Introduction
Regulering av cellevekst og celledødsimmunresponser er sentral for rollen av transkripsjonsfaktor familien av interferon-regulerende faktorer. IRF5 markeres som å være avgjørende for regulering av immunresponser mellom type 1, en inflammatorisk fremme reaksjon og type 2, en immunrespons rettet mot vevsreparasjon. IRF5 er nøkkelen i kreft 1, og autoimmunitet 2, 3, 4, 5.
Den tett hud mus (Tsk / +) er en modell for vev fibrose og sklerodermi på grunn av en duplisering mutasjon i fibrillin-1 genet. Denne mutasjonen resulterer i en tett hud og en økning i bindevev. Disse musene utvikler myokardial inflammasjon, fibrose og endelig hjertesvikt 5, 6, 7,> 8, 9. Sklerodermi er en autoimmun fibrotisk lidelse som berører ca 150 000 pasienter i USA seks. Kjennetegnene på denne sykdommen er fibrose av indre organer, inkludert hjertet 7, 8, 9, 10, 11.
Naturen av studien krevde utformingen av et inhiberende peptid. Programvaren tilnærmingen ble valgt fremfor en tradisjonell måte ved hjelp av en fag-display. Programvaren tilnærmingen er enklere og mindre tidkrevende. Den RCSB Databanken brukes til å identifisere aktuelle bindingssteder 12. For å studere samspillet mellom den nydesignede peptid med rekombinant protein og å fokusere på de bindende parametrene, ble en teknikk som kalles biolag interferometri brukt. Biolag interferometri er en biosensor basert technique som bestemmer bindende affinitet, tilknytning og dissosiasjon ved hjelp av en biosensor og en bindende prøve. Den biosensor kan være fluorescerende, luminescently, radiometrisk og kolorimetrisk merket. Målingen er basert på masse tillegg eller uttømming likner forening og dissosiasjon 13, 14. Målet med denne studien var å forstå hvilken rolle IRF5 i myocardial betennelse og fibrose. Målet var å få innsikt i rollen som IRF5 i utviklingen av vev fibrose og sklerodermi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (Protokoll: AUA # 1517). All forskning som involverer mus ble gjennomført i samsvar med PHS politikk.
1. Design av Decoy Peptide
- Finn IRF5 3D struktur og basere design på den. Design en 17 mer, betegnes IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD), hvor aspartat (D) er byttet ut med serin (S) for å etterligne fosforylering i IRF5 på 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Analyse av 3D sulfhydrylgrupper og kunnskap om IRF5 mekanisme for aktivering, dvs. serin fosforylering, foreslått at en strategi for målretting IRF5 var å generere en lokkedue peptid. Se figur 1. For å identifisere den beste regionen i 3D-struktur, bruk en molekylær modellering programvare for å designe små molecules og peptider 15.
NB: Det kritiske trinnet i denne prosessen er tilgjengeligheten av 3D-strukturen av målproteinet og dens mulige bindingsseter. 3D-struktur av IRF5 representerer nøyaktig hvordan IRF5 dimerizes etter fosforylering. Substitusjon av aspartat for serin eller treonin er outsourcet. Peptidet blir syntetisert separat uten å være knyttet til IRF5. - Replikere fosfo-domenet simpelthen ved å erstatte D til S. På grunnlag av den opprinnelige sekvensen (ELSWSADSIRLQISNPD, få et nytt peptid IRF5S med aminosyresekvensen av Ac-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH2 (IRF5D).
2. Biolag Interferometri (BLI)
MERK: rensing for rekombinant IRF5 ble outsourcet. 16
- Biotin etikett IRF5 i et molart forhold på 1: 1 av biotin til ligand med en biotinylering reagens som omfatter en langkjedet linker. Den lange kjeden linker vil sikre en mer aktiv og homogen ligand overflaten.
- Tilsett 1 ml 2 mg / ml IRF5 til 13 ul av 20 mM biotin reagens eller øke volumene hvis nødvendig. Inkuber på is i 2 timer. Etter merking, bruke en avsaltingsspinnkolonne for å fjerne reaksjonsblandingen fra det merkede protein.
- Inkuber biotin-merkede liganden med biosensorer for 15 min. Unngå over-merking og juster 1: 1 molart forhold. Etter merking, bruke en avsaltingsspinnkolonne for å fjerne reaksjonsblandingen fra det merkede protein.
- Inkuber biotin-merket IRF5 biosensorer i 10 minutter i forskjellige konsentrasjoner av den IRF5 attrappen peptid. Foreningen og dissosiasjon priser ble bestemt som beskrevet 10, 17, 18.
3. apoptose og proliferasjon Analyser
- Spredning analysen via bioreduction av tetrazolium
- Administrere IRF5D fortynnet i PBS (1 mg /kg / d, injisere et volum 20 ul i en 20 g mus) subkutant med en 27-gauge nål med en standard scruffing teknikk eller ved PBS alene til Tsk / + og C57Bl / 6J-mus i 21 dager.
- Bedøve mus med isofluran (5%) og utføre en cervikal dislokasjon. Skjære hjertene ved å kutte åpne brystet langs brystbenet. Løft opp hjertet med pinsett og ta hjertet.
- Lyser de hjerter med en proteinlyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF 10 og bestemme proteinkonsentrasjonen ved Bradford assay 19.
- Coat 96-brønners plater med C57Bl / 6J hjerte matrise isolert som beskrevet i seksjon 7. Fortynn den PBS suspendert C57Bl / 6J kardial matrise til en konsentrasjon på 20 mikrogram / ml og tilsett 30 mL av C57Bl / 6J kardial til hver brønn. La det stå over natten ved 37 ° C i kuvøse.
- Kultur menneskelige umbilical vein celler ved hjelp av 500 ml av endothelial basal media med 0,4% bovint hjerneekstrakt, 0,1% askorbinsyre, 0,1% hydrokortison, 0,1% human epidermal vekstfaktor, 2% føtalt bovint serum og 0,1% gentamicin / amfotericin B tilsatt til den. Kultur av cellene i 96-brønners plater ved 5% CO2 og 95% romluft med en tetthet på 25.000 celler per brønn. Stimulere med økende konsentrasjoner av IRF5D mellom 0 - 100 mikrogram / ml i mediet (Volumet var mellom 0 og 50 pl / ml).
- Bestem celleproliferasjon etter tre dager og vurdere forskjeller i absorbans på en mikroplateleser. Reaksjonen er en bioreduction av MTS tetrazoliumforbindelse. NADPH eller NADH dehydrogenase er produsert av enzymer i metabolsk aktive celler.
- Som MTS tetrazoliumforbindelsen er lagret frosset ved -20 ° C, tines forbindelsen langsomt i løpet av ca 90 minutter ved romtemperatur. Pipetter 20 mL i hver brønn av en 96 brønners plate, og legge til 100 mL av kultur media til det. Inkuber platen ved 37 ° C i 1 til 4 timer i en HUMIdified, 5% CO 2 kammer.
- Les absorbansen ved en bølgelengde på 490 nm.
- Apoptose analysen via caspase aktivitet
MERK: Den eksperimentelle oppsettet er det samme som ovenfor 3.1.1 til 3.1.5.- Stimulere cellene med økende konsentrasjoner av IRF5D mellom 0 - 100 mikrogram / ml i mediet.
- Legg grønn deteksjon til caspase 3/7 substratet til ECS og inkuberes det i 30 minutter ved 37 ° C. Vurdere fluorescens på mikroplateavleser samtidig med en absorpsjons / emisjonsbølgelengde på 502/530 nm. Kjør eksperimenter i tre eksemplarer.
MERK: grønn fluorescerende middel er en fire-aminosyre-peptid bundet til en nukleinsyre-bindende fargestoff. Dette reagenset blir selvlysende når spaltet etter kaspase 3 og 7 aktivering. Denne fluorescens måles. Fordelen er en reduksjon i vasketrinnet.
4. Vurdering av IRF5 og ICAM-1 Expression i Hørt
- Administrere IRF5D fortynnet i PBS (1 mg / kg / d, injisere et volum 20 ul i en 20 g mus) subkutant med en 27-gauge nål med en standard scruffing teknikk eller ved PBS alene til TSK / + og C57BL / 6J-mus en gang per dag i 21 dager.
- Bedøve mus med isofluran (5%) og utføre en cervikal dislokasjon. Skjære hjertene ved å kutte åpne brystet langs brystbenet. Løft opp hjertet med pinsett og ta hjertet.
- Lyser de hjerter med en proteinlyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF 10 og bestemme proteinkonsentrasjonen ved Bradford assay 19.
- Utfør en western blot på lysatene av hjerter. Fortynne prøvene til 25 ug totalt protein og et volum på 40 ul med Laemmli-prøvebuffer inneholdende 5% merkaptoetanol. Kjøre prøvene på en 4 - 15% TGX gel ved 50 mV i 5 min. Øke spenningen til 100 mV i 1 time inntil fargestoffet fram renner ut.
- Plassere gelen på 1x overføringsbuffer (25 mM Tris, 190 mM glycin, 20% metanol, pH justeres til 8,3 om nødvendig) og inkuberes i 10 - 15 min.
- Monter overføring sandwich (svamp, filter, gel, cellulose membran, filter, svamp). Pass på at ingen bobler er fanget i mellom. Blottet bør være på katoden og gelen på anoden. Overfør i 1 time i kjølerommet på 100 mA.
- Den neste dag, skyll blot og deretter blokkere bakgrunn i 5% fettfri tørrmelk i 30 minutter ved romtemperatur. Skyll blot med Tris-bufret saltvann inneholdende 5% Tween tre ganger i 5 minutter hver.
- Inkuber over natten med de primære antistoffer ved hjelp av primære polyklonale antistoffer mot IRF5 eller ICAM-1. Fortynn antistoffene i Tris-bufret saltoppløsning i en 1: 1000 fortynning.
- Fortynn de sekundære antistoffer i Tris-bufret saltløsning og inkuber blot i 1 time ved romtemperatur. For sekundære antistoffer, bruk pepperrot konjugert esel anti-mus IgG (1: 10.000) og pepperrotperoksidase esel anti-geite-IgG (1: 10.000), respektivt.
- Påfør chemiluminescence til blot etter blanding av komponentene i henhold til produsentens protokoll og inkuberes i 3 min til luminesce band av interesse. Utsett blot til en X-ray film. Bruk ImageJ å måle tettheten. Normalisere tetthetsverdier til kontrollbåndene 10.
5. Vurdering av provoserende Cell Numbers etter IRF5 Hemming
- Administrere IRF5D fortynnet i PBS (1 mg / kg / d) subkutant med en 27-gauge nål med en standard scruffing teknikk eller ved PBS alene til Tsk / + og C57Bl / 6J-mus i 21 dager.
- Bedøve mus med isofluran (5%) og utføre en cervikal dislokasjon. Skjære hjertene ved å kutte åpne brystet langs brystbenet. Løft opp hjertet med pinsett og ta hjertet. Snap fryse og lagre skåret hjertene til analyse.
- Monter frosne hjerter på tissUE holdere som passer til kryostaten i bruk. Klipp 10 mikrometer tykke frosne seksjoner på en cryostat for immunhistokjemi.
- Feste de frosne seksjoner med 1% paraformaldehyd i fosfat-bufret saltløsning i 20 minutter ved romtemperatur. Permeabilize seksjonene med 0,5% Triton-X-100 i PBS i 5 min.
Forsiktig: Paraformaldehyde er regulert kreftfremkallende og må håndteres med forsiktighet. - Fortynn anti-kanin CD64, en monocytt / makrofag markør 1: 200 i PBS. Bruk på de faste seksjoner og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C.
- Vask objektglass i PBS i 5 min tre ganger ved romtemperatur.
- Fortynnet anti-rotte NIMP, en primær nøytrofile markør 1: 200 i PBS. Bruk på de faste seksjoner og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C.
- Vask objektglassene i 5 min tre ganger med PBS ved romtemperatur.
- Fortynn de sekundære antistoffer anti-kanin Alexa 488 og konjugert anti-rotte Alexa 488 konjugeres 1: 200 i PBS.
- Påfør anti-kanin Alexa 488 og konjugert anti-rotte Alexa 488 konjugerte sekundære antistoffer til seksjonene i 30 minutter ved 37 ° C tilsvarende. Volumet av antistoff varierer i henhold til størrelsen av delen. Beløpet skal dekke delen sjenerøst. I de fleste tilfeller volumet er mellom 100 og 200 ul.
- Bruke 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) som et kjernefysisk flekk i en 1: 1000 fortynning i PBS. Tilsett 1 pl til 1 ml PBS og bruke DAPI i det siste vasketrinn. Legg vandig montering media til et dekkglass og sette den inn på lysbildet.
- Analyser fluorescensmerkede deler av konfokalmikroskopi hjelp av en 40X olje målet. Bruk eksitasjonsbølgelengdene 488 og emisjonsbølgelengder større enn 530 nm for CD64 og NIMP. DAPI var begeistret med 360 nm og slippes ut ved 460 nm i blått. Skille monocytter / makrofager og nøytrofile (n = 10 bilder per antistoff, fra tre forskjellige mus i hver gruppe) ved sin annen merking og telle dem. Uttrykke data som antall telte celler.
6. Cell avhengig vasodilatasjon etter IRF5 Hemming
- Bedøve C57BL / 6J kontrollmus og TSK / + mus med og uten peptid behandling med en ketamin (80-100 mg / kg) / xylazin (minst 10 - 12,5 mg / kg) blanding. Injiser ketamin / xylazin blanding intraperitonealt. Beherske musen manuelt.
- Bruk en 25 gauge eller mindre nål. Sett nålen inn i den nedre høyre kvadrant av abdomen. Trekk stempelet før injeksjon for å sikre at nålen ikke inn i en blodåre eller tarmen.
- Når et tilstrekkelig nivå av anestesi er nådd, sikre musen i liggende stilling, tørke pelsen med alkohol gjennomvåt gasbind pad, og ved hjelp av en saks åpne brysthulen og fjerne hjertet.
MERK: Eventuell avblødning vil avlive musen og gjøre disseksjon enklere ved trykkavlastning i blodkar og dermed minimere blødning når du skjærer blodkar.- Åpne huden usinga saks, kutte opp fra brystet lateralt i forhold til kjevebenet med forsiktighet for å ikke forstyrre den underliggende vev mot forsiden av kjeven.
- Dissekere facialis arterien ved å fjerne det myke vevet rundt det.
- Forsiktig: Ikke skade fartøyet eller napp på facialis arterie samtidig som eksponert vev badet i MOPS buffer (2,0 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,02 mM EDTA, 5,0 mM glukose, 4,7 mM KCl, 1,17 mM MgSO4 · 7H 2 O, 3,0 mM MOPS, 145 mM NaCl, 1,2 mM NaH 2PO 4 · H2O, 2,0 mM pyrodruesyre) for å forhindre uttørking. Opptre under en kikkert stereo zoom dissekere mikroskop (forstørrelse av 3,5X til 45X) og en fiberoptisk lyskilde.
- Isoler facialis arterien.
- Ta tak i facialis proksimalt for første forgreningen og distal til der arterien vil bli kuttet. Skjær arterien fra moderarterien, den ytre halsarterie. Fjern facialis arteries fra kontrollmusene, TSK / + mus med og uten IRF5D behandling.
- Mens du holder arterien i tang, kuttet de to grenene kommer av facialis, slik at fartøyet skal forsiktig løftet mens noen uncut omliggende vev kan identifiseres og kuttet.
- Fortsett på denne måten til forgreningen er nådd kutte både datter arteriene å frigjøre fartøyet. Det er ikke nødvendig å klemme fartøyene før kutting på grunn av lettet trykk i vaskulaturen fra fjerning av hjertet. Sette fartøyet i MOPS-buffer mens den andre facialis arterien ble dissekert og isolert.
- Cannulate fartøyene ved å binde dem på glass pipetter med en terminal diameter på 125-175 nm. Preload glass pipetter og buffer reservoarer med MOPS buffer.
Forsiktig: Unngå luftbobler dannes i pipettene. - Bind fartøyene på pipettene bruker oftalmiske sting.
- Monter fartøyet kamre på en omvendt triocular microscope med et videokamera vedlegg. Kjør video gjennom en video caliper målesystem for målinger på skjermen av skipene. 20
- Trykk dem i en to-trinns prosess. Først med MOPS fylte reservoarer i en høyde over fartøyet lik 20 mmHg trykk, åpne kraner ventiler i reservoar linjer til fartøyet manuelt. Inspisere fartøyet for tegn på lekkasje rundt båndene og ned lengden av fartøyet. For det andre, heve reservoarene til 60 mmHg og reinspect fartøyet.
- Når trykk 60 mmHg, la skipene til stabilisering i 30 min.
- For å kunne vurdere vasodilatasjon som reaksjon på acetylkolin (10 -7 til 10 -4 M), preconstrict fartøyet til en diameter på 50-75% av sin maksimale diameter ved hjelp av 1 til 3,0 x 10 -8 til 10 -7 M U46619. Etter at fartøyet for å stabilisere i 6 minutter, tilsett acetylkolin til badet i 2 min varighet trinn slik atsluttkonsentrasjoner i badekaret er 10 -7, 10 -6 10 -5, 10 -4. Mål vasodilatasjon i alle tre gruppene.
7. Isolering av Cardiac ekstracellulær matriks
- Bedøve C57BL / 6J kontrollmus og TSK / + mus med og uten peptid behandling med isofluran (5%) og utføre en cervikal dislokasjon. Skjære hjertene ved å kutte åpne brystet langs brystbenet. Løft opp hjertet med pinsett og ta hjertet.
- Sett fjernet hjerter i et beger og tilsett 15 ml hyperton 1% natrium (SDS). Omrør hjerter i 1% SDS-løsning i 18 timer ved romtemperatur for å bryte opp cellene ved tilsetning av en rørestav for den 1% SDS oppløsning og la den begerglasset på en røreplate.
Forsiktig: Vær oppmerksom på at ekstracellulære matrise vil gå i oppløsning hvis venstre for lenge i hyperton løsning. Derimot, hvis hjertene ikke blir agitert lenge nok i hypertonisk oppløsning, deretter cellene vil ikke riktigoppløse og det vil være cellerester igjen i begerglasset. - Vask i 30 minutter i 15 ml 0,5% Triton X-100. Deretter vaskes i 15 minutter med 15 ml PBS. Decellularize hvert hjerte individuelt.
- Snap-fryse den ekstracellulære matriks i flytende nitrogen og powderize den frosne hjerte ekstracellulære matriks med en på forhånd avkjølt morter.
- Lage en suspensjon av pulvermassen i PBS inneholdende 1% antibiotikum. Volumet tilsatt i de fleste tilfeller er 300 ul. Sonikere suspensjon i 30 - 60 s på is på høy innstilling.
MERK: Det er svært viktig at prøven holder kulden. Vær oppmerksom på at suspensjonen er meget viskøs på grunn av det høye proteininnhold glykan. - Bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en Bradford assay.
MERK: Kontroller at det er anti-biotiske og anti-sopp i suspensjon. Penicillin / streptomycin er den mest brukte og anbefalte.
8. Vurdering av Nuclear Translokasjon av Immunohistochemistry
- For å belegge objektglass og tallerkner bruke en sluttkonsentrasjon på 20 ug / ml av den kardiale ekstracellulær matriks i PBS. Pipetter 500 mL av hjerte ekstracellulære matrise løsning i en 100 mm skål for belegg og 150 mL av den endelige ekstracellulære matrise løsning på et lysbilde.
- Hemme IRF5 ved tilsetning IRF5D i en 50 mikrogram / ml konsentrasjon i 24 timer til rotte neonatale hjertemuskelceller i kultur. La kontrollere myocyte kulturer ubehandlet.
- Vurdere smugling av IRF5 fra cytosol til kjernen ved hjelp av immunfluorescens og analysere ved konfokalmikroskopi. Identifiser grønn merking for IRF5, identifisere den blå DAPI flekken for kjernen
- Påfør den primære anti-IRF5 antistoff. Det primære antistoff ble anvendt i en 1: 200 fortynning i PBS. Inkuber objektglass i 30 minutter ved 37 ° C og følger med tre 5-min vasketrinn. Det sekundære antistoffet var Alexa 488-merket geit anti-mus IgG-antistoff.
- Fortynn den sekundære antistoff 1: 1000 dirensning i PBS. Inkuber sekundære antistoff i 30 minutter ved 37 ° C. Oppnå atom flekken med DAPI. Fortynn DAPI 1: 1000 i PBS. Vask objektglassene totalt 3 ganger i 5 min og tilsett DAPI til den tredje og siste vasketrinn.
- Capture trafficking ved hjelp konfokalmikroskopi og måle fluorescens intensitet i kjernen og cytosol som tidligere beskrevet 10. Identifiser grønn merking for IRF5, identifisere den blå DAPI flekken for kjernen. Cellene som viser blå kjerner med grønn merking i dem inneholder aktivert IRF5, som smugles fra cytosol til kjernen. Når IRF5 ikke er aktivert, grønt merking finnes i cytosol.
- Analyser fluorescensmerkede celler ved konfokalmikroskopi hjelp av en 40X olje målet. Bruke en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm og emisjonsbølgelengder som er større enn 530 nm for IRF5. Bruke en eksitasjonsbølgelengde på 360 nm og en emisjonsbølgelengde på 460 nm for visualisering av DAPI.
- Utfør variansanalyse (ANOVA) for gjentatte tiltak innenfor og mellom grupper. Følg ANOVA med Bonferroni er modifikasjon av studenter t-test. Uttrykke dataene som standard feil av gjennomsnittet.
- Bedøve C57BL / 6J kontrollmus og TSK / + mus med og uten peptid behandling med en ketamin (80-100 mg / kg) / xylazin (minst 10 - 12,5 mg / kg) blanding. Injiser ketamin / xylazin blanding intraperitonealt. Beherske musen manuelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene vist i figur 1 viser hvordan å designe et peptid. Figur 1, øverst til venstre, viser regionen (mellom de 2 gule pilene, aminosyrer (aa) 425-436) i IRF5 som blir fosforylert av en rekke kinaser. Figur 1, øverst til høyre, viser en gul oval der IRF5 er fosforylert domene bindes. Den dimere struktur av 3DSH ble rotert for å observere en kløft eller dal til venstre for Helix 2 (aa303-312). Det er her fosfo-haledomene av IRF5 er ment for å sette seg fast når den er fullt aktivert (dvs. serin fosforylert), som danner en homodimer og antatt biologisk aktiv tilstand.
I figur 2 er bindingsaktiviteten målt ved hjelp av biolag interferometri avbildet. For å fastslå at lokkefugl peptid IRF5D er ikke giftig, ble spredning og apoptose vurderes etter behandling av calen med økende konsentrasjoner av IRF5D (figur 3). ICAM-1, en inflammatorisk markør, og IRF5 uttrykk ble redusert etter behandling av de TSK / + mus med IRF5D som bestemt ved western blot analyse (figur 4). Antallet nøytrofiler (NIMP) og CD64 ble redusert som bestemt ved immunohistokjemi etter behandling med IRF5D (figur 5). Endotelfunksjon ble forbedret i facialis arteriene i TSK / + mus etter IRF5D forhold til Tsk / + mus uten IRF5D behandling (figur 6). Større antall IRF5 positive kjerner i muskelceller dyrkede på Tsk / + hjertematrise ble visualisert i forhold til C57BL / 6J hjerte matrise. Behandling av kulturene med IRF5D resulterte i redusert antall IRF5 positive kjerner (figur 7).
Figur 1: 3D Protein Structure av IRF5. A) Den øvre venstre Figuren viser området peptidet er designet for. B) Regionen som blir fosforylert fremhevet av de to gule piler er aminosyrer (aa) 425 - 436 i IRF5. C) Det nedre panel viser homodimert funksjonelt kompleks. Den homodimerisk tallet presenteres for enklere visning av regionen der fosforylert halen domenet IRF5 binder seg til å danne en homodimer. Dette tallet har vært tidligere utgitt 21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Biolag Interferometri av IRF5D. Denne figuren viser binding av IRF5 til IRF5D vurdert av biolaye r interferometri. Analyse viste at programvare IRF5 binder seg til IRF5D med en Kd på 3,72 ± 0,75 x 10 -6 M (gjennomsnitt ± SD, n = 3). Dette tallet har vært tidligere utgitt 21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: celleproliferasjon og apoptose. Disse søylediagram viser at økende konsentrasjoner av IRF5D har ingen innflytelse på celleproliferasjon (venstre) eller apoptose (til høyre), og ble ikke endret ved å øke nivåene av IRF5D. Dette tallet er tidligere blitt publisert 21 (gjennomsnitt ± SD, p <0,05, n = 4).k "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: ICAM-1 og IRF5 Expression i hjertet. ICAM-1 (A) og (B) IRF5 uttrykk ble redusert i hjertemuskelen av Tsk + mus etter behandling IRF5D som demonstrert ved Western blot. Dataene ble normalisert for å aktin lastekontroll (gjennomsnitt ± SD, p <0,05, n = 3). Dette tallet har vært tidligere utgitt 21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5:CD64 (A) og NIMP (B) Expression i hjertet. Antallet monocytter / makrofager og nøytrofile ble redusert etter IRF5D behandling som demonstrert ved immunhistokjemi (gjennomsnitt ± SD, * = p <0,05, C57BL / 6J vs. Tsk / +; # = p <0,025, Tsk / + vs. Tsk / + + IRF5D; n = 3, 10 bilder per antistoff). Pilene markere monocytter / makrofager (A) og nøytrofile (B). Skalaen barer er 10 mikrometer. Dette tallet har vært tidligere utgitt 21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Cell Funksjon og Vasodilatasjon. IRF5D administrasjon forbedret acetylkolin indusert vasodilatasjon av facialis arteriene i TSK / + mus (gjennomsnitts &# 177; SD, p <0,05, n = 6). Dette tallet har vært tidligere utgitt 21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: IRF5 Nuclear Translokasjon av IRF5 i dyrkede myocytter med IRF5 hemming. IRF5 inhibering av IRF5D (50 ug / ml, 24 timer) gir færre IRF5 positive kjerner i myocytter dyrkede på Tsk / + kardial matrise og C57Bl / 6J hjerte matrise. Pilene viser IRF5 positive kjerner (gjennomsnitt ± SD, p <0,05, n = 3). Målestokken er fem mikrometer. Dette tallet har vært tidligere utgitt 21. Vennligst CLICk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet var å designe en IRF5 inhibitor å belyse rollen IRF5 på betennelse, fibrose, og vaskulær funksjon i hjertene til TSK / + mus. Funnene er at IRF5D ikke induserer spredning eller apoptose. Videre inflammasjon ble redusert og vaskulær funksjon forbedret. Disse dataene tyder på at IRF5 spiller en viktig mekanistisk rolle i utviklingen av inflammasjon og fibrose i sentrum av TSK / + mus, og at det har potensiale til å tjene som et terapeutisk mål.
Første skritt var å designe en inhibitor. Når et peptid er utformet, flere punkter må tas i betraktning: sekvenslengde, sekundær struktur, rester utsatt for oksydasjon, aminosyresammensetning, amidering og tildekking, aminosyrer i den N-terminale ende, og aminosyrene i den C-terminale ende, og ligand vedlegg. Den ideelle sekvenslengde er mellom 10 til 15 rester for å sikre best mulig totalutbytte, færre urenheter, og redusert kostnad. Det er vik-tant å være klar over sekundære strukturer som beta sheet formasjon. Beta ark dannelse kan resultere i en høy grad av slettede sekvenser. Unngå rester som er utsatt for oksydasjon, som kan føre til sidereaksjoner som kan påvirke effektiviteten av peptidet. For å kontrollere løseligheten, syntese og rensing holde sammensetningen av de aminosyre-byggestener for peptidet under 50% hydrofobe aminosyrer, og sikrer at det er nok ladede rester. N- og C-termini må velges på en uladet tilstand. Unngå glutamat ved N-terminus og unngå cystein, prolin, glycin og i C-terminus. Legg en spacer mellom peptid og ligand for å minimere folding. Derfor kan de trenger for å være maskert som en amid uten kostnad.
IRF5D utforming var basert på 3D-strukturen. En 17 mer, betegnes IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD) ble utformet, hvor aspartat (D) ble byttet ut med serin (S) for å etterligne fosforylering i IRF5 på 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Dettetilnærming er rett frem på grunn av ny datateknologi. Ulempen med denne teknikken er den opprinnelige investering i programvaren. Det er imidlertid betydelige samlede besparelsene sammenlignet med kostnadene forbundet med arbeidskraft og materialer som brukes i andre hemmer metoder for design, som fag skjerm 22. Det kritiske trinnet i denne prosessen er tilgjengeligheten av 3D-strukturen av målproteinet og dens mulige bindingsseter. Begrensningen til å utforme en inhibitor er muligheten for at en feil region er valgt og inhibitoren ikke blokkerer det ønskede protein. Den andre muligheten er en delvis blokkering av det ønskede protein.
Med peptidet i hånden fokus beveger seg for å teste toksisitet av attrappen peptidet ved å måle celleoverlevelse. Først IRF5D ble testet ved bruk av varierende konsentrasjoner. IRF5D induserer ikke apoptose og ikke fremme spredning selv ved høye konsentrasjoner. Metodene som brukes her er standard og gi pålitelige data. Den tetrazolium fargestoff bioreduction har vært brukt i mange år 23. Denne analysen ble valgt på grunn av dens reproduserbarhet og tid-effektivitet, sammenlignet med andre metoder, f.eks telle celler manuelt, noe som er svært tidkrevende. Bruke BrdU å merke prolifererende celler krever radioaktivitet, som er følsom, men kan være farlig. Den tetrazolium fargestoff bioreduction er tidsbesparende og krever ikke radioaktivitet. Begrensningene til tetrazolium fargestoff bioreduction er utbredt i studier som involverer oksydo- reduktiv potensial. Uansett hvor oksydo- reduktiv potensial skjer, falske positiver er hyppigere 24.
Isolasjon av ekstracellulære matrise ble kjøpt ved å løse alle hjerteinfarkt celler med en hyperton løsning. Protokollen ble utviklet fra studier ved anvendelse av en perfusjon apparat til en enkel agitering prosess 25. den duration ble bestemt empirisk ved å ta forskjellige tidspunkter: 12, 14, 16, 18, 20 timer. Den ekstracellulære matriks ble analysert for celleavfall etter forskjellige tidspunkter 25. De viktigste fallgrubene decellularization er sopp og bakteriell forurensning. Det anbefales å bruke anti-sopp og anti-mikrobielle forbindelser. Å belegge retter, er det ekstracellulære matrise powderized og suspendert i PBS. På grunn av det høye innholdet av elastisk materiale, har prøven ikke fullstendig oppløst. Ultralydbehandling på høyere intensitet innstillinger uten å varme opp prøven er avgjørende. Fordelen ved bruk av ekstracellulær matriks i forhold til andre beleggsmidler er at den ekstracellulære matriks er en sammensmelting av proteiner fysiologisk forekommende og den forbinder in vivo og in vitro analyser. Denne tilnærmingen er mer fysiologisk enn belegning med en enkelt forbindelse som kollagen eller fibronectin alene. Den gir også innsikt i betydningen av signalering initiert ved endringer iden ekstracellulære matriks. En begrensning av denne protokollen er tydelig ødeleggelse av matrisen og fjerne viktige signalkomponenter fra matrisen. Det er viktig å være forsiktig når decellularizing matrisen.
Anvendelsen av intakt vev som er isolert fartøy åpner opp muligheten for å studere vasodilatasjon in situ og med minimal forstyrrelse av enzymer. Denne metoden er mest tilfredsstillende for å studere endotelfunksjonen i en rekke dyr og sykdommer. Duling var den første til å beskrive denne metoden hos gris. Fartøyene i gris er dypt i vev; derav papir beskrev gelatin fiksering. Tidlige studier i vasodilatasjon brukes carotis 26. Vi videreutviklet teknikk å bruke facialis arterier 27. Facialis arterier er mer tilsvarende i størrelse til en motstand arterie enn halspulsåren. En begrensning av denne protokollen er skjørheten i fartøyet, som må fjernes intakt requiring praksis.
I sammendraget, utvikle IRF5D gjort oss i stand til å vurdere involvering av IRF5 i betennelse og fibrose i hjertet. Dette resulterte i de data som er vist i denne studien. IRF5D er et nyttig verktøy for å studere mekanismene for IRF5 i ulike sykdommer samt antyder IRF5 som en mulig narkotika mål 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100- 100ml | |
| Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody | Thermo Fisher | A11001 | |
| Bardford reagent | Thermo Fisher | 23200 | Pierce |
| Biosensors | Forte-Bio | MR18-0009 | |
| CD64 (H-250) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-15364 | |
| CellEvent Caspase-3/7 Substrate | Thermo Fisher/Life Technologies | C10427 | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit | Promega | G3580 | Promega |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher | D-1306 | 1:1,000 dilution in PBS |
| donkey anti rat Alexa 488 | Thermo Fisher | A-21208 | 1:1,000 dilution in PBS |
| ECL plus | GE healthcare/Amersham | RPN2133 | After a lot of trial and error we came back to this one |
| Eclipse TE 200-U microscope with EZ C1 laser scanning software | Nikon | ||
| goat anti rabbit Alexa 488 | Thermo Fisher | A-11008 | 1:1,000 dilution in PBS |
| HRP anti-goat | Santa Cruz Biotechnologies | sc-516086 | !:10,000 dilution in TBS |
| HRP donkey anti-mouse | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2315 | 1:10,000 dilution in TBS |
| ICAM-1 antibody | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1511 | 1:200 dilution in PBS |
| IRF5 antibody (H56) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-98651 | |
| Micro plate reader Elx800 | Biotek | ||
| NIMP neutrophil marker | Santa Cruz Biotechnologies | sc-133821 | 1:200 dilution in PBS |
| Octet RED | Forte Bio | protein-protein binding | |
| Peptide design Medit SA software | RCSB.org | ||
| Recombinant IRF5 protein synthesis | TopGene Technologies | protein expression, synthesis service | |
| sodium dodecyl phosphate | Sigma Aldrich | 436143 | detergent |
| Ketamine | Pharmacy | Schedule III controlled substance, presciption required | |
| Xylazine | MedVet | ||
| 3.5X-45X Trinocular Dissecting Zoom Stereo Microscope with Gooseneck LED Lights | Am Scope | SKU: SM-1TSX-L6W | |
| Zeba Desalting Columns | Thermofisher | 2161515 | |
| Endothelial Basal Media EBM Bullet kit | Lonza | CC-3124 | kit contains growth supplemets |
| VIA-100K | Boeckeler Instruments | ||
| 4 - 15% TGX gel | Bio-Rad | 5671081 | |
| MedSuMo software | Medit, Palaiseau, France | ||
| Laemmli Buffer | BioRad |
References
- Bi, X., et al. Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis. Breast Cancer Res. 13 (6), 111 (2011).
- Dideberg, V., et al. An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases. Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).
- Graham, R. R., et al. A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus. Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).
- Krausgruber, T., et al. IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses. Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).
- Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease. Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).
- Mayes, M. D., et al. Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis. Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).
- Dimitroulas, T., et al. Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease. Curr Pharm Des. , (2013).
- Botstein, G. R., LeRoy, E. C. Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches. Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).
- Oram, S., Stokes, W. The heart in scleroderma. Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).
- Xu, H., et al. 4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice. PLoS One. 7 (12), 52046 (2012).
- Steen, V. The heart in systemic sclerosis. Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).
- Deshpande, N., et al. The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema. Nucleic Acids Res. 33, Database issue D233-D237 (2005).
- Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
- Matthew, A. Current biosensor technologies in drug discovery. Drug Discovery. , 69 (2006).
- Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. A review of MED-SuMo applications. Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).
- Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).
- Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry. PloS one. 9 (9), 106882 (2014).
- Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Bauer, P. M., et al. Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase. J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).
- Weihrauch, D., et al. An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice. PLoS One. 11 (4), 0151999 (2016).
- Hoogenboom, H. R., et al. Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).
- Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
- Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Res Notes. 8 (1), 1 (2015).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
- Weihrauch, D., et al. Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).
- Roy, S., P, P. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects. Mavragani, C. , 35 (2011).
