Summary
Dieses Protokoll liefert ein Verfahren für die Gewinnung von embryonalen Maus-Stammzellen (MESC) -conditioned Medium (MESC-CM), abgeleitet von Serum (fötales Rinderserum, FBS) - und Feeder (Maus embryonale Fibroblasten, MEFs) -freien Bedingungen für eine Zelle -freie Ansatz. Es kann für die Behandlung von Hautalterung und Alterungs-assoziierten Erkrankungen Anwendung finden.
Introduction
Das Ziel dieses Protokolls ist embryonalen Maus-Stammzellen (MESC) -conditioned Medium (MESC-CM) von serum- und Feeder-freien Kulturbedingungen zu sammeln und ihre biologischen Funktionen zu charakterisieren.
Im Allgemeinen haben embryonale Stammzellen ( ES- Zellen) ein großes Potential für die regenerative Medizin und Zelltherapie aufgrund ihrer Pluripotenz und Fähigkeit zur Selbsterneuerung 1-3. Jedoch hat die direkte Transplantation von Stammzellen mehrere Einschränkungen, wie Immunabstoßung und Tumorbildung 4,5. Daher kann ein zellfreier Ansatz eine alternative therapeutische Strategie für die regenerative Medizin zur Verfügung stellen und Alterungs Interventionen 6,7.
Seneszenz wird als ein zelluläres Pendant zur Alterung von Geweben und Organen betrachtet, von einem permanenten Zustand der Wachstumsarrest, veränderte Zellphysiologie und Verhalten charakterisiert. Altern ist der Hauptrisikofaktor für weit verbreitete Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf- Erkrankungen, typ - 2 - Diabetes und neurodegenerative Krankheit 8. Einer der offensichtlichen Merkmale des Alterns ist der Rückgang der regenerative Potenzial von Geweben, die durch Stammzellalterung und Erschöpfung 9 verursacht wird. Viele Studien haben signifikante pharmakologische Moleküle gezeigt, wie Rapamycin 9, Resveratrol 10 und Metformin 11 und hämatogenen systemische Faktoren, nämlich GDF11 12, die die Fähigkeit haben konsequent Alterung verzögern und die Lebensdauer verlängern.
In der vorliegenden Studie wurde MESC-CM wurde ohne Serum (fötales Rinderserum, FBS) und feeder (Maus embryonale Fibroblasten, MEFs) -Schichten geerntet, um die Kontamination von Serumfaktoren und sekretorischen Faktoren von MEFs auszuschließen. Diese Bedingungen erlaubt eine serum-und Feeder-freie CM, die folglich die genaue Identifizierung von MESC spezifischen sekretorischen Faktoren aktiviert.
Diese vorgeschlagene Protokoll ist sehr leistungsfähig, relativ kostengünstig und einfachzu bedienen. Diese Technik liefert einen Einblick in die Charakterisierung von MESC abgeleiteten löslichen Faktoren, die eine anti-Seneszenz Wirkung vermitteln kann, die für die Entwicklung eines sicheren und potenziell vorteilhaft zellfreien therapeutischen Ansatz zur Interventionen für alterungs assoziierten Krankheiten und andere regenerative verwendet werden kann, Behandlungen.
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Protocol
HINWEIS: Ein Schema des serum- und feeder freien CM Sammelprotokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Materialien (Herstellung von MEF, Medium, Platten, und Lösungen)
- Bereiten Sie 500 ml Medium zur Kultur der MEFs. Ergänzung nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% FBS (ESC-Qualität), 50 Einheiten / ml Penicillin und 50 mg / ml Streptomycin.
- Isolieren MEFs von Embryonen nach einer etablierten Routine - Protokoll 13 und halten sie in MEF Medium.
- Bereiten 500 ml Medium der mESCs zur Kultur. DMEM mit 15% FBS und 2 mM L-Glutamin, 100 & mgr; M nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 100 & mgr; M β-Mercaptoethanol, 100 Einheiten / ml Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 50 Einheiten / ml Penicillin und 50 mg / ml Streptomycin.
- Bereiten Sie die verkleisterte Platten (5 verkleisterte Platten / 1 MESC Platte) durch die Beschichtung 10 cm Zellkulturschalen mit 5 ml 0,1% Gelatine-Lösung. Inkubieren für mindestens 10 min bei Raumtemperatur.
- Bereiten 500 ml des reduzierten Serum Medium für einen serumfreien Zustand mESCs. Supplement Reduzierte Serum Medien mit 1,2 g Natriumhydrogencarbonat (pH 7,0). Man filtriert durch ein 0,2 um Flaschenaufsatz-Filter.
- Bereiten Sie die Seneszenz assoziierten β-Galactosidase (SA β-gal) Färbelösung für den Nachweis von seneszenten Zellen: 1 mg / ml X-gal (gelöst in Dimethylformamid, DMF), 40 mM Citronensäure / Natriumphosphat-Puffer (pH 6,0) mM, 5 Kaliumferricyanid, 5 mM Kaliumferrocyanid, 150 mM NaCl und 2 mM MgCl 2 14.
ACHTUNG: (Gefährliche) DMF ist eine giftige und ätzende Lösung. Tragen Sie persönliche Schutzkleidung (zB Nitril oder Latex - Handschuhe, einen Laborkittel und Schutzbrille) , wenn Lösung Handhabung. Verwenden Sie einen Abzug durchführen. - Bereiten Sie 500 ml Medium zur Kultur humanen dermalen Fibroblasten (HDF, NHDF-Ad-Der-Fibroblast). Ergänzung DMEM mit 10% FBS und 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin.
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer Zellkultur biologischen Schutzhaube.
- Behandeln die MEFs mit 20 ml MEF-Medium, enthaltend 10 ug / ml Mitomycin C in einer 15 cm Zellkulturschale. Inkubieren für 2 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Saugen Sie das Medium aus MEFs. Waschen der Zellen mit PBS dreimal. 3 ml Trypsin-EDTA (TE, 1x) und Inkubation für 3 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Nach 3 min, neutralisieren die TE mit 6 ml MEF Medium und zentrifugieren für 3 min bei 300 x g.
- Resuspendieren in 5 ml MEF Medium. Bestimmung der Zellzahl in der resultierenden Zellsuspension unter Verwendung von Trypan-Blau-Färbung und einer Zählkammer. Platte inaktivierten MEFs (feeder) bei einer Dichte von 2 x 10 6 Zellen pro 10-cm Zellkulturschale in MEF Medium. Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Tauschen Sie das MEF Medium mit MESC Medium 24 Stunden nach der Zubringer Plattierung (auf derfolgender Tag).
- Platte die mESCs (G4 F1 - Hybrid - ES - Zelle) in einer Dichte von 2 × 10 6 Zellen auf dem Zubringer mit MESC Medium. Inkubieren für 48 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
HINWEIS: Die Anti-Aging - Wirkung von MESC-CM ist wahrscheinlich stärker , wenn unteren Kanalnummer mESCs 15-17 verwendet werden. Wir erwarben eine G4 MESC Leitung von Dr. Andras Nagy in Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Kanada. - Halten der Zellen bei einer relativ hohen Dichte und der Durchgang bei einer 70-80% subkonfluenten Zustand. Ersetzen Sie das Medium mit frischem MESC Medium täglich.
3. Sammlung von Serum- und Feeder freie konditionierte Medium (1B und 2B)
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer Zellkultur biologischen Schutzhaube.
- Spülen Sie die MESC Platte mit 5 ml PBS. 1 ml TE (2.5x) und Inkubation für 3 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Nach 3 min neutralisieren die TE mit 2 ml MESC medium und zentrifugieren für 3 min bei 300 x g.
- Resuspendieren in 5 ml Medium MESC und Platte 1 ml in jede Gelatine beschichteten Kulturschale (5 verkleisterte Platten / 1 MESC Platte) in MESC Medium. Kultur bei 37 ° C und 5% CO 2 , bis 80-85% Konfluenz erreicht ist .
- Waschen Sie mESCs mit ausreichend PBS, die Zellen (8 ml pro 10 cm Platte) zur Deckung für 10 min pro Wasch, für insgesamt drei Wäschen. Inkubieren in Reduziertes Serum Medium für 24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
HINWEIS: Der Waschschritt wichtig ist FBS Kontamination zu verhindern. Es ist wichtig , die Inkubationszeit 18,19 folgen. - Sammeln MESC-CM in ein 50 ml konisches Röhrchen und zentrifugieren für 20 min bei 2.500 x g. Die überstehende Flüssigkeit Lösung (CM) nach der Zentrifugation. Man filtriert durch ein 0,2 um Flaschenaufsatz-Filter.
4. Auswirkungen von embryonalen Maus-Stammzellen-konditionierte Medium (MESC-CM)
HINWEIS: Die Wirkungen von MESC-CM wurden durch mehrere Verfahren validiert, wieSA β-gal-Assay, Zellzyklus-Analyse und qRT-PCR.
- SA β-gal Assay (3A)
- Seed HDFs bei einer Dichte von 2 x 10 4 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen in HDF Medium. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Nach einer Inkubation über Nacht Verwerfungs Hälfte des HDF Medium und fügen Sie MESC-CM und Kontrollmedium. Inkubieren für 72 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. Steuermittel aus einem serumfreien Medium (Reduced Serum Medien) in einer Gelatine-beschichtete Schale in Abwesenheit von mESCs abgeleitet.
- Waschen Sie die Zellen mit ausreichend PBS, die Zellen (2 ml pro 6-Well-Platte) zur Abdeckung für 30 Sekunden pro Wäsche, für insgesamt zwei Wäschen. In 3,7% Paraformaldehyd (PFA) zur Fixierung. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur.
ACHTUNG: (Gefährliche) Paraformaldehyd ist eine giftige und ätzende Lösung. Tragen Sie persönliche Schutzkleidung (zB Nitril oder Latex - Handschuhe, einen Laborkittel und Schutzbrille) , wenn die Lösung der Handhabung.Verwenden Sie einen Abzug durchführen. - Saugen Sie das Fixierungslösung. Waschen der fixierten Zellen mit PBS zweimal, wie in Schritt 4.1.3 beschrieben.
- Fügen Sie die SA β-gal-Färbung Lösung (1-2 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte). bei 37 ° C für 17,5 Stunden inkubiert.
HINWEIS: Es wird nicht in einem CO 2 -Inkubator inkubiert werden. - Absaugen SA β-gal Färbelösung und wasche die Zellen zweimal mit PBS wie in Schritt 4.1.3 beschrieben.
- Fügen Sie die Eosin-Lösung für die Gegenfärbung. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur. Waschen der Zellen mit PBS zweimal, wie in Schritt 4.1.3 beschrieben.
- Bildzellen bei 100-facher Vergrößerung eines Lichtmikroskops und die Aufnahmen eine angeschlossene Digitalkamera für die nachfolgende Analyse unter Verwendung verwendet wird.
HINWEIS: Die Gesamtzahl der Zellen in einer Blind Weise und der Prozentsatz der SA β-gal positiven blauen Zellen gezählt werden, berechnet werden.
- Zellzyklus - Analyse (3B)
- Seed HDFs bei einer Dichte von8 x 10 4 Zellen pro Well in einer 6 cm Zellkulturschale in HDF Medium. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Nach einer Inkubation über Nacht Verwerfungs Hälfte des HDF Medium und fügen Sie MESC-CM und Kontrollmedium. Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Trypsinize die Zellen, wie beschrieben in Schritt 3.1 und Zentrifuge für 5 min bei 300 x g. Waschen der Zellen mit kalter PBS - Lösung (PBS mit 0,5 mM CaCl 2 und 2% FBS, 1 ml pro 1,5 ml Röhrchen) zweimal und Zentrifuge 3 min bei 2.500 x g. Resuspendieren in 100 & mgr; l kaltem PBS-Lösung.
- Fixieren Sie die Zellen von 200 ul kaltem Ethanol fallen während Verwirbelung. Lagerung bei 4 ° C für mindestens 1 Stunde.
- Waschen der Zellen mit kalter PBS-Lösung zweimal, wie in Schritt 4.2.3 beschrieben.
- Resuspendieren der Zellen in 250 & mgr; l Natriumcitrat-Puffer (1,12%, pH 8,5) 50 ug / ml RNase enthielt. bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
- In 250 ul NatriumcitratPuffer, enthaltend 50 ug / ml Propidiumiodid. Inkubieren für 20 min bei Raumtemperatur.
- Messen Sie die 10.000 Zellen in jeder Probe mit Hilfe der Durchflusszytometrie 20.
- qRT-PCR (3C)
- Seed HDFs und fügen Sie MESC-CM, wie in den Schritten 4.1.1 und 4.1.2 beschrieben.
- Isolieren der Gesamt-RNA aus den HDFs eines RNA-Extraktions-Kits unter Verwendung von gemäß dem Protokoll des Herstellers. Quantifizieren der extrahierten Gesamt - RNA mit einem Spektralphotometer 21.
- Synthetisieren cDNA durch Zugabe von 1 & mgr; g der Gesamt - RNA auf einem 20 & mgr; l Reaktionsmischung , die Oligo (dT) Primern und M-MLV reverse Transkriptase, entsprechend dem Protokoll des Herstellers 20.
- Messung der Amplifikation der cDNA mit einer Echtzeit - PCR - Maschine, unter Verwendung von Grün PCR Master Mix und spezifische Gen - Primer (Supplement Tabelle 1). Normalisieren der Daten mit GAPDH Ausdruck. Verwenden Sie das folgende PCR-Protokoll: initial deNaturierung für 10 min bei 95 ° C; 45 Zyklen für 15 Sekunden bei 95 ° C, 20 sec bei 55 ° C und 35 sec bei 72 ° C; und der Schmelzkurve Stufe für 15 sec bei 95 ° C, 1 min bei 60 ° C, 30 sec bei 95 ° C und 5 sec bei 60 ° C 15.
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Representative Results
Ursprünglich mESCs sind auf einem MEF Feeder in MESC Medium mit FBS und andere Ergänzungen (1A und 2A) gehalten. CM wurde von mESCs in der verkleinerten Serum Medien ohne Feeder - Schicht, FBS oder andere Ergänzungen (1B und 2B) gesammelt. Diese Kulturbedingungen ermöglicht es uns, MESC spezifische konditionierte Medium ohne eine mögliche Kontamination durch die Faktoren aus dem Einzug, FBS oder andere Ergänzungen zu sammeln. Das Kontrollmedium wurde unter den gleichen Kulturbedingungen gesammelt, ohne mESCs.
mESCs zeigen unterschiedliche Morphologien zwischen den beiden Kulturmedien: i) normalen MESC Kulturbedingungen (2A) und ii) serum - und Feeder - freie Kulturbedingungen (2B). Die MESC Kolonien wuchsen auf einer MEF Schicht und zeigte eine ovale und glänzendes Aussehen unter der normalen MESC Kultur cEDINGUNGEN (2A). Im Gegenteil, zeigten die mESCs im serum- und Feeder-freien Kulturbedingungen eine abgeflachte und unregelmäßiger Morphologie (2B).
Die funktionelle Charakterisierung von MESC-CM wurde von Seneszenz-assoziierte Methoden, wie SA β-gal - Assay (3A), Zellzyklus - Analyse (3B) und qPCR (3C) erreicht. Behandlung von seneszenten HDFs mit MESC-CM verringert , um die Anzahl der positiven SA β-gal-positive Zellen, die ein Indikator der zellulären Seneszenz ist (3A). Zellzyklusanalyse zeigte , dass MESC-CM Behandlung dramatisch die Anzahl der Zellen in der S und G 2 / M - Phase erhöht, während sie die Anzahl der Zellen in der G 0 / G 1 -Phase (3B) reduziert. Darüber hinaus verringert MESC-CM Behandlung der Seneszenz-assoziierte Gen-Expressionsniveaus (namely, p53, p21 und p16) und der Seneszenz-assoziierte sekretorischen Phänotyp (SASP) Expressionslevel (IL-6).
Abbildung 1: Herstellung und Optimierung von MESC-CM. Experimentelle Strategie zur Herstellung und Optimierung von serumfreien und Feeder-freien CM. (A) Normale MESC Kulturbedingungen und (B) serum - und Feeder-freie MESC-CM Kulturbedingungen. C: Kontrollmedium ohne FBS und MEF; CM: konditionierte Medium ohne FBS und MEF. Modifiziert mit Erlaubnis von Bae et al. 15. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Hellfeld imAlter mESCs. mESCs unter (A) normalen Bedingungen und (B) serum - und Feeder - freien Bedingungen. Gelbe Pfeile zeigen feeder-Zelle (MEF) in normalen MESC Kulturbedingungen. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Charakterisierung des Anti-Aging - Wirkung von MESC-CM. (A) SA β-gal Aktivität Anfärbung und der Prozentsatz der SA β-gal-positive Zellen. (B) Zellzyklusanalyse mittels Durchflusszytometrie. (C) Expression von Seneszenz-assoziierte Genexpressionsniveaus (p53, p21 und p16) und Seneszenz-assoziierte sekretorischen Phänotyp (SASP) Expressionslevel (IL-6) durch qRT-PCR. Werte sind der Mittelwert ± SD. Zahlen sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch Einweg-ANOVA und Tukey-post-hoc-Test identifiziert. * P <0,05, ** p <0,01. Y = nicht seneszenten Zellen; S: seneszenten Zellen; C: Kontrollmedium ohne FBS und MEF; CM: konditionierte Medium ohne FBS und MEF. Maßstabsbalken = 10 um. Modifiziert mit Erlaubnis von Bae et al. 15. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Für die erfolgreiche Sammlung von Serum- und Feederfreien MESC-CM, sollten die folgenden Vorschläge in Betracht gezogen werden. Der wichtigste Faktor ist für die Sammlung von MESC-CM frühen Passage mESCs verwenden. Bisher hat es sich gezeigt, dass eine frühe Passage MESC-CM bessere Anti-Aging-Effekte im Vergleich zu späten Passage mESCs hat. Die Passage Anzahl von mESCs wurde berichtet, ihr Entwicklungspotenzial 16 und Pluripotenz 17 zu beeinflussen.
Während weitere Forschung ist notwendig, die spezifischen Faktoren des MESC Sekretom zu analysieren, die anti-Seneszenz Effekte induzieren, können wir schließen, dass derzeit MESC-CM ausreicht Seneszenz auf zellulärer Ebene zu verringern.
Die Identifizierung von MESC spezifischen sekretorischen Faktoren, die seneszenten Zellen zurück in jungen Zellen zufällt für zukünftige Studien kritisch sein. Für qualitativ hochwertige Analysen zu den sekretorischen Moleküle wie Antikörper - Array 15 eind Sekretom Analyse der Waschschritt während der mittlere Erfassungsprozess (Schritt 3) ist kritisch. Wenn der Waschschritt nicht ordnungsgemäß durchgeführt wird, werden die Moleküle durch sekretorische Serum (FBS) -Komponenten 18,19 kontaminiert.
Die Serum- und Feederfreie Inkubationszeit (24 h) ist sehr wichtig, in der mittleren Erfassungsprozess (Schritt 3), die längere Inkubationszeit (über 24 Stunden) kann die Möglichkeit der Zelle Autolyse oder Apoptose durch Verhungern unter dem Serum erhöhen - und abgereichertes Bedingungen 18,19 Felchen-. Die normale ESC Kulturbedingung erfordert eine Feeder - Schicht für die Langzeitkultivierung von undifferenzierten Zellen, wie die Zuführung einer großen Anzahl von Molekülen 22 absondert. Die mit Gelatine beschichtete Platte verhindert die Möglichkeit einer Kontamination von den feeder-Zellen.
Die MESC-CM, geerntet von Serum- und Feederfreie Kulturbedingungen, hat eine Anti-Seneszenz Fähigkeit in seneszenten HDFs. Anti-Seneszenz Effekte von mESC-CM wurden von Seneszenz-assoziierte mehrere Ablesungen, wie SA β-gal Aktivität gezeigt; eine erhöhte Proliferationspotential (Zellzyklus-Analyse); und reduzierte p53, p21, p16 und IL-6 - Gen - Expressionsniveaus (3A - 3C).
Wenn menschliche primäre Zellen behandelt werden, mit MESC-CM, Xeno-Kontamination wäre ein kritischer Punkt für die klinische Anwendung sein. Daher wäre eine Untersuchung der sekretorischen Faktoren aus menschlichen WSR oder iPSCs eine wichtige Zukunftsstudie für die klinische Anwendung von CM von dem Ursprung des Menschen abgeleitet. Die Konvergenz einer zellfreien Ansatz basiert auf einer Stammzellen und einer Anti-Seneszenz Studie wird erwartet, dass das aktuelle Verständnis der Seneszenz-assoziierten Erkrankungen zu erweitern, in einen besseren Einblick in Verbesserungen auf therapeutische Ansätze ergeben.
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Acknowledgments
Diese Forschung wurde von der Basic Science Research Program (2013R1A1A2060930) und dem Medical Research Center-Programm (2015R1A5A2009124) durch die National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung. Diese Forschung wird auch von einem Start-up Betriebskostenzuschuss der Hospital for Sick Children (HK Sung) unterstützt. Wir möchten, dass Laura Barwell und Sarah JS Kim für ihre hervorragende Hilfe bei der Bearbeitung des Manuskripts und Dr. Andras Nagy für die Bereitstellung der G4 MESC Linie zu danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50 units/ml penicillin and 50 mg/ml streptomycin |
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2 mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100 µM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100 µM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100 units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1 mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5 mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5 mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150 mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 mM |
| Mitomycin C | Sigma | #M4287 | 10 µg/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50 µg/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter | Corning | #430513 | 0.2 μm |
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