Summary
Questo protocollo fornisce un metodo per la raccolta di cellule staminali embrionali di topo (Mesc) medio -conditioned (Mesc-CM) derivato dal siero (siero fetale bovino, FBS) - e di alimentazione (fibroblasti embrionali di topo, MEF) Condizioni senza glutine per una cella approccio-free. Può essere applicabile per il trattamento di invecchiamento e malattie associate invecchiamento.
Introduction
L'obiettivo di questo protocollo è quello di raccogliere il mouse sulle cellule staminali embrionali (Mesc) medio -conditioned (Mesc-CM) da condizioni di coltura di siero e privo di alimentazione e per caratterizzare le sue funzioni biologiche.
In generale, le cellule staminali embrionali (ESC) hanno un grande potenziale per la medicina rigenerativa e terapia cellulare per la loro pluripotenza e la capacità di auto-rinnovamento 1-3. Tuttavia, il trapianto diretto di cellule staminali ha diverse limitazioni, come rigetto immunitario e la formazione del tumore 4,5. Pertanto, un approccio libero-cella può fornire una strategia terapeutica alternativa per la medicina rigenerativa e invecchiamento interventi 6,7.
Senescenza è visto come controparte cellulare per l'invecchiamento dei tessuti e organi, caratterizzato da uno stato permanente di arresto della crescita, fisiologia cellulare alterata e comportamenti. L'invecchiamento è il principale fattore di rischio per le malattie prevalenti tra cui il cancro, le malattie cardiovascolari, tipo diabete 2, e neurodegenerazione 8. Una delle caratteristiche evidenti di invecchiamento è la diminuzione del potenziale rigenerativo dei tessuti, che è causato da invecchiamento delle cellule staminali e la stanchezza 9. Molti studi hanno dimostrato significativi molecole farmacologiche, come la rapamicina 9, il resveratrolo 10, e metformina 11, e fattori sistemici per via ematica, cioè GDF11 12, che hanno la capacità di ritardare l'invecchiamento in modo coerente ed estendere durata della vita.
Nel presente studio, Mesc-CM è stato raccolto senza siero strati (siero fetale bovino, FBS) e l'alimentatore (fibroblasti embrionali di topo, MEF) per escludere la contaminazione di fattori di siero e fattori di secrezione dal MEF. Queste condizioni consentite per un CM di siero e privo di alimentatore che di conseguenza ha permesso l'identificazione accurata di Mesc-specifici fattori secretoria.
Questo protocollo proposto è altamente efficiente, relativamente conveniente e facileoperare. Questa tecnica fornisce intuizioni la caratterizzazione di fattori solubili Mesc-derivati che possono mediare un effetto anti-senescenza, che può essere usato per lo sviluppo di un approccio terapeutico privo di cellule sicuro e potenzialmente vantaggiosa verso interventi per le malattie invecchiamento associate e altre rigenerativa trattamenti.
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Protocol
NOTA: Uno schema del sierica- e protocollo di raccolta CM-free alimentatore è mostrato in Figura 1.
1. Materiali (Preparazione del MEF, Medium, piatti, e Solutions)
- Preparare 500 ml di terreno alla cultura i MEF. Supplemento Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) con 10% FBS (ESC qualità), 50 unità / ml di penicillina, 50 mg / ml di streptomicina.
- Isolare MEF da embrioni a seguito di un protocollo di routine consolidata 13 e mantenerli in media MEF.
- Preparare 500 ml di terreno alla cultura i mESCs. DMEM è completato con 15% FBS e 2 mM L-glutammina, 100 mM aminoacidi non essenziali (NEAA), 100 mM β-mercaptoetanolo, 100 unità / ml fattore inibitorio della leucemia (LIF), 50 unità / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina.
- Preparare i piatti gelatinizzati (5 piastre gelatinizzati / 1 Mesc piastra) rivestendo 10 cm piatti di coltura di cellule con 5 ml di soluzione di gelatina 0,1%. Incubare per almeno 10 min a temperatura ambiente.
- Preparare 500 ml di siero ridotto media per una condizione senza siero di mESCs. Supplemento ridotto siero di media con 1,2 g di sodio bicarbonato (pH 7,0). Filtrare su filtro bottiglia-top 0,2 micron.
- Preparare la senescenza associata β-galattosidasi (SA β-gal) soluzione colorante per la rilevazione di cellule senescenti: 1 mg / ml di X-gal (sciolto in dimetilformammide, DMF), acido citrico 40 mM / tampone fosfato di sodio (pH 6,0) , 5 mM di potassio ferricianuro, 5 mM ferrocianuro di potassio, 150 mM NaCl, e 2 mM MgCl 2 14.
ATTENZIONE: (pericolosi) DMF è una soluzione tossico e corrosivo. Indossare indumenti di protezione individuale (guanti per esempio, nitrile o in lattice, un camice da laboratorio e occhiali) nel maneggiare soluzione. Utilizzare una cappa aspirante. - Preparare 500 ml di terreno alla cultura umana fibroblasti dermici (HDFS, NHDF-Ad-Der-fibroblasti). Supplemento DMEM con 10% FBS e 100 unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina.
NOTA: Eseguire tutte le fasi in una cappa di sicurezza biologica coltura cellulare.
- Trattare i MEF con 20 ml di terreno MEF contenente 10 ug / ml di mitomicina C in 15 centimetri piatto di coltura cellulare. Incubare per 2 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Aspirare il supporto dal MEF. Lavare le cellule con PBS per tre volte. Aggiungere 3 ml di tripsina-EDTA (TE, 1x) e incubare per 3 minuti a 37 ° C e 5% CO 2. Dopo 3 minuti, neutralizzare la TE con 6 ml di terreno MEF e centrifugare per 3 min a 300 x g.
- Risospendere in 5 ml di terreno MEF. Determinare il numero di cellule in sospensione cellulare risultante utilizzando trypan colorazione blu e un emocitometro. Piatto MEF inattivati (alimentazione) ad una densità di 2 x 10 6 cellule per 10 cm piatto di coltura di cellule in medium MEF. Incubare per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Sostituire il medium MEF con il mezzo Mesc 24 ore dopo la placcatura l'alimentatore (sullagiorno seguente).
- Piatto le mESCs (G4 ibrido F1 cellule ES) ad una densità di 2 x 10 6 cellule sull'alimentatore con mezzo MESC. Incubare per 48 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
NOTA: L'effetto anti-invecchiamento della Mesc-CM è probabile più forte quando il numero di passaggio inferiore mESCs vengono utilizzati 15-17. Abbiamo acquisito una linea G4 Mesc dal Dr. Andras Nagy in Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Canada. - Mantenere le cellule ad una densità relativamente elevata e il passaggio ad uno stato sub-confluenti 70-80%. Sostituire il supporto con il mezzo Mesc fresco tutti i giorni.
3. Raccolta di di siero e senza alimentatore mezzo condizionato (Figura 1B e 2B)
NOTA: Eseguire tutte le fasi in una cappa di sicurezza biologica coltura cellulare.
- Sciacquare la piastra Mesc con 5 ml di PBS. Aggiungere 1 ml di TE (2,5x) e incubare per 3 minuti a 37 ° C e 5% CO 2. Dopo 3 minuti, neutralizzare il TE con 2 ml di Mesc medium e centrifugare per 3 min a 300 x g.
- Risospendere in 5 ml di terreno Mesc e piastra di 1 ml in ciascuna di gelatina rivestite cultura piatto (5 piastre gelatinizzati / 1 Mesc piatto) in media Mesc. Coltura a 37 ° C e 5% CO 2 fino 80-85% di confluenza viene raggiunto.
- Lavare mESCs con sufficienti PBS a coprire le cellule (8 ml per 10 cm Piatto) per 10 minuti per lavaggio, per un totale di tre lavaggi. Incubare a ridotto siero media per 24 ore a 37 ° C e 5% di CO 2.
NOTA: La fase di lavaggio è importante per prevenire la contaminazione FBS. E 'importante seguire il tempo di incubazione 18,19. - Raccogliere Mesc-CM in un tubo da 50 ml e centrifugare per 20 minuti a 2500 x g. Raccogliere il surnatante (CM) dopo la centrifugazione. Filtrare su filtro bottiglia-top 0,2 micron.
4. Effetti staminali embrionali di topo-Cell condizionata Medium (Mesc-CM)
NOTA: Gli effetti della Mesc-CM sono stati convalidati da diversi metodi, come ad esempioSA test β-gal, analisi del ciclo cellulare, e qRT-PCR.
- SA β-gal Assay (Figura 3A)
- HDFs Seed ad una densità di 2 x 10 4 cellule per pozzetto in piastre da 6 pozzetti in terreno HDF. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% CO 2.
- A seguito di una notte di incubazione, scartare la metà del mezzo HDF e aggiungere Mesc-CM e mezzo di controllo. Incubare per 72 ore a 37 ° C e 5% CO 2. mezzo di controllo è derivato dal terreno privo di siero (Reduced Serum media) in un piatto di gelatina rivestita in assenza di mESCs.
- Lavare le cellule con PBS sufficienti a coprire le cellule (2 ml per 6 pozzetti) per 30 sec per lavaggio, per un totale di due lavaggi. Aggiungere 3,7% paraformaldeide (PFA) per il fissaggio. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
ATTENZIONE: (pericolosi) Paraformaldeide è una soluzione tossico e corrosivo. Indossare indumenti di protezione individuale (ad esempio, nitrile o guanti di lattice, un camice da laboratorio e occhiali) nel maneggiare la soluzione.Utilizzare una cappa aspirante. - Aspirare la soluzione di fissaggio. Lavare le cellule fissate con PBS due volte, come descritto al punto 4.1.3.
- Aggiungere la soluzione di β-gal colorazione SA (1-2 ml per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti). Incubare per 17,5 ore a 37 ° C.
NOTA: non deve essere incubato in un incubatore CO 2. - Aspirare la soluzione colorante β-gal SA e lavare le cellule con PBS due volte, come descritto al punto 4.1.3.
- Aggiungere la soluzione Eosina per contro-colorazione. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule due volte con PBS, come descritto al punto 4.1.3.
- celle di immagine a ingrandimento 100X utilizzando un microscopio immagini di luce e acquisire utilizzando una fotocamera digitale collegata per successive analisi.
NOTA: Il numero totale di cellule può essere contato in modo cieco e la percentuale di SA β-gal positive cellule blu può essere calcolato.
- Analisi del ciclo cellulare (Figura 3B)
- HDFs seme ad una densità di8 x 10 4 cellule per pozzetto in una cella di sei centimetri cultura piatto in media HDF. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% CO 2.
- A seguito di una notte di incubazione, scartare la metà del mezzo HDF e aggiungere Mesc-CM e mezzo di controllo. Incubare per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Trypsinize le cellule, come indicato nel punto in 3.1, e centrifugare per 5 min a 300 x g. Lavare le cellule con soluzione fredda PBS (PBS con 0,5 mM CaCl 2 e 2% FBS, 1 ml per 1,5 ml di tubo) due volte e centrifugare per 3 minuti a 2500 x g. Risospendere in 100 ml di soluzione PBS freddo.
- Fissare le cellule facendo cadere 200 ml di etanolo freddo mentre vortex. Conservare a 4 ° C per almeno 1 ora.
- Lavare le cellule con soluzione fredda PBS due volte, come descritto al punto 4.2.3.
- Risospendere le cellule in 250 microlitri di tampone citrato di sodio (1,12%, pH 8,5) contenente 50 ug / ml RNasi. Incubare per 30 minuti a 37 ° C.
- Aggiungere 250 ml di citrato di sodiotampone contenente 50 ug / ml di ioduro di propidio. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Misurare le 10.000 cellule in ciascun campione usando citometria a flusso 20.
- qRT-PCR (Figura 3C)
- HDFs semi e aggiungere Mesc-CM, come descritto ai punti 4.1.1 e 4.1.2.
- Isolare RNA totale dalle HDFs utilizzando un kit di estrazione di RNA secondo il protocollo del produttore. Quantificare l'RNA totale estratto utilizzando uno spettrofotometro 21.
- Sintetizzare cDNA aggiungendo 1 mg di RNA totale a 20 ul di miscela di reazione contenente oligo primer (dT) e M-MLV trascrittasi inversa, secondo il protocollo 20 del produttore.
- Misurare l'amplificazione del cDNA con una macchina PCR in tempo reale, utilizzando miscela master Verde PCR e primers gene specifici (Supplemento Tabella 1). Normalizzare i dati con l'espressione GAPDH. Utilizzare il seguente protocollo PCR: iniziale denaturation per 10 min a 95 ° C; 45 cicli per 15 secondi a 95 ° C, 20 sec a 55 ° C, e 35 sec a 72 ° C; e la fase curva di fusione per 15 sec a 95 ° C, 1 min a 60 ° C, 30 sec a 95 ° C e 5 secondi a 60 ° C 15.
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Representative Results
In origine, mESCs sono mantenuti su un alimentatore MEF in media Mesc con FBS e altri integratori (Figure 1A e 2A). CM è stato raccolto da mESCs a ridotto siero media senza uno strato alimentatore, FBS, o altri supplementi (figure 1B e 2B). Questa condizione la cultura ci permette di raccogliere Mesc specifico mezzo condizionato senza potenziale contaminazione da fattori dall'alimentatore, FBS, o altri supplementi. Il mezzo di controllo è stato raccolto nelle stesse condizioni di coltura senza mESCs.
mESCs mostrano diverse morfologie tra i due mezzi di cultura: i) normali Mesc condizioni di coltura (Figura 2A) e ii) di siero e condizioni di coltura priva di alimentazione (Figura 2b). Le colonie Mesc cresciuti su uno strato MEF e dimostrato un aspetto ovale e lucido sotto il normale Mesc cultura condizioni (Figura 2A). Al contrario, le mESCs nella sierica- e condizioni di coltura privo di alimentazione mostravano una morfologia appiattita e irregolare (Figura 2B).
La caratterizzazione funzionale Mesc-CM è stato ottenuto con metodi senescenza-associata, come SA test β-gal (Figura 3A), analisi del ciclo cellulare (Figura 3B), e qPCR (Figura 3C). Trattamento di HDFs senescenti con Mesc-CM diminuito il numero di SA cellule β-gal-positivi positivi, che è un indicatore di senescenza cellulare (Figura 3A). Analisi del ciclo cellulare ha rivelato che il trattamento Mesc-CM aumentato drammaticamente il numero di cellule nel S e G 2 / M di fase, che ha ridotto il numero di cellule in G 0 / G 1 fase (Figura 3B). Inoltre, il trattamento Mesc-CM diminuito i livelli di espressione genica senescenza-associati (namely, p53, p21, e p16) ei livelli di espressione secretoria fenotipo (SASP) senescenza-associato (IL-6).
Figura 1: Preparazione e ottimizzazione di Mesc-CM. strategia sperimentale per la preparazione e l'ottimizzazione dei senza siero e senza alimentatore CM. (A) Normale Mesc condizione di cultura e (B) di siero e privo di alimentatore Mesc-CM condizione di cultura. C: controllo del mezzo senza FBS e MEF; CM: mezzo condizionato senza FBS e MEF. Modificata con il permesso di Bae et al. 15. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Campo chiaro imetà compresa tra i mESCs. mESCs punto (a) condizioni normali e (B) di siero e di condizioni di assenza di alimentazione. Le frecce gialle indicano cella alimentatore (MEF) nelle normali condizioni di coltura Mesc. Barre di scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Caratterizzazione degli effetti anti-invecchiamento di Mesc-CM. Attività colorazione (A) SA β-gal e la percentuale di cellule SA β-gal positive. (B) analisi del ciclo cellulare mediante citometria di flusso. (C) i livelli di espressione di livelli senescenza associati espressione genica (p53, p21 e p16) e livelli di espressione senescenza associata secretoria fenotipo (SASP) (IL-6) da qRT-PCR. I valori sono la media ± SD. I dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. differenze statisticamente significative tra i gruppi sono stati identificati da una via ANOVA e test post-hoc di Tukey. * P <0.05, ** p <0.01. Y = cellule non senescenti; S: cellule senescenti; C: controllo del mezzo senza FBS e MEF; CM: mezzo condizionato senza FBS e MEF. Barre di scala = 10 micron. Modificata con il permesso di Bae et al. 15. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Per la collezione di successo di di siero e Mesc-CM senza alimentatore, i seguenti suggerimenti dovrebbero essere presi in considerazione. Il fattore più critico è usando mESCs passaggio primi per la raccolta di Mesc-CM. In precedenza, è stato dimostrato che il passaggio anticipato Mesc-CM ha migliori effetti anti-invecchiamento rispetto al mESCs fine del passaggio. Stato segnalato il numero passaggio di mESCs di influenzare il loro potenziale di sviluppo 16 e 17 pluripotenza.
Anche se sono necessarie ulteriori ricerche per analizzare i fattori specifici del secretoma Mesc, che inducono effetti anti-senescenza, possiamo concludere che attualmente Mesc-CM è sufficiente a diminuire la senescenza a livello cellulare.
L'identificazione dei fattori di secrezione specifici Mesc che ricadono cellule senescenti torna a cellule giovani sarà fondamentale per gli studi futuri. Per l'alta qualità analizza sulle molecole secretorie, come anticorpo matrice 15 unad analisi secretoma, la fase di lavaggio durante il processo di raccolta medio (passaggio 3) è critica. Se la fase di lavaggio non è correttamente condotto, le molecole di secrezione saranno contaminati da siero componenti (FB) 18,19.
Il tempo di incubazione di siero e senza alimentatore (24 ore) è molto importante nel processo di raccolta medio (fase 3), come il tempo di incubazione più lungo (oltre 24 ore) può aumentare la possibilità di autolisi cellulare o apoptosi per fame sotto il siero - e feeder- condizioni impoverito 18,19. La condizione normale cultura ESC richiede uno strato alimentatore per la coltura a lungo termine di cellule indifferenziate, come l'alimentatore secerne un gran numero di molecole 22. La piastra di gelatina rivestita previene la possibilità di contaminazione delle cellule di alimentazione.
Il Mesc-CM, raccolto dalle condizioni di coltura di siero e privo di alimentazione, ha una capacità anti-senescenza in HDFs senescenti. Effetti anti-senescenza di mESC-CM è stato dimostrato da molteplici letture senescenza-associati, come ad esempio SA attività β-gal; un potenziale proliferativo maggiore (analisi del ciclo cellulare); e p53, p21, p16, e IL-6 livelli di espressione genica (- 3C Figura 3a) ridotto.
Quando le cellule primarie umane vengono trattate con Mesc-CM, xeno-contaminazione sarebbe un problema critico per l'applicazione clinica. Pertanto, una ricerca dei fattori di secrezione dal CES o iPSCs umani sarebbe uno studio futuro importante per l'applicazione clinica di CM derivati da origini umane. La convergenza di un approccio cell-free basato su un cellule staminali e uno studio anti-senescenza si prevede di ampliare l'attuale comprensione delle malattie associate senescenza, con conseguente maggiore comprensione miglioramenti su approcci terapeutici.
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Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dalla scienza Basic Program Research (2013R1A1A2060930) e il Medical Research Programma Center (2015R1A5A2009124) attraverso la Fondazione Nazionale delle Ricerche di Corea (NRF), finanziato dal Ministero della Scienza, ICT, e la pianificazione futura. Questa ricerca è supportata anche da una start-up sovvenzione di funzionamento dalla Hospital for Sick Children (HK Sung). Vorremmo ringraziare Laura e Sarah Barwell JS Kim per la loro eccellente aiuto nella redazione di questo manoscritto e il Dr. Andras Nagy per la fornitura della linea G4 Mesc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50 units/ml penicillin and 50 mg/ml streptomycin |
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2 mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100 µM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100 µM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100 units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1 mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5 mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5 mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150 mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 mM |
| Mitomycin C | Sigma | #M4287 | 10 µg/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50 µg/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter | Corning | #430513 | 0.2 μm |
References
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