Introduction
세포 증식과 세포 사멸의 면역 반응의 조절은 인터페론 조절 인자의 전사 인자 계열의 역할 핵심이다. IRF5는 1 형과 면역 반응의 조절, 염증 촉진 반응과 2 형, 면역 반응 대상으로 조직 복구에 매우 중요하다고 강조한다. IRF5 1 암 및자가 면역 2, 3, 4, 5의 핵심이다.
꽉 피부 마우스 (쯧 / +)이 때문에 피 브릴 린 (fibrillin)-1 유전자의 중복 돌연변이에 조직의 섬유화 및 경피증을위한 모델이다. 단단한 피부에이 돌연변이 결과 및 결합 조직의 증가. 이러한 쥐 심근 염증, 섬유증 최종적 심부전 5, 6, 7을 개발> 8,9. 경피증은 미국 (6)에서 약 15 만 명에 영향을 미치는자가 면역 섬유 성 질환이다. 이 질환의 특징은 하트 7, 8, 9, 10, 11을 포함한 내부 장기의 섬유화된다.
연구의 특성상 저해 펩티드의 디자인을 요구했다. 소프트웨어 방법은 파지 디스플레이를 이용하여 기존의 방식을 통해 선택되었다. 소프트웨어 접근 방식은 쉽고 적은 시간을 소모합니다. RCSB 데이터 뱅크는 적절한 결합 부위 (12)를 식별하는 데 사용된다. 재조합 단백질 새롭게 설계 펩타이드의 상호 작용을 연구 및 바인딩 파라미터에 집중하는 기술이라고 biolayer 간섭 법을 사용 하였다. Biolayer 간섭은 바이오 센서 기반 techniq입니다UE 즉, 바이오 센서 및 바인딩 샘플을 사용하여 결합 친화, 협회 및 탈퇴를 결정한다. 바이오 센서는 형광, luminescently, 라디오 측정 및 비색 표시 될 수 있습니다. 이 측정은 질량 부가 또는 고갈 협회 탈퇴 13, 14 닮은에 기초한다. 본 연구의 목적은 염증과 심근 섬유증 IRF5의 역할을 이해하는 것이다. 목표는 조직의 섬유화 및 경피증의 개발에 IRF5의 역할에 대한 통찰력을 얻을 수 있었다.
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Protocol
이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 엄격히 준수하여 실시 하였다. 이 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (: AUA 번호 1517 프로토콜)에 의해 승인되었다. 마우스와 관련된 모든 연구는 PHS 정책에 부합 하였다.
미끼 펩타이드 1. 디자인
- IRF5의 3D 구조를 찾아 그 위에 디자인을 기반으로. 438 (ELSWSADSIRLQISNPD) - 17 메르 디자인, 아스 파르 테이트 (D)가 421에서 IRF5의 인산화를 모방하는 세린 (S)로 대체된다 IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD)를,라고. 3D의 설 프히 드릴 그룹 및 활성화 IRF5의 메커니즘에 대한 지식, 즉, 세린 인산화의 분석 IRF5을 대상으로 하나의 전략이 미끼 펩타이드를 생성 할 것을 제안했다. 그림 1을 참조하십시오. 3 차원 구조에서 최적의 영역을 식별하기 위해 작은 molecul 설계를위한 분자 모델링 소프트웨어를 사용하여ES 및 펩타이드 15.
주 :이 프로세스의 중요한 단계는 3D 대상 단백질의 구조 및 그것의 가능한 결합 부위의 이용이다. IRF5의 3 차원 구조를 정확하게 인산화 후 어떻게 IRF5 dimerizes을 나타냅니다. 세린 또는 트레오닌에 대한 아스파 테이트의 대체 아웃소싱. 펩타이드 IRF5에 연결되지 않고 개별적으로 합성된다. - 단순히 원래의 시퀀스에 기초하여 S.위한 D를 대입하여 포스 도메인 복제 (ELSWSADSIRLQISNPD는 AC-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH 2 (IRF5D)의 아미노산 서열을 갖는 새로운 펩타이드 IRF5S을 만든다.
2. Biolayer 간섭계 (BLI)
참고 : 재조합 IRF5의 정제 아웃소싱했다. (16)
- (1)의 몰비 바이오틴 라벨 IRF5 : 바이오틴 1 장쇄 링커를 포함하는 비 오티 닐화 시약 리간드. 긴 체인 링커는보다 적극적이고 동질적인 리그를 보장합니다차 표면.
- 20 mM의 비오틴 시약 13 μL에 2 mg을 1 ㎖ / mL의 IRF5을 추가하거나 필요한 경우 볼륨을 높입니다. 2 시간 동안 얼음에서 인큐베이션. 표지 한 후, 표지 된 단백질로부터 반응 혼합물을 제거하는 탈염을 스핀 컬럼을 사용한다.
- 15 분 동안 바이오 센서와 비오틴 표지 된 리간드를 부화. 오버 라벨을 피하고 1 조정 : 1 몰비. 표지 한 후, 표지 된 단백질로부터 반응 혼합물을 제거하는 탈염을 스핀 컬럼을 사용한다.
- IRF5 디코이 펩티드의 상이한 농도에서 10 분간 비오틴 표지 IRF5 바이오 센서 부화. 협회와 해리 비율은, 18 17, 10 설명한 바와 같이 측정 하였다.
3. 세포 사멸 및 증식 분석 실험
- 테트라 졸륨의 bioreduction 통해 증식 분석
- IRF5D는 PBS에 희석 관리 (1 밀리그램 /kg / d를 21 일 동안 쯧 / + 및 C57BL / 6J 마우스에 혼자 PBS 표준 scruffing 기술에 의해 또는하여 27 게이지 바늘로 피하)은 20g 마우스에 볼륨 20 μL를 주입.
- 이소 플루 란 (5 %)로 쥐를 마취하고 경추 탈구를 수행합니다. 흉골을 따라 가슴을 열고 절단하여 마음을 절제. 집게와 함께 마음을 들어 올리고 심장을 제거합니다.
- 를 Lyse 50 mM 트리스 -HCl, pH 7.4, 브래드 포드 분석법 (19)에 의해 0.5 % NP-40, 250 mM의 염화나트륨, 5 mM의 EDTA, 50 mM의 NaF로 (10) 및 결정 단백질 농도를 함유하는 단백질을 용해 완충액으로 마음.
- 부 (7)에 기술 된 바와 같이 고립 된 C57BL / 6J 심장 매트릭스 코트 96 웰 플레이트 희석 PBS를 20 μg의 / ㎖의 농도로 C57BL / 6J 심장 행렬을 일시 중단하고 각 웰에 C57BL / 6J 심장의 30 μL를 추가합니다. 이 인큐베이터에서 37 ° C에서 하룻밤 정착하자.
- 내피의 기저 m의 500 ㎖를 사용하여 배양 인간 제대 정맥 세포0.4 % 소 뇌 추출물, 0.1 % 아스코르브 산, 0.1 % 하이드로 코르티손, 0.1 % 인간 표피 성장 인자, 2 % 우 태아 혈청 및 젠타 마이신 / 암포 테리 신 B가 추가로 0.1 % edia. 문화 아니라 당 25,000 세포의 밀도와 5 % CO 2, 95 %의 실내 공기에서 96 웰 플레이트에 세포. 0 사이 IRF5D 농도의 증가와 함께 자극 - 미디어에 100 μg의 / ㎖ (양을 0에서 50 μL / ㎖ 사이에 있었다).
- 사흘 세포 증식을 결정하고 마이크로 플레이트 리더에 대한 흡광도의 차이를 평가한다. 반응물 MTS 테트라 졸륨 화합물의 bioreduction이다. NADPH 또는 NADH는 대사 활성 세포에서 탈수소 효소에 의해 생성된다.
- MTS에 테트라 졸륨 화합물을 -20 ℃에서 냉동 저장되기 때문에, 상기 화합물을 실온에서 천천히 위에 대략 90 분간 해동. 피펫 (20)를 96 웰 플레이트의 각 웰에 μL, 그것에 배양액 100 μL를 추가한다. 습도에서 1 ~ 4 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어dified, 5 % CO 2 챔버.
- 490 nm의 파장에서 흡광도를 참조하십시오.
- 카스파 활동을 통해 세포 사멸 분석
참고 :이 실험 장치는 3.1.5에 3.1.1 상기와 동일합니다.- 용지에 100 μg의 / ㎖ - 0 사이 IRF5D 증가하는 농도로 세포를 자극한다.
- ECS에에 카스파 3/7 기판에 녹색 감지 기능을 추가하고 37 ° C에서 30 분 동안 그것을 품어. 530분의 502 나노 미터의 흡수 / 방출 파장과 동시에 마이크로 플레이트 리더에서 형광을 평가한다. 세중의 실험을 실행합니다.
주 : 녹색 형광 제는 핵산 결합 색소에 결합 된 네 개의 아미노산 펩타이드이다. 카스파 제 3, 7 정품 인증 후 절단 할 때 시약은 형광된다. 이 형광을 측정한다. 이점은 세척 단계의 감소이다.
들으에서 IRF5 및 ICAM-1 발현 4. 평가티
- 표준 scruffing 기술에 의해 또는 혼자 쯧 / + 및 C57BL / 6J 마우스로 한 번 PBS로 27 게이지 바늘로 피하 (20 g을 마우스에 볼륨 20 μL를 주입, 1 ㎎ / ㎏ / d)에 PBS에 희석 IRF5D를 관리 이십일일에 대한 하루.
- 이소 플루 란 (5 %)로 쥐를 마취하고 경추 탈구를 수행합니다. 흉골을 따라 가슴을 열고 절단하여 마음을 절제. 집게와 함께 마음을 들어 올리고 심장을 제거합니다.
- 를 Lyse 50 mM 트리스 -HCl, pH 7.4, 브래드 포드 분석법 (19)에 의해 0.5 % NP-40, 250 mM의 염화나트륨, 5 mM의 EDTA, 50 mM의 NaF로 (10) 및 결정 단백질 농도를 함유하는 단백질을 용해 완충액으로 마음.
- 마음의 해물에 웨스턴 블롯을 수행합니다. 25 μg의 총 단백질 및 5 % 글리세롤을 함유하는 램 믈리 시료 완충액 40 μL의 부피로 샘플을 희석. 5 분 50 MV에서 15 % TGX 젤 - 4의 샘플을 실행합니다. 염료 앞이 다 될 때까지 1 시간 동안 100 MV에 전압을 증가시킨다.
- 15 분 - (필요한 경우 8.3의 pH를 조정, 25 mM 트리스, 190 mM의 글리신, 20 % 메탄올) 10 부화 1X 전송 버퍼에 젤을 놓습니다.
- 전사 샌드위치 (스폰지 필터, 겔, 셀룰로스 멤브레인 필터, 스폰지)를 조립한다. 기포가 사이에 갇혀되지 않습니다 있는지 확인하십시오. 블롯은 양극과 음극에서 겔이어야한다. 100mA의 추운 방에서 1 시간 동안 전송합니다.
- 다음 날, 오 린스 한 후, 실온에서 30 분 동안 5 % 탈지 분유 백그라운드 블록. 트리스 블롯을 5 분마다 5 % 트윈 세 번을 함유하는 완충 식염수 헹군다.
- IRF5 또는 ICAM-1 차 폴리 클로 날 항체를 사용하여 기본 항체와 하룻밤 품어. 1000 희석 : 트리스 항체는 1 완충 식염수 희석.
- 트리스 이차 항체 완충 염수로 희석하고, 실온에서 1 시간 동안 블롯을 배양한다. 이차 항체를 들어, 사용 양 고추 냉이 과산화 효소가 접합 된 당나귀 항 - 마우스 IGG (1 : 10,000) 및 고추 냉이 퍼 옥시 다제 당나귀 방지 염소 IgG를 (1 : 10,000) 각각.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 혼합 구성 요소 후 오에 화학 발광을 적용하고 관심있는 밴드를 조명하기 위해 3 분 동안 품어. X 선 필름에 노출 오. 밀도를 측정하기 위해 ImageJ에 사용합니다. 상기 제어 대역 (10)에 밀도 값을 정규화한다.
IRF5 억제 후 염증성 세포 수의 (5) 평가
- 표준 scruffing 기술에 의해 또는 PBS에 의해 피하 27 게이지 바늘로 PBS (1 ㎎ / ㎏ / d)에 희석 IRF5D를 관리 형 쯧에 / + 21 일 C57BL가 / 6J 마우스.
- 이소 플루 란 (5 %)로 쥐를 마취하고 경추 탈구를 수행합니다. 흉골을 따라 가슴을 열고 절단하여 마음을 절제. 집게와 함께 마음을 들어 올리고 심장을 제거합니다. 스냅 동결 및 분석까지 절제의 마음을 저장합니다.
- 담배 마는에 얼어 붙은 마음을 탑재사용되는 저온 유지 장치에 적합한 단말 보유자. 면역 조직 화학 염색을위한 저온 유지 장치에 10 μm의 두께 동결 절편을 잘라.
- 실온에서 20 분 동안 인산염 완충 염수 중 1 % 파라 포름 알데히드로 고정 된 부분을 고정한다. 5 분 동안 PBS에서 0.5 % 트리톤 - X 100 섹션을 Permeabilize 하시려면.
주의 : 파라 포름 알데히드가 규제 발암 물질이며주의하여 취급 할 필요가있다. - 항 - 토끼 CD64, 단핵구 / 대 식세포 마커 1을 희석 : (200)을 PBS에. 고정 섹션에 적용하고 37 ° C에서 30 분 동안 품어.
- 실온에서 5 분 동안 PBS로 세 번 슬라이드를 세척한다.
- 안티 쥐 NIMP, 기본 호중구 마커 1을 희석 : (200)을 PBS에. 고정 섹션에 적용하고 37 ° C에서 30 분 동안 품어.
- 실온에서 5 분 동안 PBS로 3 회 세척 슬라이드.
- 이차 항체를 항 - 토끼 희석 알렉사 488 공액 안티 쥐 알렉사 488 (1) 공액 200를 PBS로.
- 항 - 토끼 알렉사 (48)을 적용8 결합 및 안티 쥐 알렉사 37 ° C에서 30 분 동안 섹션에 488 복합 이차 항체 따라. 항체의 양은 부분의 크기에 따라 달라진다. 양이 넉넉한 섹션을 포함해야한다. 대부분의 경우에 체적이 100 내지 200 μL이다.
- PBS에서 1,000 희석 : 1의 핵 얼룩으로 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI)를 사용합니다. 1 mL의 PBS로 1 μL를 추가하고 마지막 세척 단계에서 DAPI를 사용합니다. 커버 슬립에 수성 장착 미디어를 추가하고 슬라이드에 넣어.
- 40 배 오일 목표를 사용하여 공 초점 현미경에 의한 형광 표지 된 부분을 분석합니다. 사용 여자는 CD64과 NIMP에 대한보다 큰 530 nm 인 488과 발광 파장을 파장을. DAPI는 360 nm의에 흥분과 파란색 460 nm에서 방출되었다. 서로 다른 라벨로 (각 그룹의 3 가지 마우스에서, n은 항체 당 10 이미지) 단핵구 / 대 식세포와 호중구를 구분하고이를 계산합니다. 계산 세포의 수와 같은 데이터를 표현한다.
IRF5의 억제 후 6 셀 의존 혈관 확장
- (- 100 ㎎ / ㎏ 80) / 자일 라진 (10-12.5 ㎎ / ㎏) 혼합물과 케타민과 펩타이드 처리없이 C57BL / 6J 제어 마우스 및 쯧 / + 마우스를 마취. 복강 케타민 / 자일 라진의 혼합물을 주입한다. 수동으로 마우스를 억제.
- 25 게이지 또는 작은 바늘을 사용합니다. 복부의 오른쪽 아래 사분면에 바늘을 삽입합니다. 바늘이 혈관 또는 창자를 입력하지 않도록 주입 전에 플런저를 철회.
- 마취의 충분한 수준에 도달하면, 누운 위치에 마우스를 확보 알코올을 적신 거즈 패드와 모피를 닦아, 그리고 가위가 흉강을 열고 심장을 제거하여.
참고 : 과다 출혈 마우스를 안락사와 혈관을 절단 할 때 따라서 출혈을 최소화 혈관에 압력을 완화하여 쉽게 절개를 만들 것입니다.- 피부 날기를 엽니 다턱의 앞쪽으로 기본 조직을 방해하지로서 위의 조지아 쌍주의 턱뼈에 가슴 측면에서 절단.
- 주변 연조직을 제거하여 facialis 동맥 해부.
- 주의 : MOPS 버퍼에 목욕 노출 된 조직을 유지하면서 facialis 동맥에 혈관 또는 예인선을 손상하지 마십시오 (2.0 mM의 염화칼슘 2 · 2H 2 O, 0.02 mM의 EDTA, 5.0 mM의 포도당, 4.7 밀리미터의 KCl, 1.17 mM의 황산 4 · 7H 2 O, 3.0 MM의 MOPS, 145 mM의 염화나트륨, 1.2 밀리미터의 NaH 2 PO 4 · H 2 O, 2.0 mM의 피루브산)는 탈수를 방지합니다. 양안 스테레오 줌 해부 현미경 (45 배에 3.5 배의 배율) 및 광섬유 광원에서 수행합니다.
- facialis 동맥을 분리합니다.
- 동맥이 절단 될 위치에 대한 첫 번째 분기 및 말단에 facialis의 근위부를 잡고. 부모 동맥 외부 경동맥의 동맥을 잘라. facialis의 arterie를 제거와 IRF5D 처리없이 제어 마우스, 쯧 / + 마우스에서의.
- 여전히 포셉에서 동맥을 누른 상태에서, 두 가지가 어떤 포경 주변 조직이 식별 및 절단 될 수있는 반면 선박이 부드럽게 해제 할 수는 facialis을 오는 잘라.
- 분기점은 선박을 확보하기 위해 두 딸의 동맥을 절단에 도달 할 때까지이 방법을 계속합니다. 심장을 제거하지 혈관에 안심 압력으로 인해 가공하기 전에 용기를 고정 할 필요는 없다. 다른 facialis 동맥을 해부 및 격리 된 상태에서 MOPS 버퍼에 용기를 넣습니다.
- 175 μm의 - (125)의 단자 직경이 유리 피펫에 그들을 묶는하여 혈관을 Cannulate. MOPS 버퍼 유리 피펫 및 버퍼 저수지를 미리로드.
주의 : 피펫에 형성되는 공기 방울을 방지합니다. - 안과 용 봉합사를 사용하여 피펫에 혈관을 묶어.
- 반전 triocular MICR에 선박 챔버를 탑재비디오 카메라 첨부 oscope. 혈관 화면 측정에 대한 비디오 캘리퍼 측정 시스템을 통해 동영상을 실행. (20)
- 두 단계의 과정을 가압. 제 20 mmHg의 압력과 동일 용기 위의 높이에서 MOPS 채워진 저장소 수동 용기 리저브 라인 스톱 콕 밸브를 열로. 동점 주위와 선박의 길이 아래로 누출 흔적이 선박을 검사합니다. 둘째, 60 mmHg로에 저수지를 제기하고 용기를 재검사.
- 60 mmHg의 압력으로되면, 용기를 30 분 동안 평형을 허용한다.
- 3.0 X 10-8 10-7 M의 U46619 - 1을 이용하여 그 최대 직경의 75 % - 아세틸 콜린 (10-7 M 내지 10-4)에 응답하여 혈관 확장을 평가하기 위해, 직경 50 선박 preconstrict. 시킨 후 용기는 6 분 동안 2 분 안정화 시간 단계에서 욕조로 아세틸 등을 추가하는목욕의 최종 농도는 10-7, 10-6, 10-5, 10-4이다. 세 그룹 모두에서 혈관 확장을 측정합니다.
심장 세포 외 매트릭스의 7 격리
- 로와 이소 플루 란 (5 %)와 펩타이드 처리없이 C57BL / 6J 제어 마우스 및 쯧 / + 마우스를 마취하고 경추 탈구를 수행합니다. 흉골을 따라 가슴을 열고 절단하여 마음을 절제. 집게와 함께 마음을 들어 올리고 심장을 제거합니다.
- 비이커에 제거 마음을 넣어 15 mL로 고장 성 1 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS)를 추가한다. 1 % SDS 용액에 교반 막대를 추가하고 저어 접시에 비커를 넣어 세포를 파괴 실온에서 18 시간 동안 1 % SDS 용액의 마음을 선동.
주의 : 고장 성 용액에 너무 오래 방치하면 세포 외 기질이 분해된다는 점에 유의해야합니다. 마음이 고장 성 용액에 충분한 시간 교반하지 않으면 반대로, 만약 세포가 적절하지 않을 것이다용해 비커에 남아있는 세포 파편이있을 것이다. - 15 mL의 0.5 % 트리톤 X-100의 30 분 동안 세척 하였다. 그런 다음 15 mL의 PBS로 15 분간 씻는다. 개별적으로 마음을 Decellularize.
- 액체 질소에서 세포 외 기질을 스냅 동결과 미리 냉각 박격포와 유 봉 얼어 붙은 심장 세포 외 기질을 powderize.
- PBS 1 % 항생 물질을 함유하는 분말 화 된 기질의 현탁액을 만든다. 대부분의 경우에 추가 된 부피 300 μL이다. 높은 설정에 얼음에 60 초 - 30 현탁액을 초음파 처리.
참고 : 샘플 차가운 유지하는 것이 매우 중요합니다. 서스펜션으로 인해 높은 단백질 글리 칸 콘텐츠에 매우 점성주의하십시오. - 브래드 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정한다.
참고 : 서스펜션의 항생, 항 곰팡이가 있는지 확인합니다. 페니실린 / 스트렙토 마이신이 가장 일반적으로 사용되는 추천이다.
Immunohistochemist에 의한 핵 전좌 8. 평가공예
- 코트 요리와 슬라이드에 20 μg의 PBS에서 심장 세포 외 기질의 / mL의 최종 농도를 사용합니다. 심장 세포 외 기질 코팅 100mm의 접시에 용액과 슬라이드에 최종 외 기질 용액 150 μL의 500 μL 피펫.
- 배양 신생아 심장 근세포 쥐를 24 시간 동안 50 μg의 / ㎖ 농도 IRF5D 추가하여 IRF5을 억제한다. 처리되지 않은 심근 문화를 제어 둡니다.
- 핵 사용하여 면역에 세포질에서 IRF5의 인신 매매를 평가하고 공 초점 현미경으로 분석 할 수 있습니다. , IRF5의 녹색 표시를 확인하고 핵의 푸른 DAPI 염색을 식별
- 기본 안티 IRF5 항체를 적용합니다. PBS 200 희석 차 항체는 1에서 사용 하였다. 37 ° C에서 30 분간 슬라이드를 부화 세 5 분간 세척 단계를 따른다. 이차 항체 알렉사 488 표지 된 염소 항 - 마우스 IgG 항체이다.
- 희석 이차 항체를 1 : 1,000 디PBS에서 lution. 37 ° C에서 30 분 동안 이차 항체 인큐베이션. DAPI 핵 얼룩을 얻을 수 있습니다. PBS 1000 : DAPI 1 희석. 5 분 동안 슬라이드 3 회 총을 씻고 세 번째와 마지막 세척 단계에 DAPI를 추가합니다.
- 이전으로 공 초점 현미경과 핵에서 측정 형광 강도와 세포질을 사용하여 캡처 인신 매매 (10)을 설명했다. , IRF5의 녹색 표시를 확인하고 핵의 푸른 DAPI 염색을 식별합니다. 그들 녹색 라벨과 푸른 핵을 나타내는 세포는 핵 세포질에서 인신 매매 IRF5를 활성화 들어 있습니다. IRF5이 활성화되지 않은 그린 표지는 세포질에서 발견된다.
- 40 배 오일 목표를 사용하여 공 초점 현미경에 의한 형광 표지 된 세포를 분석 할 수 있습니다. IRF5보다 큰 530 nm 인 488 nm의 방출 파장의 여기 파장을 사용합니다. 360 나노 미터의 여기 파장 및 DAPI 시각화 460 나노 미터의 방출 파장을 사용한다.
- 내 및 그룹 사이의 반복 측정에 대한 분산 (ANOVA) 분석을 수행합니다. 학생 t 테스트의 페로 니의 수정과 ANOVA를 수행합니다. 평균의 표준 오차로 데이터를 표현한다.
- (- 100 ㎎ / ㎏ 80) / 자일 라진 (10-12.5 ㎎ / ㎏) 혼합물과 케타민과 펩타이드 처리없이 C57BL / 6J 제어 마우스 및 쯧 / + 마우스를 마취. 복강 케타민 / 자일 라진의 혼합물을 주입한다. 수동으로 마우스를 억제.
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Representative Results
도 1에서 보여준 결과 펩타이드를 디자인하는 방법을 보여준다. 그림 1, 왼쪽은 키나제의 숫자에 의해 인산화되어 IRF5의 영역 (2 노란색 화살표 사이, 아미노산 (AA) 425-436)를 보여줍니다. 그림 1, 오른쪽은 IRF5의 인산화 도메인이 결합하는 노란 타원형을 보여줍니다. 3DSH의 이량 체 구조는 나선 2 (aa303-312)의 왼쪽에 갈라진 틈이나 계곡을 관찰하기 위해 회전했다. IRF5의 포스 테일 도메인이 완전히 (즉, 세린 인산화) 호모 다이머 형성 및 가정 생물학적으로 활성 상태로 활성화 될 때 바인딩 예상되는 곳이다.
도 2에서, biolayer 간섭계에 의해 측정 된 결합 활성이 도시되어있다. 미끼 펩타이드 IRF5D는 독성이 아님을 확인하려면, 증식 및 세포 사멸은 C를 처리 한 후 평가 하였다IRF5D의 농도를 (그림 3) 증가 ELL 학생. ICAM-1, 염증 마커 및 IRF5 표현은 웨스턴 블롯 분석 (그림 4)에 의해 결정되는 IRF5D와 쯧 / + 마우스 치료 후 감소 하였다. IRF5D 치료 (그림 5) 후 면역 조직 화학 염색에 의해 결정되는 호중구 (NIMP) 및 CD64의 수는 감소 하였다. IRF5D가 IRF5D 치료 (그림 6)없이 쯧 / + 마우스와 비교 후 내피 기능 쯧 / + 마우스의 facialis 동맥에서 향상되었다. 쯧 / + 심장 매트릭스에서 배양 심근 세포에 IRF5 긍정적 인 핵의 큰 번호는 C57BL / 6J 심장 매트릭스에 비해 시각화 하였다. IRF5D와 문화의 치료는 IRF5 긍정적 인 핵 (그림 7)의 수가 감소의 결과.
그림 1 : 3D 단백질 StructurIRF5의 전자. A) 상단 왼쪽 그림은 펩타이드 위해 설계 된 영역을 보여줍니다. IRF5에서 436 - B) 두 개의 노란색 화살표로 강조 인산화되고이 지역은 아미노산 (AA) (425)에게 있습니다. C) 하판은 동종이 량체 복합체의 기능을 나타낸다. 동종이 량체 그림은 IRF5의 인산화 꼬리 도메인이 동종 이합체를 형성하기 위해 결합 영역을 쉽게 볼 수 있도록 제공됩니다. 이 그림은 이전에 21 게시되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : IRF5D의 Biolayer 간섭계. 이 그림은 biolaye에 의해 평가 IRF5D 할 IRF5의 결합을 보여줍니다 r에 간섭. 분석 소프트웨어는 IRF5는 3.72 ± 0.75 × 10 -6 M의 K d를 함께 IRF5D에 결합 것으로 나타났다 (SD ± 의미를, N = 3). 이 그림은 이전에 21 게시되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 세포 증식 및 세포 사멸. 이러한 막대 그래프는 IRF5D 증가하는 농도가 세포 증식 (왼쪽) 또는 아폽토시스 (오른쪽)에 영향이 없다는 것을 보여 주며, IRF5D 수준의 증가에 의해 변경되지 않았다. 이 그림은 이전에 21 (평균 ± SD, P <0.05, N = 4) 출판되었습니다.K ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 심장에서 ICAM-1과 IRF5 식입니다. 웨스턴 블롯에 의해 입증 된 바와 같이 ICAM-1 (A) 및 IRF5 (B) 식은 IRF5D 처리 후의 쯧 + 쥐의 심근 감소 하였다. 데이터가 액틴 부하 제어에 정상화되었다 (SD, P <0.05 평균 ± N = 3). 이 그림은 이전에 21 게시되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 :심장에서 CD64 (A) 및 NIMP는 (B) 식입니다. 단핵구 / 대 식세포와 호중구의 수는 (SD 평균 ± 면역 조직 화학 염색에 의해 입증 된 바와 같이 IRF5D 처리 후 감소 하였다 * = P <0.05, 쯧 대 C57BL / 6J / + # = p <0.025, 쯧 / + 쯧 대 / + + IRF5D, N = 3, 항체 당 10 이미지). 화살표는 단핵구 / 대 식세포 (A) 및 호중구 (B)를 강조. 스케일 바는 10 μm의 수 있습니다. 이 그림은 이전에 21 게시되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 세포 기능 및 혈관 확장. IRF5D 정부는 쯧 / + 마우스의 facialis 동맥의 아세틸 콜린에 의한 혈관 확장을 (의미 개선# 177; SD, p <0.05, N = 6). 이 그림은 이전에 21 게시되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : IRF5 억제와 배양 심근 세포에 IRF5의 IRF5 핵 전좌. IRF5D에 의해 IRF5 억제 (50 μg의 / mL로, 24 시간)을 쯧 / + 심장 매트릭스와 C57BL / 6J 심장 매트릭스에서 배양 심근 세포에 적은 IRF5 긍정적 인 핵으로 이어집니다. 화살표는 IRF5 긍정적 인 핵 (SD, P <0.05 ± 의미, N = 3) 묘사한다. 스케일 바 5 μm의입니다. 이 그림은 이전에 21 게시되었습니다. CLIC하세요이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 케이.
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Discussion
목표는 쯧 / + 마우스의 마음에 염증, 섬유화, 혈관 기능에 IRF5의 역할을 규명하기 위해 IRF5 억제제를 설계하는 것이 었습니다. 결과는 IRF5D이 증식 또는 세포 사멸을 유도하지 않았다 있습니다. 또한, 염증 감소와 혈관 기능이 향상되었다. 이러한 데이터는 IRF5 쯧 / + 마우스의 심장 염증 및 섬유증의 개발에 중요한 역할을 기계적 것을 제안하고이 치료 표적이 될 수있는 잠재력을 가지고있다.
첫 번째 단계는 억제제를 설계하는 것이었다. 펩티드를 설계 할 때, 여러 점을 고려되어야한다 : 시퀀스 길이, 이차 구조의 C 말단의 N 말단 아미노산의 산화, 아미노산 조성, 아미드 화 및 캡 아미노산 경향 잔류 와 리간드 첨부. 이상적인 시퀀스 길이가 가장 전체 수율, 적은 불순물 및 비용 절감을 보장하기 위해 15-10 사이의 잔류 물이다. 그것은 impor의입니다중대장은 베타 시트 형성과 같은 보조 구조를 알고 있어야합니다. 베타 시트 형성 삭제 서열의 높은 수준을 초래할 수있다. 펩타이드의 효과에 영향을 줄 수있는 반응을 좌우로 이어질 수있는 산화하는 경향이 잔류하지 마십시오. 용해도, 합성 및 정제를 제어하기 위해 50 %의 소수성 아미노산 아래 펩티드 아미노산 빌딩 블록의 구성을 유지하고 충분한 대전 잔기 있다는 것을 보장한다. N- 및 C- 말단는 충전되지 않은 상태에서 선택해야합니다. N- 말단에 글루타메이트를 피하고 C 말단에 시스테인, 프롤린, 글리신을 피하십시오. 폴딩을 최소화하기 위해 펩티드 리간드 사이에 스페이서를 추가합니다. 따라서, 그들은 무료로 아미드로 마스크해야 할 수 있습니다.
IRF5D 디자인은 3 차원 구조에 기초 하였다. 17 메르는 아스 파르 테이트 (D)을 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD)에서 IRF5의 인산화를 모방하는 세린 (S) 교체되었을 경우 IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD)가 설계했다라고. 이접근 방식으로 인해 새로운 컴퓨터 기술에 정직하고 있습니다. 이 기법의 단점은 소프트웨어의 초기 투자이다. 그러나, 노동 및 파아지 디스플레이 (22) 등의 다른 억제제 설계 방법에 사용되는 물질과 관련된 비용에 비해 상당한 비용 절감 전반적인있다. 이 프로세스의 중요한 단계는 3D 대상 단백질의 구조 및 그것의 가능한 결합 부위의 이용이다. 억제제의 설계 제한이 틀린 영역이 선택되고, 억제제는 목적 단백질을 차단하지 가능성이다. 다른 가능성은 목적 단백질의 일부 차단된다.
손 펩티드 초점 세포 생존율을 측정함으로써 디코이 펩티드의 독성을 시험으로 이동한다. 먼저 IRF5D은 다양한 농도를 사용하여 테스트 하였다. IRF5D는 세포 사멸을 유도하지 않고 더 높은 농도에서 증식을 촉진하지 않습니다. 여기에 사용 된 방법은 역입니다ndard하고 신뢰할 수있는 데이터를 제공합니다. 테트라 졸륨 염료 bioreduction 수년 23에 사용되었다. 예를 들어, 다른 방법과 비교하여 본 분석은 매우 어느 시간이 소모되는 수동 셀 카운트 때문에 재현성 및 시간 효과 선택되었다. 증식 세포 레이블을 BrdU의를 사용하여 민감한 방사능을 필요로하지만 위험 할 수 있습니다. 테트라 졸륨 염료 bioreduction은 시간에 효율적이며 방사능을 필요로하지 않습니다. 테트라 졸륨 염료 bioreduction의 제한 옥시도 - 환원 전위를 포함하는 연구에 널리 퍼져있다. 옥시 - 환원 전위가 발생 어디든지, 오탐 (false positive) 24 더 자주 있습니다.
세포 외 기질의 분리는 고장 성 용액 모두 심근 세포를 용해시켜 획득 하였다. 프로토콜은 단순한 교반 공정 25 관류 장치를 사용한 연구로부터 발전되었다. durat이온 상이한 시점을 고려하여 실험적으로 측정 하였다 : 12, 14, 16, 18, 20 시간. 다른 시간이 25 포인트 후 세포 외 기질은 세포 파편을 분석 하였다. 탈세 포화의 주요 함정은 곰팡이와 세균 오염 수 있습니다. 항진균 및 항균 화합물을 사용하는 것이 좋습니다. 코트 요리에, 세포 외 매트릭스는 powderized하고 PBS에 현탁. 인해 탄성 물질의 높은 함량으로, 샘플이 완전히 용해되지 않는다. 샘플을 가열하지 않고 더 높은 강도의 설정에 초음파가 필수적이다. 다른 코팅제를 통해 세포 외 기질을 사용하는 경우의 장점은 세포 외 기질 단백질의 융합이 일어나는 생리하고 생체 내 및 시험 관내 분석에서 연결 때문이다. 이러한 접근은 단독으로 콜라겐이나 피브로넥틴 등을 단일 화합물로 코팅보다 생리이다. 또한 변화에 의해 시작 시그널링의 중요성에 대한 통찰력을 제공합니다세포 외 기질. 이 프로토콜의 제한은 명확 행렬에서 행렬 및 제거 중요한 신호 성분의 파괴이다. 이 행렬을 decellularizing 때주의하는 것이 필수적입니다.
조직 손상과 같은 고립 된 용기의 사용 현장에서 효소의 최소한의 간섭으로 혈관 확장을 연구 할 수있는 가능성을 연다. 이 방법은 동물의 질병의 다양한 내피 기능을 연구하는 것이 가장 적절하다. Duling 돼지에서이 방법을 설명하는 첫번째이었다. 돼지의 혈관 조직에 깊은; 따라서 논문은 젤라틴 고정을 설명했다. 혈관 확장의 초기 연구는 경동맥 (26)을 사용했다. 우리 facialis 동맥 (27)을 사용하는 기술을 정제. Facialis 동맥은 경동맥보다 저항 동맥의 크기에 더 많은 동일합니다. 이 프로토콜의 제한이 필요한 용기의 취약성 그대로 requirin 제거 될g 연습.
요약하면, 개발 IRF5D은 심장의 염증과 섬유화에 IRF5의 참여를 평가 할 수있게. 이 연구에 도시 된 데이터 결과. IRF5D는 가능한 약물 표적 (28)로 IRF5을 제안뿐만 아니라 각종 질병에 IRF5의 메커니즘을 연구하는 유용한 도구입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100- 100ml | |
| Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody | Thermo Fisher | A11001 | |
| Bardford reagent | Thermo Fisher | 23200 | Pierce |
| Biosensors | Forte-Bio | MR18-0009 | |
| CD64 (H-250) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-15364 | |
| CellEvent Caspase-3/7 Substrate | Thermo Fisher/Life Technologies | C10427 | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit | Promega | G3580 | Promega |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher | D-1306 | 1:1,000 dilution in PBS |
| donkey anti rat Alexa 488 | Thermo Fisher | A-21208 | 1:1,000 dilution in PBS |
| ECL plus | GE healthcare/Amersham | RPN2133 | After a lot of trial and error we came back to this one |
| Eclipse TE 200-U microscope with EZ C1 laser scanning software | Nikon | ||
| goat anti rabbit Alexa 488 | Thermo Fisher | A-11008 | 1:1,000 dilution in PBS |
| HRP anti-goat | Santa Cruz Biotechnologies | sc-516086 | !:10,000 dilution in TBS |
| HRP donkey anti-mouse | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2315 | 1:10,000 dilution in TBS |
| ICAM-1 antibody | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1511 | 1:200 dilution in PBS |
| IRF5 antibody (H56) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-98651 | |
| Micro plate reader Elx800 | Biotek | ||
| NIMP neutrophil marker | Santa Cruz Biotechnologies | sc-133821 | 1:200 dilution in PBS |
| Octet RED | Forte Bio | protein-protein binding | |
| Peptide design Medit SA software | RCSB.org | ||
| Recombinant IRF5 protein synthesis | TopGene Technologies | protein expression, synthesis service | |
| sodium dodecyl phosphate | Sigma Aldrich | 436143 | detergent |
| Ketamine | Pharmacy | Schedule III controlled substance, presciption required | |
| Xylazine | MedVet | ||
| 3.5X-45X Trinocular Dissecting Zoom Stereo Microscope with Gooseneck LED Lights | Am Scope | SKU: SM-1TSX-L6W | |
| Zeba Desalting Columns | Thermofisher | 2161515 | |
| Endothelial Basal Media EBM Bullet kit | Lonza | CC-3124 | kit contains growth supplemets |
| VIA-100K | Boeckeler Instruments | ||
| 4 - 15% TGX gel | Bio-Rad | 5671081 | |
| MedSuMo software | Medit, Palaiseau, France | ||
| Laemmli Buffer | BioRad |
References
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