Summary
このプロトコルは、マウス胚性幹細胞（MESC）を収集するための方法を提供するメディア-conditioned（MESC-CM）血清（ウシ胎児血清、FBS）に由来する - とフィーダー細胞のための（マウス胚線維芽細胞、MEFの）フリー条件フリーアプローチ。これは、老化や老化関連疾患の治療のために適用することができます。
Introduction
このプロトコルの目的は、血清および無フィーダー培養条件から培地（MESC-CM）を-conditionedし、その生物学的機能を特徴づけるために、マウス胚性幹細胞（MESC）を収集することです。
一般的には、胚性幹細胞（ESCは）による自己再生1-3のための彼らの多能性と能力に再生医療や細胞治療のための大きな可能性を持っています。しかし、幹細胞の直接移植は、免疫拒絶および腫瘍形成4,5のようないくつかの制限を有します。従って、無細胞アプローチは、再生医療や老化介入6,7の代替治療戦略を提供することができます。
老化は、増殖停止、改変された細胞生理学、および行動の永続的な状態によって特徴付けられる組織や臓器の老化に対する細胞相手と見られています。老化、癌、心臓血管疾患、Tなどの流行病のための主要な危険因子であります2型糖尿病、および神経変性8を YPE。老化の明らかな特徴の一つは、幹細胞の老化や枯渇9によって引き起こされる組織の再生能力の低下、です。多くの重要な研究は、このような一貫して老化を遅らせ、寿命を延長する能力を持っているラパマイシン9、レスベラトロール10、およびメトホルミン11、および血液媒介全身の要因、すなわちGDF11 12、薬理学的分子を、示しています。
本研究では、MESC-CMは、血清因子とのMEFからの分泌因子の混入を排除するために、血清（ウシ胎児血清、FBS）およびフィーダー（マウス胚線維芽細胞、MEFの）層なしで収穫されています。これらの条件は、結果的にMESC固有の分泌因子の正確な同定を可能に血清および無フィーダーCMを可能にしました。
この提案されたプロトコルは、非常に効率的で比較的費用対効果、および容易動作します。この技術は、老化関連疾患及びその他の再生のための介入に向かって安全かつ潜在的に有利な無細胞治療アプローチの開発のために使用することができる抗老化効果を媒介することができるMESC由来の可溶性因子の特性への洞察を提供しますトリートメント。
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Protocol
注：血清及び無フィーダーCM収集プロトコルの概略図を図1に示されています。
1.材料（MEFを、ミディアム、プレート、および溶液の調製）
- 文化のMEFに培地の500ミリリットルを準備します。 10％FBS（ESC品質）、50単位/ mlペニシリン、および50mg / mlストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を補足。
- 確立されたルーチンプロトコル13次胚からのMEFを単離し、MEF培地中で維持します。
- 文化へたmESCを培地500mlを準備します。 DMEM、15％FBSおよび2mMのL-グルタミン、100μMの非必須アミノ酸（NEAA）、100μMのβメルカプトエタノール、100ユニット/ mlの白血病抑制因子（LIF）、50単位/ mlペニシリン、および50が補充されますミリグラム/ mlのストレプトマイシン。
- 0.1％ゼラチン溶液の5mlを10cmの細胞培養皿をコーティングすることによりゼラチン化プレート（5ゼラチン化プレート/ 1 MESCプレート）を準備します。少なくとも10分間インキュベート室温で。
- たmESCの無血清条件に減少血清培地の500ミリリットルを準備します。サプリメントは、炭酸水素ナトリウム（pHは7.0）の1.2グラムと血清培地を削減しました。 0.2μmのボトルトップフィルターに通してフィルタリングします。
- 老化関連βガラクトシダーゼ（SAβ-GAL）老化細胞の検出のための染色溶液調製：1mg / mlのX-GALを、40mMのクエン酸/リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）（ジメチルホルムアミド、DMFに溶解） 、5mMのフェリシアン化カリウム、5mMのフェロシアン化カリウム、150mMのNaCl、及び2mMのMgCl 2 14。
注意：（危険）DMFは、有毒で腐食性のソリューションです。ソリューションを取り扱う場合の個人防護服（ 例えば、ニトリルまたはラテックス手袋、白衣、およびゴーグル）を着用してください。ヒュームフードを使用してください。 - 文化ヒト皮膚線維芽細胞（HDFを、NHDF-ADデア・線維芽細胞）への培地500mlを準備します。 10％FBSおよび100単位/ mlのペニシリンおよび100mg / mlストレプトマイシンを含むDMEMを補います。
注：細胞培養生物学的安全フード内のすべてのステップを実行します。
- 15cmの細胞培養皿にマイトマイシンCを10μg/ mlを含むMEF培地20mlでのMEFを扱います。 37℃で2時間、5％CO 2インキュベートします。
- MEFからの培地を吸引除去します。 PBSで細胞を3回洗浄します。トリプシンEDTA（TE、1×）の3 mlを加え、37℃で3分間、5％CO 2インキュベートします。 3分後、300×gで3分間MEF培地と遠心分離機の6ミリリットルでTEを中和します。
- MEF培地5mlで再懸濁。トリパンブルー染色し、血球計数器を用いて得られた細胞懸濁液中の細胞数を決定します。 MEF培地中の10-cmの細胞培養皿あたり2×10 6細胞の密度でプレートに不活性化したMEF（フィーダー）。 37℃で24時間、5％CO 2インキュベートします。
- 上（フィーダをメッキした後、MESC媒体24時間とMEF培地を交換してください翌日）。
- MESC培地でフィーダー上で2×10 6細胞の密度でプレートたmESC（G4 F1ハイブリッドES細胞）。 37℃で48時間、5％CO 2インキュベートします。
注：MESC-CMのアンチエイジング効果が低い継代数のたmESCは15-17を使用しているときに可能性が強いです。私たちは、ルーネンフェルト・タネンバウム研究所、マウントサイナイ病院、25のオードストリート、トロント、ON、M5T 3H7、カナダで博士アンドラーシュナジからG4 MESCラインを取得しました。 - 70から80までパーセントサブコンフルエントな状態で比較的高い密度と継代で細胞を保管してください。毎日新鮮なMESC培地で培地を交換してください。
3.血清の収集とフィーダー馴化培地（図1Bおよび図2B）
注：細胞培養生物学的安全フード内のすべてのステップを実行します。
- 5mlのPBSでMESCプレートをすすぎます。 TE（2.5倍）の1ミリリットルを加え、37℃で3分間、5％CO 2インキュベートします。 3分後、MESC mediu 2mlのTEを中和メートルと300×gで3分間遠心操作します。
- MESC媒体の各ゼラチンコート培養皿（5ゼラチン化プレート/ 1 MESCプレート）にMESC媒体とプレートの5ミリリットル1ミリリットル中に再懸濁。 37℃で培養し、5％CO 2 80〜85までの％の密集度に達します。
- 合計3回の洗浄のために、1回の洗浄あたり10分間細胞（10cmプレートあたり8ミリリットル）をカバーするのに十分なPBSでたmESCを洗ってください。 37℃で24時間、5％CO 2のための低血清培地中でインキュベートします。
注：洗浄工程は、FBSの汚染を防止することが重要です。インキュベーション時間18,19に従うことが重要です。 - 2500×gで20分間、50ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機にMESC-CMを収集します。遠心分離後の上澄み液（CM）を収集します。 0.2μmのボトルトップフィルターに通してフィルタリングします。
マウス胚の4効果幹細胞馴化培地（MESC-CM）
注：MESC-CMの効果は、次のようないくつかの方法によって検証されましたSAβ-galアッセイ、細胞周期分析、定量RT-PCR。
- SAのβ-galアッセイ（図3A）
- HDF培地で6ウェルプレート中のウェル当たり2×10 4細胞の密度でシードのHDF。 37℃で一晩インキュベートし、5％CO 2。
- 一晩のインキュベーション後、廃棄HDF媒体の半分とはMESC-CMと制御媒体を追加します。 37℃で72時間、5％CO 2インキュベートします。制御媒体がたmESCの非存在下におけるゼラチンコートディッシュで（血清メディア縮小）無血清培地に由来します。
- 2回の洗浄の合計のために、1回の洗浄につき30秒間細胞（6ウェルプレート当たり2ミリリットル）をカバーするのに十分なPBSで細胞を洗浄。固定のために3.7％パラホルムアルデヒド（PFA）を追加します。室温で5分間インキュベートします。
注意：（危険）パラホルムアルデヒドは有毒で腐食性のソリューションです。ソリューションを取り扱う場合の個人防護服（ 例えば、ニトリルまたはラテックス手袋、白衣、およびゴーグル）を着用してください。ヒュームフードを使用してください。 - 固定液を吸引します。ステップ4.1.3で説明したように、PBSで2回固定した細胞を洗浄。
- SAβ-gal染色液（1-2 1mlあたり6ウェルプレート中）を追加します。 37℃で17.5時間インキュベートします。
注：これは、CO 2インキュベーター中でインキュベートされるべきではありません。 - SAβ-gal染色溶液を吸引し、ステップ4.1.3で説明したように、PBSで2回細胞を洗浄します。
- カウンター染色用エオシンソリューションを追加します。室温で5分間インキュベートします。ステップ4.1.3で説明したように、PBSで2回細胞を洗浄。
- その後の分析のために取り付けられたデジタルカメラを使用して、光学顕微鏡、キャプチャ画像を用いて100倍の倍率で画像セル。
注：細胞の総数は、ブラインド方法でカウントすることができ、SAのβ-gal陽性の青色細胞の割合を算出することができます。
- 細胞周期分析（図3B）
- の密度で種子のHDFHDF培地6cmの細胞培養皿中でウェルあたり8×10 4個の細胞。 37℃で一晩インキュベートし、5％CO 2。
- 一晩のインキュベーション後、廃棄HDF媒体の半分とはMESC-CMと制御媒体を追加します。 37℃で24時間、5％CO 2インキュベートします。
- 3.1で説明したステップとして、細胞をトリプシン処理し、300×gで5分間遠心操作します。冷PBS溶液で細胞を洗浄2500×gで3分間、2回遠心分離（PBS 0.5 mMのCaCl 2を、2％FBS、1.5ミリリットルチューブあたり1ミリリットルで）。冷PBS溶液100μlで再懸濁。
- ボルテックスしながら冷エタノールを200μlをドロップすることによって細胞を固定。少なくとも1時間、4℃で保管してください。
- ステップ4.2.3で説明したように、二回の冷PBS溶液で細胞を洗浄。
- 50μg/ mlのRNアーゼを含有するクエン酸ナトリウム緩衝液250μL（1.12％pH値8.5）に細胞を再懸濁。 37℃で30分間インキュベートします。
- クエン酸ナトリウム250μlのを追加します。50μg/ mlのヨウ化プロピジウムを含むバッファー。室温で20分間インキュベートします。
- 20フローサイトメトリーを用いて、各試料中の10,000細胞を測定します。
- 定量RT-PCR（図3C）
- 種子のHDFとステップ4.1.1と4.1.2で説明したように、MESC-CMを追加します。
- 製造業者のプロトコルに従ってRNA抽出キットを使用してのHDFからトータルRNAを単離します。分光光度計21を用いて抽出した全RNAを定量化します。
- 製造業者のプロトコール20に従って、オリゴ（dT）プライマーおよびM-MLV逆転写酵素を含む反応混合物の20μlに1μgの全RNAを添加することにより、cDNAを合成。
- グリーンPCRマスターミックスと特定の遺伝子プライマー（ 補足 表1）を用いて、リアルタイムPCR装置を用いてcDNAの増幅を測定します。 GAPDH発現を用いてデータを正規化します。以下のPCRプロトコルを使用します。最初のデ95℃で10分間naturation。 95℃で15秒間の45サイクル、55℃で20秒間、および72℃で35秒間。 95°C、60°Cで1分間、95℃で30秒間、および60℃15で5秒で15秒間融解曲線ステージ。
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Representative Results
もともと、たmESCは、FBSおよび他のサプリメント（ 図1Aおよび2A）とのMESC培地中のMEFフィーダー上で維持されています。 CMは、フィーダー層、FBSまたは他のサプリメント（ 図1Bおよび2B）なし低血清培地におけるたmESCから収集しました。この培養条件は、潜在的なフィーダからの要因による汚染、FBS、または他のサプリメントなしMESC-特定の条件培地を収集することを可能にします。制御媒体たmESCことなく、同一の培養条件下で回収しました。
ⅰ）通常のMESC培養条件（ 図2A）およびii）血清および無フィーダー培養条件（ 図2B）：たmESCは、2つの培養媒体間の異なる形態を示します。 MESCコロニーは、MEF層上に成長し、通常のMESC文化cの下の楕円形で光沢のある外観を示しましたonditions（ 図2A）。逆に、血清および無フィーダー培養条件のたmESCは偏平で不規則な形態（ 図2B）を示しました。
MESC-CMの機能的特徴付けは、SAβ-galアッセイ（ 図3A）、細胞周期解析（ 図3B）、および定量PCR（ 図3C）などの老化に関連する方法によって達成されました。 MESC-CMと老化のHDFの治療は、細胞老化（ 図3A）の指標である正のSAのβ-gal陽性細胞の数を、減少しました。細胞周期分析は、G 0 / G 1期（ 図3B）内のセルの数を減少させ、一方MESC-CM処理が劇的に、S中の細胞の数を増加し、G 2 / M期ことを明らかにしました。また、MESC-CM処理をn（老化関連遺伝子の発現レベルの減少しましたamely、p53の、P21、およびP16）及び老化関連分泌表現型（SASP）の発現レベル（IL-6）。
図1：MESC-CMの調製と最適化。無血清および無フィーダーCMの準備と最適化のための実験的な戦略。 （A）通常MESCの培養条件および（B）血清および無フィーダーMESC-CMの培養条件。 C：FBSおよびMEFなしのコントロール培地; CM：FBSおよびMEFなしの馴化培地。ペらの許可を得て修正されました。 15。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：明視野イムたmESCの年齢。 （A）通常の条件および（B）血清およびフィーダーなしの条件下でたmESC。黄色の矢印は、通常のMESC培養条件におけるフィーダー細胞（MEFの）を示します。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：MESC-CMのアンチエイジング効果のキャラクタリゼーション。 （A）SAβ-gal活性染色およびSAのβ-gal陽性細胞の割合。フローサイトメトリーによる（B）細胞周期分析。 （C）のqRT-PCRによる老化関連遺伝子の発現レベル（p53の、P21、及びP16）及び老化関連分泌表現型（SASP）の発現レベル（IL-6）の発現レベル。値は平均±SDであります。数値は3回の独立した実験の代表です。群間の統計的有意差は一方向ANOVAおよびTukeyの事後検定によって同定しました。 * P <0.05、** P <0.01。 Y =非老化細胞; S：老化細胞; C：FBSおよびMEFなしのコントロール培地; CM：FBSおよびMEFなしの馴化培地。スケールバー=10μmです。ペらの許可を得て修正されました。 15。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
血清および無フィーダーMESC-CMの成功収集のために、以下の提案を考慮に入れなければなりません。最も重要な要因は、MESC-CMを収集するための初期継代たmESCを使用しています。以前は、初期継代MESC-CMは、後期継代たmESCと比較して、より良好なアンチエイジング効果を有することが示されています。たmESCの継代数は、それらの発生能16及び多能17に影響を与えることが報告されています。
さらなる研究は、抗老化作用を誘導するMESCのsecretome、特定の要因を分析するために必要とされているが、我々は、現在MESC-CMは、細胞レベルで老化を減少させるのに十分であると結論付けることができます。
若い細胞に戻って老化細胞を元に戻すMESC固有の分泌因子の同定は今後の研究のために重要となります。高品質は、このような抗体アレイ15のような分泌分子、上の分析についてD secretome分析、メディア収集プロセス（ステップ3）の間に洗浄工程が非常に重要です。洗浄工程が適切に行われていない場合は、分泌分子は、血清（FBS）コンポーネント18,19によって汚染されます。
（24時間以上）より長いインキュベーション時間は、血清の下で飢餓によって細胞の自己分解またはアポトーシスの可能性を増大させることができるように血清および無フィーダー培養時間（24時間）は、培地収集プロセス（ステップ3）で非常に重要です-と枯渇条件18,19を feeder-。フィーダは、分子22の多くを分泌するように、通常のESCの培養条件は、未分化細胞の長期培養のためのフィーダー層を必要とします。ゼラチン被覆プレートは、フィーダー細胞からの汚染の可能性を防止します。
血清および無フィーダー培養条件から収穫MESC-CMは、老化のHDFにおける抗老化能力を持っています。 mESC-の抗老化効果CMは、SAβ-gal活性などの老化関連の複数の読み出しによって実証されています。強化された増殖能（細胞周期分析）。およびp53、P21、P16、及びIL-6の遺伝子発現レベル（ - 3C 図3A）を減少させました。
ヒト初代細胞はMESC-CMで処理される場合、異種汚染が臨床応用のための重要な課題であろう。したがって、ヒトESCまたはiPS細胞から分泌因子の調査は、人間の起源由来のCMの臨床応用のための重要な今後の研究であろう。幹細胞と抗老化研究に基づいて、無細胞アプローチの収束が治療法上の改善に大きな洞察が得られ、老化関連疾患の現在の理解を拡大することが期待されます。
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Acknowledgments
この研究は、基礎科学研究開発プログラム（2013R1A1A2060930）および医学研究センタープログラム（2015R1A5A2009124）韓国国立研究財団を通じて（NRF）、科学、ICT省が資金を提供し、今後の計画によってサポートされていました。この研究はまた、病気の子供のための病院からの起動オペレーティング・グラント（HK歌唱）でサポートされています。私たちは、G4 MESCラインを提供するために、この原稿博士アンドラーシュナジの編集中にその優れた助けのためのLaura BarwellとサラJSキムに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50 units/ml penicillin and 50 mg/ml streptomycin |
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2 mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100 µM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100 µM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100 units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1 mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5 mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5 mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150 mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 mM |
| Mitomycin C | Sigma | #M4287 | 10 µg/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50 µg/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter | Corning | #430513 | 0.2 μm |
References
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