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Immunology and Infection

पृथक वेसल्स के वैसोडायलेटेशन और चुस्त-त्वचा चूहे के बाह्य मैट्रिक्स का अलगाव

Published: March 24, 2017 doi: 10.3791/55036
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 3, 1, 4, 5, 6, 3
1Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 2Clement J. Zablocki Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Surgery, Division of Pediatric Surgery, Children's Research Institute, 4Department of Orthopedic Surgery, Medical College of Wisconsin, 5Deptarment of Anesthesiology, Clement J Zblocki Veteran Affairs Medical Center, 6Department of Medicine, Division of Cardiology, Medical College of Wisconsin

Introduction

सेल के विकास और कोशिका मृत्यु प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के नियमन इंटरफेरॉन विनियामक कारकों का प्रतिलेखन कारक परिवार की भूमिका के लिए केंद्रीय है। IRF5 टाइप 1 के बीच प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विनियमन, एक सूजन को बढ़ावा देने प्रतिक्रिया और टाइप 2, एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को निशाना बनाने ऊतकों की मरम्मत के लिए महत्वपूर्ण होने के रूप में प्रकाश डाला है। IRF5 कैंसर 1, और autoimmunity 2, 3, 4, 5 में महत्वपूर्ण है।

तंग त्वचा माउस (Tsk / +) fibrillin -1 जीन में उत्परिवर्तन के कारण दोहराव ऊतक फाइब्रोसिस और scleroderma के लिए एक मॉडल है। एक तंग त्वचा में इस उत्परिवर्तन के परिणाम और संयोजी ऊतक में वृद्धि हुई है। इन चूहों, दौरे सूजन, फाइब्रोसिस और अंत में दिल की विफलता 5, 6, 7 का विकास> 8, 9। Scleroderma एक autoimmune fibrotic यूनाइटेड स्टेट्स 6 में लगभग 150,000 मरीजों को प्रभावित विकार है। इस रोग की पहचान दिल 7, 8, 9, 10, 11 सहित आंतरिक अंगों की फाइब्रोसिस हैं।

अध्ययन की प्रकृति एक निरोधात्मक पेप्टाइड की डिजाइन की मांग की। सॉफ्टवेयर दृष्टिकोण एक फेज प्रदर्शन का उपयोग कर एक परंपरागत दृष्टिकोण पर चुना गया था। सॉफ्टवेयर दृष्टिकोण आसान और कम समय लगता है। RCSB डेटा बैंक उचित बाध्यकारी साइटों 12 की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है। पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ नए डिजाइन पेप्टाइड की बातचीत का अध्ययन और बाध्यकारी मानकों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, एक तकनीक बुलाया biolayer इंटरफेरोमेट्री इस्तेमाल किया गया था। Biolayer इंटरफेरोमेट्री एक biosensor आधारित techniq हैUE कि बंधन आत्मीयता, संघ और disassociation एक biosensor और एक बाध्यकारी नमूना का उपयोग करते हुए निर्धारित करता है। biosensor fluorescently, luminescently, radiometrically और colorimetrically लेबल किया जा सकता। माप बड़े पैमाने पर अतिरिक्त या कमी एसोसिएशन और disassociation 13, 14 दिखने पर आधारित है। इस अध्ययन का उद्देश्य दौरे सूजन और फाइब्रोसिस में IRF5 की भूमिका को समझने के लिए किया गया था। लक्ष्य ऊतक फाइब्रोसिस और scleroderma के विकास में IRF5 की भूमिका में जानकारी हासिल करने के लिए किया गया था।

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Protocol

इस अध्ययन की देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों की प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार बाहर किया गया था। प्रोटोकॉल संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (: AUA # 1517 प्रोटोकॉल) द्वारा अनुमोदित किया गया था। चूहों से जुड़े सभी अनुसंधान PHS नीति के अनुरूप किया गया था।

1. प्रलोभन पेप्टाइड का डिजाइन

  1. IRF5 के 3 डी संरचना का पता लगाएं और उस पर डिजाइन का आधार। 438 (ELSWSADSIRLQISNPD) - डिजाइन एक 17 मेर, IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD), जहां aspartate (डी) में 421 IRF5 में फोस्फोराइलेशन नकल करने के लिए सेरीन (एस) के लिए एवजी है करार दिया। 3 डी sulfhydryl समूहों और सक्रियण के IRF5 के तंत्र का ज्ञान, यानी, सेरीन फोस्फोराइलेशन के विश्लेषण का सुझाव दिया एक प्रलोभन पेप्टाइड उत्पन्न करने के लिए किया गया था कि IRF5 को निशाना बनाने के लिए एक रणनीति। चित्रा 1 देखें। 3 डी संरचना में सबसे अच्छा क्षेत्र की पहचान करने के लिए, छोटे Molecul डिजाइन करने के लिए एक आणविक मॉडलिंग सॉफ्टवेयर का उपयोगतों और पेप्टाइड्स 15।
    नोट: इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम लक्ष्य प्रोटीन की 3 डी संरचना और उसके संभव बाध्यकारी साइटों की उपलब्धता है। IRF5 के 3 डी संरचना सही फोस्फोराइलेशन के बाद कैसे IRF5 dimerizes प्रतिनिधित्व करता है। सेरीन या threonine के लिए aspartate के प्रतिस्थापन आउटसोर्स है। पेप्टाइड IRF5 से जोड़ा जा रहा है बिना अलग से संश्लेषित है।
  2. Phospho-डोमेन दोहराने बस मूल अनुक्रम के आधार पर एस डी के लिए प्रतिस्थापन द्वारा (ELSWSADSIRLQISNPD, एसी-ELDWDADDIRLQIDNPD-राष्ट्रीय राजमार्ग 2 (IRF5D) के अमीनो एसिड अनुक्रम के साथ एक नई पेप्टाइड IRF5S बनाते हैं।

2. Biolayer इंटरफेरोमेट्री (BLI)

नोट: पुनः संयोजक IRF5 के लिए शुद्धि आउटसोर्स किया गया था। 16

  1. 1 के एक दाढ़ अनुपात में बायोटिन लेबल IRF5: 1 बायोटिन की एक biotinylation अभिकर्मक एक लंबी श्रृंखला लिंकर को शामिल करने के साथ ligand करने के लिए। लंबी श्रृंखला लिंकर एक और अधिक सक्रिय और समरूप लिगा सुनिश्चित करेगाएन डी सतह।
    1. 2 मिलीग्राम के 1 एमएल / एमएल IRF5 20 मिमी बायोटिन अभिकर्मक के 13 μL में जोड़े या अगर जरूरत मात्रा में वृद्धि हुई है। 2 घंटे के लिए बर्फ पर सेते हैं। लेबलिंग के बाद, लेबल प्रोटीन से प्रतिक्रिया मिश्रण को हटाने के लिए एक desalting स्पिन स्तंभ का उपयोग करें।
  2. 15 मिनट के लिए biosensors के साथ बायोटिन लेबल ligand सेते हैं। ओवर-लेबलिंग से बचें और 1 समायोजित: 1 दाढ़ अनुपात। लेबलिंग के बाद, लेबल प्रोटीन से प्रतिक्रिया मिश्रण को हटाने के लिए एक desalting स्पिन स्तंभ का उपयोग करें।
  3. IRF5 प्रलोभन पेप्टाइड के विभिन्न सांद्रता में 10 मिनट के लिए बायोटिन लेबल IRF5 biosensors सेते हैं। एसोसिएशन और हदबंदी दरों 10 में वर्णित, 17, 18 के रूप में निर्धारित किया गया है।

3. Apoptosis और प्रसार Assays

  1. Tetrazolium की bioreduction के माध्यम से प्रसार परख
    1. प्रशासन IRF5D पीबीएस में पतला (1 मिलीग्राम /किलो / डी, एक मात्रा 20 μL एक 20 ग्राम माउस में subcutaneously एक 27 गेज सुई के साथ पीबीएस एक मानक scruffing तकनीक द्वारा या अकेले Tsk / + और C57BL / 6J चूहों को 21 दिनों के लिए इंजेक्षन)।
    2. isoflurane (5%) के साथ चूहों anesthetize और एक गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं। उरोस्थि साथ सीने में खुला काटने से दिल आबकारी। संदंश के साथ दिल को लिफ्ट और दिल को हटा दें।
    3. Lyse एक प्रोटीन सेल 50 मिमी Tris एचसीएल 7.4 पीएच, ब्रैडफोर्ड परख 19 से 0.5% एनपी 40, 250 मिमी NaCl, 5 मिमी EDTA, 50 मिमी NAF 10 और निर्धारित प्रोटीन एकाग्रता युक्त बफर के साथ दिल।
    4. C57BL / 6J हृदय मैट्रिक्स धारा 7 में वर्णित के रूप में अलग-थलग साथ कोट 96 अच्छी तरह प्लेटें पतला पीबीएस 20 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए C57BL / 6J हृदय मैट्रिक्स को निलंबित कर दिया है और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए C57BL / 6J हृदय के 30 μL जोड़ें। यह इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर तय है।
    5. संस्कृति मानव नाल की शिरा endothelial बेसल मीटर के 500 एमएल का उपयोग कोशिकाओं0.4% गोजातीय मस्तिष्क निकालने, 0.1% एस्कॉर्बिक एसिड, 0.1% hydrocortisone, 0.1% मानव epidermal वृद्धि कारक, 2% भ्रूण गोजातीय सीरम और 0.1% जेंटामाइसिन / amphotericin बी यह जोड़ा साथ edia। संस्कृति अच्छी तरह से प्रति 25,000 कोशिकाओं के घनत्व के साथ 5% सीओ 2 और 95% कमरे में हवा में 96 अच्छी तरह से प्लेटों पर कोशिकाओं। 0 के बीच IRF5D की सांद्रता में वृद्धि के साथ उत्तेजित - मीडिया में 100 माइक्रोग्राम / एमएल (संस्करणों 0 और 50 μL / एमएल के बीच थे)।
    6. तीन दिनों के बाद सेल प्रसार का निर्धारण करते हैं और एक microplate रीडर पर absorbance में मतभेद का आकलन करें। प्रतिक्रिया एमटीएस tetrazolium परिसर के एक bioreduction है। NADPH या NADH पाचन सक्रिय कोशिकाओं में डिहाइड्रोजनेज एंजाइमों द्वारा निर्मित है।
    7. जैसा कि एमटीएस tetrazolium यौगिक संग्रहीत है -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए, यौगिक कमरे के तापमान पर धीरे-धीरे खत्म हो गया लगभग 90 मिनट पिघलना। पिपेट एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में 20 μL, और यह करने के लिए संस्कृति मीडिया के 100 μL जोड़ें। एक Humi में 1 से 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेतेdified, 5% सीओ 2 चैम्बर।
    8. 490 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर absorbance पढ़ें।
  2. कस्पासे गतिविधि के माध्यम से Apoptosis परख
    नोट: प्रयोगात्मक सेट अप करने के लिए 3.1.5 3.1.1 ऊपर के रूप में ही है।
    1. मीडिया में 100 माइक्रोग्राम / एमएल - 0 के बीच IRF5D की सांद्रता में वृद्धि के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित।
    2. ईसीएस के लिए कस्पासे 3/7 सब्सट्रेट करने के लिए हरे रंग का पता लगाने जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए यह सेते हैं। 502/530 एनएम के एक अवशोषण / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ एक साथ microplate रीडर पर प्रतिदीप्ति का आकलन करें। तीन प्रतियों में प्रयोगों को चलाने के।
      नोट: हरी फ्लोरोसेंट एजेंट एक चार अमीनो एसिड पेप्टाइड एक न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी डाई करने के लिए बाध्य है। जब कस्पासे 3 और 7 के सक्रियण के बाद cleaved यह अभिकर्मक फ्लोरोसेंट हो जाता है। इस प्रतिदीप्ति मापा जाता है। लाभ धोने चरणों में एक कमी है।

4. IRF5 और सुन में ICAM-1 अभिव्यक्ति का आकलनटी

  1. एक मानक scruffing तकनीक द्वारा या अकेले Tsk / + और C57BL / 6J चूहों को एक बार पीबीएस द्वारा एक 27 गेज सुई के साथ पीबीएस में पतला IRF5D प्रशासन (1 मिलीग्राम / किग्रा / डी, एक 20 ग्राम माउस में एक मात्रा 20 μL इंजेक्षन) subcutaneously प्रति 21 दिनों के लिए दिन।
  2. isoflurane (5%) के साथ चूहों anesthetize और एक गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं। उरोस्थि साथ सीने में खुला काटने से दिल आबकारी। संदंश के साथ दिल को लिफ्ट और दिल को हटा दें।
  3. Lyse एक प्रोटीन सेल 50 मिमी Tris एचसीएल 7.4 पीएच, ब्रैडफोर्ड परख 19 से 0.5% एनपी 40, 250 मिमी NaCl, 5 मिमी EDTA, 50 मिमी NAF 10 और निर्धारित प्रोटीन एकाग्रता युक्त बफर के साथ दिल।
    1. दिल की lysates पर एक पश्चिमी धब्बा प्रदर्शन करना। 25 माइक्रोग्राम कुल प्रोटीन और Laemmli नमूना 5% mercaptoethanol युक्त बफर के साथ 40 μL की मात्रा के नमूने पतला। 5 मिनट के लिए 50 एम वी पर 15% TGX जेल - एक 4 पर नमूने चलाएँ। जब तक डाई सामने बाहर चलाता है 1 घंटे के लिए 100 एम वी वोल्टेज बढ़ाएँ।
    2. 1x स्थानांतरण बफर में जेल प्लेस (25 मिमी Tris, 190 मिमी ग्लाइसिन, 20% मेथनॉल, 8.3 पीएच को समायोजित यदि आवश्यक हो तो) और 10 के लिए सेते - 15 मिनट।
    3. हस्तांतरण सैंडविच (स्पंज, फिल्टर, जेल, सेल्यूलोज झिल्ली, फ़िल्टर, स्पंज) इकट्ठा करो। सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले के बीच में फंस रहे हैं। धब्बा कैथोड और एनोड पर जेल में होना चाहिए। 100 मा पर ठंडे कमरे में 1 घंटे के लिए स्थानांतरण।
    4. अगले दिन, धब्बा कुल्ला और फिर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 5% नोनफेट शुष्क दूध में पृष्ठभूमि ब्लॉक। कुल्ला Tris साथ धब्बा 5 मिनट प्रत्येक के लिए 5% बीच युक्त तीन बार खारा बफर।
    5. IRF5 या ICAM-1 प्राथमिक पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रातोंरात सेते हैं। पतला Tris में एंटीबॉडी एक 1 में खारा बफर: 1,000 कमजोर पड़ने।
    6. पतला Tris में माध्यमिक एंटीबॉडी खारा बफर और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए धब्बा सेते हैं। माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए, उपयोग हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित गधा विरोधी माउस पुलिस महानिरीक्षकजी (1: 10,000) और हॉर्सरैडिश peroxidase गधा विरोधी बकरी आईजीजी (1: 10,000), क्रमशः।
    7. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार मिश्रण घटकों के बाद दाग chemiluminescence लागू करें और 3 मिनट के लिए सेते ब्याज की बैंड luminesce करने के लिए। एक एक्स-रे फिल्म के लिए धब्बा बेनकाब। ImageJ का प्रयोग घनत्व को मापने के लिए। नियंत्रण बैंड 10 घनत्व मूल्यों मानक के अनुसार।

5. IRF5 निषेध के बाद भड़काऊ सेल नंबर का आकलन

  1. एक मानक scruffing तकनीक द्वारा या पीबीएस द्वारा पीबीएस (1 मिलीग्राम / किग्रा / डी) एक 27 गेज सुई के साथ subcutaneously में पतला IRF5D प्रशासन अकेले Tsk करने के लिए / + और 21 दिनों के लिए C57BL / 6J चूहों।
  2. isoflurane (5%) के साथ चूहों anesthetize और एक गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं। उरोस्थि साथ सीने में खुला काटने से दिल आबकारी। संदंश के साथ दिल को लिफ्ट और दिल को हटा दें। स्नैप फ्रीज और विश्लेषण जब तक excised दिलों की दुकान।
  3. Tiss पर जमे हुए दिलों माउंटUE धारकों उपयोग में cryostat के लिए उपयुक्त है। immunohistochemistry के लिए एक cryostat पर 10 माइक्रोन मोटी जमे हुए वर्गों में कटौती।
  4. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए फॉस्फेट बफर खारा में 1% paraformaldehyde के साथ जमे हुए वर्गों को ठीक करें। 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.5% ट्राइटन एक्स 100 के साथ वर्गों Permeabilize।
    सावधानी: Paraformaldehyde एक विनियमित कैसरजन है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए।
  5. पीबीएस में 200: पतला विरोधी खरगोश CD64, एक monocyte / बृहतभक्षककोशिका मार्कर 1। तय वर्गों के लिए लागू करते हैं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. स्लाइड पीबीएस में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  7. पीबीएस में 200: पतला विरोधी चूहा NIMP, एक प्राथमिक न्युट्रोफिल मार्कर 1। तय वर्गों के लिए लागू करते हैं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  8. कमरे के तापमान पर पीबीएस के साथ तीन बार 5 मिनट के लिए स्लाइड्स धो लें।
  9. पतला माध्यमिक एंटीबॉडी विरोधी खरगोश एलेक्सा 488 संयुग्मित और विरोधी चूहा एलेक्सा 488 संयुग्मित 1: पीबीएस में 200।
  10. लागू विरोधी खरगोश एलेक्सा 488 संयुग्मित और विरोधी चूहा एलेक्सा 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए वर्गों के लिए 488 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी तदनुसार। एंटीबॉडी की मात्रा खंड के आकार के अनुसार बदलता रहता है। राशि उदारता खंड को शामिल करना चाहिए। ज्यादातर मामलों में मात्रा 100 और 200 के बीच μL है।
  11. पीबीएस में 1,000 कमजोर पड़ने: एक 1 में एक परमाणु दाग ​​के रूप में 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) का प्रयोग करें। 1 μL 1 एमएल पीबीएस में जोड़ें और पिछले धोने कदम में DAPI का उपयोग करें। एक कवर पर्ची के लिए जलीय बढ़ते मीडिया जोड़ें और स्लाइड पर डाल दिया।
  12. confocal माइक्रोस्कोपी एक 40x तेल उद्देश्य का उपयोग करके fluorescently लेबल वर्गों का विश्लेषण। उत्तेजना का उपयोग CD64 और NIMP के लिए अधिक से अधिक 530 एनएम के 488 और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य तरंगदैर्य। DAPI 360 एनएम के साथ उत्साहित और नीले रंग में 460 एनएम पर उत्सर्जित किया गया था। उनके विभिन्न लेबलिंग से भेद monocytes / मैक्रोफेज और neutrophils (एन = एंटीबॉडी प्रति 10 छवियों, प्रत्येक समूह में 3 अलग चूहों से) और उन्हें गिनती। एक्सप्रेस गिना कोशिकाओं की संख्या के रूप में डेटा।

    IRF5 निषेध के बाद 6. सेल निर्भर Vasodilation

    1. (- 100 मिलीग्राम / किग्रा 80) / xylazine (10 - 12.5 मिलीग्राम / किग्रा) मिश्रण के साथ और एक ketamine साथ पेप्टाइड उपचार के बिना C57BL / 6J चूहों पर नियंत्रण और TSK / + चूहों anesthetize। ketamine / xylazine मिश्रण intraperitoneally इंजेक्षन। मैन्युअल माउस को नियंत्रित।
      1. एक 25 गेज या छोटे सुई का प्रयोग करें। पेट के निचले सही चक्र में सुई डालें। इंजेक्शन से पहले सवार को वापस लेने के लिए सुनिश्चित करें कि सुई एक रक्त वाहिका या आंत्र प्रवेश नहीं करता है।
    2. एक बार संज्ञाहरण का पर्याप्त स्तर तक पहुँच गया है, लापरवाह स्थिति में माउस सुरक्षित शराब लथपथ धुंध पैड के साथ फर पोंछ, और कैंची की एक जोड़ी वक्ष गुहा को खोलने और दिल को हटाने का उपयोग कर।
      नोट: Exsanguination माउस euthanize और विच्छेदन वाहिका में दबाव से राहत इस प्रकार से खून बह को न्यूनतम जब रक्त वाहिकाओं काटने से आसान कर देगा।
      1. त्वचा usin खोलेंकैंची की जोड़ी गा, देखभाल के साथ जबड़े की हड्डी को सीने में पार्श्व से काटने के रूप में जबड़े के सामने की ओर अंतर्निहित ऊतकों को परेशान नहीं करने के लिए।
      2. यह चारों ओर कोमल ऊतकों को हटाने के द्वारा facialis धमनी काटना।
      3. सावधानी: जबकि MOPS बफर में नहाया उजागर ऊतक रखने पोत या facialis धमनी पर tug घायल मत (2.0 मिमी 2 CaCl · 2H 2 हे, 0.02 मिमी EDTA, 5.0 मिमी ग्लूकोज, 4.7 मिमी KCl, 1.17 मिमी MgSO 4 · 7H 2 हे, 3.0 मिमी mops, 145 मिमी NaCl, 1.2 मिमी नः 2 4 पीओ · एच 2 हे, 2.0 मिमी पाइरुविक एसिड) सुखाना रोकने के लिए। एक दूरबीन स्टीरियो जूम विदारक माइक्रोस्कोप (45x करने के लिए 3.5 की बढ़ाई) और एक फाइबर ऑप्टिक प्रकाश स्रोत के तहत प्रदर्शन करना।
    3. facialis धमनी अलग।
      1. पहले विभाजन और जहां धमनी में कटौती की जाएगी करने के लिए बाहर करने के लिए facialis समीपस्थ समझ। माता-पिता धमनी, बाह्य मन्या धमनी से धमनी कट। facialis arterie हटायेचूहों पर नियंत्रण, के साथ और IRF5D इलाज के बिना Tsk / + चूहों से एस।
      2. हालांकि अभी भी संदंश में धमनी पकड़े, दो शाखाओं में कटौती, facialis बंद आ रहा है की अनुमति के पोत धीरे उठाया जा जबकि किसी भी काटा हुआ आसपास के ऊतकों की पहचान की और कटे जा सकता है।
      3. इस तरह से जारी रखें जब तक विभाजन पोत मुक्त करने के लिए दोनों बेटी धमनियों काटने पर पहुंच गया है। दिल को हटाने से वाहिका में राहत मिली दबाव की वजह से काटने से पहले वाहिकाओं शिकंजा कसने की कोई जरूरत नहीं है। MOPS बफर में पोत रखा, जबकि अन्य facialis धमनी विच्छेदित और अलग है।
      4. 175 माइक्रोन - 125 के एक टर्मिनल व्यास के साथ कांच pipettes पर उन्हें बांधने से जहाजों Cannulate। कांच pipettes और mops बफर के साथ बफर जलाशयों प्रीलोड करें।
        सावधानी: pipettes में बनाने से हवाई बुलबुले को रोकने।
      5. नेत्र टांके का उपयोग कर pipettes पर जहाजों बाँधो।
    4. एक औंधा triocular माइकर पर पोत कक्षों माउंटएक वीडियो कैमरा के लगाव के साथ oscope। जहाजों की स्क्रीन माप के लिए एक वीडियो कैलिपर माप प्रणाली के माध्यम से वीडियो चलाएँ। 20
      1. उन्हें एक दो कदम प्रक्रिया में दबाव। सबसे पहले, पोत 20 एमएमएचजी दबाव के बराबर के ऊपर एक ऊंचाई पर MOPS से भरे जलाशयों, मैन्युअल पोत को जलाशय लाइनों में पानी निकलने की टोंटी वाल्व खोलने के साथ। संबंधों के आसपास है और पोत की लंबाई नीचे लीक के संकेत के लिए पोत का निरीक्षण किया। दूसरा, 60 एमएमएचजी के लिए जलाशयों बढ़ाने के लिए और पोत reinspect।
      2. एक बार जब 60 एमएमएचजी पर दबाव डाला, वाहिकाओं 30 मिनट के लिए संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं।
    5. 3.0 x 10 -8 को 10 -7 एम U46619 - इसकी अधिकतम व्यास 1 का उपयोग कर के 75% - आदेश acetylcholine (10 -7 10 एम -4) के जवाब में वैसोडायलेटेशन का आकलन करने के लिए, 50 एक व्यास के लिए पोत preconstrict। अनुमति के बाद पोत, 6 मिनट के लिए स्थिर 2 मिनट की अवधि चरणों में स्नान करने के लिए acetylcholine जोड़ने की है कि इस तरहस्नान में अंतिम सांद्रता 10 -7, 10 -6, 10 -5, 10 -4 रहे हैं। सभी तीन समूहों में वैसोडायलेटेशन उपाय।

    7. कार्डिएक बाह्य मैट्रिक्स का अलगाव

    1. साथ और isoflurane (5%) के साथ पेप्टाइड उपचार के बिना C57BL / 6J चूहों पर नियंत्रण और TSK / + चूहों anesthetize और एक गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं। उरोस्थि साथ सीने में खुला काटने से दिल आबकारी। संदंश के साथ दिल को लिफ्ट और दिल को हटा दें।
    2. एक बीकर में हटा दिल रखो और 15 एमएल अतितनावी 1% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) जोड़ें। 1% एसडीएस समाधान के लिए एक हलचल पट्टी को जोड़ने और हलचल प्लेट पर बीकर डाल द्वारा कोशिकाओं को तोड़ने के लिए कमरे के तापमान पर 18 घंटे के लिए 1% एसडीएस समाधान में दिल आंदोलन।
      सावधानी: पता है कि बाह्य मैट्रिक्स यदि अतितनावी समाधान में भी लंबे समय के लिए छोड़ दिया बिखर जाएगा। इसके विपरीत, यदि दिल अतितनावी समाधान में काफी लंबे समय से उत्तेजित नहीं कर रहे हैं, तो कोशिकाओं को ठीक से नहीं होगाभंग करने और सेल मलबे बीकर में छोड़ दिया हो जाएगा।
    3. 15 एमएल 0.5% ट्राइटन X-100 में 30 मिनट के लिए धो लें। फिर 15 एमएल पीबीएस के साथ 15 मिनट के लिए धो लें। व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक दिल Decellularize।
    4. तरल नाइट्रोजन में बाह्य मैट्रिक्स स्नैप फ्रीज और एक पूर्व ठंडा मोर्टार और मूसल के साथ जमे हुए हृदय बाह्य मैट्रिक्स powderize।
    5. पीबीएस 1% एंटीबायोटिक युक्त चूर्णित मैट्रिक्स के निलंबन बनाओ। मात्रा ज्यादातर मामलों में जोड़ा 300 μL है। उच्च सेटिंग पर बर्फ पर 60 एस - 30 के लिए निलंबन Sonicate।
      नोट: यह बहुत महत्वपूर्ण है कि नमूना ठंड रहती है। पता है कि निलंबन उच्च प्रोटीन glycan सामग्री की वजह से बहुत चिपचिपा है रहो।
    6. एक ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण।
      नोट: सुनिश्चित नहीं है कि विरोधी जैविक और निलंबन में एंटी-फंगल। पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन सबसे अधिक इस्तेमाल किया और सिफारिश कर रहे हैं।

    Immunohistochemist द्वारा परमाणु स्थानान्तरण के 8. आकलनRY

    1. कोट व्यंजन और स्लाइड के लिए 20 माइक्रोग्राम प्रति पीबीएस में हृदय बाह्य मैट्रिक्स का / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता का उपयोग करें। कोटिंग के लिए एक 100 मिमी डिश में हृदय बाह्य मैट्रिक्स समाधान और एक स्लाइड पर अंतिम बाह्य मैट्रिक्स समाधान के 150 μL के Pipet 500 μL।
    2. संस्कृति में नवजात हृदय myocytes चूहे के लिए 24 घंटे के लिए एक 50 माइक्रोग्राम / एमएल एकाग्रता में IRF5D जोड़कर IRF5 रोकते हैं। इलाज myocyte संस्कृतियों पर नियंत्रण छोड़ दें।
    3. immunofluorescence का उपयोग करने के लिए नाभिक cytosol से IRF5 की तस्करी का आकलन करें और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण। , IRF5 के लिए हरी लेबलिंग पहचानें नाभिक के लिए नीले रंग DAPI दाग की पहचान
    4. प्राथमिक विरोधी IRF5 एंटीबॉडी लागू करें। पीबीएस में 200 कमजोर पड़ने: प्राथमिक एंटीबॉडी एक 1 में इस्तेमाल किया गया था। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं और तीन 5 मिनट धोने कदम के साथ पालन करें। माध्यमिक एंटीबॉडी एलेक्सा 488 लेबल बकरी विरोधी माउस आईजीजी एंटीबॉडी था।
    5. माध्यमिक एंटीबॉडी पतला 1: 1,000 diपीबीएस में lution। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी सेते हैं। DAPI के साथ परमाणु दाग ​​पाना। पीबीएस में 1,000: DAPI 1 पतला। स्लाइड 5 मिनट के लिए 3 बार की कुल धो और तीसरे और अंतिम चरण के लिए धोने DAPI जोड़ें।
    6. पहले के रूप में confocal माइक्रोस्कोपी और नाभिक में उपाय के प्रतिदीप्ति तीव्रता और cytosol का उपयोग करके कैद की तस्करी में 10 में वर्णित है। , IRF5 के लिए हरी लेबलिंग पहचानें नाभिक के लिए नीले रंग DAPI दाग की पहचान। कोशिकाओं है कि उन में हरे रंग की लेबलिंग के साथ नीले रंग के नाभिक का प्रदर्शन IRF5, जो नाभिक को cytosol से तस्करी सक्रिय होते हैं। जब IRF5 सक्रिय नहीं है, हरे रंग की लेबलिंग cytosol में पाया जाता है।
    7. confocal माइक्रोस्कोपी एक 40x तेल उद्देश्य का उपयोग करके fluorescently लेबल कोशिकाओं का विश्लेषण। IRF5 के लिए अधिक से अधिक 530 एनएम के 488 एनएम और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का प्रयोग करें। 360 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और DAPI के दृश्य के लिए 460 एनएम के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का प्रयोग करें।

    1. भीतर और समूहों के बीच दोहराया उपायों के लिए विचरण (एनोवा) का विश्लेषण करते हैं। छात्र टी परीक्षण के Bonferroni के संशोधन के साथ एनोवा का पालन करें। एक्सप्रेस मतलब की मानक त्रुटि के रूप में डेटा।

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Representative Results

चित्रा 1 में प्रदर्शन परिणाम कैसे एक पेप्टाइड डिजाइन करने के लिए दिखा। चित्रा 1, ऊपरी बाएँ, IRF5 में क्षेत्र (2 पीले तीर के बीच, अमीनो एसिड (एए) 425-436) है कि kinases की एक संख्या से phosphorylated दिखाता है। चित्रा 1, ऊपरी सही, एक पीले रंग की अंडाकार जहां IRF5 के फॉस्फोरिलेटेड डोमेन बांधता पता चलता है। 3DSH की dimeric संरचना कुण्डल 2 (aa303-312) के बाईं ओर एक फांक या घाटी का निरीक्षण करने के लिए घुमाया गया था। यह जहां IRF5 की phospho-पूंछ डोमेन जब यह पूरी तरह से सक्रिय होता है (यानी, सेरीन फॉस्फोरिलेटेड), के गठन एक homodimer और उसके ग्रहण जैविक रूप से सक्रिय राज्य के लिए बाध्य करने के लिए माना जाता है।

चित्रा 2 में, biolayer इंटरफेरोमेट्री द्वारा मापा बाध्यकारी गतिविधि दिखाया गया है। तय है कि प्रलोभन पेप्टाइड IRF5D विषाक्त नहीं है, प्रसार और apoptosis सी के इलाज के बाद का मूल्यांकन किया गयाIRF5D की बढ़ती सांद्रता (चित्रा 3) के साथ एल। ICAM-1, एक सूजन मार्कर, और IRF5 भाव के रूप में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (चित्रा 4) के द्वारा निर्धारित IRF5D साथ Tsk / + चूहों के इलाज के बाद कम हो गई थी। के रूप में IRF5D के साथ उपचार (चित्रा 5) के बाद immunohistochemistry द्वारा निर्धारित न्यूट्रोफिल (NIMP) और CD64 की संख्या में कमी कर रहे थे। Endothelial समारोह Tsk / + चूहों के facialis धमनियों में बाद IRF5D Tsk / + IRF5D उपचार (चित्रा 6) के बिना चूहों की तुलना में सुधार हुआ है। Tsk / + हृदय मैट्रिक्स पर सुसंस्कृत myocytes में IRF5 सकारात्मक नाभिक की अधिक से अधिक संख्या C57BL / 6J हृदय मैट्रिक्स की तुलना में कल्पना थे। IRF5D के साथ संस्कृतियों का उपचार IRF5 सकारात्मक नाभिक (चित्रा 7) के कम संख्या में हुई।

आकृति 1
चित्रा 1: 3 डी प्रोटीन स्ट्रक्चरल डिजाइनIRF5 के ई। ए) ऊपरी बाएँ आंकड़ा क्षेत्र पेप्टाइड के लिए डिजाइन किया गया था पता चलता है। IRF5 में 436 - बी) क्षेत्र है, जो किया जा रहा दो पीले तीर से प्रकाश डाला फॉस्फोरिलेटेड अमीनो एसिड (एए) 425 हैं। सी) कम पैनल homodimeric कार्यात्मक जटिल दर्शाया गया है। homodimeric आंकड़ा जहां क्षेत्र IRF5 की फॉस्फोरिलेटेड पूंछ डोमेन एक homodimer फार्म के लिए बांध की आसान देखने के लिए प्रस्तुत किया है। यह आंकड़ा पहले 21 प्रकाशित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: IRF5D की Biolayer इंटरफेरोमेट्री। यह आंकड़ा IRF5 के बंधन biolaye द्वारा मूल्यांकन IRF5D को दर्शाता है आर इंटरफेरोमेट्री। विश्लेषण सॉफ्टवेयर (एन =, ± एसडी मतलब 3) से पता चला है कि IRF5 3.72 ± 0.75 x 10 -6 एम के एक कश्मीर डी के साथ IRF5D को बांधता है। यह आंकड़ा पहले 21 प्रकाशित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: सेल प्रसार और Apoptosis। ये बार रेखांकन दिखाने IRF5D की बढ़ती सांद्रता सेल प्रसार (बाएं) या apoptosis (दाएं) पर कोई प्रभाव है कि, और IRF5D के बढ़ते स्तर से बदल नहीं थे। यह आंकड़ा पहले से प्रकाशित किया गया है 21 (मतलब ± एसडी, पी <0.05, एन = 4)।कश्मीर "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: ICAM -1 और IRF5 दिल में अभिव्यक्ति। के रूप में पश्चिमी धब्बा द्वारा प्रदर्शन ICAM-1 (ए) और IRF5 (बी) के भाव IRF5D उपचार के बाद Tsk + चूहों के मायोकार्डियम में कम है। डेटा actin लोडिंग नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत था (± एसडी, पी <0.05 मतलब है, एन = 3)। यह आंकड़ा पहले 21 प्रकाशित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:CD64 (ए) और NIMP (बी) के दिल में अभिव्यक्ति। monocytes / मैक्रोफेज और neutrophils की संख्या IRF5D उपचार के रूप में immunohistochemistry द्वारा प्रदर्शन के बाद कम था (± एसडी मतलब है, * = पी <0.05, C57BL / 6J बनाम Tsk / +; # = पी <0.025, Tsk / + बनाम Tsk / + + IRF5D, एन = 3, एंटीबॉडी प्रति 10 चित्र)। तीर monocytes / मैक्रोफेज (ए) और न्यूट्रोफिल (बी) पर प्रकाश डाला। स्केल सलाखों 10 माइक्रोन कर रहे हैं। यह आंकड़ा पहले 21 प्रकाशित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: सेल समारोह और Vasodilation। IRF5D प्रशासन में सुधार Tsk / + चूहों के facialis धमनियों की acetylcholine प्रेरित वैसोडायलेटेशन (मतलब &# 177; एसडी, पी <0.05, एन = 6)। यह आंकड़ा पहले 21 प्रकाशित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7: IRF5 निषेध के साथ संवर्धित myocytes में IRF5 की IRF5 परमाणु translocation। IRF5D द्वारा IRF5 निषेध (50 माइक्रोग्राम / एमएल, 24 घंटे) Tsk / + हृदय मैट्रिक्स और C57BL / 6J हृदय मैट्रिक्स पर सुसंस्कृत myocytes में कम IRF5 सकारात्मक नाभिक की ओर जाता है। तीरों को दर्शाती IRF5 सकारात्मक नाभिक (± एसडी, पी <0.05 मतलब है, एन = 3)। पैमाने पर पट्टी 5 माइक्रोन है। यह आंकड़ा पहले 21 प्रकाशित किया गया है। क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ k।

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Discussion

लक्ष्य Tsk / + चूहों के दिलों में सूजन, फाइब्रोसिस, और नाड़ी समारोह पर IRF5 की भूमिका को स्पष्ट करने के लिए एक IRF5 अवरोध डिजाइन करने के लिए किया गया था। निष्कर्ष है कि IRF5D प्रसार या apoptosis प्रेरित नहीं कर रहे हैं। इसके अलावा, सूजन कम हो गया था और नाड़ी समारोह में सुधार हुआ। ये आंकड़े बताते हैं IRF5 Tsk / + चूहों के दिल में सूजन और फाइब्रोसिस के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है यंत्रवत कि और यह एक चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में सेवा करने के लिए क्षमता है।

पहले कदम के लिए एक अवरोध डिजाइन करने के लिए किया गया था। जब एक पेप्टाइड बनाया गया है, कई बिंदुओं को ध्यान में रखा जाना है: अनुक्रम लंबाई, माध्यमिक संरचना, ऑक्सीकरण, एमिनो एसिड संरचना, amidation और कैपिंग, अमीनो एसिड एन टर्मिनस और सी टर्मिनस में अमीनो एसिड में होने का खतरा अवशेष, और ligand लगाव। आदर्श अनुक्रम लंबाई सबसे अच्छा समग्र उपज, कम दोष, और कम लागत सुनिश्चित करने के लिए 15 के बीच 10 अवशेषों है। यह महत्वपूर्ण हैउग्रवादी बीटा चादर गठन की तरह माध्यमिक संरचनाओं के बारे में पता होना। बीटा चादर गठन नष्ट कर दिया दृश्यों के एक उच्च डिग्री में परिणाम कर सकते हैं। ऑक्सीकरण जो प्रतिक्रियाओं जो पेप्टाइड की प्रभावशीलता को प्रभावित कर सकता पक्ष की नेतृत्व कर सकते हैं होने का खतरा अवशेषों से बचें। घुलनशीलता, संश्लेषण, और शुद्धि नियंत्रित करने के लिए, 50% हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड नीचे पेप्टाइड के लिए एमिनो एसिड इमारत ब्लॉकों की संरचना रखने के लिए और यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त आरोप लगाया अवशेषों देखते हैं कि। एन और सी Termini एक uncharged राज्य में चुने जाने की जरूरत। एन टर्मिनस पर ग्लूटामेट से बचें और सी टर्मिनस पर सिस्टीन, प्रोलाइन, और ग्लाइसिन से बचें। तह कम करने के लिए पेप्टाइड और ligand के बीच एक स्पेसर जोड़ें। इसलिए, वे प्रभारी के बिना एक एमाइड के रूप में नकाबपोश करने की आवश्यकता हो सकती है।

IRF5D डिजाइन 3 डी संरचना पर आधारित था। एक 17 मेर, करार दिया IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD), डिजाइन किया गया था, जहां aspartate (डी) सेरीन (एस) के लिए प्रतिस्थापित किया गया था 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD) पर IRF5 में फोस्फोराइलेशन नकल करने के लिए। इसदृष्टिकोण सीधे आगे उपन्यास कंप्यूटर प्रौद्योगिकी की वजह से है। इस तकनीक का दोष यह सॉफ्टवेयर में प्रारंभिक निवेश है। हालांकि, वहाँ महत्वपूर्ण समग्र बचत जब श्रम और फेज प्रदर्शन 22 की तरह, अन्य अवरोध डिजाइन तरीकों में प्रयुक्त सामग्री के साथ जुड़े लागत के साथ तुलना कर रहे हैं। इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम लक्ष्य प्रोटीन की 3 डी संरचना और उसके संभव बाध्यकारी साइटों की उपलब्धता है। एक अवरोध डिजाइनिंग की सीमा संभावना है कि एक गलत क्षेत्र चुना जाता है और अवरोध वांछित प्रोटीन को अवरुद्ध नहीं कर रहा है। दूसरी संभावना यह वांछित प्रोटीन की एक आंशिक अवरुद्ध है।

हाथ में पेप्टाइड के साथ ध्यान केंद्रित सेल अस्तित्व को मापने के द्वारा प्रलोभन पेप्टाइड की विषाक्तता परीक्षण के लिए ले जाता है। सबसे पहले, IRF5D अलग सांद्रता का उपयोग कर परीक्षण किया गया था। IRF5D apoptosis प्रेरित नहीं है और यहां तक ​​कि उच्च सांद्रता में प्रसार प्रचार नहीं करता। यहाँ तरीकों का इस्तेमाल किया एसटीए हैंndard और विश्वसनीय आंकड़े दे। Tetrazolium डाई bioreduction कई वर्षों से 23 के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस परख, अन्य तरीकों, जैसे की तुलना में इसकी reproducibility और समय-प्रभावशीलता के कारण चुना गया था मैन्युअल कोशिकाओं की गिनती जो बहुत समय लेने वाली है। proliferating कोशिकाओं लेबल BrdU का प्रयोग रेडियोधर्मिता है, जो संवेदनशील है की आवश्यकता है, लेकिन खतरनाक हो सकता है। tetrazolium डाई bioreduction समय कुशल है और रेडियोधर्मिता की आवश्यकता नहीं है। tetrazolium डाई bioreduction की सीमाओं oxido-reductive संभावित शामिल अध्ययन में प्रचलित है। जहां कहीं oxido-reductive संभावित होता है, झूठी सकारात्मक अधिक लगातार 24 हैं।

बाह्य मैट्रिक्स के अलगाव के एक अतितनावी समाधान के साथ सभी मायोकार्डियल कोशिकाओं भंग द्वारा अधिग्रहण कर लिया था। प्रोटोकॉल एक सरल प्रक्रिया आंदोलन 25 को एक छिड़काव उपकरण का उपयोग अध्ययन से विकसित किया गया था। duratआयन अलग अलग समय बिंदुओं लेने के द्वारा अनुभव से मूल्यांकन किया गया था: 12, 14, 16, 18, 20 h। अलग अलग समय के बाद 25 अंक बाह्य मैट्रिक्स सेल मलबे के लिए विश्लेषण किया गया था। decellularization का मुख्य नुकसान फंगल और बैक्टीरियल संदूषण हैं। यह एंटी-फंगल और एंटी-माइक्रोबियल यौगिकों का उपयोग करने की सलाह दी है। कोट बर्तन करने के लिए, बाह्य मैट्रिक्स powderized और पीबीएस में निलंबित कर दिया है। लोचदार सामग्री के उच्च सामग्री के कारण, नमूना पूरी तरह से भंग नहीं करता। नमूना को हीटिंग के बिना उच्च तीव्रता सेटिंग्स पर sonication जरूरी है। अन्य कोटिंग एजेंटों पर बाह्य मैट्रिक्स का उपयोग करने का लाभ यह है कि बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के एक समामेलन physiologically होने वाली है और यह जोड़ता इन विवो और इन विट्रो assays में है। यह दृष्टिकोण कोलेजन या fibronectin अकेले की तरह एक ही परिसर के साथ कोटिंग से अधिक शारीरिक है। यह भी में परिवर्तन की ओर से शुरू संकेत के महत्व में जानकारी देता हैबाह्य मैट्रिक्स। इस प्रोटोकॉल की एक सीमा स्पष्ट रूप से मैट्रिक्स और मैट्रिक्स से महत्वपूर्ण संकेत घटकों को हटाने का विनाश है। ऐसा नहीं है जब मैट्रिक्स decellularizing सतर्क रहना जरूरी है।

बरकरार ऊतक की तरह अलग-थलग वाहिकाओं के उपयोग के बगल में और एंजाइमों के न्यूनतम हस्तक्षेप के साथ वैसोडायलेटेशन अध्ययन करने की संभावना को खोलता है। इस विधि सबसे जानवरों और रोगों की एक किस्म में endothelial समारोह का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त है। Duling पहले सूअरों में इस विधि का वर्णन करने के लिए किया गया था। सुअर में जहाजों के ऊतकों में गहरी हैं; इसलिए कागज जिलेटिन निर्धारण का वर्णन किया। वैसोडायलेटेशन में प्रारंभिक अध्ययन मन्या धमनियों 26 का इस्तेमाल किया। हम तकनीक परिष्कृत facialis धमनियों 27 का उपयोग करने के लिए। Facialis धमनियों कैरोटिड धमनी से एक प्रतिरोध धमनी के आकार में और अधिक बराबर हैं। इस प्रोटोकॉल की एक सीमा जहाज है, जो जरूरत की कमजोरी बरकरार requirin हटाया जा रहा हैजी अभ्यास।

सारांश में, विकासशील IRF5D दिल में सूजन और फाइब्रोसिस में IRF5 की भागीदारी का आकलन करने के लिए हमें सक्षम होना चाहिए। इस डाटा को इस अध्ययन में दर्शाया में हुई। IRF5D के रूप में अच्छी तरह से विभिन्न रोगों में IRF5 के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक संभव दवा लक्ष्य 28 के रूप में IRF5 पता चलता है के रूप में एक उपयोगी उपकरण है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Triton X 100 Sigma Aldrich X100- 100ml
Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody  Thermo Fisher A11001
Bardford reagent Thermo Fisher 23200 Pierce 
Biosensors Forte-Bio MR18-0009
CD64 (H-250) Santa Cruz Biotechnologies sc-15364
CellEvent Caspase-3/7 Substrate Thermo Fisher/Life Technologies C10427
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit Promega G3580 Promega
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fisher D-1306 1:1,000 dilution in PBS
donkey anti rat Alexa 488 Thermo Fisher A-21208 1:1,000 dilution in PBS
ECL plus GE healthcare/Amersham RPN2133 After a lot of trial and error we came back to this one
Eclipse TE 200-U microscope with EZ C1 laser scanning software Nikon
goat anti rabbit Alexa 488 Thermo Fisher A-11008 1:1,000 dilution in PBS
HRP  anti-goat Santa Cruz Biotechnologies sc-516086 !:10,000 dilution in TBS
HRP donkey anti-mouse Santa Cruz Biotechnologies sc-2315 1:10,000 dilution in TBS
ICAM-1 antibody Santa Cruz Biotechnologies sc-1511 1:200 dilution in PBS
IRF5 antibody (H56) Santa Cruz Biotechnologies sc-98651
Micro plate reader Elx800 Biotek
NIMP neutrophil marker Santa Cruz Biotechnologies sc-133821 1:200 dilution in PBS
Octet RED Forte Bio protein-protein binding
Peptide design  Medit SA software RCSB.org
Recombinant IRF5 protein synthesis TopGene Technologies protein expression, synthesis service
sodium dodecyl phosphate Sigma Aldrich 436143 detergent
Ketamine Pharmacy Schedule III controlled substance, presciption required 
Xylazine MedVet
3.5X-45X Trinocular Dissecting Zoom Stereo Microscope with Gooseneck LED Lights Am Scope SKU: SM-1TSX-L6W
Zeba Desalting Columns Thermofisher 2161515
Endothelial Basal Media EBM Bullet kit Lonza CC-3124 kit contains growth supplemets
VIA-100K  Boeckeler Instruments
4 - 15% TGX gel Bio-Rad 5671081
MedSuMo software Medit, Palaiseau, France
Laemmli Buffer BioRad

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 121 सूजन फाइब्रोसिस मायोकार्डियम endothelial समारोह IRF5 scleroderma
पृथक वेसल्स के वैसोडायलेटेशन और चुस्त-त्वचा चूहे के बाह्य मैट्रिक्स का अलगाव
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Weihrauch, D., Krolikowski, J. G.,… More

Weihrauch, D., Krolikowski, J. G., Jones, D. W., Zaman, T., Bamkole, O., Struve, J., Pagel, P. S., Lohr, N. L., Pritchard, Jr., K. A. Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice. J. Vis. Exp. (121), e55036, doi:10.3791/55036 (2017).

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