Summary
Denne protokollen gir en fremgangsmåte for innsamling av muse-embryonale stamceller (Mesc) -conditioned medium (Mesc-CM) avledet fra serum (føtalt bovint serum, FBS) - og mater (mus embryonale fibroblaster, MEFs) -fri forhold for en celle -gratis tilnærming. Det kan være aktuelt for behandling av aldring og aldring-assosierte sykdommer.
Introduction
Målet med denne protokollen er å samle mus embryonale stamceller (Mesc) -conditioned medium (Mesc-CM) fra serum-og mater frie dyrkningsforhold og for å karakterisere sine biologiske funksjoner.
Generelt, embryonale stamceller (ESCS) har et stort potensiale for regenerativ medisin og celleterapi på grunn av deres pluripotency og evne til selvfornyelse 1-3. Imidlertid er direkte transplantasjon av stamceller har flere begrensninger, for eksempel immunavstøtning og tumordannelse 4,5. Derfor kan en celle-fri tilnærming gir en alternativ behandlingsstrategi for regenerativ medisin og aldring intervensjoner 6,7.
Senescence blir sett på som en mobil motstykke til aldring av vev og organer, preget av en permanent tilstand av vekst arrest, endret cellefysiologi og atferd. Aldring er den viktigste risikofaktor for utbredte sykdommer, inkludert kreft, hjerte- og karsykdommer, type 2 diabetes, og neurodegeneration 8. En av de åpenbare karakteristikkene av aldring er nedgangen i den regenerative potensialet i vev, som er forårsaket av stamcelle aldring og utmattelse 9. Mange betydelige studier har vist farmakologiske molekyler, slik som rapamycin 9, resveratrol 10, og metformin 11, og blodbårne systemiske faktorer, nemlig GDF11 12, som har evnen til å gjennomgående forsinke aldring og forlenge levetiden.
I denne studien har Mesc-CM blitt høstet uten serum (føtalt bovint serum, FBS) og mater (mus embryonale fibroblaster, MEFs) lag for å utelukke forurensning av serumfaktorer og sekretoriske faktorer fra MEFs. Disse forholdene er tillatt for en serum-og mater fritt CM som dermed muliggjorde nøyaktig identifikasjon av Mesc-spesifikke sekretoriske faktorer.
Denne foreslåtte protokoll er svært effektiv, forholdsvis kostnadseffektiv og lettå operere. Denne teknikken gir innsikt i den karakteriseringen av Mesc-avledet oppløselige faktorer som kan mediere en anti-senescens virkning, som kan anvendes for utvikling av en sikker og potensielt fordelaktige cellefritt terapeutisk tilnærming mot intervensjoner for aldring-assosierte sykdommer og andre regenerative behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: En skjematisk av serum-og mater fritt CM samling protokollen er vist i figur 1.
1. Materialer (Utarbeidelse av MEFs, Medium, plater og løsninger)
- Forbered 500 ml medium til kultur de MEFs. Supplement Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 10% FBS (ESC kvalitet), 50 enheter / ml penicillin og 50 mg / ml streptomycin.
- Isolere MEFs fra embryoer etter en etablert rutine protokoll 13 og holde dem i MEF medium.
- Forbered 500 ml medium til kultur de mESCs. DMEM supplert med 15% FBS og 2 mM L-glutamin, 100 uM ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 100 uM β-merkaptoetanol, 100 enheter / ml leukemi-inhiberende faktor (LIF), 50 enheter / ml penicillin, og 50 mg / ml streptomycin.
- Fremstille gelatinerte platene (5 gelatinerte plater / 1 Mesc plate) ved å belegge 10 cm cellekulturskåler med 5 ml 0,1% gelatinoppløsning. Inkuber i minst 10 min ved romtemperatur.
- Forbered 500 ml Redusert Serum medium for serum-fri tilstand mESCs. Supplement Redusert Serum media med 1,2 g natrium-bikarbonat (pH 7,0). Filtrer gjennom et 0,2 mikrometer flaske-top filter.
- Fremstille den begynnende alderdom-assosierte β-galaktosidase (SA β-gal) farging løsning for påvisning av senescent celler: 1 mg / ml X-gal (oppløst i dimetylformamid, DMF), 40 mM sitronsyre / natriumfosfatbuffer (pH 6,0) , 5 mM kaliumferricyanid, 5 mM kaliumferrocyanid, 150 mM NaCl og 2 mM MgCl2 14.
FORSIKTIG: (Farlig) DMF er en giftig og etsende løsning. Bruk personlig verneutstyr (f.eks, nitril eller latex hansker, laboratoriefrakk, og briller) når løsningen håndtering. Bruk en avtrekkshette. - Forbered 500 ml medium til kultur menneskelige dermale fibroblaster (HDFs, NHDF-Ad-Der-fibroblast). Supplere DMEM med 10% FBS og 100 enheter / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin.
MERK: Utfør alle trinnene i en cellekultur biologisk sikkerhet hette.
- Behandle MEFs med 20 ml MEF medium inneholdende 10 ug / ml mitomycin C i en 15 cm cellekulturskål. Inkuber i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Aspirer medium fra MEFs. Vask cellene med PBS tre ganger. Tilsett 3 ml trypsin-EDTA (TE, 1x) og inkuberes i 3 minutter ved 37 ° C og 5% CO2. Etter 3 min, nøytralisere den TE med 6 ml av MEF medium og sentrifuger i 3 minutter ved 300 x g.
- Resuspender i 5 ml MEF medium. Bestemme celletallet i den resulterende cellesuspensjonen ved hjelp av trypan blått-farging og et hemocytometer. Plate inaktiv MEFs (mater) ved en tetthet på 2 x 10 6 celler pr 10 cm cellekulturskål i MEF medium. Inkuber i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Bytt MEF medium med Mesc medium 24 timer etter plating materen (påneste dag).
- Plate de mESCs (G4 F1 hybrid ES celle) ved en tetthet på 2 x 10 6 celler på materen med Mesc medium. Inkuber i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
MERK: anti-aging effekt av Mesc-CM er sannsynlig sterkere når lavere passeringsnummer mESCs brukes 15-17. Vi kjøpte en G4 Mesc linje fra Dr. Andras Nagy i Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Canada. - Holde cellene ved en forholdsvis høy tetthet og passasjen ved en 70-80% sub-konfluent tilstand. Erstatt medium med frisk Mesc medium daglig.
3. Innsamling av serum-og mater-frie kondisjonerte mediet (Figur 1B og 2B)
MERK: Utfør alle trinnene i en cellekultur biologisk sikkerhet hette.
- Skyll Mesc plate med 5 ml PBS. Tilsett 1 ml TE (2,5 ganger) og inkuberes i 3 minutter ved 37 ° C og 5% CO2. Etter 3 min, nøytralisere TE med 2 ml Mesc medium og sentrifuger i 3 minutter ved 300 x g.
- Resuspender i 5 ml Mesc medium og platen 1 ml i hvert gelatin-belagte kulturskål (5 gelatinerte plater / 1 Mesc plate) i Mesc medium. Kultur ved 37 ° C og 5% CO2 inntil 80-85% konfluens er nådd.
- Vask mESCs med tilstrekkelig PBS for å dekke cellene (8 ml per 10 cm plate) i 10 minutter per vask, for totalt tre vaskinger. Inkuber i redusert serummedium i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
MERK: Vaske trinnet er viktig for å hindre FBS forurensning. Det er viktig å følge inkubasjonstiden 18,19. - Samle Mesc-CM inn i et 50 ml konisk rør og sentrifuger i 20 minutter ved 2500 x g. Samle den overliggende oppløsning (CM) etter sentrifugering. Filtrer gjennom et 0,2 mikrometer flaske-top filter.
4. Effekter av Mouse Embryonic Stem Cell kondisjonerte Medium (Mesc-CM)
MERK: Effekten av Mesc-CM ble validert av flere metoder, for eksempelSA β-gal-analysen, cellesyklusanalyse, og QRT-PCR.
- SA β-gal-analysen (figur 3A)
- Seed HDFs ved en tetthet på 2 x 10 4 celler pr brønn i 6-brønners plater i medium HDF. Inkuber over natten ved 37 ° C og 5% CO2.
- Etter en overnatting inkubasjon, kast halvparten av HDF medium og tilsett Mesc-CM og kontroll medium. Inkuber i 72 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Kontrollmediet er avledet fra serumfritt medium (redusert Serum Media) i en gelatin-belagt fatet i fravær av mESCs.
- Vask cellene med PBS tilstrekkelig for å dekke cellene (2 ml per seks-brønns plate) i 30 sekunder per vask, for en total av to vaskinger. Legg 3,7% paraformaldehyde (PFA) for fiksering. Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
FORSIKTIG: (Farlig) Paraformaldehyde er en giftig og etsende løsning. Bruk personlig verneutstyr (f.eks, nitril eller latex hansker, laboratoriefrakk, og briller) ved håndtering av løsningen.Bruk en avtrekkshette. - Aspirer fikseringsløsning. Vask de fikserte celler med PBS to ganger, som beskrevet i trinn 4.1.3.
- Tilsett SA β-gal-farging oppløsning (1-2 ml per brønn i en 6-brønn plate). Inkuber i 17,5 timer ved 37 ° C.
MERK: Det er ikke inkuberes i en CO 2 inkubator. - Aspirer SA β-gal-farging løsning og vaske cellene med PBS to ganger, som beskrevet i trinn 4.1.3.
- Tilsett Eosin løsning for kontra farging. Inkuber i 5 min ved romtemperatur. Vask cellene to ganger med PBS, som beskrevet i trinn 4.1.3.
- Bilde cellene ved 100X forstørrelse ved hjelp av et lysmikroskop og ta bilder med et vedlagt digitalkamera for senere analyse.
NB: Det totale antall celler kan telles på en blind måte, og prosentandelen av SA β-gal-positive blå celler kan beregnes.
- Cell Cycle Analysis (figur 3B)
- Seed HDFs ved en tetthet på8 x 10 4 celler per brønn i en 6 cm cellekultur rett i HDF medium. Inkuber over natten ved 37 ° C og 5% CO2.
- Etter en overnatting inkubasjon, kast halvparten av HDF medium og tilsett Mesc-CM og kontroll medium. Inkuber i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Trypsineres cellene, som beskrevet i trinn 3.1, og sentrifuger i 5 minutter ved 300 x g. Vask cellene med kald PBS-løsning (PBS med 0,5 mM CaCl2 og 2% FBS, 1 ml per 1,5 ml rør) to ganger og sentrifuger i 3 min ved 2500 x g. Resuspender i 100 ul kald PBS-oppløsning.
- Fiksere cellene ved å slippe 200 ul kald etanol under virvling. Oppbevar ved 4 ° C i minst 1 time.
- Vask cellene med kald PBS-oppløsning to ganger, som beskrevet i trinn 4.2.3.
- Resuspender cellene i 250 pl natriumcitrat-buffer (1,12%, pH 8,5) inneholdende 50 pg / ml RNase. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
- Tilsett 250 ul av natriumcitratbuffer inneholdende 50 ug / ml propidiumjodid. Inkuber i 20 minutter ved romtemperatur.
- Mål 10.000 celler i hver prøve ved hjelp av flowcytometri 20.
- QRT-PCR (figur 3C)
- Seed HDFs og legge Mesc-CM, som beskrevet i trinn 4.1.1 og 4.1.2.
- Isolere total RNA fra de HDFs ved hjelp av en RNA-ekstraksjon kit ifølge produsentens protokoll. Kvantifisere hentet total RNA ved hjelp av et spektrofotometer 21.
- Syntetisere cDNA ved tilsetning av 1 ug av det totale RNA i en 20 ul reaksjonsblanding inneholdende oligo (dT) primere og M-MLV revers transkriptase, i henhold til produsentens protokoll 20.
- Mål forsterkningen av cDNA med en real-time PCR maskin, ved hjelp Grønn PCR Master Mix og spesifikke genet primere (Supplement Tabell 1). Normaliserer dataene med GAPDH uttrykk. Bruk følgende PCR-protokoll: innledende denaturation i 10 minutter ved 95 ° C; 45 sykluser for 15 sek ved 95 ° C, 20 sek ved 55 ° C og 35 sek ved 72 ° C; og smeltekurven trinnet i 15 sekunder ved 95 ° C, 1 minutt ved 60 ° C, 30 sek ved 95 ° C, og 5 sek ved 60 ° C 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Opprinnelig er mESCs opprettholdes på en MEF mater i Mesc medium med FBS og andre kosttilskudd (figur 1A og 2A). CM ble samlet inn fra mESCs i Redusert Serum Media uten en mater lag, FBS, eller andre kosttilskudd (Tall 1B og 2B). Denne kulturen tilstanden tillater oss å samle Mesc spesifikke kondisjonert medium uten potensiell forurensning av faktorene fra materen, FBS, eller andre kosttilskudd. Kontrollmediet ble samlet opp under de samme dyrkningsbetingelser uten mESCs.
mESCs viser forskjellige morfologi mellom de to kulturmedia: i) normale Mesc dyrkningsbetingelser (figur 2A) og ii) serum-og mater-frie dyrkningsbetingelser (figur 2B). De Mesc koloniene vokste på en MEF lag og demonstrert en oval og skinnende utseende under normal Mesc kultur conditions (Figur 2A). Tvert imot, det mESCs i serum-og mater-frie dyrkningsbetingelser viste en utflatet og uregelmessig morfologi (figur 2B).
Den funksjonelle karakterisering av Mesc-CM ble oppnådd ved senescence-assosiert metoder, slik som SA β-gal-analysen (figur 3A), cellesyklusanalyse (figur 3B), og qPCR (figur 3C). Behandling av senescent HDFs med Mesc-CM redusert antall positive SA β-gal-positive celler, som er en indikator på celle senescens (figur 3A). Cellesyklusanalyse avslørte at Mesc-CM behandling dramatisk økt antall celler i S og G2 / M fase, mens det reduserte antallet celler i G 0 / G en fase (figur 3B). I tillegg vil redusert Mesc-CM behandling de senescence-forbundet genuttrykk nivåer (namely, p53, p21 og p16) og senescence-assosierte sekretorisk fenotype (SASP) ekspresjonsnivåer (IL-6).
Figur 1: Utarbeidelse og optimalisering av Mesc-CM. Eksperimentell strategi for utarbeidelse og optimalisering av serum-fri og mater fritt CM. (A) Normal Mesc kultur tilstand og (B) serum-og mater fritt Mesc-CM kultur tilstand. C: kontrollere medium uten FBS og MEF; CM: kondisjonert medium uten FBS og MEF. Modifisert med tillatelse fra Bae et al. 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Bright feltet imalderen mESCs. mESCs henhold til (A) normale forhold og (B) serum-og mater-frie forhold. Gule piler indikerer mater celle (MEFs) i normale Mesc dyrkningsforhold. Skala barer = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Karakterisering av anti-aldringseffekten av Mesc-CM. (A) SA β-gal-aktivitet farving og prosenten av SA β-gal-positive celler. (B) Celle syklus analyse ved flowcytometri. (C) ekspresjon nivåer av senescence-assosierte genekspresjon nivåer (p53, p21, og P16) og begynnende alderdom-assosiert sekretorisk fenotype (SASP) ekspresjonsnivåer (IL-6) av QRT-PCR. Verdier er gjennomsnitt ± SD. Tallene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Statistisk signifikante forskjeller mellom gruppene ble identifisert ved enveis ANOVA og Tukey post-hoc test. * P <0,05, ** p <0,01. Y = ikke-senescent celler; S: senescent celler; C: kontrollere medium uten FBS og MEF; CM: kondisjonert medium uten FBS og MEF. Skala barer = 10 mikrometer. Modifisert med tillatelse fra Bae et al. 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For en vellykket samling av serum-og mater fritt Mesc-CM, bør følgende forslag tas i betraktning. Den mest kritiske faktoren er å bruke tidlige passasje mESCs for innsamling av Mesc-CM. Tidligere har det vist seg at tidlig passasje Mesc-CM har bedre anti-aging effekt sammenlignet med senere passasje mESCs. Passasjen antall mESCs har blitt rapportert å påvirke deres utviklingspotensial 16 og pluripotency 17.
Selv om ytterligere forskning er nødvendig for å analysere de spesifikke faktorer av Mesc secretome, som induserer anti-senescence effekter, kan vi konkludere med at tiden Mesc-CM er tilstrekkelig for å redusere begynnende alderdom på cellenivå.
Identifiseringen av Mesc spesifikke sekretoriske faktorer som hjemfaller senescent celler tilbake til unge celler vil være avgjørende for fremtidige studier. For høy kvalitet analyser av de sekretoriske molekyler, slik som antistoff-matrisen 15 end secretome analyse, er vasketrinnet i løpet av medium innsamlingsprosessen (trinn 3) kritisk. Dersom vasketrinnet ikke er riktig utført, vil de sekretoriske molekylene bli forurenset av serum (FBS) komponenter 18,19.
Den serum-og mater fritt inkubasjonstid (24 timer) er svært viktig i medium innsamlingsprosessen (trinn 3), som jo lengre inkubasjonstid (i løpet av 24 timer) kan øke muligheten for celle autolyse eller apoptose av sult under serum - og feeder- utarmet forhold 18,19. Den normale ESC kulturen tilstand krever en matesjikt for langvarig dyrkning av udifferensierte celler, som mater utskiller et stort antall molekyler 22. Den gelatin-belagt plate forhindrer muligheten for forurensning fra feeder-celler.
Den Mesc-CM, høstet fra serum-og mater frie dyrkningsforhold, har en anti-aldrings evne i senescent HDFs. Anti-senescence effekter av mESC-CM er blitt demonstrert av senescence-assosiert flere avlesninger, for eksempel SA β-gal-aktivitet; en forbedret proliferativ potensial (cellesyklusanalyse); og redusert p53, p21, p16, og IL-6 genuttrykk nivåer (figur 3A - 3C).
Når humane primære celler behandles med Mesc-CM, ville xeno-forurensning være et kritisk problem for klinisk anvendelse. Derfor vil en undersøkelse av de sekretoriske faktorer fra humane ESCs eller iPSCs være en viktig fremtidige studier for den kliniske anvendelse av CM avledet fra humane opprinnelse. Konvergens av et cellefritt tilnærming basert på et stamceller og en anti-senescens Studien forventes å utvide den nåværende forståelse av senescence-assosierte sykdommer, noe som resulterer i større innsikt i forbedringer på terapeutiske tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Basic Science Research Program (2013R1A1A2060930) og Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) gjennom National Research Foundation of Korea (NRF), finansiert av departementet for vitenskap, IKT, og fremtidig planlegging. Denne forskningen er også støttet av en start-up Drifts Grant fra The Hospital for Sick Children (HK Sung). Vi vil gjerne takke Laura Barwell og Sarah JS Kim for deres gode hjelp i å endre denne manuskript og Dr. Andras Nagy for å gi G4 Mesc linje.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50 units/ml penicillin and 50 mg/ml streptomycin |
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2 mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100 µM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100 µM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100 units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1 mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5 mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5 mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150 mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 mM |
| Mitomycin C | Sigma | #M4287 | 10 µg/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50 µg/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter | Corning | #430513 | 0.2 μm |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608 (2012).
- Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
- Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
- Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
- Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
- Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
- Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
- Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
- Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
- Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192 (2013).
- Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
- Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
- Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
- Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
- Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
- Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
- Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
- Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).
