Introduction
Regulación del crecimiento celular y la respuesta inmune de muerte celular es fundamental para el papel de la familia de factores de transcripción de factores reguladores de interferón. IRF5 se pone de relieve como crucial para la regulación de la respuesta inmune entre el tipo 1, la promoción de una respuesta inflamatoria y tipo 2, una reparación de tejidos respuesta inmune de orientación. IRF5 es clave en el cáncer de 1, y la autoinmunidad 2, 3, 4, 5.
El ratón apretado-piel (Tsk / +) es un modelo para la fibrosis del tejido y la esclerodermia debido a una mutación de duplicación en el gen de la fibrilina-1. Esta mutación da como resultado un apretado-piel y un aumento en el tejido conectivo. Estos ratones desarrollan inflamación miocárdica, fibrosis e insuficiencia finalmente corazón 5, 6, 7,> 8, 9. La esclerodermia es un trastorno fibrótico autoinmune que afecta a aproximadamente 150.000 pacientes en los Estados Unidos 6. Las características de esta enfermedad son la fibrosis de los órganos internos, incluyendo el corazón 7, 8, 9, 10, 11.
La naturaleza del estudio exigía el diseño de un péptido inhibidor. El enfoque de software fue elegido sobre un enfoque tradicional usando una visualización de fagos. El enfoque de software es más fácil y menos consume mucho tiempo. El banco de datos RCSB se utiliza para identificar sitios de unión apropiados 12. Para estudiar la interacción del péptido de nuevo diseño con la proteína recombinante y centrarse en los parámetros de unión, se utilizó una técnica llamada interferometría capa biológica. Biocapa interferometría es un techniq basado biosensorue lo que determina la afinidad de unión, de asociación y disociación utilizando un biosensor y una muestra de unión. El biosensor puede ser fluorescente, luminiscentemente, etiquetado radiométricamente y colorimétricamente. La medición se basa en la adición de masa o el agotamiento se asemeja asociación y disociación 13, 14. El objetivo de este estudio fue comprender el papel de IRF5 en la inflamación y la fibrosis miocárdica. El objetivo era profundizar en el papel de IRF5 en el desarrollo de la fibrosis del tejido y la esclerodermia.
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Protocol
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo (Protocolo: AUA # 1517). Todas las investigaciones con ratones se llevó a cabo de conformidad con la política PHS.
1. Diseño de Decoy Péptido
- Encuentra estructura 3D de la IRF5 y basar el diseño en él. Diseño de un 17 mer, denominado IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD), donde aspartato (D) se sustituye por serina (S) para imitar la fosforilación en IRF5 en 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Análisis de grupos sulfhidrilo en 3D y el conocimiento de mecanismo de activación de IRF5, es decir, fosforilación de la serina, sugirió que una estrategia para la orientación IRF5 era generar un péptido señuelo. Ver Figura 1. Para identificar la mejor región en la estructura 3D, utilice un software de modelado molecular para diseñar pequeña moleculES y péptidos 15.
NOTA: El paso crítico en este proceso es la disponibilidad de la estructura 3D de la proteína diana y sus posibles sitios de unión. La estructura 3D de IRF5 representa con precisión cómo se dimeriza IRF5 después de la fosforilación. La sustitución de aspartato de serina o treonina se externaliza. El péptido se sintetiza por separado, sin estar vinculados a IRF5. - Replicar la fosfo-dominio de la simple sustitución de D S. Sobre la base de la secuencia original (ELSWSADSIRLQISNPD, hacer una nueva IRF5S péptido con la secuencia de aminoácidos de Ac-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH2 (IRF5D).
2. Biocapa Interferometría (BLI)
NOTA: La purificación de IRF5 recombinante fue subcontratada. dieciséis
- marcador de biotina IRF5 en una relación molar de 1: 1 de la biotina a un ligando con un reactivo de biotinilación que incorpora un enlazador de cadena larga. El enlazador de cadena larga asegurará una liga más activo y homogéneond superficie.
- Añadir 1 ml de 2 mg / mL IRF5 a 13 l de reactivo de biotina 20 mM o aumentar los volúmenes si es necesario. Incubar en hielo durante 2 h. Después del marcaje, utilizar una columna de desalación de centrifugado para eliminar la mezcla de reacción de la proteína marcada.
- Incubar el ligando marcado con biotina con los biosensores para 15 min. Evitar el exceso de etiquetado y ajustar la relación molar 1: 1. Después del marcaje, utilizar una columna de desalación de centrifugado para eliminar la mezcla de reacción de la proteína marcada.
- Incubar los marcados con biotina biosensores IRF5 por 10 min en diferentes concentraciones del péptido IRF5 señuelo. Las velocidades de asociación y disociación se determinaron como se ha descrito 10, 17, 18.
3. apoptosis y Ensayos de proliferación
- Ensayo de proliferación a través de la biorreducción tetrazolio
- Administrar IRF5D diluyó en PBS (1 mg /kg / d, inyectar un volumen de 20 l en un ratón de 20 g) por vía subcutánea con una aguja de calibre 27 por una técnica de Scruffing estándar o por PBS solo a Tsk / + y ratones C57BL / 6J durante 21 días.
- Anestesiar a los ratones con isoflurano (5%) y realizar una dislocación cervical. Escindir los corazones por cortar y abrir el pecho a lo largo del esternón. Alza el corazón con unas pinzas y quitar el corazón.
- Lyse los corazones con un tampón de lisis que contiene proteínas mM Tris-HCl 50 pH 7,4, 0,5% NP-40, NaCl 250 mM, EDTA 5 mM, NaF 10 mM 50 y determinar la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford 19.
- Escudo placas de 96 pocillos con C57Bl 6J matriz / cardiaco aislado como se describe en el apartado 7. Diluir el PBS suspendidos C57Bl 6J matriz / cardiaco a una concentración de 20 mg / ml y se añaden 30 l de la C57Bl / 6J cardíaca a cada pocillo. Se deja reposar durante la noche a 37 ° C en la incubadora.
- células de la vena umbilical humana cultivo utilizando 500 ml de endotelial basal media con extracto 0,4% de cerebro bovino, ácido ascórbico 0.1%, 0.1% de hidrocortisona, factor de crecimiento epidérmico humano 0,1%, suero bovino fetal al 2% y 0,1% de gentamicina / anfotericina B añadido a la misma. Cultivar las células en placas de 96 pocillos a 5% de CO2 y 95% de aire ambiente con una densidad de 25.000 células por pocillo. Estimular con concentraciones crecientes de IRF5D entre 0 - 100 mg / ml en los medios de comunicación (volúmenes fueron de entre 0 y 50 l / ml).
- Determinar la proliferación de las células después de tres días y evaluar las diferencias en la absorbancia en un lector de microplacas. La reacción es una biorreducción del compuesto de tetrazolio MTS. NADPH o NADH es producido por enzimas deshidrogenasa en las células metabólicamente activas.
- Como se almacena el compuesto de tetrazolio MTS se congelaron a -20 ° C, descongelar el compuesto lentamente durante aproximadamente 90 minutos a temperatura ambiente. Pipeta de 20 l en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, y se añaden 100 l de medio de cultivo a ella. Incubar la placa a 37 ° C durante 1 a 4 horas en una humidified, 5% de CO 2 cámara.
- Leer la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm.
- Ensayo de apoptosis a través de la actividad de caspasa
NOTA: El montaje experimental es el mismo que el anterior 3.1.1 a 3.1.5.- Estimular las células con concentraciones crecientes de IRF5D entre 0 - 100 mg / ml en los medios.
- Añadir detección de verde para el sustrato de la caspasa 3/7 a la ECs y se incuba durante 30 min a 37 ° C. Evaluar la fluorescencia en el lector de microplacas de forma simultánea con una longitud de onda de absorción / emisión de 502/530 nm. Ejecutar los experimentos por triplicado.
NOTA: El agente fluorescente verde es un péptido de cuatro aminoácidos unido a un colorante de unión de ácidos nucleicos. Este reactivo se vuelve fluorescente cuando se escinde después de la caspasa 3 y 7 de activación. Esta fluorescencia se mide. La ventaja es una reducción de los pasos de lavado.
4. Evaluación de la IRF5 e ICAM-1 de expresión en la audiciónt
- Administrar IRF5D diluido en PBS (1 mg / kg / d, inyectar un volumen de 20 l en un ratón de 20 g) por vía subcutánea con una aguja de calibre 27 por una técnica de Scruffing estándar o por PBS solo a / + C57BL 6J TSK / una vez por día durante 21 días.
- Anestesiar a los ratones con isoflurano (5%) y realizar una dislocación cervical. Escindir los corazones por cortar y abrir el pecho a lo largo del esternón. Alza el corazón con unas pinzas y quitar el corazón.
- Lyse los corazones con un tampón de lisis que contiene proteínas mM Tris-HCl 50 pH 7,4, 0,5% NP-40, NaCl 250 mM, EDTA 5 mM, NaF 10 mM 50 y determinar la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford 19.
- Realizar una transferencia western de lisados de corazones. Diluir las muestras de 25 g de proteína total y un volumen de 40 l con tampón de muestra de Laemmli que contiene 5% de mercaptoetanol. Ejecutar las muestras en un 4 - gel TGX 15% a 50 mV durante 5 min. Aumentar el voltaje a 100 mV durante 1 hora hasta que el frente del colorante se agota.
- Colocar el gel en tampón de transferencia 1x (Tris 25 mM, glicina 190 mM, metanol al 20%, se ajusta el pH a 8,3 si es necesario) y se incuba durante 10 - 15 min.
- Montar el sándwich de transferencia (esponja, filtro, gel, membrana de celulosa, filtro, esponja). Asegúrese de que no hay burbujas atrapadas en el medio. La transferencia debe estar en el cátodo y el gel en el ánodo. Transferir durante 1 h en el cuarto frío a 100 mA.
- El día siguiente, enjuague el blot y luego bloquear el fondo en la leche en polvo sin grasa al 5% durante 30 min a temperatura ambiente. Enjuague la mancha con solución salina tamponada con Tris que contiene 5% de Tween tres veces durante 5 minutos cada uno.
- Incubar toda la noche con los anticuerpos primarios utilizando anticuerpos policlonales primarios a IRF5 o ICAM-1. Diluir los anticuerpos en solución salina amortiguadora Tris en una dilución 1: 1000.
- Diluir los anticuerpos secundarios en solución salina amortiguadora Tris e incubar la mancha durante 1 hora a temperatura ambiente. burro para anticuerpos secundarios, peroxidasa de rábano picante uso conjugado anti-Ig de ratónG (1: 10.000) y peroxidasa de rábano picante burro anti-IgG de cabra (1: 10.000), respectivamente.
- Aplicar quimioluminiscencia a la blot después de los componentes de mezcla de acuerdo con el protocolo del fabricante y se incuba durante 3 min a luminiscencia las bandas de interés. Exponer la transferencia a una película de rayos X. ImageJ utilizar para medir la densidad. Normalizar los valores de la densidad de las bandas de control 10.
5. Evaluación del número de células inflamatorias después IRF5 Inhibición
- Administrar IRF5D diluido en PBS (1 mg / kg / d) por vía subcutánea con una aguja de calibre 27 por una técnica de Scruffing estándar o por PBS solo a Tsk / + y ratones C57BL / 6J durante 21 días.
- Anestesiar a los ratones con isoflurano (5%) y realizar una dislocación cervical. Escindir los corazones por cortar y abrir el pecho a lo largo del esternón. Alza el corazón con unas pinzas y quitar el corazón. Snap congelar y almacenar los corazones extirpados hasta su análisis.
- Montar los corazones congelados en TISStitulares ue apropiadas para el criostato en uso. Cortar 10 micras de espesor cortes congelados en un criostato para inmunohistoquímica.
- Fijar las secciones congeladas con 1% de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato durante 20 min a temperatura ambiente. Permeabilizar las secciones con 0,5% Triton X-100 en PBS durante 5 min.
Precaución: El paraformaldehido es un carcinógeno regulado y debe ser manejado con cuidado. - Diluir anti-conejo de CD64, un monocito / macrófagos marcador 1: 200 en PBS. Aplicar a las secciones fijas e incubar durante 30 minutos a 37 ° C.
- Lavado de los portaobjetos en PBS durante 5 min tres veces a temperatura ambiente.
- Diluir anti-rata NIMP, un marcador de neutrófilos primario 1: 200 en PBS. Aplicar a las secciones fijas e incubar durante 30 minutos a 37 ° C.
- Lavar los portaobjetos durante 5 min tres veces con PBS a temperatura ambiente.
- Diluir los anticuerpos secundarios anti-conejo Alexa 488 conjugado y anti-rata conjugado Alexa 488 1: 200 en PBS.
- Aplicar anti-conejo Alexa 488 conjugado y anti-rata Alexa 488 anticuerpos secundarios conjugados a las secciones durante 30 minutos a 37 ° C en consecuencia. El volumen de anticuerpo varía según el tamaño de la sección. La cantidad debe cubrir la sección generosamente. En la mayoría de los casos, el volumen es de entre 100 y 200 l.
- Usar 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) como una mancha nuclear en una dilución 1: 1000 en PBS. Añadir 1 l en 1 ml de PBS y utilizar el DAPI en la última etapa de lavado. Añadir un medio acuoso de montaje de una hoja de cubierta y lo puso sobre el portaobjetos.
- Analizar las secciones marcadas con fluorescencia por microscopía confocal utilizando un objetivo de aceite de 40X. Uso de excitación longitudes de onda de emisión de 488 y longitudes de onda de 530 nm mayor que para CD64 y NIMP. DAPI se excitó con 360 nm y emite a 460 nm en azul. Distinguir los monocitos / macrófagos y neutrófilos (n = 10 imágenes por anticuerpo, a partir de 3 ratones diferente en cada grupo) por su diferente etiquetado y contarlos. Expresar los datos como el número de células contadas.
6. célula vasodilatación dependiente del IRF5 después de Inhibición
- Anestesie / 6J ratones de control y C57Bl TSK / + ratones con y sin tratamiento péptido con una mezcla de ketamina (80 - 100 mg / kg) / xilazina (10 a 12,5 mg / kg) mezcla. Se inyecta la mezcla de ketamina / xilazina por vía intraperitoneal. Restringir el ratón manualmente.
- Use un medidor 25 o aguja más pequeña. Insertar la aguja en el cuadrante inferior derecho del abdomen. Retirar el émbolo antes de la inyección para asegurar que la aguja no entra en un vaso sanguíneo o el intestino.
- Una vez que se haya alcanzado un nivel suficiente de anestesia, asegurar el ratón en la posición supina, limpie la piel con el alcohol almohadilla de gasa empapada, y el uso de un par de tijeras abrir la cavidad torácica y quitar el corazón.
NOTA: El desangrado será la eutanasia el ratón y hacer más fácil la disección aliviando la presión en el sistema vascular reduciendo así al mínimo el sangrado cuando se cortan los vasos sanguíneos.- Abrir la piel usinga par de tijeras, corte desde el lateral del pecho a la mandíbula con cuidado para no molestar a los tejidos subyacentes hacia la parte anterior de la mandíbula.
- Disecar la arteria facialis mediante la eliminación de los tejidos blandos alrededor de ella.
- Precaución: no daña al buque o tirón en facialis arteria mientras se mantiene el tejido expuesto bañado en tampón MOPS (CaCl 2,0 mM 2 · 2H 2 O, EDTA 0,02 mM, glucosa 5,0 mM, KCl mM 4,7, 1,17 mM de MgSO4 · 7H 2 O, 3.0 MOPS mM, NaCl 145 mM, 1,2 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O, 2,0 mM de ácido pirúvico) para prevenir la desecación. Realizar bajo un microscopio de disección zoom binocular (aumento de 3,5 veces a 45X) y una fuente de luz de fibra óptica.
- Aislar la arteria facialis.
- Agarre el proximal facialis a la primera bifurcación y distal al lugar donde se cortó la arteria. Cortar la arteria de la arteria matriz, la arteria carótida externa. Retire el arterie facialiss de los ratones de control, TSK / + ratones con y sin tratamiento IRF5D.
- Mientras mantiene la arteria en el fórceps, cortar las dos ramas que salió de la facialis, permitiendo que el barco se eleve suavemente mientras que cualquier tejido circundante sin cortar puede ser identificado y cortado.
- Continuar de esta manera hasta que se alcanza la bifurcación de corte ambas arterias hija para liberar el recipiente. No hay necesidad de sujetar los vasos antes de cortar debido a la presión de alivio en la vasculatura de la eliminación del corazón. Poner el recipiente en tampón MOPS mientras que la otra arteria facialis se diseca y aislado.
- Cannulate los vasos atándolos en pipetas de vidrio con un diámetro terminal de 125 - 175 micras. Precargar las pipetas de vidrio y embalses tampón con tampón MOPS.
Precaución: Evitar la formación de burbujas de aire en las pipetas. - Atar los vasos en las pipetas utilizando suturas oftálmicas.
- Montar las cámaras de los vasos en un micr triocular invertidaoscope con un accesorio de cámara de vídeo. Ejecutar el vídeo a través de un sistema de medición del calibre de vídeo para mediciones en pantalla de los vasos. 20
- Presurizar en un proceso de dos pasos. En primer lugar, con los depósitos llenos-MOPS a una altura por encima del recipiente igual a la presión de 20 mmHg, abrir manualmente las válvulas de llave de paso en las líneas de depósito al recipiente. Inspeccionar el buque en busca de signos de fugas alrededor de los lazos y abajo de la longitud del recipiente. En segundo lugar, aumentar los depósitos a 60 mmHg y vuelva a inspeccionar el buque.
- Una vez presurizado a 60 mmHg, deja que los recipientes se equilibren durante 30 min.
- A fin de evaluar la vasodilatación en respuesta a la acetilcolina (10 -7 a 10 -4 M), preconstrict el recipiente a un diámetro desde 50 hasta 75% de su diámetro máximo usando 1-3,0 x 10 -8-10 -7 U46619 M. Después de permitir que el buque se estabilice durante 6 minutos, añadir la acetilcolina al baño en los pasos 2 min de duración tal que laconcentraciones finales en el baño son 10 -7, -6 10, 10 -5, 10 -4. Medir la vasodilatación en los tres grupos.
7. Aislamiento de cardiaca matriz extracelular
- Anestesie / 6J ratones de control y C57Bl TSK / + ratones con y sin tratamiento péptido con isoflurano (5%) y realizar una dislocación cervical. Escindir los corazones por cortar y abrir el pecho a lo largo del esternón. Alza el corazón con unas pinzas y quitar el corazón.
- Ponga los corazones extraídos en un vaso y añadir 15 ml de 1% de dodecilsulfato de sodio hipertónico (SDS). Agitar corazones en la solución de SDS al 1% durante 18 horas a temperatura ambiente para romper las células mediante la adición de una barra de agitación a la solución de SDS 1% y poner el vaso de precipitados sobre una placa de agitación.
Precaución: Tenga en cuenta que la matriz extracelular se desintegrará si se deja demasiado tiempo en una solución hipertónica. A la inversa, si el corazón no se agitan el tiempo suficiente en una solución hipertónica, a continuación, las células no correctamentedisolver y habrá restos de células que queda en el vaso de precipitados. - Lavar durante 30 min en 15 ml de 0,5% Triton X-100. A continuación, lavar durante 15 minutos con 15 ml de PBS. Decellularize cada corazón de forma individual.
- Snap-congelar la matriz extracelular en nitrógeno líquido y se pulveriza la matriz extracelular cardiaca congelado con un mortero previamente enfriado y mano de mortero.
- Hacer una suspensión de la matriz pulverizado en PBS que contenía 1% de antibiótico. El volumen añadido en la mayoría de los casos es de 300 l. Sonicar la suspensión durante 30 - 60 s en hielo en el ajuste alto.
NOTA: Es muy importante que la muestra mantiene fría. Tenga en cuenta que la suspensión es muy viscoso debido al contenido de glucanos de alto valor proteico. - Determinar la concentración de proteína usando un ensayo de Bradford.
NOTA: Asegúrese de que no es anti-bióticos y anti-hongos en la suspensión. La penicilina / estreptomicina son los más comúnmente usado y recomendado.
8. Evaluación de la translocación nuclear por Immunohistochemistry
- Para platos de la capa y toboganes de utilizar una concentración final de 20 mg / ml de la matriz extracelular cardiaca en PBS. Pipetear 500 l de la solución cardiaca extracelular de matriz en una placa de 100 mm para el recubrimiento y 150 l de la solución final de la matriz extracelular en un portaobjetos.
- Inhibir IRF5 añadiendo IRF5D en una concentración 50 mg / ml durante 24 h a la rata miocitos cardíacos neonatales en cultivo. Deja cultivos de control sin tratar miocitos.
- Evaluar el tráfico de IRF5 desde el citosol a la inmunofluorescencia núcleo y analizar mediante microscopia confocal. Identificar el etiquetado verde para IRF5, identificar la mancha DAPI azul para el núcleo
- Aplicar el anticuerpo anti-IRF5 primaria. El anticuerpo primario se utilizó en una dilución 1: 200 en PBS. Incubar los portaobjetos durante 30 min a 37 ° C y seguir con tres etapas de lavado de 5 min. El anticuerpo secundario era de cabra Alexa 488 marcado con anticuerpo anti-IgG de ratón.
- Diluir el anticuerpo secundario 1: 1000 dilución en PBS. Incubar el anticuerpo secundario durante 30 min a 37 ° C. Lograr la tinción nuclear con DAPI. Diluir DAPI 1: 1000 en PBS. Se lavan los portas con un total de 3 veces durante 5 minutos y añadir DAPI a la tercera y última etapa de lavado.
- El tráfico de captura mediante el uso de la microscopía confocal y la intensidad de fluorescencia medida en los núcleos y el citosol como se ha descrito previamente 10. Identificar el etiquetado verde para IRF5, identificar la mancha DAPI azul para el núcleo. Las células que presentan núcleos azules con el etiquetado verde en los contienen activan IRF5, que trafica desde el citosol al núcleo. etiquetado verde cuando IRF5 no se activa se encuentra en el citosol.
- Analizar las células marcadas con fluorescencia por microscopía confocal utilizando un objetivo de aceite de 40X. Utilice una longitud de onda de excitación de 488 nm y de emisión de longitudes de onda de 530 nm mayor que para IRF5. Utilice una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm para la visualización de DAPI.
- Realizar el análisis de la varianza (ANOVA) para medidas repetidas dentro y entre los grupos. Siga ANOVA con la modificación de estudiantes t-test de Bonferroni. Expresar datos que el error estándar de la media.
- Anestesie / 6J ratones de control y C57Bl TSK / + ratones con y sin tratamiento péptido con una mezcla de ketamina (80 - 100 mg / kg) / xilazina (10 a 12,5 mg / kg) mezcla. Se inyecta la mezcla de ketamina / xilazina por vía intraperitoneal. Restringir el ratón manualmente.
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Representative Results
Los resultados demostrados en la Figura 1 muestran cómo diseñar un péptido. La Figura 1, parte superior izquierda, muestra la región (entre las 2 flechas amarillas, los aminoácidos (aa) 425 a 436) en IRF5 que es fosforilada por una serie de quinasas. La figura 1, parte superior derecha, muestra un óvalo de color amarillo donde dominio fosforilada de IRF5 une. La estructura dimérica de 3DSH se hizo girar para observar una hendidura o valle a la izquierda de la hélice 2 (aa303-312). Aquí es donde se supone que el dominio fosfo-cola de IRF5 de unirse cuando está totalmente activa (es decir, serina fosforilado), la formación de un homodímero y su estado biológicamente activo asumido.
En la Figura 2, la actividad de unión medida por interferometría capa biológica se representa. Para determinar que el péptido IRF5D señuelo no es tóxico, proliferación y apoptosis fueron evaluados después de tratar el cells con concentraciones crecientes de IRF5D (Figura 3). Expresiones ICAM-1, un marcador inflamatorio, y IRF5 se redujeron después de tratar las TSK / + ratones con IRF5D como se determina por análisis de transferencia Western (Figura 4). El número de neutrófilos (nimp) y CD64 se redujeron tal como se determina por inmunohistoquímica después del tratamiento con IRF5D (Figura 5). La función endotelial se ha mejorado en las arterias facialis de TSK / + ratones después de IRF5D comparación con Tsk / + ratones sin tratamiento IRF5D (Figura 6). Un mayor número de núcleos IRF5 positivos en miocitos cultivados en Tsk matriz / + cardíaco se visualizaron en comparación con C57BL 6J matriz / cardíaco. El tratamiento de los cultivos con IRF5D dio lugar a un número reducido de núcleos positivos IRF5 (Figura 7).
Figura 1: La proteína 3D Structure de IRF5. A) La figura superior izquierda muestra la región del péptido fue diseñado. B) La región que se está fosforilada destaca por las dos flechas amarillas son los aminoácidos (aa) 425 - 436 en IRF5. C) El panel inferior muestra el complejo funcional homodimérica. La figura homodimérica se presenta para facilitar la visualización de la región donde el dominio de cola fosforilada de IRF5 se une para formar un homodímero. Esta cifra ha sido publicado previamente 21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Biocapa Interferometría de IRF5D. Esta figura muestra la unión de IRF5 a IRF5D evaluada por biolaye r interferometría. El software de análisis mostró que IRF5 se une a IRF5D con una Kd de 3,72 ± 0,75 x 10 -6 M (media ± SD, n = 3). Esta cifra ha sido publicado previamente 21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Proliferación celular y la apoptosis. Estos gráficos de barras que muestran que concentraciones crecientes de IRF5D no tienen ninguna influencia sobre la proliferación celular (izquierda) o la apoptosis (a la derecha), y no fueron alterados por el aumento de los niveles de IRF5D. Esta cifra ha sido publicado previamente 21 (media ± desviación estándar, p <0,05, n = 4).k "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: ICAM-1 y IRF5 Expresión en el corazón. IRF5 expresiones (B) ICAM-1 (A) y se redujeron en el miocardio de Tsk + ratones después del tratamiento IRF5D como se demuestra por transferencia de western. Los datos se normalizaron con el control de actina de carga (media ± DE, p <0,05, n = 3). Esta cifra ha sido publicado previamente 21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:CD64 (A) y NIMP (B) Expresión en el corazón. El número de monocitos / macrófagos y neutrófilos se redujo después del tratamiento IRF5D como se demuestra por inmunohistoquímica (media ± SD, * = p <0,05, C57BL / 6J vs. Tsk / +; # = p <0,025, Tsk / + vs. Tsk / + + IRF5D; n = 3, 10 imágenes por anticuerpo). Las flechas resaltan los monocitos / macrófagos (A) y los neutrófilos (B). Las barras de escala son de 10 micras. Esta cifra ha sido publicado previamente 21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: la función celular y la vasodilatación. administración IRF5D mejoró la acetilcolina inducida por la vasodilatación de las arterias facialis de TSK / + ratones (media y# 177; SD, p <0,05, n = 6). Esta cifra ha sido publicado previamente 21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: La translocación nuclear de IRF5 IRF5 en cultivos de miocitos con la inhibición IRF5. inhibición IRF5 por IRF5D (50 mg / ml, 24 h) conduce a un menor número de núcleos IRF5 positivos en los miocitos cultivados en Tsk matriz / + cardíaco y C57Bl / 6J matriz cardíaco. Las flechas representan IRF5 núcleos positivos (media ± DE, p <0,05, n = 3). La barra de escala es de 5 micras. Esta cifra ha sido publicado previamente 21. Por favor click aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El objetivo era diseñar un inhibidor IRF5 para dilucidar el papel de IRF5 sobre la inflamación, fibrosis y la función vascular en los corazones de TSK / + ratones. Los resultados son que IRF5D no indujo la proliferación o la apoptosis. Por otra parte, la inflamación se redujo y la función vascular mejorada. Estos datos sugieren que IRF5 juega un papel mecanicista importante en el desarrollo de la inflamación y fibrosis en el corazón de TSK / + ratones y que tiene el potencial de servir como una diana terapéutica.
El primer paso fue el diseño de un inhibidor. Cuando un péptido es diseñado, varios puntos tienen que ser tomadas en consideración: longitud de la secuencia, estructura secundaria, los residuos propensos a la oxidación, la composición de aminoácidos, amidación y tapado, los aminoácidos en los aminoácidos N-terminal y en el C-terminal, y la unión del ligando. La longitud de la secuencia ideal es entre 10 a 15 residuos para garantizar mejor rendimiento global, menos impurezas, y un coste reducido. Es importante a tener en cuenta las estructuras secundarias como la formación de lámina beta. formación de la hoja beta puede resultar en un alto grado de secuencias suprimidas. Evitar residuos propensos a la oxidación que puede conducir a reacciones secundarias que pueden afectar la eficacia del péptido. Para controlar la solubilidad, la síntesis y purificación, mantener la composición de los bloques de construcción de aminoácidos para el péptido por debajo del 50% de aminoácidos hidrófobos y asegurarse de que hay suficientes residuos cargados. N y C terminales deben ser elegidos en un estado descargado. Evitar glutamato en el extremo N-terminal y evitar cisteína, prolina y glicina en el extremo C-terminal. Añadir un espaciador entre el péptido y el ligando para minimizar plegable. Por lo tanto, puede ser que tenga que ser enmascarado como una amida sin cargo.
diseño IRF5D se basó en la estructura 3D. A 17 mer, denominado IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD) fue diseñado, donde aspartato (D) se sustituyó por serina (S) para imitar la fosforilación en IRF5 en 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Estaenfoque es sencillo debido a la novedosa tecnología informática. El inconveniente de esta técnica es la inversión inicial en el software. Sin embargo, hay un ahorro global significativa si se compara con los costos asociados con la mano de obra y materiales utilizados en otros métodos de diseño de inhibidor, como presentación de fagos 22. El paso crítico en este proceso es la disponibilidad de la estructura 3D de la proteína diana y sus posibles sitios de unión. La limitación de diseño de un inhibidor es la posibilidad de que se elige una región mal y el inhibidor no está bloqueando la proteína deseada. La otra posibilidad es un bloqueo parcial de la proteína deseada.
Con el péptido en la mano el foco se mueve para probar la toxicidad del péptido señuelo mediante la medición de la supervivencia celular. En primer lugar, IRF5D fue probada usando concentraciones variables. IRF5D no induce apoptosis y no promueve la proliferación incluso a concentraciones más altas. Los métodos utilizados aquí son staándar y dar datos fiables. La biorreducción colorante de tetrazolio se ha utilizado durante muchos años 23. Este ensayo fue elegido debido a su reproducibilidad y hora-efectividad en comparación con otros métodos, por ejemplo, el recuento de células manualmente que se consume mucho tiempo. El uso de BrdU para etiquetar células proliferantes requiere la radiactividad, que es sensible, sino que puede ser peligroso. La biorreducción colorante de tetrazolio es eficiente en el tiempo y no requiere de la radiactividad. Las limitaciones de la biorreducción colorante de tetrazolio es frecuente en estudios con potencial oxido-reductor. Dondequiera que se produce potencial de oxido-reductor, los falsos positivos son más frecuentes 24.
El aislamiento de la matriz extracelular fue adquirida mediante la disolución de todas las células del miocardio con una solución hipertónica. El protocolo fue evolucionado a partir de los estudios que utilizan un aparato de perfusión a un simple proceso de agitación 25. el Duration se evaluó empíricamente mediante la adopción de diferentes puntos de tiempo: 12, 14, 16, 18, 20 h. La matriz extracelular se analizó para determinar los residuos celulares después señala el diverso tiempo 25. Los principales escollos de descelularización son la contaminación por hongos y bacterias. Se aconseja el uso de compuestos anti-hongos y anti-microbianas. Para platos de la capa, la matriz extracelular es pulverizada y se suspendió en PBS. Debido al alto contenido de material elástico, la muestra no se disuelve completamente. La sonicación de la configuración de mayor intensidad y sin calentamiento de la muestra es imprescindible. La ventaja de utilizar la matriz extracelular a través de otros agentes de revestimiento es que la matriz extracelular es una fusión de proteínas que ocurren fisiológicamente y que conecta la in vivo y en ensayos in vitro. Este enfoque es más fisiológica de recubrimiento con un solo compuesto como el colágeno o la fibronectina solo. También da una idea de la importancia de la señalización iniciada por los cambios enla matriz extracelular. Una limitación de este protocolo es claramente la destrucción de la matriz y la eliminación de componentes de señalización importantes de la matriz. Es imperativo tener cuidado al decellularizing la matriz.
El uso de vasos aislados como de tejidos intactos abre la posibilidad de estudiar la vasodilatación in situ y con una mínima interferencia de enzimas. Este método es más adecuado para estudiar la función endotelial en una variedad de animales y enfermedades. Duling fue el primero en describir este método en los cerdos. Los vasos de cerdo son profundas en el tejido; de ahí el papel se describe la fijación de gelatina. Los primeros estudios en la vasodilatación utilizan arterias carótidas 26. Hemos refinado la técnica a utilizar facialis arterias 27. arterias facialis son más equivalentes en tamaño a una arteria resistencia de la arteria carótida. Una limitación de este protocolo es la fragilidad de la embarcación, que debe ser eliminado requirin intactag práctica.
En resumen, el desarrollo de IRF5D nos permitió evaluar la participación de IRF5 en la inflamación y fibrosis en el corazón. Esto dio lugar a los datos representados en este estudio. IRF5D es una herramienta útil para estudiar los mecanismos de IRF5 en diversas enfermedades, así como sugiere IRF5 como una posible diana terapéutica 28.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100- 100ml | |
| Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody | Thermo Fisher | A11001 | |
| Bardford reagent | Thermo Fisher | 23200 | Pierce |
| Biosensors | Forte-Bio | MR18-0009 | |
| CD64 (H-250) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-15364 | |
| CellEvent Caspase-3/7 Substrate | Thermo Fisher/Life Technologies | C10427 | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit | Promega | G3580 | Promega |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher | D-1306 | 1:1,000 dilution in PBS |
| donkey anti rat Alexa 488 | Thermo Fisher | A-21208 | 1:1,000 dilution in PBS |
| ECL plus | GE healthcare/Amersham | RPN2133 | After a lot of trial and error we came back to this one |
| Eclipse TE 200-U microscope with EZ C1 laser scanning software | Nikon | ||
| goat anti rabbit Alexa 488 | Thermo Fisher | A-11008 | 1:1,000 dilution in PBS |
| HRP anti-goat | Santa Cruz Biotechnologies | sc-516086 | !:10,000 dilution in TBS |
| HRP donkey anti-mouse | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2315 | 1:10,000 dilution in TBS |
| ICAM-1 antibody | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1511 | 1:200 dilution in PBS |
| IRF5 antibody (H56) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-98651 | |
| Micro plate reader Elx800 | Biotek | ||
| NIMP neutrophil marker | Santa Cruz Biotechnologies | sc-133821 | 1:200 dilution in PBS |
| Octet RED | Forte Bio | protein-protein binding | |
| Peptide design Medit SA software | RCSB.org | ||
| Recombinant IRF5 protein synthesis | TopGene Technologies | protein expression, synthesis service | |
| sodium dodecyl phosphate | Sigma Aldrich | 436143 | detergent |
| Ketamine | Pharmacy | Schedule III controlled substance, presciption required | |
| Xylazine | MedVet | ||
| 3.5X-45X Trinocular Dissecting Zoom Stereo Microscope with Gooseneck LED Lights | Am Scope | SKU: SM-1TSX-L6W | |
| Zeba Desalting Columns | Thermofisher | 2161515 | |
| Endothelial Basal Media EBM Bullet kit | Lonza | CC-3124 | kit contains growth supplemets |
| VIA-100K | Boeckeler Instruments | ||
| 4 - 15% TGX gel | Bio-Rad | 5671081 | |
| MedSuMo software | Medit, Palaiseau, France | ||
| Laemmli Buffer | BioRad |
References
- Bi, X., et al. Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis. Breast Cancer Res. 13 (6), 111 (2011).
- Dideberg, V., et al. An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases. Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).
- Graham, R. R., et al. A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus. Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).
- Krausgruber, T., et al. IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses. Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).
- Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease. Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).
- Mayes, M. D., et al. Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis. Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).
- Dimitroulas, T., et al. Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease. Curr Pharm Des. , (2013).
- Botstein, G. R., LeRoy, E. C. Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches. Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).
- Oram, S., Stokes, W. The heart in scleroderma. Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).
- Xu, H., et al. 4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice. PLoS One. 7 (12), 52046 (2012).
- Steen, V. The heart in systemic sclerosis. Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).
- Deshpande, N., et al. The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema. Nucleic Acids Res. 33, Database issue D233-D237 (2005).
- Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
- Matthew, A. Current biosensor technologies in drug discovery. Drug Discovery. , 69 (2006).
- Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. A review of MED-SuMo applications. Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).
- Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).
- Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry. PloS one. 9 (9), 106882 (2014).
- Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Bauer, P. M., et al. Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase. J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).
- Weihrauch, D., et al. An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice. PLoS One. 11 (4), 0151999 (2016).
- Hoogenboom, H. R., et al. Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).
- Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
- Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Res Notes. 8 (1), 1 (2015).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
- Weihrauch, D., et al. Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).
- Roy, S., P, P. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects. Mavragani, C. , 35 (2011).
