Summary
Detta protokoll ger en metod för insamling av mus embryonala stamceller (Mesc) -konditionerat medium (Mesc-CM) härstammar från serum (fetalt bovint serum, FBS) - och matar (mus embryonala fibroblaster, MEF) -fria förutsättningar för en cell -fri tillvägagångssätt. Det kan vara tillämplig för behandling av åldrande och åldersassocierade sjukdomar.
Introduction
Målet med detta protokoll är att samla mus embryonala stamceller (Mesc) -konditionerat medium (Mesc-CM) från serum-och matarfria odlingsbetingelser och för att karakterisera dess biologiska funktioner.
I allmänhet, embryonala stamceller (ESC) har stor potential för regenerativ medicin och cellterapi på grund av deras pluripotens och förmåga till självförnyelse 1-3. Emellertid den direkta transplantation av stamceller har flera begränsningar, såsom immunavstötning och tumörbildning 4,5. Därför kan ett cellfritt förhållningssätt ger en alternativ terapeutisk strategi för regenerativ medicin och åldrande insatser 6,7.
Åldrande ses som en cellulär motsvarighet till den åldrande vävnader och organ, som kännetecknas av ett permanent tillstånd av tillväxthämning, förändrad cellfysiologi, och beteenden. Åldrande är den viktigaste riskfaktorn för sjukdomarna inklusive cancer, hjärt- och kärlsjukdomar, tYP 2-diabetes, och neurodegeneration 8. En av de uppenbara egenskaperna hos åldrande är nedgången i regenerativ potential vävnader, som orsakas av stamcells åldrande och utmattning 9. Många betydande studier har visat farmakologiska molekyler, såsom rapamycin 9, resveratrol 10, och metformin 11, och blodburna systemiska faktorer, nämligen GDF11 12, som har förmågan att konsekvent fördröja åldrande och förlänga livslängden.
I den aktuella studien har Mesc-CM skördats utan serum (fetalt bovinserum, FBS) och matare (mus embryonala fibroblaster, MEF) skikt för att utesluta kontaminering av serumfaktorer och sekretoriska faktorer från MEF. Dessa villkor är tillåtna för en serum-och matarfria CM som därmed möjliggjorde korrekt identifiering av Mesc specifika sekretoriska faktorer.
Denna föreslagna protokoll är mycket effektiv, relativt kostnadseffektiv och lättatt driva. Denna teknik ger insikter i karakterisering av Mesc härledda lösliga faktorer som kan förmedla en anti-åldrande effekt, som kan användas för att utveckla en säker och potentiellt fördelaktiga cellfritt terapeutiskt tillvägagångssätt mot insatser för äldre relaterade sjukdomar och andra regenerativ behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ANMÄRKNING: En schematisk bild av serum- och feeder-fria CM samling protokoll visas i figur 1.
1. Material (Beredning av MEF, Medium, tallrikar, och lösningar)
- Bered 500 ml medium att odla MEF. Komplettera Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 10% FBS (ESC kvalitet), 50 enheter / ml penicillin och 50 mg / ml streptomycin.
- Isolera MEF från embryon efter en etablerad rutin protokoll 13 och hålla dem i MEF medium.
- Bered 500 ml medium att odla mESCs. DMEM kompletterad med 15% FBS och 2 mM L-glutamin, 100 | jM icke-essentiella aminosyror (NEAA), 100 ^ M β-merkaptoetanol, 100 enheter / ml leukemihämmande faktor (LIF), 50 enheter / ml penicillin, och 50 mg / ml streptomycin.
- Förbered gelatineplattorna (5 gelatine plattor / 1 Mesc platta) genom att belägga 10 cm cellodlingsskålar med 5 ml 0,1% gelatinlösning. Inkubera under åtminstone 10 min vid rumstemperatur.
- Förbereda 500 ml Reducerat Serum Medium för ett serumfritt tillstånd hos mESCs. Supplement Reducerat Serum Media med 1,2 g natriumvätekarbonat (pH 7,0). Filtrera genom ett 0,2 um flasktoppfiltret.
- Förbered senescens-associerade β-galaktosidas (SA β-gal) färgning lösning för detektion av åldrande celler: 1 mg / ml X-gal (löst i dimetylformamid, DMF), 40 mM citronsyra / natriumfosfatbuffert (pH 6,0) , 5 mM kaliumferricyanid, 5 mM kaliumferrocyanid, 150 mM NaCl och 2 mM MgCl2 14.
VARNING: (farliga) DMF är en giftig och frätande lösning. Bär personlig skyddsutrustning (t.ex., nitril eller latexhandskar, en labbrock och skyddsglasögon) vid hantering av lösningen. Använd ett dragskåp. - Bered 500 ml medium till kultur humana hudfibroblaster (HDFS, NHDF-Ad-Der-Fibroblast). Komplettera DMEM med 10% FBS och 100 enheter / ml penicillin och 100 mg / ml streptomycin.
OBS: Genomför alla steg i en cellkultur biologisk säkerhet huva.
- Behandla MEF med 20 ml MEF-medium innehållande 10 | j, g / ml av mitomycin C i en 15 cm cellodlingsskål. Inkubera i 2 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Aspirera mediet från MEF. Tvätta cellerna med PBS tre gånger. Tillsätt 3 ml trypsin-EDTA (TE, 1 x) och inkubera under 3 minuter vid 37 ° C och 5% CO2. Efter 3 min, neutralisera TE med 6 ml MEF medium och centrifugera i 3 min vid 300 x g.
- Resuspendera i 5 ml MEF medium. Bestämma antalet celler i den resulterande cellsuspensionen med användning av trypanblått-färgning och en hemocytometer. Plattinaktive MEF (feeder) vid en densitet av 2 x 10 6 celler per 10-cm cellkulturskål i MEF medium. Inkubera i 24 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Byt ut MEF medium med Mesc mediet 24 h efter plätering mataren (pånästa dag).
- Plate de mESCs (G4 F1 hybrid ES-cell) vid en densitet av 2 x 10 6 celler på mataren med Mesc medium. Inkubera i 48 h vid 37 ° C och 5% CO2.
OBS: anti-aging effekten av Mesc-CM är sannolikt starkare när lägre passagenummer mESCs används 15-17. Vi förvärvade en G4 Mesc linje från Dr Andras Nagy i Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Kanada. - Hålla cellerna vid en relativt hög densitet och passage vid en 70-80% sub-konfluent tillstånd. Byt medium med färskt Mesc medel dagligen.
3. Insamling av Serum och Feeder fritt konditionerat medium (Figur 1B och 2B)
OBS: Genomför alla steg i en cellkultur biologisk säkerhet huva.
- Skölj Mesc plattan med 5 ml PBS. Tillsätt 1 ml TE (2,5x) och inkubera under 3 minuter vid 37 ° C och 5% CO2. Efter 3 min, neutralisera TE med 2 ml Mesc medium och centrifugera under 3 min vid 300 x g.
- Resuspendera i 5 ml Mesc medium och plattan 1 ml i varje gelatinbelagda odlingsskål (5 gelatinerade plattor / 1 Mesc platta) i Mesc medium. Odling vid 37 ° C och 5% CO2 tills 80-85% konfluens uppnåtts.
- Tvätta mESCs med tillräcklig PBS för att täcka cellerna (8 ml per 10 cm platta) under 10 min per tvätt, för totalt tre tvättar. Inkubera i reducerat serummedium under 24 timmar vid 37 ° C och 5% CO2.
OBS: Tvättsteget är viktigt att förhindra FBS förorening. Det är viktigt att följa inkubationstiden 18,19. - Samla Mesc-CM i en 50 ml koniskt rör och centrifugera i 20 min vid 2500 x g. Samla in supernatantlösningen (CM) efter centrifugering. Filtrera genom ett 0,2 um flasktoppfiltret.
4. Effekter av Mouse embryonala stamceller konditionerade medium (Mesc-CM)
OBS: Effekterna av Mesc-CM validerades genom flera metoder, såsomSA β-gal-analysen, cellcykelanalys och QRT-PCR.
- SA β-gal-analys (figur 3A)
- Utsädes HDFS vid en densitet av 2 x 10 4 celler per brunn i 6-brunnsplattor i HDF medium. Inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
- Efter en inkubation över natten, kassera hälften av HDF-medium och tillsätt Mesc-CM och kontrollmedium. Inkubera i 72 h vid 37 ° C och 5% CO2. Kontrollmedium är härledd från serumfritt medium (Reduced Serum Media) i en gelatinbelagda skålen i frånvaro av mESCs.
- Tvätta cellerna med tillräcklig PBS för att täcka cellerna (2 ml per 6-brunnar) för 30 sek per tvätt, för totalt två tvättar. Lägg 3,7% paraformaldehyd (PFA) för fixering. Inkubera under 5 min vid rumstemperatur.
VARNING: (farliga) Paraformaldehyd är en giftig och frätande lösning. Bär personlig skyddsutrustning (t.ex., nitril eller latexhandskar, en labbrock och skyddsglasögon) vid hantering av lösningen.Använd ett dragskåp. - Aspirera fixeringslösning. Tvätta de fixerade cellerna med PBS två gånger, såsom beskrivs i steg 4.1.3.
- Tillsätt SA β-gal-färgningslösning (1-2 ml per brunn i en 6-brunnsplatta). Inkubera under 17,5 h vid 37 ° C.
OBS: Det är att inte inkuberas i en CO2-inkubator. - Aspirera SA β-gal-färgningslösning och tvätta cellerna med PBS två gånger, såsom beskrivs i steg 4.1.3.
- Tillsätt Eosin lösning för kontra färgning. Inkubera under 5 min vid rumstemperatur. Tvätta cellerna med PBS två gånger, såsom beskrivs i steg 4.1.3.
- Bild celler vid 100 gångers förstoring med hjälp av ett ljusmikroskop och ta bilder med hjälp av en bifogad digital kamera för efterföljande analys.
OBS: Det totala antalet celler kan räknas i en blind sätt och den procentuella andelen av SA β-gal-positiva blåa celler kan beräknas.
- Cell Cycle Analysis (figur 3B)
- Utsädes HDFS vid en densitet av8 x 10 4 celler per brunn i en 6 cm cellodlingsskål i HDF medium. Inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
- Efter en inkubation över natten, kassera hälften av HDF-medium och tillsätt Mesc-CM och kontrollmedium. Inkubera i 24 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Trypsinize cellerna, såsom beskrivs steg i 3,1, och centrifugera under 5 min vid 300 x g. Tvätta cellerna med kall PBS-lösning (PBS med 0,5 mM CaCl2 och 2% FBS, 1 ml per 1,5 ml rör) två gånger och centrifugera i 3 min vid 2500 x g. Återsuspendera i 100 pl kall PBS-lösning.
- Fixera cellerna genom att släppa 200 pl kall etanol under virvling. Lagra vid 4 ° C under minst en timme.
- Tvätta cellerna med kall PBS-lösning två gånger, såsom beskrivs i steg 4.2.3.
- Resuspendera cellerna i 250 | il av natriumcitratbuffert (1,12%, pH 8,5) innehållande 50 ^ g / ml RNas. Inkubera i 30 min vid 37 ° C.
- Tillsätt 250 pl av natriumcitratbuffert innehållande 50 ^ g / ml propidiumjodid. Inkubera i 20 min vid rumstemperatur.
- Mät 10.000 celler i varje prov med användning av flödescytometri 20.
- QRT-PCR (figur 3C)
- Seed HDFS och lägga Mesc-CM, som beskrivs i steg 4.1.1 och 4.1.2.
- Isolera totalt RNA från de HDFS med användning av en RNA-extraktion kit enligt tillverkarens protokoll. Kvantifiera det extraherade total-RNA med hjälp av en spektrofotometer 21.
- Syntetisera cDNA genom tillsats av 1 | j, g av den totala RNA till en 20 | il reaktionsblandning innehållande oligo (dT) primers och M-MLV omvänt transkriptas, enligt tillverkarens protokoll 20.
- Mät förstärkning av cDNA med en realtids-PCR maskin med grön PCR Master Mix och specifik gen primers (Tillägg Tabell 1). Normalisera data med GAPDH uttryck. Använd följande PCR-protokoll: initial denaturering i 10 min vid 95 ° C; 45 cykler för 15 sek vid 95 ° C, 20 sek vid 55 ° C, och 35 sek vid 72 ° C; och smältkurvan scen för 15 sek vid 95 ° C, 1 min vid 60 ° C, 30 sek vid 95 ° C och 5 s vid 60 ° C 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ursprungligen är mESCs hölls på en MEF matare i Mesc medium med FBS och andra kosttillskott (figurerna 1A och 2A). CM samlades in från mESCs i minskade serum Media utan ett matarskikt, FBS, eller andra tillskott (figurerna 1B och 2B). Denna kultur tillstånd tillåter oss att samla Mesc specifika konditionerat medium utan potentiell förorening av faktorerna från mataren, FBS, eller andra kosttillskott. Kontrollmediet uppsamlades under samma odlingsbetingelser, utan mESCs.
mESCs visar olika morfologier mellan två odlingsmedier: i) normala Mesc odlingsbetingelser (fig 2A) och ii) serum- och feeder-fria odlingsbetingelser (figur 2b). De Mesc kolonier växte på ett MEF lager och visade en oval och glänsande utseende under normala Mesc kultur cILLKOR (Figur 2A). Tvärtom de mESCs i serum- och feeder-fria odlingsbetingelser visade en utplattad och oregelbunden morfologi (Figur 2B).
Den funktionella karakteriseringen av Mesc-CM uppnåddes genom hudåldrande-associerade metoder, såsom SA β-gal-analysen (figur 3A), cellcykelanalys (figur 3B), och qPCR (figur 3C). Behandling av åldrande HDFS med Mesc-CM minskade antalet positiva SA β-gal-positiva celler, vilket är en indikator på cellulärt åldrande (figur 3A). Cellcykelanalys avslöjade att Mesc-CM behandling dramatiskt ökat antalet celler i S och G2 / M-fas, medan den reducerade antalet celler i G 0 / G en fas (figur 3B). Dessutom minskade Mesc-CM behandling av hudåldrande associerade genuttryck nivåer (nAmely, p53, p21, och P16) och hudåldrande associerade sekretorisk fenotyp (SASP) expressionsnivåer (IL-6).
Figur 1: Förberedelse och optimering av Mesc-CM. Experimentell strategi för framställning och optimering av serumfritt och feeder-fri CM. (A) Normal Mesc odlingsbetingelse och (B) serum- och feeder-fria Mesc-CM odlingsbetingelse. C: kontrollmedium utan FBS och MEF; CM: konditionerat medium utan FBS och MEF. Modifierad med tillstånd från Bae et al. 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bright fält imåldrarna mESCs. mESCs enligt (A) normala förhållanden och (B) serum-och matarfria förhållanden. Gula pilar indikerar matarcell (MEF) i normala Mesc odlingsbetingelser. Skalstrecken = 100 ^ m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Karakterisering av anti-aging effekt av Mesc-CM. (A) SA β-gal-aktivitet färgning och procentandelen SA β-gal-positiva celler. (B) Cellcykelanalys medelst flödescytometri. (C) Expressionsnivåer av hudåldrande associerade genen expressionsnivåer (p53, p21 och p16) och senescens-associerade sekretorisk fenotyp (SASP) expressionsnivåer (IL-6) genom QRT-PCR. Värden är medelvärde ± SD. Figurer är representativa för tre oberoende experiment. Statistiskt signifikanta skillnader mellan grupperna identifierades genom en-vägs ANOVA och Tukeys post hoc-test. * P <0,05, ** p <0,01. Y = icke-åldrande celler; S: åldrande celler; C: kontrollmedium utan FBS och MEF; CM: konditionerat medium utan FBS och MEF. Skalstrecken = 10 | im. Modifierad med tillstånd från Bae et al. 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För en framgångsrik insamling av serum-och feeder-fri Mesc-CM, bör följande förslag beaktas. Den mest kritiska faktorn är att använda tidig passage mESCs för insamling av Mesc-CM. Tidigare har det visat sig att en tidig passage Mesc-CM har bättre anti-aging effekter jämfört med slutet av passage mESCs. Passagen antalet mESCs har rapporterats påverka deras utvecklingspotential 16 och pluripotens 17.
Medan ytterligare forskning behövs för att analysera de specifika faktorer i Mesc secretome, som inducerar anti-hudåldrande effekter, kan vi nu konstatera att Mesc-CM är tillräcklig för att minska åldrande på cellnivå.
Identifieringen av Mesc specifika sekretoriska faktorer som återgår åldrande celler till unga celler kommer att vara avgörande för framtida studier. För högkvalitativa analyser av de sekretoriska molekyler, såsom antikroppar array 15 ettd secretome analys, är tvättsteget under medel processen samling (steg 3) kritisk. Om tvättsteget inte genomförs korrekt, kommer sekretoriska molekyler förorenas av serum (FBS) komponenter 18,19.
Det serum-och matarfria inkubationstid (24 timmar) är mycket viktigt på medellång processen samling (steg 3), som längre inkubationstiden (över 24 timmar) kan öka risken för cell autolys eller apoptos av svält under serum - och feeder- utarmade förhållanden 18,19. Den normala ESC kulturen tillstånd kräver ett matarskikt för långvarig odling av odifferentierade celler, som mataren utsöndrar ett stort antal molekyler 22. Gelatin-belagda plattan förhindrar risken för föroreningar från matarceller.
Den Mesc-CM, skördas från serum-och feeder-fria odlingsbetingelser, har en anti-senescens förmåga i åldrande HDFS. Anti-hudåldrande effekterna av mESC-CM har visats genom hudåldrande associerade flera avläsning, såsom SA β-gal-aktivitet; en förbättrad proliferativ potential (cellcykelanalys); och reducerad p53, p21, p16, och IL-6-genen expressionsnivåer (Figur 3A - 3C).
När humana primära celler behandlas med Mesc-CM skulle xeno kontaminering vara en viktig fråga för klinisk tillämpning. Därför skulle en undersökning av de sekretoriska faktorer från mänskliga ekonomiska och sociala råd eller iPSCs vara en viktig framtidsstudie för den kliniska användningen av CM som härrör från människans ursprung. Konvergensen av ett cellfritt strategi som bygger på en stamceller och en anti-åldrande studie förväntas öka den nuvarande förståelsen av hudåldrande associerade sjukdomar, vilket resulterar i större insikt i förbättringar av terapeutiska metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Basic Science Research Program (2013R1A1A2060930) och Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) genom National Research Foundation of Korea (NRF), som finansieras av ministeriet för vetenskap, IT och framtida planering. Denna forskning stöds också av en start-up driftsbidrag från sjukhuset för sjuka barn (HK Sung). Vi vill tacka Laura Barwell och Sarah JS Kim för deras utmärkta hjälp att redigera detta manuskript och Dr Andras Nagy för att tillhandahålla G4 Mesc linje.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50 units/ml penicillin and 50 mg/ml streptomycin |
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2 mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100 µM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100 µM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100 units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1 mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5 mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5 mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150 mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 mM |
| Mitomycin C | Sigma | #M4287 | 10 µg/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50 µg/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter | Corning | #430513 | 0.2 μm |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608 (2012).
- Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
- Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
- Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
- Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
- Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
- Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
- Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
- Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
- Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192 (2013).
- Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
- Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
- Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
- Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
- Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
- Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
- Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
- Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).
