Summary
Este protocolo proporciona um método para a recolha de células estaminais embrionárias de rato (MESC) forma climatizados, (MESC-CM) derivado de soro (soro fetal de bovino, FBS) - e do alimentador (fibroblastos embrionários de ratinho, MEFs) Livres de condições para uma célula abordagem -livre. Pode ser aplicável para o tratamento do envelhecimento e das doenças associadas ao envelhecimento.
Introduction
O objetivo deste protocolo é recolher rato com células-tronco embrionárias (MESC) meio climatizados, (MESC-CM) a partir de condições de cultura sérica e livre de alimentação e caracterizar suas funções biológicas.
Em geral, as células-tronco embrionárias (CES) têm um grande potencial para a medicina regenerativa e terapia celular, devido à sua pluripotência e capacidade de auto-renovação 1-3. No entanto, o transplante de células-tronco directa tem várias limitações, tais como a rejeição imunológica e a formação do tumor 4,5. Portanto, uma abordagem livre de células pode fornecer uma estratégia terapêutica alternativa para a medicina regenerativa e envelhecimento intervenções 6,7.
A senescência é visto como um homólogo celular para o envelhecimento dos tecidos e órgãos, caracterizado por um estado permanente de paragem do crescimento, fisiologia celular alterada, e comportamentos. O envelhecimento é o principal fator de risco para doenças prevalentes, incluindo cancro, doenças cardiovasculares, tYpê 2 diabetes e neurodegeneração 8. Uma das características óbvias de envelhecimento é o declínio no potencial regenerativo dos tecidos, que é causada pelo envelhecimento de células-tronco e exaustão 9. Muitos estudos têm demonstrado significativas moléculas farmacológicas, tais como a rapamicina 9, o resveratrol 10, 11 e metformina, e factores sistémicos transmitidas pelo sangue, a saber, GDF11 12, que tem a capacidade de atrasar o envelhecimento de forma consistente e estender a esperança de vida.
No presente estudo, MESC-CM foi colhida sem soro camadas (soro fetal bovino, FBS) e alimentação (rato embrionárias fibroblastos, MEFs) para excluir a contaminação de fatores séricos e factores de secreção de MEFs. Estas condições permitidas para uma CM sérica e livre de alimentador que, consequentemente, permitiu a identificação precisa dos fatores de secreção MESC específicas do.
Este protocolo proposto é altamente eficiente, de custo relativamente eficaz e fácilpara operar. Esta técnica proporciona perspectivas sobre a caracterização de factores solúveis MESC-derivados que podem mediar um efeito anti-senescência, que pode ser utilizada para o desenvolvimento de uma abordagem terapêutica isento de células segura e potencialmente vantajoso para intervenções para as doenças do envelhecimento-associados e de outros regenerativa tratamentos.
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Protocol
NOTA: Um esquema do protocolo de recolha sérica e CM isento de alimentador é mostrado na Figura 1.
1. Materiais (Preparação de MEFs, Medium, pratos e Soluções)
- Preparar 500 ml de meio de cultura para os MEFs. Suplemento Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de FBS (qualidade CES), 50 unidades / ml de penicilina, e 50 mg / ml de estreptomicina.
- Isolar MEFs de embriões seguindo um protocolo de rotina estabelecida 13 e mantê-los em meio MEF.
- Preparar 500 ml de meio de cultura para os mESCs. DMEM é suplementado com 15% de FBS e 2 mM de L-glutamina, 100 uM aminoácidos não essenciais (NEAA), 100 uM β-mercaptoetanol, 100 unidades / factor inibidor de leucemia ml (LIF), 50 unidades / ml de penicilina, e 50 mg / ml de estreptomicina.
- Preparar as placas gelatinizados (5 placas gelatinizados / 1 placa MESC) por revestimento de placas de cultura celular de 10 cm com 5 ml de solução de gelatina a 0,1%. Incuba-se durante pelo menos 10 min à temperatura ambiente.
- Prepare 500 ml de Redução de meio de soro para uma condição livre de soro de mESCs. Suplemento de meio de soro reduzido com 1,2 g de bicarbonato de sódio (pH 7,0). Filtrar através de um filtro de garrafa-top 0,2 m.
- Prepara-se o associada à senescência β-galactosidase (SA β-gal) de solução corante para a detecção de células senescentes: 1 mg / ml de X-gal (dissolvido em dimetilf ormamida, DMF), ácido cítrico 40 mM / tampão de fosfato de sódio (pH 6,0) , ferricianeto de potássio 5 mM, ferrocianeto de potássio 5 mM, NaCl 150 mM, e 2 mM de MgCl 2 14.
CUIDADO: (Perigosos) DMF é uma solução tóxico e corrosivo. Usar vestuário de protecção pessoal (por exemplo, borracha nitrílica ou luvas de látex, um jaleco e óculos de proteção) ao manusear solução. Use um exaustor. - Prepare 500 ml de meio para a cultura de fibroblastos dérmicos humanos (HDFS, NHDF-Ad-Der-de fibroblastos). Suplemento DMEM com FBS a 10% e 100 unidades / ml de penicilina e 100 mg / ml de estreptomicina.
NOTA: Realizar todas as etapas de um capô de segurança biológica de cultura de células.
- Tratar as MEFs com 20 ml de meio de MEF contendo 10 ug / ml de mitomicina C em uma placa de cultura celular de 15 cm. Incubar durante 2 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Aspirar o meio de MEFs. Lavam-se as células com PBS três vezes. Adicionar 3 ml de tripsina-EDTA (TE, 1x) e incubar durante 3 min a 37 ° C e 5% de CO 2. Após 3 min, neutralizar o TE com 6 ml de meio de MEF e centrifuga-se durante 3 min a 300 x g.
- Ressuspender em 5 ml de meio de MEF. Determinar o número de células na suspensão de células resultante utilizando coloração com azul de tripano e um hemocitómetro. Placa MEFs inactivadas (alimentador) a uma densidade de 2 X 10 6 células por 10 cm de placa de cultura de células em meio de MEF. Incubar durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Substituir o meio de MEF com meio MESC 24 h após o plaqueamento o alimentador (nadia seguinte).
- Placa os mESCs (G4 F1 celulares ES híbrido) a uma densidade de 2 x 10 6 células no alimentador com meio MESC. Incubar durante 48 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
NOTA: O efeito anti-envelhecimento de MESC-CM é provavelmente mais forte quando o número de passagem inferior mESCs são usados 15-17. Adquirimos uma linha G4 MESC do Dr. Andras Nagy no Instituto Lunenfeld-Tanenbaum Research, Mount Sinai Hospital, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Canadá. - Manter as células a uma densidade relativamente elevada e uma passagem no estado de sub-confluência de 70-80%. Substituir o meio com meio MESC fresco diariamente.
3. Recolha de sérica e sem Alimentador meio condicionado (Figura 1B e 2B)
NOTA: Realizar todas as etapas de um capô de segurança biológica de cultura de células.
- Lavar a placa MESC com 5 ml de PBS. Adicionar 1 ml de TE (2,5x) e incubar durante 3 min a 37 ° C e 5% de CO 2. Após 3 min, neutralizar o TE com 2 ml de MESC medium e centrifuga-se durante 3 min a 300 x g.
- Ressuspender em 5 ml de meio e MESC placa 1 ml para cada placa de cultura revestidos com gelatina (placas gelatinizados 5/1 MESC placa) em meio MESC. Cultura a 37 ° C e 5% de CO2, até 80-85% de confluência é atingido.
- Lavar com PBS mESCs suficiente para cobrir as células (8 mL por placa de 10 cm) durante 10 min por lavagem, para um total de três lavagens. Incubar em Redução meio de soro durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
NOTA: O passo de lavagem é importante para evitar a contaminação de FBS. É importante seguir o tempo de incubação 18,19. - Recolhe MESC-CM em um tubo de 50 ml e centrifugar durante 20 min a 2500 x g. Recolhe-se o sobrenadante da solução (CM) depois da centrifugação. Filtrar através de um filtro de garrafa-top 0,2 m.
4. Efeitos do rato-tronco embrionárias Médio com ar-Cell (MESC-CM)
NOTA: Os efeitos de MESC-MC foram validados por vários métodos, tais como aSA ensaio β-gal, análise do ciclo celular, e de qRT-PCR.
- SA β-gal Ensaio (Figura 3A)
- HDFs semente a uma densidade de 2 x 10 4 culas por po em placas de 6 poços em meio de HDF. Incubar durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Após uma incubação durante a noite, meia descarte do meio HDF e adicionar MESC-CM e médio controle. Incubar durante 72 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. meio de controlo é derivado a partir de meio isento de soro (meio de soro reduzido) em uma placa revestida com gelatina na ausência de mESCs.
- Lavam-se as células com PBS suficiente para cobrir as células (2 ml por placa de 6 poços) durante 30 segundos por cada lavagem, para um total de duas lavagens. Adicionar 3,7% de paraformaldeído (PFA) para fixação. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
CUIDADO: (Perigosos) O paraformaldeído é uma solução tóxico e corrosivo. Usar vestuário de protecção pessoal (por exemplo, borracha nitrílica ou luvas de látex, um jaleco e óculos de proteção) ao manusear a solução.Use um exaustor. - Aspirar a solução de fixação. Lavam-se as células fixadas, com PBS, duas vezes, conforme descrito no passo 4.1.3.
- Adicionar a solução de coloração β-gal SA (1-2 ml por poço numa placa de 6 poços). Incuba-se durante 17,5 horas a 37 ° C.
NOTA: Não está a ser incubadas numa incubadora de CO 2. - Aspirar a solução de coloração β-gal SA e lavar as células duas vezes com PBS, como descrito no passo 4.1.3.
- Adicionar a solução de eosina para a contra-coloração. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Lavar as células duas vezes com PBS, como descrito no passo 4.1.3.
- células de imagens em 100X com uma luz imagens de microscópio e captura usando uma câmera digital anexada para posterior análise.
NOTA: O número total de células pode ser contado de uma maneira cega e a percentagem de células azuis positivas β SA-gal pode ser calculada.
- Análise do ciclo celular (Figura 3B)
- HDFs sementes a uma densidade de8 x 10 4 culas por po numa placa de cultura celular de 6 cm de forma HDF. Incubar durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Após uma incubação durante a noite, meia descarte do meio HDF e adicionar MESC-CM e médio controle. Incubar durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Tripsinizar as células, como descrito no passo 3.1, e centrifuga-se durante 5 min a 300 x g. Lavam-se as células com uma solução de PBS frio (PBS com 0,5 mM de CaCl 2 e 2% de FBS, 1 ml por tubo 1,5 ml) duas vezes e centrifuga-se durante 3 min a 2500 x g. Ressuspender em 100 uL de solução de PBS frio.
- Fixar as células, largando 200 mL de etanol frio, enquanto vórtex. Armazenar a 4 ° C durante pelo menos 1 h.
- Lavam-se as células com solução de PBS frio, duas vezes, conforme descrito no passo 4.2.3.
- Ressuspender as células em 250 ul de tampão de citrato de sódio (1,12%, pH 8,5) contendo 50 ug / ml de RNase. Incubar durante 30 min a 37 ° C.
- Adicionar 250 ul de citrato de sódiotampão contendo / ml de iodeto de propídio 50 ug. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente.
- Medem-se as células de 10.000 em cada amostra utilizando a citometria de fluxo 20.
- qRT-PCR (Figura 3C)
- HDFs sementes e adicione MESC-CM, conforme descrito nos passos 4.1.1 e 4.1.2.
- Isolar o ARN total a partir dos HDFs utilizando um kit de extracção de ARN de acordo com o protocolo do fabricante. Quantificar o ARN total extraído usando um espectrofotómetro 21.
- Sintetizar ADNc por adição de 1 ug do ARN total para a 20 ul de mistura reaccional contendo iniciadores oligo (dT) e M-MLV de transcriptase inversa, de acordo com o protocolo do fabricante 20.
- Medir a amplificação do cDNA com uma máquina de PCR em tempo real, utilizando PCR master mix verde e iniciadores específicos de gene (Suplemento Tabela 1). Normalizar os dados com a expressão GAPDH. Use o seguinte protocolo de PCR: de inicialnaturação durante 10 min a 95 ° C; 45 ciclos de 15 seg a 95 ° C, 20 seg a 55 ° C, e 35 seg a 72 ° C; e a fase de fusão curva durante 15 seg a 95 ° C, 1 min a 60 ° C, 30 seg a 95 ° C, e 5 segundos a 60 ° C 15.
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Representative Results
Originalmente, mESCs são mantidos em um alimentador MEF em meio com FBS a MESC e outros suplementos (Figuras 1A e 2A). CM foi recolhido a partir de mESCs na redução meio de soro, sem uma camada de alimentação, de FBS, ou outros suplementos (Figuras 1B e 2B). Esta condição cultura nos permite coletar específico do MESC meio condicionado sem potencial contaminação pelos fatores do alimentador, FBS, ou outros suplementos. O meio de controlo foi recolhido sob as mesmas condições de cultura, sem mESCs.
mESCs mostram diferentes morfologias entre os dois meios de cultura: i) as condições normais de cultura Mesc (Figura 2A) e ii) sérica e condições de cultura isento de alimentação (Figura 2B). As colônias Mesc cresceu em uma camada MEF e demonstrou uma aparência oval e brilhante sob o normal, MESC cultura cs condições (Figura 2A). Pelo contrário, os mESCs no sérica e condições de cultura isento de alimentação mostrou uma morfologia achatada e irregular (Figura 2B).
A caracterização funcional de MESC-CM foi conseguida por métodos associada com a senescência, tais como sa ensaio β-gal (Figura 3A), análise do ciclo celular (Figura 3B), e de qPCR (figura 3C). Tratamento de HDFs senescentes com MESC-CM reduziu o número de células β-Gal-SA positivos positivos, que é um indicador de senescência celular (Figura 3A). Análise do ciclo celular revelaram que o tratamento MESC-CM aumentou dramaticamente o número de células na fase S e G2 / M, enquanto que reduziu o número de células em G 0 / G 1 fase (Figura 3B). Além disso, o tratamento MESC-CM diminuiu os níveis de expressão do gene associado com a senescência (Namely, p53, p21, e p16) e os níveis de expressão de secreção fenótipo (SASP) associada com a senescência (IL-6).
Figura 1: Preparação e optimização de MESC-CM. estratégia experimental para a preparação e otimização de CM sem soro e sem alimentação. (A) condição e cultura normal MESC (B) sérica e condição de cultura MESC-CM sem alimentação. C: controlar meio sem FBS e MEF; CM: meio condicionado sem FBS e MEF. Modificado com a permissão de Bae et al. 15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: im Campo brilhanteidades de mESCs. mESCs sob (A) condições normais e (B) sérica e condições isentas de alimentação. Setas amarelas indicam células de alimentação (MEFs) em condições normais de cultura Mesc. Barras de escala = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caracterização do efeito anti-envelhecimento de MESC-CM. Coloração de actividade (A) SA β-gal e a percentagem de células β SA-gal-positivos. (B) análise do ciclo celular por citometria de fluxo. (C) Os níveis de expressão de níveis associados com a senescência de expressão de genes (p53, p21, e p16) e níveis associada a senescência fenótipo secretor (SASP) Expressão (IL-6) por meio de qRT-PCR. Os valores são a média ± SD. Figuras são representativos de três experiências independentes. diferenças estatisticamente significativas entre os grupos foram identificados por ANOVA one-way e teste post-hoc de Tukey. * P <0,05, ** p <0,01. Y = células não senescentes; S: células senescentes; C: controlar meio sem FBS e MEF; CM: meio condicionado sem FBS e MEF. Barras de escala = 10 uM. Modificado com a permissão de Bae et al. 15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para a recolha bem sucedida de sérica e MESC-CM sem alimentador, as seguintes sugestões devem ser levados em consideração. O fator mais crítico é usando mESCs passagem precoce para a recolha de MESC-CM. Anteriormente, demonstrou-se que no início passagem MESC-CM tem melhores efeitos anti-envelhecimento em comparação com mESCs passagem final. O número passagem do mESCs tem sido relatada a afectar o seu potencial de desenvolvimento 16 e pluripotência 17.
Embora pesquisas adicionais são necessárias para analisar os fatores específicos do secretome MESC, que induzem efeitos anti-senescência, que atualmente pode concluir que MESC-CM é suficiente para diminuir a senescência ao nível celular.
A identificação de fatores de secreção específica do Mesc que revertam células senescentes de volta para as células jovens será fundamental para estudos futuros. Para as análises de alta qualidade sobre as moléculas de secreção, como a matriz de anticorpo 15 umanálise secretoma d, o passo de lavagem durante o processo de recolha de meio (passo 3) é crítico. Se a etapa de lavagem não é bem conduzido, as moléculas secretoras será contaminada pelo soro (FBS) componentes 18,19.
O tempo de incubação sérica e sem alimentador (24 h) é muito importante no processo de recolha de meio (passo 3), como o tempo de incubação mais longos (mais de 24 horas), podem aumentar a possibilidade de autólise celular ou apoptose por inanição sob o soro - e feeder- condições esgotados 18,19. A condição normal cultura CES requer uma camada alimentadora para a cultura de longo prazo de células indiferenciadas, enquanto o alimentador segrega um grande número de moléculas de 22. A placa revestida com gelatina impede a possibilidade de contaminação a partir das células alimentadoras.
O MESC-CM, colhidas a partir de condições de cultura sérica e livre de alimentação, tem uma capacidade anti-senescência em HDFs senescentes. efeitos anti-senescência de mESC-CM ter sido demonstrado por leituras múltiplas associadas com a senescência, como a actividade β-gal SA; um potencial proliferativo reforçada (análise do ciclo celular); e reduzida p53, p21, p16, IL-6 e os níveis de expressão do gene (Figura 3A - 3C).
Quando as células primárias humanas são tratadas com MESC-CM, xeno-contaminação seria uma questão crítica para a aplicação clínica. Portanto, uma investigação dos fatores de secreção de CES ou iPSCs humanos seria um futuro estudo importante para a aplicação clínica da CM derivado de origens humanas. A convergência de uma abordagem livre de células com base em um células-tronco e um estudo anti-senescência é esperado para expandir a compreensão atual de doenças associadas à senescência, resultando em maior conhecimento sobre melhorias em abordagens terapêuticas.
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Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Ciência Básica Pesquisa (2013R1A1A2060930) e do Programa do Centro de Investigação Médica (2015R1A5A2009124) através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência, TIC e planejamento futuro. Esta pesquisa também é apoiado por uma subvenção de funcionamento Start-up do Hospital for Sick Children (HK Sung). Nós gostaríamos de agradecer a Laura Barwell e Sarah JS Kim por sua excelente ajuda na edição deste manuscrito e Dr. Andras Nagy para fornecer a linha G4 MESC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50 units/ml penicillin and 50 mg/ml streptomycin |
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2 mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100 µM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100 µM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100 units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1 mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5 mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5 mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150 mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 mM |
| Mitomycin C | Sigma | #M4287 | 10 µg/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50 µg/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter | Corning | #430513 | 0.2 μm |
References
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