप में। ठंड पीबीएस समाधान के साथ कोशिकाओं को धो दो बार और सेंट्रीफ्यूज पर 2500 x जी 3 मिनट के लिए (0.5 मिमी 2 CaCl और 2% FBS, प्रति 1.5 मिलीलीटर ट्यूब 1 मिलीलीटर के साथ पीबीएस)। ठंड पीबीएस समाधान के 100 μl में Resuspend।
    4. ठंड इथेनॉल के 200 μl छोड़ने जबकि vortexing द्वारा कोशिकाओं को ठीक करें। कम से कम 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    5. कदम 4.2.3 में वर्णित के रूप में, दो बार ठंड पीबीएस समाधान के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    6. सोडियम साइट्रेट बफर के 250 μl (1.12%, पीएच 8.5) 50 माइक्रोग्राम / एमएल RNase युक्त कोशिकाओं Resuspend। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    7. सोडियम साइट्रेट के 250 μl जोड़ेबफर 50 माइक्रोग्राम / एमएल propidium आयोडाइड से युक्त। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
    8. 20 प्रवाह cytometry का उपयोग प्रत्येक नमूने में 10,000 कोशिकाओं को मापने।
  3. QRT- पीसीआर (चित्रा 3 सी)
    1. कदम 4.1.1 और 4.1.2 में वर्णित के रूप में बीज HDFS और, mESC-मुख्यमंत्री जोड़ें।
    2. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक शाही सेना निकासी किट का उपयोग कर HDFS से कुल शाही सेना को अलग। निकाले कुल शाही सेना एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर 21 का उपयोग कर यों।
    3. प्रतिक्रिया oligo (डीटी) प्राइमरों और एम MLV रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस युक्त मिश्रण की एक 20 μl के लिए कुल शाही सेना के 1 माइक्रोग्राम जोड़कर सीडीएनए संश्लेषण निर्माता प्रोटोकॉल 20 के अनुसार।
    4. एक वास्तविक समय पीसीआर मशीन के साथ सीडीएनए के प्रवर्धन उपाय, ग्रीन पीसीआर मास्टर मिश्रण और विशिष्ट जीन प्राइमरों (पूरक तालिका 1) का उपयोग कर। GAPDH अभिव्यक्ति के साथ डेटा मानक के अनुसार। निम्नलिखित पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करें: प्रारंभिक de95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए naturation; 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड के लिए 45 चक्र, 55 डिग्री सेल्सियस पर 20 सेकंड, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 35 सेकंड; और 95 डिग्री सेल्सियस, 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट, 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड, और 60 डिग्री सेल्सियस 15 पर 5 सेकंड में 15 सेकंड के लिए पिघलने वक्र अवस्था।

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Representative Results

मूल रूप से, mESCs FBS और अन्य की खुराक (आंकड़े 1 ए और 2 ए) के साथ mESC माध्यम में एक MEF फीडर पर रखा जाता है। मुख्यमंत्री एक फीडर परत, FBS, या अन्य की खुराक (आंकड़े 1 बी और 2 बी) के बिना कम सीरम मीडिया में mESCs से एकत्र किया गया था। इस संस्कृति हालत हमें फीडर, FBS, या अन्य की खुराक से कारकों से संभावित प्रदूषण को बिना वातानुकूलित माध्यम mESC-विशिष्ट इकट्ठा करने के लिए अनुमति देता है। नियंत्रण मध्यम एक ही संस्कृति की शर्तों के तहत एकत्र किया गया था, mESCs के बिना।

i) सामान्य mESC संस्कृति की स्थिति (2A चित्रा) और द्वितीय) सीरम और फीडर मुक्त संस्कृति की स्थिति (चित्रा 2 बी): mESCs दो संस्कृति मीडिया के बीच अलग morphologies दिखा। mESC कालोनियों एक MEF स्तर पर वृद्धि हुई है और सामान्य mESC संस्कृति सी के तहत एक अंडाकार और चमकदार उपस्थिति का प्रदर्शन कियाonditions (2A चित्रा)। इसके विपरीत, सीरम और फीडर मुक्त संस्कृति की स्थिति में mESCs एक चपटी और अनियमित आकृति विज्ञान (चित्रा 2 बी) दिखाया।

MESC-मुख्यमंत्री के कार्यात्मक विशेषताओं ऐसे एसए β-लड़की परख (चित्रा 3 ए), सेल चक्र विश्लेषण (चित्रा 3 बी), और qPCR (चित्रा 3 सी) के रूप में वार्धक्य जुड़े तरीकों, द्वारा हासिल की थी। MESC-मुख्यमंत्री के साथ वृद्ध होनेवाला HDFS का उपचार सकारात्मक एसए β-लड़की पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या है, जो सेलुलर वार्धक्य (चित्रा 3 ए) का सूचक है कमी आई है। सेल चक्र विश्लेषण से पता चला है कि mESC-मुख्यमंत्री उपचार नाटकीय रूप से एस में कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई है और जी 2 / एम चरण है, जबकि यह जी 0 / जी 1 चरण (चित्रा 3 बी) में कोशिकाओं की संख्या कम हो। इसके अलावा, mESC-मुख्यमंत्री उपचार वार्धक्य जुड़े जीन अभिव्यक्ति के स्तर में कमी आई (एनAmely, P53, P21, और P16) और वार्धक्य जुड़े स्रावी phenotype (SASP) अभिव्यक्ति के स्तर (आईएल -6)।

आकृति 1
चित्रा 1: तैयारी और mESC-मुख्यमंत्री के अनुकूलन। तैयारी और सीरम मुक्त और फीडर मुफ्त मुख्यमंत्री के अनुकूलन के लिए प्रायोगिक रणनीति। (क) सामान्य mESC संस्कृति हालत और (बी) सीरम और फीडर मुफ्त mESC-मुख्यमंत्री संस्कृति हालत। सी: नियंत्रित कर FBS और MEF बिना मध्यम; मुख्यमंत्री: FBS और MEF बिना वातानुकूलित माध्यम। बेई एट अल से अनुमति के साथ संशोधित। 15। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: उज्ज्वल क्षेत्र immESCs की उम्र। के तहत (ए) सामान्य परिस्थितियों और (बी) सीरम और फीडर मुक्त परिस्थितियों mESCs। पीले तीर सामान्य mESC संस्कृति की स्थिति में फीडर सेल (MEFs) से संकेत मिलता है। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: mESC-मुख्यमंत्री के विरोधी उम्र बढ़ने के प्रभाव की विशेषता। (ए) एसए β-लड़की गतिविधि धुंधला और एसए β-लड़की पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत। (बी) के प्रवाह cytometry द्वारा कोशिका चक्र विश्लेषण। (सी) QRT- पीसीआर द्वारा वार्धक्य जुड़े जीन अभिव्यक्ति के स्तर (P53, P21, और P16) और वार्धक्य जुड़े स्रावी phenotype (SASP) अभिव्यक्ति के स्तर (आईएल -6) की अभिव्यक्ति के स्तर। मान ± एसडी मतलब हैं। आंकड़े तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। समूहों के बीच सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद एक तरह से एनोवा और Tukey के बाद अस्थायी परीक्षण द्वारा की पहचान की गई। * पी <0.05, ** पी <0.01। वाई = गैर वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं; एस: वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं; सी: नियंत्रित कर FBS और MEF बिना मध्यम; मुख्यमंत्री: FBS और MEF बिना वातानुकूलित माध्यम। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन। बेई एट अल से अनुमति के साथ संशोधित। 15। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सीरम और फीडर मुफ्त mESC-मुख्यमंत्री के सफल संग्रह के लिए, निम्नलिखित सुझावों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण कारक mESC-मुख्यमंत्री के संग्रह के लिए जल्दी पारित होने mESCs का उपयोग कर रहा है। इससे पहले, यह दिखाया गया है कि जल्दी पारित होने mESC-मुख्यमंत्री देर बीतने के mESCs की तुलना में बेहतर विरोधी उम्र बढ़ने के प्रभाव है। MESCs के पारित होने संख्या उनके विकास के संभावित 16 और 17 pluripotency को प्रभावित करने के लिए सूचित कर दिया गया है।

अतिरिक्त अनुसंधान mESC secretome, जो विरोधी वार्धक्य प्रभाव को उत्पन्न की विशिष्ट कारकों का विश्लेषण करने की जरूरत है, जबकि वर्तमान में हम निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि mESC-मुख्यमंत्री सेलुलर स्तर पर वार्धक्य कम करने के लिए पर्याप्त है।

mESC-विशिष्ट स्रावी कारक है कि वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं युवा कोशिकाओं को वापिस की पहचान के भविष्य के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण होगा। उच्च गुणवत्ता वाले ऐसे एंटीबॉडी सरणी 15 एक के रूप में स्रावी अणुओं, पर विश्लेषण के लिएडी secretome विश्लेषण, मध्यम संग्रह की प्रक्रिया के दौरान धोने कदम (चरण 3) गंभीर है। धोने कदम ठीक से आयोजित नहीं है, तो स्रावी अणुओं सीरम (FBS) घटकों 18,19 से दूषित हो जाएगा।

सीरम और फीडर मुफ्त ऊष्मायन समय (24 घंटे), मध्यम संग्रह प्रक्रिया (चरण 3) में बहुत महत्वपूर्ण अब ऊष्मायन समय के रूप में (24 घंटा से अधिक) है सीरम के तहत भुखमरी से सेल autolysis या apoptosis की संभावना को बढ़ा सकता है - और समाप्त की स्थिति 18,19 feeder-। के रूप में फीडर अणुओं 22 की एक बड़ी संख्या का स्राव सामान्य ईएससी संस्कृति हालत, undifferentiated कोशिकाओं की लंबी अवधि के संवर्धन के लिए एक फीडर परत की आवश्यकता है। जिलेटिन लेपित प्लेट फीडर कोशिकाओं से संक्रमण की संभावना को रोकता है।

mESC-मुख्यमंत्री, सीरम और फीडर मुक्त संस्कृति की स्थिति से काटा, वृद्ध होनेवाला HDFS में एक विरोधी वार्धक्य की क्षमता है। mESC- के विरोधी वार्धक्य प्रभावमुख्यमंत्री इस तरह के एसए β-लड़की गतिविधि के रूप में वार्धक्य जुड़े कई readouts, द्वारा प्रदर्शन किया गया है; एक बढ़ाया proliferative संभावित (सेल चक्र विश्लेषण); और P53, P21, P16, और आईएल -6 जीन अभिव्यक्ति के स्तर (- 3 सी चित्रा 3) कम हो।

मानव प्राथमिक कोशिकाओं mESC-मुख्यमंत्री के साथ व्यवहार कर रहे हैं, जब Xeno संदूषण नैदानिक ​​आवेदन के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा होगा। इसलिए, मानव ESCs या IPSCs स्रावी से कारकों की एक जांच मुख्यमंत्री के नैदानिक ​​आवेदन मानव मूल से व्युत्पन्न के लिए एक महत्वपूर्ण भविष्य के अध्ययन के लिए किया जाएगा। एक सेल मुक्त एक स्टेम कोशिकाओं और एक विरोधी वार्धक्य अध्ययन पर आधारित दृष्टिकोण के अभिसरण वार्धक्य जुड़े रोगों की वर्तमान समझ का विस्तार करने के लिए, चिकित्सकीय दृष्टिकोण पर सुधार में अधिक से अधिक जानकारी में जिसके परिणामस्वरूप उम्मीद है।

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Acknowledgments

इस शोध बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम (2013R1A1A2060930) और मेडिकल रिसर्च सेंटर कार्यक्रम (2015R1A5A2009124) कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन के माध्यम से (एनआरएफ), विज्ञान, सूचना और संचार प्रौद्योगिकी मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित है, और भविष्य की योजना का समर्थन किया था। इस शोध भी अस्पताल बीमार बच्चे के लिए (एच सुंग) से एक शुरू हुआ ऑपरेटिंग अनुदान द्वारा समर्थित है। हम इस पांडुलिपि और डॉ एनड्रास नागी संपादन जी -4 mESC लाइन उपलब्ध कराने के लिए उनके उत्कृष्ट मदद के लिए लौरा Barwell और सारा जे एस किम को धन्यवाद देना चाहूंगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen #11960-044
FBS Invitrogen #30044333 20%, ES cell quality
Penicillin and streptomycin Invitrogen #15140 50 units/ml penicillin and 50 mg/ml streptomycin
L-glutamine Invitrogen #25030 2 mM
Nonessential amino acids (NEAA) Invitrogen #11140 100 µM
β-mercaptoethanol  Sigma #M3148 100 µM
Leukemia inhibitory factor  Millipore #ESG1107 100 units/ml
OPTI-MEM Invitrogen #22600
X-gal  Sigma #B4252 1 mg/ml
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 3.70%
Dimethylformamide (DMF) Sigma #D4551
Potassium ferricyanide Aldrich #455946 5 mM
potassium ferrocyanide Aldrich #455989 5 mM
NaCl Sigma #S7653 150 mM
MgCl2 Sigma #M2393 2 mM
Mitomycin C Sigma #M4287 10 µg/ml
Propidium iodide  Sigma #P4170 50 µg/ml
TRIzol Ambion #15596018
M-MLV reverse transcript-tase Promega #M170B
Power SYBR Green PCR master mix  Applied Biosystems #4367659
HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast  LONZA #CC-2511
Bottle top filter Corning #430513 0.2 μm

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References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608 (2012).
  3. Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
  4. Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  5. Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
  6. Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
  7. Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
  8. Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
  9. Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
  10. Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
  11. Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192 (2013).
  12. Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
  13. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  14. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  15. Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
  16. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
  17. Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
  18. Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
  19. Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
  20. Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
  21. Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
  22. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).

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Bae, Y. U., Sung, H. K., Kim, J. R. Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach. J. Vis. Exp. (119), e55035, doi:10.3791/55035 (2017).

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