Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

جمع Serum- وخالية من تغذية الفأر الجنينية الجذعية المتوسطة مكيفة الخليوي لنهج خالية من خلية

Published: January 8, 2017 doi: 10.3791/55035
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Smart-aging Convergence Research Center, College of Medicine, Yeungnam University, 2Physiology and Experimental Medicine Program, The Hospital for Sick Children Research Institute, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

Summary

يوفر هذا البروتوكول طريقة لجمع الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (مسك) المتوسطة -conditioned (مسك-CM) المستمدة من مصل الدم (مصل الجنين البقري، FBS) - والمغذية (الخلايا الليفية الجنينية الماوس، MEFS) شروط خالية للخلية نهج خالية. قد تكون قابلة للتطبيق لعلاج الشيخوخة والأمراض المرتبطة بالشيخوخة.

Introduction

والهدف من هذا البروتوكول هو جمع الماوس الجنينية الخلايا الجذعية (مسك) -conditioned المتوسطة (مسك-CM) من شروط الثقافة serum- وخالية من تغذية ولتوصيف الوظائف البيولوجية.

بشكل عام، والخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) لديها إمكانات كبيرة للطب التجديدي والعلاج بالخلايا نظرا لتعدد القدرات والقدرة على التجديد الذاتي 1-3. ومع ذلك، فإن زرع المباشر للخلايا الجذعية لديها العديد من القيود، مثل الرفض المناعي، وتشكيل الورم 4،5. ولذلك، فإن نهج خالية من الخلايا قد يقدم استراتيجية علاجية بديلة للطب التجديدي والتدخلات الشيخوخة 6،7.

وينظر الشيخوخة باعتبارها نظيره الخلوي إلى شيخوخة الأنسجة والأعضاء، وتتميز حالة دائمة من اعتقال النمو، علم وظائف الأعضاء خلية تغير، والسلوكيات. الشيخوخة هي عامل الخطر الرئيسي للأمراض السائدة بما في ذلك السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية، رYPE 2 من داء السكري، والتنكس العصبي 8. واحدة من خصائص واضحة من الشيخوخة هو انخفاض في القدرة على التجدد الأنسجة، الذي ينجم عن شيخوخة الخلايا الجذعية والإرهاق 9. وقد أظهرت العديد من الدراسات الهامة الجزيئات الدوائية، مثل rapamycin 9، ريسفيراترول 10، والميتفورمين 11، والعوامل النظامية التي تنتقل عن طريق الدم، وهي GDF11 12، التي لديها القدرة على تأخير الشيخوخة باستمرار وتمديد فترة الحياة.

في هذه الدراسة، وقد تم حصادها مسك-CM دون المصل (الجنين المصل البقري، FBS) والتغذية (الماوس الجنينية الخلايا الليفية، MEFS) طبقات استبعاد التلوث من العوامل في الدم وعوامل إفرازية من MEFS. هذه الشروط السماح لCM serum- وخالية من التغذية التي بالتالي تمكين تحديد دقيق للعوامل إفرازية مسك محددة.

هذا البروتوكول المقترح كفاءة عالية، وتكلفة نسبيا فعالة، وسهلةليشغل. توفر هذه التقنية نظرة ثاقبة لتوصيف العوامل القابلة للذوبان المستمدة مسك التي يمكن أن توسط له تأثير مضاد للشيخوخة، والتي يمكن استخدامها لتطوير نهج علاجي آمن ويحتمل أن تكون مفيدة خالية من الخلايا تجاه التدخلات من أجل المرتبط بالشيخوخة الأمراض وغيرها من التجدد العلاجات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: التخطيطي لserum- وبروتوكول جمع سم الحرة المغذية هو مبين في الشكل 1.

1. المواد (إعداد MEFS والمتوسطة، لوحات، وحلول)

  1. إعداد 500 مل من المتوسط ​​لثقافة MEFS. تكملة Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM) مع 10٪ FBS (ESC الجودة) و 50 وحدة / مل البنسلين، و 50 ملغ / مل الستربتومايسين.
  2. عزل MEFS من الأجنة بعد بروتوكول روتيني إنشاء 13 والمحافظة عليها في المتوسط MEF.
  3. إعداد 500 مل من المتوسط ​​لثقافة mESCs. وتستكمل DMEM مع 15٪ FBS و 2 مم L-الجلوتامين، و 100 ميكرومتر الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، و 100 ميكرومتر β-المركابتويثانول، و 100 وحدة / مل عامل مثبط سرطان الدم (ليف) و 50 وحدة / البنسلين مل، و 50 ملغ / مل الستربتومايسين.
  4. إعداد لوحات مهيلم (5 لوحات مهيلم / 1 لوحة مسك) من خلال طلاء أطباق زراعة الخلايا 10 سم مع 5 مل من 0.1٪ محلول الجيلاتين. احتضان لمدة 10 دقيقة على الأقل بدرجة حرارة الغرفة.
  5. إعداد 500 مل من الدم انخفض متوسط ​​لحالة المصل خالية من mESCs. الملحق انخفاض المصل وسائل الإعلام مع 1.2 غرام من بيكربونات الصوديوم (7.0 درجة الحموضة). من خلال تصفية 0.2 ميكرومتر زجاجة أعلى التصفية.
  6. إعداد المرتبطة الشيخوخة β غالاكتوزيداز (SA β-غال) حل تلطيخ للكشف عن خلايا هرمة: 1 ملغ / مل X-غال (المنحلة في ثنائي ميثيل الفورماميد، DMF)، 40 ملم حمض الستريك / العازلة فوسفات الصوديوم (6.0 درجة الحموضة) و 5 ملي فيري سيانيد البوتاسيوم، 5 ملي فيرو سيانيد البوتاسيوم، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 2 ملي MgCl 2 14.
    تنبيه: (الخطرة) DMF هو الحل السامة والمسببة للتآكل. ارتداء ملابس الوقاية الشخصية (على سبيل المثال، النتريل قفازات اللاتكس أو، معطف المختبر، ونظارات واقية) عند التعامل مع الحل. استخدام غطاء الدخان.
  7. إعداد 500 مل من المتوسط ​​لثقافة الخلايا الليفية الجلدية الإنسان (HDFs، NHDF-AD-دير-الخلايا الليفية). تكملة DMEM مع FBS 10٪ و 100 وحدة / مل البنسلين و 100 ملغ / مل الستربتومايسين.
jove_title "> 2. الثقافة من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (الشكل 1A و 2A)

ملاحظة: القيام بجميع الخطوات في ثقافة خلية غطاء السلامة البيولوجية.

  1. علاج MEFS مع 20 مل من المتوسط ​​MEF التي تحتوي على 10 ميكروغرام / مل من ميتوميسين مئوية في 15 سم طبق ثقافة الخلية. احتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. نضح في المتوسط ​​من MEFS. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. إضافة 3 مل من التربسين-EDTA (TE، 1X)، واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. بعد 3 دقائق، تحييد TE مع 6 مل من المتوسط ​​MEF وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 300 × ز.
  3. resuspend في 5 مل من المتوسط ​​MEF. تحديد عدد الخلايا في تعليق الخلية الناتجة باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق وعدادة الكريات. MEFS لوحة المعطل (تغذية) في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 6 خلايا في 10 سم طبق ثقافة خلية في المتوسط MEF. احتضان لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  4. استبدال المتوسطة MEF مع مسك المتوسطة 24 ساعة بعد الطلاء وحدة التغذية (علىاليوم القادم).
  5. لوحة للmESCs (G4 F1 هجين خلية ES) في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 6 الخلايا على وحدة التغذية مع مسك المتوسطة. احتضان لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    ملاحظة: تأثير مضاد للشيخوخة مسك-CM هي على الأرجح أقوى عندما يتم استخدام عدد أقل مرور mESCs 15-17. حصلنا على خط G4 مسك من الدكتور اندراس ناجي في معهد Lunenfeld-تانينباوم بحوث، مستشفى جبل سيناء، 25 شارع أوردي، تورنتو، ON، M5T 3H7، كندا.
  6. إبقاء الخلايا في مناطق ذات كثافة عالية نسبيا والمرور في 70-80٪ حالة شبه متموجة. استبدال المتوسطة مع مسك الطازجة يوميا.

3. جمع من Serum- وخالية من الطاعم مشروطة المتوسطة (الشكل 1B و 2B)

ملاحظة: القيام بجميع الخطوات في ثقافة خلية غطاء السلامة البيولوجية.

  1. شطف لوحة مسك مع 5 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من TE (2.5x و)، واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. بعد 3 دقائق، تحييد TE مع 2 مل من مسك جامعة المدينة العالميةم وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 300 × ز.
  2. resuspend في 5 مل من مسك المتوسطة ولوحة 1 مل في كل طبق ثقافة المغلفة الجيلاتين (5 لوحات مهيلم / 1 لوحة مسك) في مسك المتوسطة. يتم التوصل إلى الثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى 80-85٪ confluency.
  3. غسل mESCs مع ما يكفي من برنامج تلفزيوني لتغطية الخلايا (8 مل لكل 10 سم لوحة) لمدة 10 دقيقة لكل غسل، أي ما مجموعه ثلاثة يغسل. احتضان في انخفاض المصل متوسطة لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    ملاحظة: الخطوة غسل مهمة لمنع التلوث FBS. من المهم أن يتبع فترة حضانة 18،19.
  4. جمع مسك-CM إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 2500 ز س. جمع الحل طاف (CM) بعد الطرد المركزي. من خلال تصفية 0.2 ميكرومتر زجاجة أعلى التصفية.

4. آثار الفأر الجنينية الجذعية مكيفة خلية المتوسطة (مسك-CM)

ملاحظة: آثار مسك-CM تم التصديق عليها من قبل العديد من الطرق، مثلSA فحص β-غال، تحليل دورة الخلية، وQRT-PCR.

  1. SA β-غال الفحص (الشكل 3A)
    1. HDFs البذور في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 4 خلايا لكل بئر في 6 لوحات جيدا في HDF المتوسطة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    2. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، نصف نبذ من المتوسط ​​HDF وإضافة مسك-CM والسيطرة المتوسطة. احتضان لمدة 72 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. مشتق المتوسطة التحكم من المصل خالية المتوسطة (خفضت المصل وسائل الإعلام) في طبق المغلفة الجيلاتين في غياب mESCs.
    3. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني كافية لتغطية الخلايا (2 مل لكل لوحة 6 جيدا) لمدة 30 ثانية في غسل، أي ما مجموعه اثنين من يغسل. إضافة 3.7٪ امتصاص العرق (PFA) لتثبيت. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      تنبيه: (الخطرة) لامتصاص العرق هو الحل السامة والمسببة للتآكل. ارتداء ملابس الوقاية الشخصية (على سبيل المثال، النتريل قفازات اللاتكس أو، معطف المختبر، ونظارات واقية) عند التعامل مع الحل.استخدام غطاء الدخان.
    4. نضح الحل التثبيت. غسل الخلايا الثابتة مع برنامج تلفزيوني مرتين، كما هو موضح في الخطوة 4.1.3.
    5. إضافة SA حل β-غال تلطيخ (1-2 مل لكل بئر في لوحة 6 جيدا). احتضان لمدة 17.5 ساعة على 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: لا ينبغي المحتضنة وفي حاضنة CO 2.
    6. نضح SA β-غال حل تلطيخ وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرتين، كما هو موضح في الخطوة 4.1.3.
    7. إضافة الحل يوزين لمكافحة تلطيخ. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرتين، كما هو موضح في الخطوة 4.1.3.
    8. خلايا الصورة في التكبير 100X باستخدام المجهر الضوئي والتقاط الصور باستخدام الكاميرا الرقمية المرفقة لتحليلها لاحقا.
      ملاحظة: العدد الكلي للخلايا يمكن الاعتماد بطريقة عمياء ويمكن حساب النسبة المئوية للSA β-غال الخلايا الزرقاء إيجابية.
  2. خلية تحليل دورة (الشكل 3B)
    1. HDFs البذور في مناطق ذات كثافة من8 × 10 4 خلايا لكل بئر في طبق خلية ثقافة 6 سم في HDF المتوسطة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    2. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، نصف نبذ من المتوسط ​​HDF وإضافة مسك-CM والسيطرة المتوسطة. احتضان لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    3. يعرض للتريبسين الخلايا، كخطوة وصفها في 3.1، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز. غسل الخلايا مع حل PBS الباردة (PBS مع 0.5 ملي CaCl 2 و 2٪ FBS، 1 مل لكل أنبوب 1.5 مل) مرتين وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 2500 ز س. resuspend في 100 ميكرولتر من محلول برنامج تلفزيوني الباردة.
    4. إصلاح الخلايا عن طريق إسقاط 200 ميكرولتر من الايثانول البارد في حين vortexing ل. تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
    5. غسل الخلايا مع الحل برنامج تلفزيوني الباردة مرتين، كما هو موضح في الخطوة 4.2.3.
    6. Resuspend الخلايا في 250 ميكرولتر من العازلة سيترات الصوديوم (1.12٪، ودرجة الحموضة 8.5) تحتوي على 50 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    7. إضافة 250 ميكرولتر من سيترات الصوديومالعازلة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل يوديد propidium. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    8. قياس الخلايا 10،000 في كل عينة باستخدام التدفق الخلوي 20.
  3. QRT-PCR (الشكل 3C)
    1. HDFs البذور وإضافة مسك-CM، كما هو موضح في الخطوات 4.1.1 و4.1.2.
    2. عزل الحمض النووي الريبي مجموع من HDFs باستخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قياس الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج باستخدام مطياف 21.
    3. توليف [كدنا بإضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع إلى 20 ميكرولتر من خليط التفاعل التي تحتوي على جزئية (DT) الاشعال و M-MLV الناسخ العكسي، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة 20.
    4. قياس التضخيم من [كدنا مع الوقت الحقيقي آلة PCR، وذلك باستخدام مزيج الرئيسي الخضراء PCR والاشعال جينية معينة (الملحق الجدول 1). تطبيع البيانات مع التعبير GAPDH. استخدام بروتوكول PCR التالية: دي الأوليnaturation لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية؛ 45 دورات لمدة 15 ثانية في 95 درجة مئوية، و 20 ثانية في 55 درجة مئوية، و 35 ثانية في 72 درجة مئوية. والمرحلة منحنى ذوبان لمدة 15 ثانية في 95 درجة مئوية، 1 دقيقة في 60 درجة مئوية، و 30 ثانية في 95 درجة مئوية، و 5 ثانية في 60 ° C 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في الأصل، يتم الاحتفاظ mESCs على وحدة التغذية MEF في المتوسط مسك مع FBS وغيرها من الملاحق (الشكلان 1A و 2A). وقد تم جمع CM من mESCs في انخفاض المصل وسائل الإعلام دون طبقة وحدة التغذية، FBS، أو غيرها من الملاحق (أرقام 1B و 2B). هذا الشرط ثقافة تسمح لنا لجمع مسك محددة المتوسطة مكيفة دون تلوث محتمل من العوامل من وحدة التغذية، FBS، أو غيرها من الملاحق. جمعت المتوسطة السيطرة في ظل الظروف الثقافة نفسها، دون mESCs.

تظهر mESCs الأشكال التضاريسية مختلفة بين وسائل الإعلام اثنين الثقافة: أ) الظروف الطبيعية الثقافة مسك (الشكل 2A) والثاني) serum- والشروط ثقافة خالية من وحدة التغذية (الشكل 2B). نمت المستعمرات مسك على طبقة MEF وأظهرت ظهور البيضاوي وبراقة تحت طبيعية مسك ثقافة جonditions (الشكل 2A). على العكس من ذلك، أظهر mESCs في serum- والشروط ثقافة خالية من تغذية التشكل بالارض وعدم انتظام (الشكل 2B).

وقد تحقق توصيف وظيفي لمسك-CM بالطرق المرتبطة الشيخوخة، مثل SA β-غال فحص (الشكل 3A)، وتحليل دورة الخلية (الشكل 3B)، وQPCR (الشكل 3C). علاج HDFs هرمة مع مسك-CM انخفض عدد SA الخلايا إيجابية β-غال إيجابية، وهو مؤشر الشيخوخة الخلوية (الشكل 3A). وكشف تحليل دورة الخلية أن العلاج مسك-CM زيادة كبيرة في عدد الخلايا في S و G 2 / M المرحلة، في حين انها قللت من عدد من الخلايا في G 0 / G 1 المرحلة (الشكل 3B). وبالإضافة إلى ذلك، انخفضت العلاج مسك-CM مستويات التعبير الجيني المرتبط الشيخوخة (نamely، البروتين p53، P21، P16 و) وإفرازية النمط الظاهري (SASP) مستويات التعبير المرتبط الشيخوخة (IL-6).

شكل 1
الشكل 1: إعداد وتعظيم الاستفادة من مسك-CM. استراتيجية تجريبية لإعداد وتعظيم الاستفادة من سم المصل خالية وخالية من وحدة التغذية. (A) عادي مسك حالة الثقافة و (ب) serum- ومسك-CM حالة ثقافة خالية من التغذية. C: السيطرة على وسيط وبدون FBS وMEF. CM: مكيفة وسيط وبدون FBS وMEF. تعديل بإذن من باي وآخرون. 15. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: مشرق ايم الحقلالأعمار من mESCs. mESCs تحت (أ) الظروف العادية و (ب) serum- وظروف الأجواء الخالية من التغذية. وتشير الأسهم الصفراء الخلايا المغذية (MEFS) في ظروف ثقافة مسك العادية. الحانات النطاق = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: توصيف تأثير مضاد للشيخوخة من مسك-CM. (A) SA β-غال تلطيخ النشاط والنسبة المئوية للخلايا إيجابية β-غال SA. (ب) تحليل دورة الخلية التدفق الخلوي. (ج) مستويات التعبير من المستويات المرتبطة الشيخوخة التعبير الجيني (البروتين p53، P21، P16 و) ويرتبط الشيخوخة إفرازية النمط الظاهري (SASP) مستويات التعبير (IL-6) من خلال QRT-PCR. القيم هي متوسط ​​± SD. الأرقام هي تمثيلية من ثلاث تجارب مستقلة. وقد تم تحديد الفروق ذات دلاله إحصائية بين المجموعات عن طريق باتجاه واحد ANOVA واختبار ما بعد خاصة توكي و. * ف <0.05، ** ف <0.01. Y = الخلايا غير هرمة. S: خلايا هرمة. C: السيطرة على وسيط وبدون FBS وMEF. CM: مكيفة وسيط وبدون FBS وMEF. الحانات النطاق = 10 ميكرون. تعديل بإذن من باي وآخرون. 15. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لنجاح جمع serum- ومسك-CM خالية المغذية، ينبغي أن تؤخذ في الاقتراحات التالية بعين الاعتبار. العامل الأكثر أهمية هو استخدام mESCs مرور وقت مبكر لجمع مسك-CM. سابقا، وقد تبين أن مرور وقت مبكر مسك-CM له تأثيرات مضادة للشيخوخة أفضل مقارنة mESCs مرور في وقت متأخر. وقد تم الإبلاغ عن عدد مرور mESCs أن تؤثر على إمكانية تطورهم 16 وتعدد القدرات 17.

بينما هناك حاجة إلى إجراء بحوث إضافية لتحليل العوامل المحددة للsecretome مسك، مما يحفز تأثيرات مضادة للشيخوخة، يمكننا أن نستنتج حاليا أن مسك-CM يكفي لتقليل الشيخوخة على مستوى الخلية.

وتحديد عوامل إفرازية-مسك المحددة التي تعود خلايا هرمة إلى خلايا شابة ستكون حاسمة للدراسات المستقبلية. لذات جودة عالية وتحلل على جزيئات إفرازية، مثل الأجسام المضادة مجموعة 15 لد تحليل secretome، فإن الخطوة الغسيل أثناء عملية جمع المتوسطة (الخطوة 3) أمر بالغ الأهمية. إذا لم تتم الخطوة الغسيل بشكل صحيح، سوف تكون ملوثة جزيئات إفرازية من المصل (FBS) مكونات 18،19.

فترة حضانة serum- وخالية من وحدة التغذية (24 ساعة) مهم جدا في عملية جمع المتوسطة (الخطوة 3)، وفترة حضانة أطول (أكثر من 24 ساعة) قد يزيد من إمكانية انحلال ذاتي الخلية أو الخلايا جوعا تحت المصل - وfeeder- الظروف المنضب 18،19. تتطلب حالة طبيعية ثقافة ESC طبقة المغذية للزراعة على المدى الطويل من خلايا غير متمايزة، ووحدة التغذية تفرز عددا كبيرا من الجزيئات 22. لوحة الجيلاتين المغلفة يمنع إمكانية حدوث تلوث من الخلايا المغذية.

ومسك-CM، تحصد من الظروف والثقافة serum- وخالية من التغذية، لديه القدرة المضادة للشيخوخة في HDFs هرمة. تأثيرات مضادة للشيخوخة من mESC-أثبتت سم من قراءات متعددة المرتبطة الشيخوخة، مثل SA النشاط β-غال. إمكانات التكاثري تعزيز (تحليل دورة الخلية)؛ وانخفاض البروتين p53، P21، P16، وIL-6 مستويات التعبير الجيني (الشكل 3A - 3C).

عندما يتم التعامل مع الخلايا الأولية الإنسان مع مسك-CM، فإن XENO التلوث من القضايا المهمة للالتطبيق السريري. ولذلك، فإن تحقيقا للعوامل إفرازية من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان أو iPSCs أن دراسة مهمة عن التطبيق السريري لCM المستمدة من أصول الإنسان المستقبل. ومن المتوقع أن توسع الفهم الحالي من الأمراض المرتبطة الشيخوخة، مما أدى إلى مزيد من التبصر في إدخال تحسينات على النهج العلاجية التقارب بين نهج خالية من الخلايا بناء على الخلايا الجذعية ودراسة مكافحة الشيخوخة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث من قبل برنامج العلوم الاساسية بحوث (2013R1A1A2060930) وبرنامج مركز الأبحاث الطبية (2015R1A5A2009124) من خلال مؤسسة البحوث الوطنية لكوريا (جبهة الخلاص الوطني)، بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات، والتخطيط المستقبلي. ويدعم هذا البحث أيضا قبل البدء غرانت التشغيل من مستشفى الأطفال المرضى (هونج كونج سونغ). ونود أن نشكر لورا BARWELL وسارة شبيبة كيم لمساعدة ممتازة في تحرير هذه المخطوطة والدكتور اندراس ناجي عن توفير خط G4 مسك.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen #11960-044
FBS Invitrogen #30044333 20%, ES cell quality
Penicillin and streptomycin Invitrogen #15140 50 units/ml penicillin and 50 mg/ml streptomycin
L-glutamine Invitrogen #25030 2 mM
Nonessential amino acids (NEAA) Invitrogen #11140 100 µM
β-mercaptoethanol  Sigma #M3148 100 µM
Leukemia inhibitory factor  Millipore #ESG1107 100 units/ml
OPTI-MEM Invitrogen #22600
X-gal  Sigma #B4252 1 mg/ml
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 3.70%
Dimethylformamide (DMF) Sigma #D4551
Potassium ferricyanide Aldrich #455946 5 mM
potassium ferrocyanide Aldrich #455989 5 mM
NaCl Sigma #S7653 150 mM
MgCl2 Sigma #M2393 2 mM
Mitomycin C Sigma #M4287 10 µg/ml
Propidium iodide  Sigma #P4170 50 µg/ml
TRIzol Ambion #15596018
M-MLV reverse transcript-tase Promega #M170B
Power SYBR Green PCR master mix  Applied Biosystems #4367659
HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast  LONZA #CC-2511
Bottle top filter Corning #430513 0.2 μm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608 (2012).
  3. Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
  4. Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  5. Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
  6. Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
  7. Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
  8. Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
  9. Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
  10. Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
  11. Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192 (2013).
  12. Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
  13. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  14. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  15. Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
  16. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
  17. Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
  18. Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
  19. Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
  20. Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
  21. Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
  22. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 119، الشيخوخة الخلوية والإعلام مكيفة (CM)، والخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية)، نهج خالية من الخلايا، وخالية من المصل، خالية الطاعم
جمع Serum- وخالية من تغذية الفأر الجنينية الجذعية المتوسطة مكيفة الخليوي لنهج خالية من خلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bae, Y. U., Sung, H. K., Kim, J. R.… More

Bae, Y. U., Sung, H. K., Kim, J. R. Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach. J. Vis. Exp. (119), e55035, doi:10.3791/55035 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter