Summary
这个协议提供了小鼠胚胎干细胞的血清衍生的集合（MESC）-conditioned培养基（MESC-CM）的方法（胎牛血清，FBS） - 和馈线（小鼠胚胎成纤维细胞，MEF中）用于小区-free条件 - 免费的做法。它可以是适用于老化和老化有关的疾病的治疗。
Introduction
这个协议的目标是从无血清和无饲养培养条件收集小鼠胚胎干细胞（MESC）-conditioned培养基（MESC-CM）和表征其生物学功能。
在一般情况下，胚胎干细胞（ESC）由于它们的多能性和产能自我更新1-3具有用于再生医学，细胞疗法的巨大潜力。然而，干细胞直接移植有几个限制，如免疫排斥和肿瘤形成4,5。因此，无细胞的方法可提供用于再生医学和老化干预6,7-替代的治疗策略。
衰老被视为蜂窝对口组织器官的老化，其特点是生长停滞，改变细胞的生理和行为的永久状态。老化为流行的疾病，包括癌症，心血管疾病，叔的主要危险因素YPE 2型糖尿病，和神经变性8。一个老龄化的明显特征是组织的再生潜能，这是由干细胞衰老和疲惫9造成的下降。许多显著研究显示药理分子，如雷帕霉素9，白藜芦醇10，和二甲双胍11，和血源性系统性的因素，即GDF11 12中，具有一致延缓衰老和延长寿命的能力。
在本研究中，卓制-CM已经收获无血清（胎牛血清，FBS）和馈线（小鼠胚胎成纤维细胞，MEF中）的层以排除血清因子和由MEF分泌因子的污染。这些条件允许的无血清和无饲养的CM那因此启用的MESC特异性分泌因子的准确识别。
这项拟议的协议效率高，相对成本效益，易于进行操作。该技术提供了见解的MESC衍生的可溶性因子表征可以介导的抗衰老作用，其可用于向干预一个安全的和潜在有利无细胞的治疗方法的开发对于衰老相关疾病和其它再生治疗。
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Protocol
注：在无血清和无饲养-CM集合协议的示意图示于图1。
1.材料（MEF中的制备，中，印版和解决方案）
- 制成500毫升之培养基来培养的MEF。有10％FBS（ESC质量），50单位/ ml青霉素和50mg / ml链霉素补充的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基（DMEM）。
- 从胚胎以下既定程序协议13 MEF中隔离和维护他们MEF培养基。
- 制成500毫升之培养基培养的mESCs。的DMEM补充有15％FBS和2mM的L-谷氨酰胺，100μM的非必需氨基酸（NEAA），100μM的β巯基乙醇，100单位/ ml白血病抑制因子（LIF），50单位/ ml青霉素，和50毫克/毫升链霉素。
- 通过用5毫升0.1％的明胶溶液涂层10 1cm池培养皿制备糊化板（5糊化板/ 1 MESC板）。孵育至少10分钟在室温下。
- 制成500毫升之低血清培养基用于mESCs的无血清状态。补充低血清介质使用1.2克碳酸氢钠（pH 7.0）中。通过0.2μm瓶顶过滤器进行过滤。
- 制备衰老相关β半乳糖苷酶（SAβ半乳糖苷酶）用于检测衰老细胞的染色溶液：1毫克/毫升X-gal的（溶解在二甲基甲酰胺，DMF）中，40 mM柠檬酸/磷酸钠缓冲液（pH 6.0） ，5mM的铁氰化钾，5mM的亚铁氰化钾，150毫摩尔NaCl和2mM MgCl 2的14。
注意：（危险）DMF是一种有毒和腐蚀性的解决方案。处理解决方案时穿戴个人防护服（ 例如，腈或乳胶手套，实验室外套，和护目镜）。使用通风橱。 - 制成500毫升之培养基培养的人皮肤成纤维细胞（HDFS，NHDF-AD-DER-成纤维细胞）。补充的DMEM含10％FBS和100单位/ ml青霉素和100mg / ml链霉素。
注：执行在细胞培养生物安全罩的所有步骤。
- 治疗的MEF用20ml含有在15厘米的细胞培养皿10微克/毫升丝裂霉素C的MEF培养基的。孵育在37℃下2小时和5％ 的 CO 2。
- 吸由MEF培养基。洗细胞用PBS洗3次。加入3 ml胰蛋白酶- EDTA（TE，1×）的孵育在37℃下3分钟和5％ 的 CO 2。 3分钟后，中和在TE用6ml MEF培养基和离心机在300×g下3分钟。
- 悬浮在5毫升MEF培养基。使用台盼蓝染色和血细胞计数器确定在所得的细胞悬浮液中的细胞数。板灭活的MEF（馈线）在MEF培养基每10厘米细胞培养皿2×10 6个细胞的密度。孵育在37℃下24小时和5％ 的 CO 2。
- 电镀的进纸器（上后，更换与卓制介质MEF培养基24小时次日）。
- 板以2×10 6个细胞的与卓制介质供给器的密度在mESCs（G4 F1杂种ES细胞）。孵育在37℃下48小时和5％ 的 CO 2。
注：卓制-CM的抗老化作用是当低传代次数mESCs使用15-17可能更强。我们Lunenfeld-的Tanenbaum研究所，西奈山医院，25奥德街，多伦多，M5T 3H7，加拿大获得了G4卓制线由安德拉斯·纳吉博士。 - 使细胞保持在在70-80％的子铺满状态相对高的密度和通道。每天更换新鲜卓制培养基中。
3.血清的收集和无饲养条件培养基（图1B和2B）
注：执行在细胞培养生物安全罩的所有步骤。
- 用5毫升的PBS冲洗卓制板。加入1ml的TE（2.5倍）的孵育在37℃下3分钟和5％ 的 CO 2。 3分钟后，中和在TE用2ml卓制mediu的米和离心机在300×g下3分钟。
- 悬浮在5ml MESC介质和板1毫升到卓制介质每明胶涂层培养皿（5糊化板/ 1 MESC板）。达到培养在37℃和5％的CO 2，直至80-85％汇合。
- 洗mESCs具有足够的PBS覆盖于每次洗涤10分钟，将细胞（8毫升，每10cm平板），总共洗涤三次。孵育在低血清培养基在37℃，24小时，5％的CO 2。
注：洗涤步骤是很重要的，以防止FBS的污染。它遵循孵育时间18,19是重要的。 - 收集MESC-CM到50ml锥形管中并离心以2500×g的20分钟。收集离心后上清液溶液（CM）。通过0.2μm瓶顶过滤器进行过滤。
4.小鼠胚胎的影响干细胞条件培养基（MESC-CM）
注：卓制-CM的效应通过几种方法，诸如验证SAβ半乳糖苷酶测定，细胞周期分析，和定量RT-PCR。
- SAβ半乳糖苷酶测定（图3A）
- 种子的HDF在HDF介质每孔2×10 4个细胞在6孔板的密度。在37℃孵育过夜，5％ 的 CO 2。
- 继隔夜培养后，HDF介质丢弃一半，并添加MESC-CM和控制网上平台。孵育在37℃下72小时和5％ 的 CO 2。控制介质从无血清培养基中在没有mESCs的明胶包被培养皿（低血清媒体）的。
- 清洗细胞具有足够的PBS覆盖于每次洗涤30秒将细胞（2毫升，每6孔板），总计两次洗涤的。添加3.7％多聚甲醛（PFA）进行固定。孵育在室温下5分钟。
注意：（危险）多聚甲醛是一种有毒和腐蚀性的解决方案。处理解决方案时穿戴个人防护服（ 例如，腈或乳胶手套，实验室外套，和护目镜）。使用通风橱。 - 吸出固定的解决方案。洗涤固定的细胞用PBS洗涤两次，如在步骤4.1.3说明。
- 添加该SAβ-gal染色溶液（1-2毫升，每孔在6孔板）。在37℃下孵育17.5小时。
注意：它不以在CO 2培养箱中培养。 - 吸出的SAβ-gal染色溶液和洗涤用PBS细胞两次，如在步骤4.1.3说明。
- 添加反染色曙红的解决方案。孵育在室温下5分钟。用PBS洗细胞两次，如在步骤4.1.3说明。
- 利用使用连接数码相机进行后续分析光学显微镜拍摄图像的图像细胞放大100倍。
注：细胞总数可以以盲方式进行计数并计算SAβ半乳糖苷酶阳性蓝色的细胞的百分比。
- 细胞周期分析（图3B）
- 在密度种子的HDF8×10 4个细胞每孔中的HDF介质将6cm细胞培养皿。在37℃孵育过夜，5％ 的 CO 2。
- 继隔夜培养后，HDF介质丢弃一半，并添加MESC-CM和控制网上平台。孵育在37℃下24小时和5％ 的 CO 2。
- Trypsinize细胞，如在3.1中描述的步骤，和离心机在300×g下5分钟。用冷PBS溶液洗涤细胞（PBS用0.5mM的CaCl 2和2％FBS的1毫升每1.5mL管中）两次并离心在2500×g下3分钟。重悬在100μl冷PBS溶液。
- 通过滴加冷乙醇200微升，同时涡旋固定细胞。储存在4℃下至少1小时。
- 洗用冷PBS溶液中的细胞两次，如在步骤4.2.3说明。
- 悬浮细胞中的柠檬酸钠缓冲液含有50微克/毫升RNA酶250微升（1.12％，pH值8.5）。在37℃下孵育30分钟。
- 加入250微升柠檬酸钠含缓冲器50微克/毫升的碘化丙啶。孵育在室温下20分钟。
- 测量10,000个细胞使用流式细胞仪20的每个样本。
- 定量RT-PCR（图3C）
- 种子的HDF并添加MESC-CM，如步骤4.1.1和4.1.2所述。
- 隔离根据制造商的方案使用RNA提取试剂盒的HDF总RNA。量化使用分光光度计21所提取的总RNA。
- 合成cDNA通过添加总RNA的1微克到20μl包含寡聚（dT）引物和M-MLV逆转录酶的反应混合物，根据生产商的方案20。
- 测量cDNA的扩增用实时PCR机，采用绿色PCR主混合物和基因特异性引物（ 补编 表1）。与正常化GAPDH表达的数据。使用以下PCR协议：初始德复性在95℃10分钟; 45个循环15秒，在95℃，20秒55℃，和72℃35秒;并在95℃下，在60℃下1分钟，95℃30秒，并在60℃下15 5秒15秒的熔融曲线的阶段。
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Representative Results
本来，mESCs保持在与FBS等补品（ 图1A和2A）卓制中的MEF饲养。的CM是由在低血清媒体mESCs收集无饲养层，FBS，或其它补充剂（ 图1B和2B）。这种文化条件允许我们从给料机，FBS，或其他补充的因素来收集MESC特定条件培养基没有潜在的污染。对照培养基在相同的培养条件下收集，无需mESCs。
mESCs显示两个培养介质之间不同的形态：和i）正常卓制培养条件（ 图2A）ⅱ）无血清和无饲养培养条件下（ 图2B）。该卓制菌落生长的MEF层上，并表现出正常的文化卓制c。在一个椭圆形的，有光泽的外观onditions（ 图2A）。与此相反，在无血清和无饲养培养条件mESCs呈扁平和不规则形态（ 图2B）。
卓制-CM的功能表征通过衰老相关方法，如SAβ半乳糖苷酶测定（ 图3A），细胞周期分析（ 图3B），和qPCR（ 图3C）来实现的。与MESC-CM衰老的HDF的治疗减少正SAβ半乳糖苷酶阳性细胞的数量，这是细胞衰老（ 图3A）的一个指标。细胞周期分析显示，MESC-CM处理显着增加的细胞数在S和G 2 / M期，而它在G 0 / G 1期（ 图3B）减少细胞的数量。此外，卓制-CM治疗降低衰老相关的基因表达水平（Namely，p53基因，p21基因，和p16）和衰老相关的分泌的表型（SASP）的表达水平（IL-6）。
图1：准备和卓制-CM的优化。对于无血清和无饲养CM的制备和优化实验策略。 （ 一 ）正常卓制培养条件和（B）无血清和无饲养层MESC-CM培养条件。 C：不控制FBS和MEF介质; CM：无FBS和MEF条件培养基。改性与来自Bae 等权限。 15。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：明场IMmESCs的年龄。根据（A）的正常条件下和（B）无血清和无饲养条件mESCs。黄色箭头表示在正常卓制培养条件下饲养细胞（MEF中）。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：MESC-CM的抗衰老作用表征。 （A）中的SAβ半乳糖苷酶的活性染色和SAβ半乳糖苷酶阳性细胞的百分比。 （B）通过流式细胞术细胞周期分析。 （C）通过qRT-PCR衰老相关的基因表达水平（p53基因，p21基因，和p16）和衰老相关的分泌的表型（SASP）的表达水平（IL-6）的表达水平。值是平均值±SD。数字代表三次独立的实验。组间统计学-显著差异通过单向ANOVA和Tukey的事后检验确定。 * P <0.05，** P <0.01。 Y =非衰老细胞;小号：衰老细胞; C：不控制FBS和MEF介质; CM：无FBS和MEF条件培养基。比例尺= 10微米。改性与来自Bae 等权限。 15。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
对于无血清和MESC-CM无饲养成功集合，下面的建议，应考虑。最关键的因素是使用早期通道mESCs为MESC-CM的集合。以前，已经显示，相比于晚期通道mESCs早期传代MESC-CM具有更好的抗衰老作用。 mESCs的通道数目已经报道影响其发育潜力16和多能性17。
而分析MESC分泌蛋白质，从而诱发抗衰老效应的具体因素，需要更多的研究，我们目前可以断定MESC-CM足以在细胞水平降低衰老。
那恢复衰老细胞恢复年轻细胞特定MESC分泌因素的识别将是未来研究的关键。为高质量的分泌的分子，如抗体阵列15的分析ð分泌蛋白质分析，在介质收集过程的洗涤步骤（步骤3）是至关重要的。如果在洗涤步骤不正确进行时，分泌分子将通过血清（FBS）组件18,19被污染。
在无血清和无饲养培养时间（24小时）是在介质中收集过程（步骤3）非常重要的，因为较长的温育时间（超过24小时）血清下通过饥饿可能增加细胞自溶或凋亡的可能性-和饲养物耗尽条件18,19。正常ESC培养条件需要用于未分化细胞的长期培养饲养层，作为馈线分泌大量的分子22的。在明胶包被板防止污染的来自饲养细胞的可能性。
所述MESC-CM，由无血清和无饲养培养条件收获，在衰老的HDF抗衰老的能力。 mESC-的抗衰老效果CM已经被证明由衰老相关的多个读数，诸如SAβ半乳糖苷酶活性;增强的增殖潜力（细胞周期分析）;和减少的p53，p21的，p16基因，和IL-6的基因表达水平（ 图3A - 3C）。
当人原代细胞与MESC-CM处理，异种污染将成为临床应用的关键问题。因此，从胚胎干细胞的人类iPS细胞或分泌的因素的调查将是临床应用CM从人类起源衍生的重要后续研究。基于干细胞和抗衰老研究的无细胞方法的收敛有望扩大衰老相关的疾病的当前理解，造成更大的洞察上的治疗方法的改进。
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Acknowledgments
这项研究是由基础科学研究发展计划（2013R1A1A2060930）和医学研究中心计划（2015R1A5A2009124）通过韩国国家研究基金会（NRF），通过科学，信息和通信技术部提供资金，以及未来规划的支持。这项研究也从病童医院（HK宋）初创工作资助。我们要感谢劳拉·巴维尔和萨拉金JS他们在编辑这个手稿和安德拉斯·纳吉博士提供G4卓制线出色的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50 units/ml penicillin and 50 mg/ml streptomycin |
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2 mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100 µM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100 µM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100 units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1 mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5 mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5 mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150 mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 mM |
| Mitomycin C | Sigma | #M4287 | 10 µg/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50 µg/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter | Corning | #430513 | 0.2 μm |
References
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