Summary
Этот протокол обеспечивает способ сбора эмбриональных стволовых клеток мыши (МЕСК) -conditioned среда (МЕСК-СМ), полученные из сыворотки (эмбриональной бычьей сыворотки, ФБС) - и фидерные (мышиные эмбриональные фибробласты, MEFs) -свободных условия для ячейки -бесплатно подход. Это может быть применимо для лечения старения и возрастного заболеваний.
Introduction
Целью этого протокола является сбор эмбриональных стволовых клеток мыши (MESC) -conditioned среды (MESC-CM) из serum- и фидерных свободных условиях культивирования и охарактеризовать его биологические функции.
В общем, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) имеют большой потенциал для регенеративной медицины и клеточной терапии в связи с их плюрипотентности и способность к самообновлению 1-3. Тем не менее, прямая трансплантация стволовых клеток имеет ряд ограничений, например, иммунного отторжения и образования опухолей 4,5. Таким образом, подход бесклеточная может обеспечить альтернативную терапевтическую стратегию для восстановительной медицины и старения вмешательств 6,7.
Старение рассматривается как сотовый аналог старения тканей и органов, характеризующееся постоянным состоянием остановки роста, измененной физиологии клеток и поведения. Старение является основным фактором риска для распространенных заболеваний, включая рак, сердечно-сосудистые заболевания, тYpe диабет 2, и нейродегенеративные 8. Одним из очевидных признаков старения является снижение регенеративного потенциала тканей, которое вызвано старением стволовых клеток и истощение 9. Многие значительные исследования показали фармакологическую молекулы, такие как рапамицин 9, ресвератрол 10 и метформина 11 и системных факторов , переносимых с кровью, а именно GDF11 12, которые имеют возможность последовательно задерживать старение и увеличить продолжительность срока службы.
В настоящем исследовании, MESC-СМ был собран без сыворотки (эмбриональной телячьей сыворотки, FBS) и фидер (эмбриональных фибробластов мыши, МЭФ) слоев, чтобы исключить загрязнение факторов в сыворотке крови и секреторных факторов из MEFs. Эти условия позволили для serum- и фидерной свободной СМ, что, следовательно, позволило точно идентифицировать MESC специфических секреторных факторов.
Этот предложенный протокол является высокоэффективным, относительно экономически эффективным и легкодействовать. Этот метод дает представление о характеристике МЕСК полученных из растворимых факторов, которые могут опосредовать противоопухолевый эффект старения, который может быть использован для разработки безопасной и потенциально выгодного бесклеточной терапевтического подхода к вмешательствах по причине старения заболеваний, ассоциированных и других восстановительно лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Схема на serum- и фидерных свободный протокол сбора CM показан на рисунке 1.
1. Материалы (Получение MEFs, Medium, тарелки, и решения)
- Приготовьте 500 мл среды для культивирования MEFs. Дополнение модифицированную Dilbecco среду Eagle (DMEM) с добавлением 10% FBS (качество ESC), 50 ед / мл пенициллина и 50 мг / мл стрептомицина.
- Изолировать MEFs из эмбрионов следуя установленным рутинного протокола 13 и поддерживать их в MEF среде.
- Приготовьте 500 мл среды для культивирования mESCs. DMEM дополнена 15% FBS и 2 мМ L-глутамина, 100 мкМ заменимых аминокислот (NEAA), 100 мкМ бета-меркаптоэтанола, 100 ед / мл ингибирующий лейкоз фактор (LIF), 50 ед / мл пенициллина и 50 мг / мл стрептомицина.
- Готовят желатинизированного пластины (5 желатинизированный пластины / 1 МЕСК пластинчатые) путем покрытия 10 см чашки культуры клеток с 5 мл 0,1% раствора желатина. Выдержите в течение не менее 10 мин при комнатной температуре.
- Приготовьте 500 мл Сниженная сыворотки среды для бессывороточной состояния mESCs. Дополнение Снижение сыворотки носителя с 1,2 г бикарбоната натрия (рН 7,0). Смесь фильтруют через бутылочной верхний фильтр 0,2 мкм.
- Подготовьте стареющих связанный -галактозидазу (SA β-гал) окрашивание раствора для обнаружения стареющих клеток: 1 мг / мл X-Gal (растворенный в диметилформамиде, DMF), 40 мМ лимонной кислоты / натрий-фосфатного буфера (рН 6,0) , 5 мМ кровяной соли, 5 мМ ферроцианида калия, 150 мМ NaCl, и 2 мМ MgCl 2 , 14.
ВНИМАНИЕ: (опасных) DMF является токсичным и коррозионным раствором. Использовать средства индивидуальной защиты (например, нитриловые или латексные перчатки, лабораторный халат и очки) при обработке раствора. Используйте вытяжку. - Приготовьте 500 мл среды к культуре фибробластов кожи человека (HDFS, NHDF-Ad-Дер-Фибробласт). Дополнение DMEM с добавлением 10% FBS и 100 ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все действия, описанные в клеточной культуре биологической безопасности капюшоном.
- Обработать MEFs с 20 мл MEF среды, содержащей 10 мкг / мл митомицина в 15 см клеточной культуральной чашки с. Инкубировать в течение 2 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Аспирируйте среды от MEFs. Промывают клетки с PBS три раза. Добавьте 3 мл трипсин-ЭДТА (ТЕ, 1x) и инкубировать в течение 3 мин при 37 ° С и 5% CO 2. Через 3 минуты, нейтрализовать TE 6 мл MEF среды и центрифуги в течение 3 мин при 300 х г.
- Ресуспендируют в 5 мл среды MEF. Определить количество клеток в полученной суспензии клеток с использованием окрашивания трипановым синим и гемоцитометра. Пластинчатые инактивированные МЭФ (фидерные) при плотности 2 × 10 6 клеток на 10 см для культивирования клеток блюдо в MEF среде. Инкубировать в течение 24 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Замените носитель MEF с MESC средой через 24 часа после нанесения покрытия фидер (наследующий день).
- Табличка mESCs (G4 гибрид F1 ES клеток) при плотности 2 × 10 6 клеток на фидере с MESC средой. Инкубировать в течение 48 часов при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: омолаживающий эффект MESC-CM, вероятно , сильнее , когда нижний пассажа mESCs используются 15-17. Мы приобрели линию G4 MESC от доктора Андраш Надь в научно-исследовательском институте Lunenfeld-Таненбаума, больницы Маунт Синай 25 Орд Street, Toronto, ON, m5t 3H7, Канада. - Сохранить клетки при относительно высокой плотности и проход на 70-80% в суб-сливающийся состоянии. Замените среду со свежей средой MESC ежедневно.
3. Сбор Serum- и фидеров свободной среды, кондиционированной (Фигура 1В и 2В)
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все действия, описанные в клеточной культуре биологической безопасности капюшоном.
- Промыть пластину МЕСК с 5 мл PBS. Добавьте 1 мл TE (2.5x) и инкубировать в течение 3 мин при 37 ° С и 5% CO 2. Через 3 минуты, нейтрализовать ТЕ с 2 мл мЭСК mediuм и центрифуги в течение 3 мин при 300 х г.
- Ресуспендируют в 5 мл среды МЕСК и пластины 1 мл в каждую желатин покрытием блюдо культуры (5 желатинизированный пластины / 1 МЕСК пластины) в МЕСК среде. Культура при 37 ° С и 5% СО 2 до 80-85% слияния будет достигнута.
- Промыть mESCs с достаточным количеством PBS, чтобы покрыть клетки (8 мл на 10 см пластины) в течение 10 мин на каждую промывку, в общей сложности на трех стирок. Выдержите в Reduced Serum среде в течение 24 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стадия промывки важно, чтобы предотвратить загрязнение FBS. Важно следить за время инкубации 18,19. - Собирают МЕСК-CM в 50 мл коническую пробирку и центрифугируют в течение 20 мин при 2500 х г. Собирают раствор надосадочной (СМ) после центрифугирования. Смесь фильтруют через бутылочной верхний фильтр 0,2 мкм.
4. Влияние эмбриональных стволовых клеток мыши-кондиционированная среда (MESC-CM)
Примечание: Эффекты МЕСК-СМ были подтверждены несколькими методами, такими какSA β-гал анализ, анализ клеточного цикла, и QRT-PCR.
- С. А. β-гал анализа (рис 3A)
- Семенной HDFS при плотности 2 × 10 4 клеток на лунку в 6-луночные планшеты в среде HDF. Инкубируют в течение ночи при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
- После инкубации в течение ночи, отбрасывать половину среды HDF и добавьте МЕСК-CM и контрольной среде. Инкубировать в течение 72 часов при температуре 37 ° С и 5% CO 2. среда управления является производным от сыворотки среде (уменьшенная Сыворотка Медиа) в чашке желатин покрытием в отсутствие mESCs.
- Промывают клетки с достаточным количеством PBS, чтобы покрыть клетки (2 мл на 6-луночный планшет) в течение 30 секунд на каждую промывку, в общей сложности на двух промываний. Добавить 3,7% параформальдегида (PFA) для фиксации. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре.
ВНИМАНИЕ: (опасных) параформальдегид является токсичным и коррозионным раствором. Использовать средства индивидуальной защиты (например, нитриловые или латексные перчатки, лабораторный халат и очки) при обработке раствора.Используйте вытяжку. - Аспирируйте решение фиксации. Промыть фиксированные клетки с PBS в два раза, как это описано в шаге 4.1.3.
- Добавить раствор β-гал окрашивания SA (1-2 мл на лунку в 6-луночный планшет). Выдержите в течение 17,5 ч при 37 ° С.
Примечание: Не следует инкубировать в CO 2 инкубаторе. - Аспирируйте окрашивание раствора β-гал SA и промыть клетки с PBS в два раза, как это описано в шаге 4.1.3.
- Добавить раствор эозином для борьбы с окрашиванием. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре. Промывают клетки с PBS в два раза, как это описано в шаге 4.1.3.
- Клетки изображение при 100-кратном увеличении с помощью светового микроскопа и захвата изображений с помощью прикрепленного цифровую камеру для последующего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество ячеек можно пересчитать в слепым методом и процент SA β-гал положительных голубых клеток может быть вычислена.
- Анализ клеточного цикла (рис 3B)
- Семенной HDFS при плотности8 х 10 4 клеток на лунку в сотовом Петри культуры 6 см в HDF среде. Инкубируют в течение ночи при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
- После инкубации в течение ночи, отбрасывать половину среды HDF и добавьте МЕСК-CM и контрольной среде. Инкубировать в течение 24 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Trypsinize клетки, как описано в шаге 3.1, и центрифуге в течение 5 мин при 300 х г. Промывают клетки с холодным раствором PBS (PBS , 0,5 мМ CaCl 2 и 2% FBS, 1 мл в 1,5 мл пробирку) дважды и центрифуге в течение 3 мин при 2500 х г. Ресуспендируют в 100 мкл холодного раствора PBS.
- Закрепить клетки путем сбрасывания 200 мкл холодного этанола в то время как встряхиванием. Хранить при температуре 4 ° С в течение по меньшей мере 1 ч.
- Промывают клетки с холодным раствором PBS в два раза, как это описано в шаге 4.2.3.
- Ресуспендируют клеток в 250 мкл буфера цитрата натрия (1,12%, рН 8,5), содержащего 50 мкг / мл РНКазы. Инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С.
- Добавить 250 мкл цитрат натриябуфер, содержащий йодид 50 мкг / мл пропиди. Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Мера 10000 клеток в каждом образце с помощью проточной цитометрии 20.
- QRT-PCR (рис 3C)
- HDFS семян и добавить MESC-CM, как описано в пунктах 4.1.1 и 4.1.2.
- Изолировать тотальной РНК из HDFS с использованием набора для экстракции РНК в соответствии с протоколом производителя. Количественно экстрагированной суммарной РНК в с использованием спектрофотометра 21.
- Синтеза кДНК путем добавления 1 мкг полной РНК в 20 мкл реакционной смеси , содержащей олиго (дТ) праймеров и М-MLV обратной транскриптазы, в соответствии с протоколом производителя 20.
- Измеряют амплификации кДНК с ПЦР в реальном времени машины, используя зеленый Master Mix ПЦР и специфических праймеров ген (Приложение таблица 1). Нормализовать данные с помощью выражения GAPDH. Используйте следующий протокол ПЦР: начальная деnaturation в течение 10 мин при 95 ° С; 45 циклов в течение 15 сек при 95 ° С, 20 сек при 55 ° С, и 35 с при 72 ° С; и кривой плавления стадия в течение 15 сек при 95 ° С, 1 мин при 60 ° С, 30 с при 95 ° С и 5 сек при 60 ° C 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Первоначально mESCs поддерживаются на MEF фидера в MESC среде с FBS и другими добавками (Фигуры 1А и 2А). CM была собрана из mESCs в Reduced Serum СМИ без фидерного слоя, FBS или других добавок (Фигуры 1В и 2В). Это состояние культуры позволяет нам собирать MESC-Specific кондиционированной среды без потенциального загрязнения факторами из питателя, FBS, или другие добавки. Контрольную среду собирали при тех же самых условиях культивирования, без mESCs.
mESCs показывают различные морфологию между двумя культуральной среды: я) нормальные MESC условия культивирования (рис 2А) и б) serum- и условия культивирования фидерные свободной (рис 2В). Колонии MESC росли на MEF слое и продемонстрировал овальную и блестящий вид под нормальной MESC культуры Conditions (Рисунок 2А). Напротив, в mESCs в serum- и фидерных свободных условиях культивирования показали сплюснутый и нерегулярную морфологию (рис 2В).
Функциональная характеристика МЕСК-СМ была достигнута путем стареющих ассоциированных методов, таких как SA β-гал анализа (фиг.3А), анализ клеточного цикла (рисунок 3б) и КПЦР (фиг.3С). Лечение стареющих HDFS с MESC-CM уменьшилось число положительных SA β-гал-позитивных клеток, что является показателем клеточного старения (рис 3А). Анализ клеточного цикла показал , что лечение MESC-СМ резко возросло количество клеток в S и G 2 / M фазы, в то время как уменьшается число клеток в / G 1 фазе G 0 (рис 3B). Кроме того, лечение МЕСК-СМ снижал уровни экспрессии гена стареющих связанный (пAmely, р53, р21, р16 и) и стареющих связанный секреторный фенотип (SASP) уровни экспрессии (IL-6).
Рисунок 1: Подготовка и оптимизация MESC-CM. Экспериментальная стратегия для подготовки и оптимизации без сыворотки и фидерной свободной КМ. (A) состояние культуры Нормальная MESC и (В) serum- и фидерных свободный MESC-CM состояние культуры. C: контроль среды без FBS и MEF; CM: кондиционированной среды без FBS и MEF. Модифицированный с разрешения Bae и соавт. 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Светлое поле имвозраст mESCs. mESCs под (A) нормальных условиях и (В) serum- и фидерных свободных условиях. Желтые стрелки указывают на фидер ячейку (МЭФ) в нормальных условиях культивирования MESC. Масштабные полоски = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Характеристика омолаживающий эффект MESC-CM. (A) SA β-гал активность окрашивания и процент SA β-гал-позитивных клеток. (В) Анализ клеточного цикла методом проточной цитометрии. (С) Уровни экспрессии уровней стареющих ассоциированной экспрессии гена (р53, р21, р16 и) и стареющих связанный секреторный фенотип (SASP) уровни экспрессии (IL-6) QRT-PCR. Значения представляют собой среднее ± SD, Цифры представляют три независимых экспериментов. Статистически-значимых различий между группами были идентифицированы с помощью однонаправленной ANOVA и апостериорных тест Тьюки. * Р <0,05, ** р <0,01. Y = не стареющие клетки; S: стареющие клетки; C: контроль среды без FBS и MEF; CM: кондиционированной среды без FBS и MEF. Шкала бар = 10 мкм. Модифицированный с разрешения Bae и соавт. 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для успешного сбора serum- и фидерных свободного MESC-CM, следующие предложения должны быть приняты во внимание. Наиболее важным фактором является то, используя ранние прохождение mESCs для сбора MESC-CM. Ранее было показано, что раннее прохождение MESC-CM имеет лучшие омолаживающие эффекты по сравнению с концом прохода mESCs. Проход количество mESCs Сообщалось , что влияет на их потенциал развития 16 и плюрипотентности 17.
Хотя необходимы дополнительные исследования для анализа конкретных факторов на secretome MESC, которые индуцируют анти-старении эффекты, мы можем сделать вывод, что в настоящее время MESC-CM достаточно, чтобы уменьшить старение на клеточном уровне.
Идентификация MESC специфических секреторных факторов, которые вернет стареющие клетки обратно в молодых клеток будет иметь решающее значение для будущих исследований. Для получения высокого качества анализов на секреторных молекул, таких как массив антител 15 вd secretome анализ, то стадию промывки в процессе сбора среды (стадия 3) имеет решающее значение. Если стадия промывки не проведено должным образом , секреторные молекулы будут загрязнены сыворотки (FBS) компонентов 18,19.
Serum- и фидерных свободное время инкубации (24 ч) очень важно в среднесрочной коллекции процесса (шаг 3), так как более длительное время инкубации (в течение 24 часов), может увеличить вероятность автолиза клеток или апоптоз от голода под сыворотки - и подачи- истощенные условия 18,19. Нормальное ESC состояние культуры требует фидерного слоя для длительного культивирования недифференцированных клеток, а питатель секретирует большое количество молекул 22. Пластина желатиновым покрытием предотвращает возможность загрязнения от фидерных клеток.
MESC-CM, собирают из serum- и фидерных свободных условиях культивирования, обладает способностью анти-старении в стареющих HDFS. Анти-старением эффекты mESC-СМ были продемонстрированы стареющих связаны несколькими считываний, таких как SA β-гал деятельности; улучшенный пролиферативный потенциал (анализ клеточного цикла); и снижение р53, р21, р16 и IL-6 уровней экспрессии генов (Фигура 3А - 3С).
Когда первичные клетки человека обрабатывают MESC-СМ, Xeno загрязнение будет критической проблемой для клинического применения. Таким образом, исследование секреторных факторов из человеческих ЭСК или ИПСК бы важное исследование будущего для клинического применения СМ, полученного из человеческого происхождения. Сходимость подхода бесклеточной основан на стволовых клеток и анти-увядания исследования, как ожидается, расширить нынешнее понимание стареющих ассоциированных заболеваний, что приводит к более полное представление о улучшений на терапевтических подходов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Программой фундаментальных исследований (Science 2013R1A1A2060930) и Научно-исследовательский центр медицинской программы (2015R1A5A2009124) в рамках Национального исследовательского фонда Кореи (СРН), финансируемого Министерством науки, ИКТ и будущего планирования. Это исследование также поддерживается начинающей операционный грант из больницы для больных детей (HK Sung). Мы хотели бы поблагодарить Лору Barwell и Сара JS Ким за отличную помощь в редактировании рукописи и д-р Андраш Надь для обеспечения линии G4 MESC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50 units/ml penicillin and 50 mg/ml streptomycin |
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2 mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100 µM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100 µM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100 units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1 mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5 mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5 mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150 mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 mM |
| Mitomycin C | Sigma | #M4287 | 10 µg/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50 µg/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter | Corning | #430513 | 0.2 μm |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608 (2012).
- Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
- Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
- Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
- Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
- Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
- Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
- Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
- Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
- Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192 (2013).
- Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
- Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
- Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
- Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
- Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
- Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
- Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
- Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).
