Summary
Denne protokol giver en metode til indsamling af musen embryonale stamceller (Mesc) -konditioneret medium (Mesc-CM) afledt af serum (føtalt bovint serum, FBS) - og feeder (mus embryonale fibroblaster, MEF'er) -fri betingelser for en celle -fri tilgang. Det kan være anvendelig til behandling af aldring og aldring-associerede sygdomme.
Introduction
Målet med denne protokol er at indsamle mus embryonale stamceller (Mesc) -konditioneret medium (Mesc-CM) fra serum- og feeder-fri dyrkningsbetingelser og at beskrive sine biologiske funktioner.
Generelt embryonale stamceller (EKSF) har et stort potentiale for regenerativ medicin og celleterapi på grund af deres pluripotens og evne til selv-fornyelse 1-3. Men den direkte transplantation af stamceller har adskillige begrænsninger, såsom immun afstødning og tumordannelse 4,5. Derfor kan en celle-fri tilgang giver en alternativ terapeutisk strategi for regenerativ medicin og aldrende interventioner 6,7.
Ældning ses som en cellulær modstykke til den aldrende væv og organer, kendetegnet ved en permanent tilstand af vækst anholdelse, ændret celle fysiologi og adfærd. Aldring er den vigtigste risikofaktor for udbredte sygdomme, herunder kræft, hjerte-karsygdomme, type 2-diabetes, og neurodegeneration 8. En af de åbenlyse karakteristika aldring er faldet i den regenerative potentiale af væv, som er forårsaget af stamceller aldring og udmattelse 9. Mange betydningsfulde undersøgelser har vist farmakologiske molekyler, såsom rapamycin 9, resveratrol 10, og metformin 11, og blodbårne systemiske faktorer, nemlig GDF11 12, der har evnen til konsekvent at forsinke ældning og forlænge levetiden.
I den foreliggende undersøgelse har Mesc-CM blevet høstet uden serum (føtalt bovint serum, FBS) og føder (muse embryonale fibroblaster, MEF'er) lag for at udelukke kontaminering af serum faktorer og sekretoriske faktorer fra MEF'er. Disse betingelser er tilladt for en serum- og feeder-fri CM, der dermed muliggjort præcis identifikation af Mesc-specifikke sekretoriske faktorer.
Denne foreslåede protokol er højeffektive, forholdsvis omkostningseffektive og letat operere. Denne teknik giver indblik i karakteriseringen af Mesc-afledte opløselige faktorer, som kan mediere en anti-senescens virkning, som kan anvendes til udvikling af et sikkert og potentielt fordelagtig cellefri terapeutisk tilgang mod indgreb for aging-associerede sygdomme og andre regenerativ behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: En skematisk af serum- og feeder-fri CM samling protokol er vist i figur 1.
1. Materialer (Udarbejdelse af MEF'er, Medium, Plader, og løsninger)
- Forbered 500 ml medium til dyrkning af MEF. Supplement Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 10% FBS (ESC kvalitet), 50 enheder / ml penicillin og 50 mg / ml streptomycin.
- Isoler MEF'er fra embryoner efter en etableret rutine protokol 13 og vedligeholde dem i MEF medium.
- Forbered 500 ml medium til kultur de mESCs. DMEM suppleres med 15% FBS og 2 mM L-glutamin, 100 uM ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 100 uM β-mercaptoethanol, 100 enheder / ml leukæmiinhiberende faktor (LIF), 50 enheder / ml penicillin og 50 mg / ml streptomycin.
- Forbered gelatinerede plader (5 gelatinerede plader / 1 Mesc plade) ved at overtrække 10 cm cellekulturskåle med 5 ml 0,1% gelatineopløsning. Inkuber i mindst 10 min ved stuetemperatur.
- Forbered 500 ml Reduceret Serum Medium for et serum-frit tilstand mESCs. Supplement Reduceret Serum Media med 1,2 g natriumbicarbonat (pH 7,0). Der filtreres gennem et 0,2 um flaske-top filter.
- Forbered senescens-associerede β-galactosidase (SA β-gal) farvningsopløsning til påvisning af senescentceller: 1 mg / ml X-gal (opløst i dimethylformamid, DMF), 40 mM citronsyre / natriumphosphatpuffer (pH 6,0) , 5 mM kaliumferricyanid, 5 mM kaliumferrocyanid, 150 mM NaCl og 2 mM MgCl2 14.
ADVARSEL: (Hazardous) DMF er et giftigt og ætsende løsning. Bær personlig beskyttelsesbeklædning (f.eks, nitril eller latex handsker, en kittel, og beskyttelsesbriller) ved håndtering løsning. Brug en emhætte. - Forbered 500 ml medium til kultur menneskelige hudfibroblaster (HDFS, NHDF-Ad-Der-fibroblast). Supplere DMEM med 10% FBS og 100 enheder / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin.
BEMÆRK: Udfør alle trin i en cellekultur biologisk sikkerhed hætte.
- Behandl MEF'er med 20 ml MEF medium indeholdende 10 ug / ml mitomycin C i en 15 cm celledyrkningsskål. Inkuber i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Aspirer mediet fra MEF. Vask cellerne med PBS tre gange. Tilsæt 3 ml trypsin-EDTA (TE, 1x) og inkuberes i 3 minutter ved 37 ° C og 5% CO2. Efter 3 min, neutralisere TE med 6 ml MEF medium og centrifugeres i tre minutter ved 300 x g.
- Resuspender i 5 ml MEF medium. Bestem celletallet i den resulterende cellesuspension under anvendelse af trypanblåt-farvning og et hæmocytometer. Plate inaktiverede MEF'er (feeder) ved en densitet på 2 x 10 6 celler pr 10 cm celledyrkningsskål i MEF medium. Inkuber i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Udskift MEF medium med Mesc medium 24 timer efter plating feeder (pådagen efter).
- Plade mESCs (G4 F1 hybrid ES-celle) ved en densitet på 2 x 10 6 celler for feeder med Mesc medium. Inkuber i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
BEMÆRK: anti-aging effekt af Mesc-CM er sandsynligvis stærkere, når lavere passage nummer mESCs bruges 15-17. Vi købte en G4 Mesc linje fra Dr. Andras Nagy i Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Canada. - Holde cellerne ved en relativt høj densitet og passage ved en 70-80% sub-sammenflydende tilstand. Udskift mediet med frisk Mesc medium dagligt.
3. Indsamling af serum- og Feeder-fri konditioneret medium (figur 1B og 2B)
BEMÆRK: Udfør alle trin i en cellekultur biologisk sikkerhed hætte.
- Skyl Mesc plade med 5 ml PBS. Der tilsættes 1 ml TE (2.5x) og inkuberes i 3 minutter ved 37 ° C og 5% CO2. Efter 3 min, neutralisere TE med 2 ml Mesc medium og centrifugeres i 3 minutter ved 300 x g.
- Resuspender i 5 ml Mesc medium og plade 1 ml i hver gelatineovertrukket dyrkningsskål (5 gelatinerede plader / 1 Mesc plade) i Mesc medium. Dyrkning ved 37 ° C og 5% CO2, indtil 80-85% sammenflydning er nået.
- Vask mESCs med tilstrækkelig PBS til at dække cellerne (8 ml pr 10 cm plade) i 10 minutter pr vask, for i alt tre vaske. Inkuber i Reduceret Serum Medium i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
BEMÆRK: Vasketrinnet er vigtigt at forhindre FBS kontaminering. Det er vigtigt at følge inkubationstiden 18,19. - Indsamle Mesc-CM i en 50 ml konisk rør og centrifugeres i 20 minutter ved 2.500 x g. Opsaml supernatanten (CM) efter centrifugering. Der filtreres gennem et 0,2 um flaske-top filter.
4. Virkninger af mus embryonale stamceller-condition Medium (Mesc-CM)
BEMÆRK: Virkningerne af Mesc-CM blev valideret ved flere fremgangsmåder, såsomSA β-gal-assayet, cellecyklusanalyse og QRT-PCR.
- SA β-gal assay (figur 3A)
- Seed HDFS ved en densitet på 2 x 10 4 celler per brønd i plader med 6 brønde i HDF medium. Inkuber natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
- Efter en inkubation natten over, kassere halvdelen af HDF-medium og tilsæt Mesc-CM og kontrolmedium. Inkuberes i 72 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Kontrolmedium er afledt af serum-frit medium (Reduceret Serum Media) i en gelatine-coatede skålen i fravær af mESCs.
- Vask cellerne med tilstrækkelig PBS til at dække cellerne (2 ml pr 6-brønds plade) i 30 sek pr vask, for i alt to vaske. Tilføj 3,7% paraformaldehyd (PFA) til fiksering. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
ADVARSEL: (Hazardous) Paraformaldehyd er et giftigt og ætsende løsning. Bær personlig beskyttelsesbeklædning (f.eks, nitril eller latex handsker, en kittel, og beskyttelsesbriller) ved håndtering af løsningen.Brug en emhætte. - Aspirer fikseringsopløsning. Vask de fikserede celler med PBS to gange, som beskrevet i trin 4.1.3.
- Tilsæt SA β-gal-farvningsopløsning (1-2 ml per brønd i en 6-brønds plade). Inkuber i 17,5 timer ved 37 ° C.
BEMÆRK: Det er ikke at blive inkuberet i en CO2-inkubator. - Aspirer SA β-gal-farvningsopløsning og vaske cellerne med PBS to gange, som beskrevet i trin 4.1.3.
- Tilsæt eosin løsning til counter-farvning. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Vask cellerne med PBS to gange, som beskrevet i trin 4.1.3.
- Billedfiler celler ved 100X forstørrelse ved anvendelse af et lysmikroskop og Tag billeder med en vedhæftet digitalkamera til efterfølgende analyse.
BEMÆRK: Det samlede antal celler kan tælles i en blind måde og kan beregnes procentdelen af SA β-gal-positive blå celler.
- Cell Cycle Analysis (figur 3B)
- Seed HDFS med en tæthed på8 x 10 4 celler per brønd i en 6 cm celledyrkningsskål i HDF medium. Inkuber natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
- Efter en inkubation natten over, kassere halvdelen af HDF-medium og tilsæt Mesc-CM og kontrolmedium. Inkuber i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Trypsinisér cellerne, som beskrevet trin i 3.1, og centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g. Vask cellerne med kold PBS-opløsning (PBS med 0,5 mM CaCl2 og 2% FBS, 1 ml pr 1,5 ml rør) to gange og centrifugeres i 3 minutter ved 2.500 x g. Resuspender i 100 pi kold PBS-opløsning.
- Fikseres cellerne ved at dryppe 200 pi kold ethanol medens der blev hvirvelbehandlet. Opbevar ved 4 ° C i mindst 1 time.
- Vask cellerne med kold PBS-opløsning to gange, som beskrevet i trin 4.2.3.
- Cellerne resuspenderes i 250 pi natriumcitratbuffer (1,12%, pH 8,5) indeholdende 50 ug / ml RNase. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
- Tilsættes 250 pi natriumcitratpuffer indeholdende 50 pg / ml propidiumiodid. Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Måle 10.000 celler i hver prøve ved anvendelse af flowcytometri 20.
- QRT-PCR (figur 3C)
- Seed HDFS og tilføje Mesc-CM, som beskrevet i trin 4.1.1 og 4.1.2.
- Isoler totalt RNA fra de HDFS under anvendelse af et RNA-ekstraktion kit ifølge producentens protokol. Kvantificere det ekstraherede total-RNA under anvendelse af et spektrofotometer 21.
- Syntetisere cDNA ved tilsætning af 1 ug af det totale RNA til en 20 pi reaktionsblanding indeholdende oligo (dT) primere og M-MLV revers transkriptase, ifølge fabrikantens protokol 20.
- Mål amplifikation af cDNA'et med en real-time PCR-maskine, ved hjælp af Green PCR Master Mix og specifikt gen primere (Supplement tabel 1). Normalisere data med GAPDH udtryk. Brug følgende PCR-protokol: indledende denaturering i 10 minutter ved 95 ° C; 45 cykler i 15 sekunder ved 95 ° C, 20 sekunder ved 55 ° C, og 35 sek ved 72 ° C; og smeltekurven scenen for 15 sekunder ved 95 ° C, 1 min ved 60 ° C, 30 sekunder ved 95 ° C, og 5 sekunder ved 60 ° C 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oprindeligt er mESCs vedligeholdes på en MEF feeder i Mesc medium med FBS og andre kosttilskud (figur 1A og 2A). CM blev indsamlet fra mESCs i Reduceret Serum Media uden et fødelag, FBS, eller andre kosttilskud (figur 1B og 2B). Denne kultur tilstand tillader os at indsamle Mesc-specifikke medium uden potentiel forurening af faktorer fra feeder, FBS, eller andre kosttilskud. Kontrol medium blev indsamlet under de samme dyrkningsbetingelser, uden mESCs.
mESCs viser forskellige morfologier mellem de to dyrkningsmedier: i) normale Mesc dyrkningsbetingelser (figur 2A) og ii) serum- og fødefri dyrkningsbetingelser (figur 2B). De Mesc kolonier voksede på en MEF lag og demonstrerede en oval og skinnende udseende under det normale Mesc kultur cETINGELSER (figur 2A). Tværtimod de mESCs i serum- og fødefri dyrkningsbetingelser viste en udfladet og uregelmæssig morfologi (figur 2B).
Den funktionelle karakterisering af Mesc-CM blev opnået ved senescens-associerede fremgangsmåder, såsom SA β-gal assay (figur 3A), cellecyklusanalyse (figur 3B), og qPCR (figur 3C). Behandling af aldrende HDFS med Mesc-CM faldt antallet af positive SA β-gal-positive celler, som er en indikator af cellulær aldring (figur 3A). Cellecyklusanalyse afslørede, at Mesc-CM behandling dramatisk forøget antallet af celler i S og G2 / M-fase, hvorimod den reducerede antallet af celler i G 0 / G 1 fase (figur 3B). Desuden Mesc-CM behandling reducerede senescens-associerede genekspressionsniveauer (nAmely, p53, p21, og p16) og senescens-associerede sekretorisk fænotype (SASP) ekspressionsniveauer (IL-6).
Figur 1: Fremstilling og optimering af Mesc-CM. Eksperimentel strategi for udarbejdelse og optimering af serum-frit og feeder-fri CM. (A) Normal Mesc dyrkningsbetingelser og (B) serum- og fødefri Mesc-CM dyrkningsbetingelser. C: kontrolmedium uden FBS og MEF; CM: konditioneret medium uden FBS og MEF. Modificeret med tilladelse fra Bae et al. 15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Bright felt imalderen mESCs. mESCs under (A) normale forhold og (B) serum- og feeder-fri forhold. Gule pile angiver feeder celle (MEF) under normale Mesc dyrkningsbetingelser. Scale barer = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Karakterisering af anti-aging effekt af Mesc-CM. (A) SA β-gal-aktivitet farvning og procentdelen af SA β-gal-positive celler. (B) Cellecyklusanalyse ved flowcytometri. (C) Ekspressionsniveauer af senescens-associerede genekspressionsniveauer (p53, p21, og p16) og senescens-associerede sekretorisk fænotype (SASP) ekspressionsniveauer (IL-6) ved QRT-PCR. Værdier er middel ± SD. Tallene er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Statistisk signifikante forskelle mellem grupper blev identificeret ved envejs ANOVA og Tukey post-hoc test. * P <0,05, ** p <0,01. Y = ikke-aldrende celler; S: aldrende celler; C: kontrolmedium uden FBS og MEF; CM: konditioneret medium uden FBS og MEF. Scale barer = 10 um. Modificeret med tilladelse fra Bae et al. 15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For en vellykket indsamling af serum- og feeder-fri Mesc-CM, bør tages hensyn til følgende forslag. Den mest kritiske faktor er at bruge tidlige passage mESCs for indsamling af Mesc-CM. Tidligere er det blevet vist, at tidlig passage Mesc-CM har bedre anti-aging effekter i forhold til sene passage mESCs. Passagen antal mESCs er blevet rapporteret til at påvirke deres udviklingsmæssige potentiale 16 og pluripotens 17.
Mens yderligere forskning er nødvendig for at analysere de specifikke faktorer af Mesc secretome, som inducerer anti-senescens virkninger, kan vi konkludere, at i øjeblikket Mesc-CM er tilstrækkelig til at reducere ældning på celleniveau.
Identifikationen af Mesc-specifikke sekretoriske faktorer, der vil fortryde aldrende celler tilbage til unge celler vil være afgørende for fremtidige undersøgelser. For høj kvalitet analyser på de sekretoriske molekyler, såsom antistof-array 15 end secretome analyse, vasketrinnet under medium indsamlingen (trin 3) er kritisk. Hvis vasketrinnet ikke er korrekt udført, vil de sekretoriske molekyler være forurenet med serum (FBS) komponenter 18,19.
Den serum- og fødefri inkubationstid (24 timer) er meget vigtig i mediet samling (trin 3), jo længere inkubationstid (over 24 timer) kan øge muligheden for celle autolyse eller apoptose ved sult under serum - og feeder- udtømte betingelser 18,19. Den normale ESC kultur tilstand kræver et fødelag for langsigtet dyrkning af udifferentierede celler som feeder udskiller et stort antal molekyler 22. Gelatine-coatede plade forhindrer muligheden for kontaminering fra fødeceller.
Den Mesc-CM, høstet fra serum- og fødefri dyrkningsbetingelser, har en anti-senescens evne i senescent HDFS. Anti-ældning virkninger af mESC-CM er blevet demonstreret ved senescens-associerede flere udlæsninger, såsom SA β-gal-aktivitet; en forbedret proliferativ potentiale (cellecyklus analyse); og reduceret p53, p21, p16 og IL-6 genekspressionsniveauer (figur 3A - 3C).
Når humane primære celler behandles med Mesc-CM, ville xeno-forurening være et kritisk problem for klinisk anvendelse. Derfor ville en undersøgelse af de sekretoriske faktorer fra humane økonomiske og sociale råd eller iPSCs være en vigtig fremtidig undersøgelse for den kliniske anvendelse af CM stammer fra menneskets oprindelse. Konvergensen af en celle-fri tilgang baseret på et stamceller og en anti-ældning studie forventes at udvide den nuværende forståelse af senescens-associerede sygdomme, hvilket resulterer i større indsigt i forbedringer på behandlingsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Basic Science Research Program (2013R1A1A2060930) og Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) gennem Grundforskningsfonden Korea (NRF), finansieret af Ministeriet for Videnskab, IKT, og fremtidig planlægning. Denne forskning understøttes også af en start-up driftstilskud fra Hospital for Sick Children (HK Sung). Vi vil gerne takke Laura Barwell og Sarah JS Kim for deres fremragende hjælp i at redigere dette manuskript og Dr. Andras Nagy for at give G4 Mesc linje.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50 units/ml penicillin and 50 mg/ml streptomycin |
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2 mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100 µM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100 µM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100 units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1 mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5 mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5 mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150 mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 mM |
| Mitomycin C | Sigma | #M4287 | 10 µg/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50 µg/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter | Corning | #430513 | 0.2 μm |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608 (2012).
- Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
- Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
- Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
- Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
- Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
- Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
- Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
- Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
- Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192 (2013).
- Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
- Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
- Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
- Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
- Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
- Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
- Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
- Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).
