Summary
Dit protocol verschaft een werkwijze voor het verzamelen van muis embryonale stamcellen (mES) -geconditioneerd medium (mES-CM) verkregen uit serum (foetaal bovine serum, FBS) - en feeder (muis embryonale fibroblasten MEF) vrij voorwaarden voor een cel -gratis aanpak. Het kan dienstig voor de behandeling van veroudering en veroudering-geassocieerde ziekten.
Introduction
Het doel van dit protocol is om de muis te verzamelen embryonale stamcellen (mES) -geconditioneerd medium (mES-CM) van serum en feeder-vrije kweekomstandigheden en zijn biologische functies te karakteriseren.
In het algemeen zijn embryonale stamcellen (SER) hebben een groot potentieel voor regeneratieve geneeskunde en celtherapie als gevolg van hun pluripotentie en capaciteit voor zelf-vernieuwing 1-3. De directe transplantatie van stamcellen heeft verschillende beperkingen, zoals afstoting en tumorvorming 4,5. Daarom kan een cel-vrije benadering van een alternatieve therapeutische strategie voor de regeneratieve geneeskunde en veroudering interventies 6,7 bieden.
Senescence wordt gezien als een cellulaire tegenhanger van de veroudering van weefsels en organen, gekenmerkt door een permanente staat van groeistop, veranderde cel fysiologie en gedrag. Veroudering is de belangrijkste risicofactor voor voorkomende ziekten zoals kanker, hart- en vaatziekten, tYpe 2 diabetes, en neurodegeneratie 8. Een voor de hand liggende kenmerken van veroudering is de daling van het regeneratieve vermogen van weefsels, die wordt veroorzaakt door stamcellen veroudering en uitputting 9. Veel belangrijke studies farmacologische moleculen, zoals rapamycine 9, resveratrol 10 en metformine 11, bloed overgedragen systemische factoren, namelijk GDF11 12, dat het vermogen om consequent veroudering te vertragen en verlengt de levensduur te laten geven.
In de onderhavige studie werd mES-CM geoogst zonder serum (foetaal bovine serum, FBS) en feeder (muis embryonale fibroblasten MEF) lagen op de verontreiniging van serumfactoren en secretoire factoren uit MEFs sluiten. Deze voorwaarden zijn toegestaan voor een serum en feeder-vrij CM dat bijgevolg kon de nauwkeurige identificatie van mES specifieke secretoire factoren.
Deze voorgestelde protocol is zeer efficiënt, relatief kosteneffectief en eenvoudigopereren. Deze techniek geeft inzicht in de karakterisering van mES-afgeleide oplosbare factoren die een anti-veroudering effect kan bemiddelen, die kunnen worden gebruikt voor de ontwikkeling van een veilig en potentieel voordelige celvrije therapeutische benadering van interventies voor veroudering geassocieerde ziekten en andere regeneratieve behandelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Een schema van de serum- en voedingsvrije CM collectie protocol wordt weergegeven in figuur 1.
1. Materialen (Voorbereiding van de MEF, Medium, platen, en oplossingen)
- Bereid 500 ml van medium tot de cultuur van de MEF. Aangevuld Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 10% FBS (ESC kwaliteit), 50 eenheden / ml penicilline en 50 mg / ml streptomycine.
- Isoleer MEF uit embryo's na een vaste routine protocol 13 en te onderhouden in MEF medium.
- Bereid 500 ml van medium tot de cultuur van de mESCs. DMEM aangevuld met 15% FBS en 2 mM L-glutamine, 100 uM niet-essentiële aminozuren (NEAA), 100 uM β-mercaptoethanol, 100 eenheden / ml leukemie remmende factor (LIF), 50 eenheden / ml penicilline, en 50 mg / ml streptomycine.
- Bereid de gegelatineerd platen (5 verstijfseld platen / 1 mES plaat) door bekleding 10 cm celkweekschalen met 5 ml 0,1% gelatineoplossing. Incubeer gedurende ten minste 10 min op kamertemperatuur.
- Bereid 500 ml Verlaagde Serum Medium voor een serumvrije toestand van mESCs. Supplement Verlaagde serum medium met 1,2 g natriumbicarbonaat (pH 7,0). Filteren door middel van een 0,2 micrometer bottle-top filter.
- Bereid de senescentie geassocieerde β-galactosidase (SA β-gal) kleuroplossing voor de detectie van verouderde cellen: 1 mg / ml X-gal (opgelost in dimethylformamide, DMF), 40 mM citroenzuur / natriumfosfaatbuffer (pH 6,0) , 5 mM kalium ferricyanide, 5 mM kaliumferrocyanide, 150 mM NaCl en 2 mM MgCl2 14.
LET OP: (gevaarlijke) DMF is een giftige en bijtende oplossing. Draag persoonlijke beschermende kleding (bijvoorbeeld, nitril of latex handschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril) bij het hanteren oplossing. Gebruik een zuurkast. - Bereid 500 ml van medium tot cultuur humane huidfibroblasten (HDF, NHDF-Ad-Der-Fibroblast). DMEM aangevuld met 10% FBS en 100 eenheden / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine.
OPMERKING: Voer alle stappen in een celkweek biologische veiligheid kap.
- Behandel de MEF met 20 ml van MEF medium dat 10 ug / ml mitomycine C in een 15 cm kweekschaal cel. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Zuig het medium van MEF. Was de cellen met PBS driemaal. Voeg 3 ml trypsine-EDTA (TE, 1x) en incubeer gedurende 3 min bij 37 ° C en 5% CO2. Na 3 min, neutraliseren TE met 6 ml van MEF medium en centrifugeer gedurende 3 min bij 300 x g.
- Hersuspenderen in 5 ml MEF medium. Bepaal het aantal cellen in de verkregen celsuspensie gebruikt trypan blauw kleuring en een hemocytometer. Plaat geïnactiveerde MEF (feeder) bij een dichtheid van 2 x 10 6 cellen per 10 cm celkweek schotel in MEF medium. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Vervang de MEF medium met mES medium 24 uur na plating de feeder (op dede volgende dag).
- De plaat mESCs (G4 F1 hybride ES cel) bij een dichtheid van 2 x 10 6 cellen op de feeder met mES medium. Incubeer gedurende 48 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
LET OP: De anti-aging effect van mES-CM is waarschijnlijk sterker als lager passage nummer mESCs worden gebruikt 15-17. Verwierven we een G4 mES lijn van Dr. Andras Nagy in Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Canada. - Houd de cellen bij een betrekkelijk hoge dichtheid en doorgang aan een 70-80% subconfluente toestand. Vervang het medium met verse mES medium dagelijks.
3. Inning van serum en Feeder-vrij geconditioneerd medium (Figuur 1B en 2B)
OPMERKING: Voer alle stappen in een celkweek biologische veiligheid kap.
- Spoel de mES plaat met 5 ml PBS. Voeg 1 ml TE (2,5 x) en incubeer gedurende 3 min bij 37 ° C en 5% CO2. Na 3 min, neutraliseren TE met 2 ml mES medium en centrifugeer gedurende 3 min bij 300 x g.
- Resuspendeer in 5 ml mES medium en plaat 1 ml in elk gelatine gecoate cultuur schotel (5 ontsloten platen / 1 mES plaat) in mES medium. Kweken bij 37 ° C en 5% CO 2 tot 80-85% confluentie bereikt.
- MESCs wassen met PBS voldoende om de cellen (8 ml per 10 cm plaat) gedurende 10 min per wasbeurt dekken, voor een totaal van drie wassingen. Incubeer in Verlaagde Serum Medium gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
OPMERKING: De wasstap is belangrijk FBS verontreiniging te voorkomen. Het is belangrijk om de incubatietijd 18,19 volgen. - Verzamel mES-CM in een 50 ml conische buis en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 2500 x g. Verzamel de bovenstaande vloeistof (CM) na centrifugeren. Filteren door middel van een 0,2 micrometer bottle-top filter.
4. Effecten van de muis embryonale stamcel-geconditioneerd medium (mES-CM)
OPMERKING: De effecten van mES-CM werden bevestigd met verschillende werkwijzen, zoalsSA β-gal-assay, celcyclus analyse en qRT-PCR.
- SA β-gal-assay (Figuur 3A)
- Zaad HDF's bij een dichtheid van 2 x 10 4 cellen per putje in 6-well platen in HDF medium. Incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% CO2.
- Na een nacht incubatie, verwerp de helft van de HDF medium en voeg mES-CM en controle medium. Incubeer gedurende 72 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Stuurmedium wordt afgeleid uit serum-vrij medium (Reduced Serum Media) in een gelatine-gecoate schaal in afwezigheid van mESCs.
- Was de cellen met PBS voldoende om de cellen (2 ml per 6-wells plaat) gedurende 30 sec per wasbeurt dekken, voor een totaal van twee wassen. Voeg 3,7% paraformaldehyde (PFA) voor bevestiging. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
LET OP: (gevaarlijke) Paraformaldehyde is een giftige en bijtende oplossing. Draag persoonlijke beschermende kleding (bijvoorbeeld, nitril of latex handschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril) bij het hanteren van de oplossing.Gebruik een zuurkast. - Zuig het fixatie-oplossing. Was de gefixeerde cellen tweemaal met PBS, zoals beschreven in stap 4.1.3.
- Voeg de SA β-gal kleuroplossing (1-2 ml per putje in een 6-wells plaat). Incubeer gedurende 17,5 uur bij 37 ° C.
Opmerking: Het is niet te geïncubeerd in een CO2 incubator. - Zuig het SA β-gal kleuroplossing en was de cellen tweemaal met PBS, zoals beschreven in stap 4.1.3.
- Voeg de Eosine oplossing voor contra-kleuring. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen tweemaal met PBS, zoals beschreven in stap 4.1.3.
- Afbeelding cellen bij 100X vergroting met behulp van een lichtmicroscoop en vast te leggen beelden met behulp van een aangesloten digitale camera voor verdere analyse.
Opmerking: Het totale aantal cellen worden geteld in een blinde wijze en het percentage SA β-gal positieve blauwe cellen kunnen worden berekend.
- Cell Cycle Analysis (Figuur 3B)
- Zaad HDF's bij een dichtheid van8 x 10 4 cellen per putje in een 6 cm celkweekschaal HDF medium. Incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% CO2.
- Na een nacht incubatie, verwerp de helft van de HDF medium en voeg mES-CM en controle medium. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Trypsinize de cellen, zoals beschreven in stap 3.1 en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g. Was de cellen met koude PBS-oplossing (PBS met 0,5 mM CaCl2 en 2% FBS, 1 ml per 1,5 ml buisje) tweemaal en centrifugeer gedurende 3 min bij 2500 x g. Resuspendeer in 100 ul koud PBS oplossing.
- Fixeer de cellen druppelsgewijs 200 ui koude ethanol terwijl vortexen. Bewaren bij 4 ° C gedurende tenminste 1 uur.
- Was de cellen met koude PBS oplossing tweemaal, zoals beschreven in stap 4.2.3.
- Resuspendeer de cellen in 250 ui natriumcitraat buffer (1,12%, pH 8,5) bevattende 50 ug / ml RNase. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Voeg 250 ul natriumcitraatbuffer bevattende 50 ug / ml propidiumjodide. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Meet de 10.000 cellen per monster via flowcytometrie 20.
- qRT-PCR (Figuur 3C)
- Seed HDF en voeg mES-CM, zoals beschreven in de stappen 4.1.1 en 4.1.2.
- Isoleer totaal RNA van de HDF's met een RNA extractie kit volgens het protocol van de fabrikant. Kwantificeren geëxtraheerde totaal RNA met behulp van een spectrofotometer 21.
- CDNA synthetiseren door toevoeging van 1 ug van totaal RNA een 20 ui reactiemengsel dat oligo (dT) primers en M-MLV reverse transcriptase volgens het protocol van de 20 fabrikant.
- Meet de amplificatie van het cDNA met real-time PCR machine met behulp Green PCR Master Mix en specifiek gen primers (Supplement Tabel 1). Normaliseren van de data met GAPDH expressie. Gebruik de volgende PCR-protocol: de aanvankelijkenaturatie gedurende 10 min bij 95 ° C; 45 cycli van 15 sec bij 95 ° C, 20 sec bij 55 ° C en 35 sec bij 72 ° C; en de smeltcurve podium voor 15 sec bij 95 ° C, 1 min bij 60 ° C, 30 sec bij 95 ° C en 5 sec bij 60 ° C 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oorspronkelijk worden mESCs bijgehouden op een MEF feeder in mES medium met FBS en andere supplementen (figuren 1A en 2A). CM werd verzameld mESCs verminderd serum medium zonder voedsterlaag, FBS of andere supplementen (figuren 1B en 2B). Deze cultuur voorwaarde stelt ons in staat om te verzamelen mES-specifieke geconditioneerd medium zonder mogelijke besmetting door de factoren uit de feeder, FBS of andere supplementen. De controle-medium werd verzameld onder dezelfde kweekomstandigheden, zonder mESCs.
mESCs tonen verschillende morfologieën tussen de twee kweekmedia: i) normale mES cultuuromstandigheden (Figuur 2A) en ii) serum- en feeder-vrije cultuur omstandigheden (figuur 2B). De mES kolonies groeiden op een MEF laag en toonde een ovaal en glanzend uiterlijk onder de normale mES cultuur caarden (Figuur 2A). Integendeel, de mESCs in de serum- en voedingsvrije kweekomstandigheden toonde een afgeplatte en onregelmatige morfologie (figuur 2B).
De functionele karakterisering van mES-CM werd bereikt door senescentie-geassocieerde werkwijzen, zoals SA β-gal-assay (figuur 3A), celcyclus analyse (Figuur 3B) en qPCR (figuur 3C). Behandeling van verouderend HDF met mES-CM nam het percentage positieve SA β-gal-positieve cellen, hetgeen een indicatie van cellulaire senescentie (Figuur 3A). Celcyclus analyse bleek dat mES-CM behandeling dramatisch toegenomen het aantal cellen in de S en G2 / M-fase, dat het verminderde het aantal cellen in de G 0 / G 1-fase (figuur 3B). Bovendien mES CM-behandeling verminderde de senescentie geassocieerde genexpressie niveaus (namely, p53, p21 en p16) en de senescentie secretorische geassocieerde fenotype (SASP) expressieniveaus (IL-6).
Figuur 1: Voorbereiding en optimalisatie van mES-CM. Experimentele strategie voor de voorbereiding en de optimalisatie van het serum-vrij en feeder-vrij CM. (A) Normale mES cultuur staat en (B) serum en feeder-free mES-CM cultuur conditie. C: medium zonder FBS en MEF controleren; CM: geconditioneerd medium zonder FBS en MEF. Gewijzigd met toestemming van Bae et al. 15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bright gebied imleeftijden van mESCs. mESCs onder (A) normale omstandigheden en (B) serum en feeder-vrije omstandigheden. Gele pijlen geven feeder cel (MEF) in normale mES kweekomstandigheden. Schaal bar = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karakterisering van het anti-verouderingseffect van mES-CM. (A) SA β-gal activiteit kleuring en het percentage SA β-gal-positieve cellen. (B) van de Cel cyclus analyse door flowcytometrie. (C) Expressie niveaus van senescence geassocieerde gen-expressie (p53, p21 en p16) en senescence geassocieerde secretorische fenotype (SASP) expressieniveaus (IL-6) door qRT-PCR. Waarden zijn het gemiddelde ± SD. De cijfers zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. Statistisch significante verschillen tussen de groepen werden geïdentificeerd door eenzijdige ANOVA en post-hoc Tukey's test. * P <0,05, ** p <0,01. Y = niet-verouderde cellen; S: verouderde cellen; C: medium zonder FBS en MEF controleren; CM: geconditioneerd medium zonder FBS en MEF. Schaalbalken = 10 urn. Gewijzigd met toestemming van Bae et al. 15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor de succesvolle collectie van serum en feeder-free mES-CM, moeten de volgende suggesties in overweging worden genomen. De meest kritische factor is het gebruik van vroege passage mESCs voor het verzamelen van mES-CM. Eerder is aangetoond dat vroege passage mES-CM heeft betere anti-aging effect vergeleken met late passage mESCs. De passage aantal mESCs gemeld hun ontwikkelingspotentieel 16 en pluripotentie 17 beïnvloeden.
Terwijl aanvulling behoeft de bijzondere kenmerken van de mES secretoom, die anti-veroudering effecten induceren te analyseren, kunnen we concluderen dat nog mES-CM volstaat senescentie verlagen op cellulair niveau.
De identificatie van mES specifieke secretoire factoren die de verouderde cellen terugkeren naar jonge cellen zullen van cruciaal belang voor toekomstige studies. Voor hoogwaardige analyses over de secretoire moleculen, zoals antilichamen matrix 15 eend secretoom analyse, de wasstap in het medium verzamelen (stap 3) is kritisch. Als de wasstap niet naar behoren wordt uitgevoerd, zal de secretoire moleculen worden besmet door serum (FBS) componenten 18,19.
De serum- en voedingsvrije incubatietijd (24 uur) is erg belangrijk in het medium verzamelen (stap 3), de langere incubatietijd (meer dan 24 uur) kan de mogelijkheid van cel autolyse of apoptose te verhogen door verhongering onder serum - en feeder- uitgeputte voorwaarden 18,19. De normale ESC kweekomstandigheid vereist een feeder-laag voor langdurige kweken van ongedifferentieerde cellen, omdat de feeder scheidt een groot aantal moleculen 22. De gelatine beklede plaat wordt voorkomen dat contaminatie van de voedingscellen.
De mES-CM, geoogst uit serum en feeder-vrije cultuur omstandigheden, heeft een anti-veroudering vermogen in verouderend HDF. Anti-veroudering effecten van mESC-CM aangetoond door senescentie-geassocieerde meervoudige uitlezingen zoals SA β-gal activiteit; een verbeterde proliferatieve potentieel (celcyclus analyse); en verminderde p53, p21, p16 en IL-6 genexpressie (Figuur 3A - 3C).
Indien menselijke primaire cellen worden behandeld met mES-CM, zou xeno-besmetting belangrijker wordt voor klinische toepassing. Daarom zou een onderzoek naar de secretoire factoren uit menselijke SER of iPSCs een belangrijke toekomstige studie voor de klinische toepassing van CM afkomstig van menselijke oorsprong zijn. De convergentie van een celvrij benadering gebaseerd op stamcellen en een anti-veroudering onderzoek wordt verwacht dat de huidige kennis van senescentie-geassocieerde ziekten vergroten, waardoor meer inzicht in verbeteringen op therapeutische benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de Basic Science Research Program (2013R1A1A2060930) en de Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) door de National Research Foundation Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van Wetenschap, ICT, en Toekomst Planning. Dit onderzoek wordt ook ondersteund door een Start-up exploitatiesubsidie van de Hospital for Sick Children (HK Sung). We willen graag Laura Barwell en Sarah JS Kim bedanken voor hun uitstekende hulp bij het bewerken van dit manuscript en Dr. Andras Nagy voor het verstrekken van de G4 mES lijn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50 units/ml penicillin and 50 mg/ml streptomycin |
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2 mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100 µM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100 µM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100 units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1 mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5 mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5 mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150 mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 mM |
| Mitomycin C | Sigma | #M4287 | 10 µg/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50 µg/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter | Corning | #430513 | 0.2 μm |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608 (2012).
- Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
- Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
- Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
- Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
- Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
- Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
- Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
- Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
- Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192 (2013).
- Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
- Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
- Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
- Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
- Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
- Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
- Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
- Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).
